CN1226420C - 基于茜素的新型显色底物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于茜素的新型显色底物。本发明还涉及这些底物的用途，以及含有这种底物的制剂。它由一种具有下列通式I的检测酶活性存在的底物构成：其中：中心环的两个酮基可被一个R11基团所取代(在较高的位置)和被OH所取代(在较低的位置)。R1是一个靶部分或H，而R2是一个靶部分H，R1和R2中的至少一个是靶部分。本发明尤其适合生物诊断领域。
Description
本发明的技术领域
本发明涉及通过利用有效显色底物检测水解酶的方法，尤其是检测糖酶、酯酶和肽酶的方法。
本发明的技术背景
许多年来，一直利用特定的底物来检测是否存在典型微生物的酶活性。通过利用特定的底物，有可能以是否发生反应为基础来描述微生物菌属的特征，或者区分属于给定菌属的不同菌株和/或菌种。
合成酶底物由两部分组成：第一部分是特异于被检测的酶活性并且在下文中被定义为靶部分；第二部分起着标识的作用并且在下文中被定义为标记部分。
这种特定底物可以是荧光的或产色的。事实上，如果第二个标记部分不再与第一个靶部分结合，那么第二个标记部分或者其与一种或多种其它化合物发生反应的产物变得具有荧光或显色(在本文中，参考由申请人申请的专利申请PCT/FR99/00781)。
本发明涉及基于茜素或蒽三酚的显色底物，所述茜素或蒽三酚被掺入到底物中时通常具有一些颜色。然而，由标记部分产生的颜色随着导致所述标记部分与所述底物靶部分分离的水解过程而增强或发生改变。优选地，由于显色因子(例如金属或高pH)的存在，生成产物的颜色特征被进一步增强。
在19世纪，发现了茜素具有与金属形成有色螯合络合物的能力。始于1826年，当茜素被首次从欧茜草植物中分离出来时，其作为染料的特性被开发应用于织物的染色。
1869年，Graebe和Liebermann研究出茜素的完全合成途径。同年，W.H.Perkin研究出更多的不同茜素，所述茜素通过取代蒽环的R3，R4，R5，R6，R7和R8位置上的不同基团来进行合成(如下所示)：
所述茜素本身并不是染料，但是与金属氧化物却能形成不溶性色素。例如，当R3位置被砜基团所取代，与铝盐的螯合作用产生了鲜亮的猩红色而与铬盐的螯合作用则产生了暗枣红色。举另外一个例子，3-硝基茜素和4-硝基茜素根据它们与之螯合的金属盐而产生不同颜色的络合物。茜素在染料工业中的用途主要由于它们与金属以皂、酸或碱金属的氢氧化物形式形成稳定的螯合络合物。
在容易合成的茜素衍生物中，可以发现3-氨基茜素和4-氨基茜素可以由3-硝基茜素和4-硝基茜素产生。4-氨基茜素由下式表示：
由于该化合物在有铝存在的条件下能产生紫色，因而具有特别的意义。而且，它是利用本技术领域技术人员熟悉的斯克洛浦(Skraup)反应合成喹啉茜素的起点，其中一种茜素喹啉(绿色)由下式表示：
取代和闭环反应能够产生完整系列的具有不同特性的改构茜素。
现有技术还表明这些化合物已经具有生物和生物化学方面的应用。鉴于在有螯合络合物存在条件下羟基蒽醌与其发生反应的速率，他们发现优选应用于检测生物样品中是否存在金属的试验中。
由茜素还原反应产生的所述蒽三酚(也被定义为脱氧茜素或蒽-1，2，10-三醇)对于本技术领域的技术人员来说已经很熟悉了。还原反应由氢氧化锌、氨、酸性氯化锡等介导。该化合物的通式如下所示：
然而，至今，还没有关于应用茜素、蒽醌型衍生物和蒽三酚的特定领域的参考文献，所述特定领域是指酶活性的检测。该领域必然包括合成其中至少有一个靶部分与茜素分子结合的底物。只要没有发生裂解所述两个不同部分的水解反应，这些底物就具有在金属离子存在的条件下不发生反应的优点。所形成的螯合络合物不可溶的事实带来了许多显著的优点：
·即使低浓度下，也具有较高的灵敏度，就是说只需要使用少量的底物，
·通过改变反应介质的组成，尤其是其含有的多价阳离子(其定义将在说明书结尾处的特定地方给出)的浓度和/或pH可以方便地调节水解产物的颜色以便适合特定应用的要求，
·他们可以容易地进行合成并且只需要少量底物(由于上述的高灵敏度)，两种因素都能降低生产成本，
·由于所述有色产物扩散效率低因此菌落容易进行分解和鉴别，和
·由于只需要痕量水平的这种底物(由于上述的高灵敏度)，生长基本上不受抑制。
通过相当经典的被称作Koenigs-Knorr方法的途径-(Koenigs，W.和Knorr，E.，Ber.，34，957，1901)已经合成出主要与糖苷结合的茜素的衍生物。利用改版的Helferich方法(Helferich B.等，Ber.，66，378(1933)和Ber.，77，194(1944)合成α-糖苷。其它衍生物与短链脂肪酸和磷酸酯或硫酸酯结合。
迄今为止，所使用的底物是例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，该底物将在随后的比较分析中与本发明的一种称作茜素β-D-半乳糖苷的底物一起进行处理。
根据本发明，本发明的所述底物比现有技术中的那些底物更有效。因此，它们检测多种用于微生物菌种和/或菌株的酶比活性测定。
本发明的底物在其它文献中也都有不同程度的提及。
因此，由Masawaki，Teruyuki等撰写的文章″从茜草根中选择性溶剂提取茜根酸并且随后采用β-糖苷酶进行水解(Selective solventextraction of ruberythric acid from madder roots and subsequenthydrolysis with β-glucosidase)″，发酵生物工程杂志(J.Ferment.Bioeng).(1996)，81(6)，567-569，涉及利用选择性溶剂从茜草根中提取蒽醌-被作为染料-的方法。一种目的是从与糖结合的蒽醌中提取茜素；其中一种是茜素-2-o-樱草苷。为了达到此目的，他们利用β-糖苷酶水解茜素-2-o-樱草苷。
由Van der Plas，Linus H.W.等发表在植物生理杂志(J.Plant.Physiol.)，(1998)，152(2/3)，235-241中的另一篇题目为″蒽醌糖基化和在Morinda citrifolia细胞悬浮液中的水解(Anthraquinoneglycosylation and hydrolysis in Morinda citrifolia cellsuspensions.Regulation and function)″的文章给出了一种糖-糖基化樱草苷存在于植物细胞中的生物学解释(参见第240页第1栏，第3段)。根据这一点，其通过某种蒽醌的水解而产生。
由Mateju，J.等发表在Folia Microbiol.(布拉格)(1974)，19(4)，307-316中的最后一篇题目为″二羟蒽醌的微生物葡糖苷化.葡糖苷化系统的一般特性(Microbial glucosidation of dihydroxyanthraquinones.General properties of the glucosidation system)″的文章涉及金霉素链霉菌的B96突变株的“葡糖苷化”活性。
然而，这些与本申请人的发明相差甚远。尽管事实上所述三篇文章都提及到基于茜素(或其它蒽醌)的底物，但是他们的多样性受到限制(只提及到少数几种化合物)，并且全部通过生物学途径来产生(底物与一种樱草苷结合并且由头两篇文章中的植物产生；底物与各种葡糖苷结合并且由第三篇文章中的灰色链霉菌产生)。而且，这些底物不被用来进行基于酶检测的诊断试验。
针对这一结果，本发明涉及一种用来检测酶活性的显色底物，该底物具有下列通式：
其中：
-R1是一个靶部分或H，而R2是一个靶部分H，R1和R2中的至少一个是靶部分，
-R3是H，SO3H，Cl，Br，F，I，NO2，NH2，NR9R10，或一个酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基团，其中X是一个烷基，芳基或芳烷基基团或一种α-氨基酸残基如丙氨酸，
-R4是H，SO3H，Cl，Br，F，I，NO2，NH2，NR9R10，OH或一个酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基团，其中X是一个烷基，芳基或芳烷基基团或一个α-氨基酸残基如丙氨酸，
-按照一种修饰的方式，R3和R4互相形成键从而创建一个具有至少五条边，优选地六条边的环，
-R5，R6，R7和R8各自由下列一种原子或原子基团组成：H，一种卤素(特别是Cl或Br)，OH，SO3H，或一个烷基或烷氧基团，而
-R9，R10各自独立地是一个甲基，烷基，芳基，芳烷基团，或一个(R9或R10)是一个环状结构(哌啶，吡咯烷，吗啉等)而另一个(R9或R10)是一个氢原子。
在一个特定的实例中，中心环的酮基被还原从而形成其中至少一个氢原子被甲基，烷基，芳基或芳烷基团取代的羟基。
本发明还涉及一种检测酶活性的存在的显色底物，该底物具有以下通式：
其中：
-R1是一个靶部分或H，而R2是一个靶部分H，并且R1和R2中的至少一个是靶部分，
-R3是H，SO3H，Cl，Br，F，I，NO2，NH2，NR9R10，或一个酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基团，其中X是一个烷基，芳基或芳烷基基团或一个α-氨基酸残基如丙氨酸，
-R4是H，SO3H，Cl，Br，F，I，NO2，NH22，NR9R10，OH或一个酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基团，其中X是一个烷基，芳基或芳烷基基团或一个α-氨基酸残基如丙氨酸，
-按照一种修饰的方式，R3和R4互相形成键从而创建一个具有至少五条边，优选地六条边的环，
-R5，R6，R7和R8各自由下列一种原子或原子基团组成：H，一种卤素(特别是Cl或Br)，OH，SO3H，或一个烷基或烷氧基团，和
-R9，R10各自是一个甲基，烷基，芳基，芳烷基团，或一个(R9或R10)是一个环状结构(哌啶，吡咯烷，吗啉等)而另一个(R9或R10)是一个氢原子，
-R11由下列原子或原子基团组成：H，SO3H，Cl，Br，F，I，NO2，NH2，NR9R10，或一个烷基，芳基，芳烷基，酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基团，其中X是一个烷基，芳基或芳烷基基团或一个α-氨基酸残基，而
-R12由H，或甲基，烷基，芳基或芳烷基团组成。
在一个特定的实例中，上述一种底物被水解，所述标记部分由在位置1和2具有两个羟基的茜素组成。该化合物的名称为1，2-二羟基蒽醌-β-D-半乳糖苷并且当它与由半乳糖组成的靶部分结合时，其通式为：
该化合物被β-半乳糖苷酶水解所生成的产物在有一种铁盐存在的条件下形成下列螯合络合物：
在上述所有实例中，R1优选地是H而R2优选地是靶部分。
更准确地说，所述靶部分由下列种类中的一种组成：
-一种糖苷，由单-、双-或多糖亚单位组成，通过α或β键与所述羟基连接，
-一种α-氨基酸或肽，
-一种有机酸，如-O-CO-(CH2)n-CH3，其中n的值在0至20之间，或，
-硫酸盐，磷酸盐，焦硫酸盐，焦磷酸盐或磷酸二酯。
在一个特定的实例中，R3和R4是这样的，当R3或R4通过C3N链(可以取代或不取代)互相连接时N优选邻接R3或R4，则形成了一个六边环。
按照上述至少一种底物用于酶活性检测的第一个技术方案，该用途在于：
-将至少一种底物与怀疑含有至少一种微生物的样品以及至少一种阳离子接触，所述底物的靶部分与需要进行分析的酶活性相匹配，所述微生物表达需要测定的酶活性，和
-监控不溶性、有色螯合络合物的形成。
优选地，所述底物被引进至少一种阳离子，所述阳离子适合于由所述酶活性释放的标记部分。
更优选地，能够用来形成不溶性螯合络合物的阳离子包括Fe2+，Al3+，Mn2+，Sn2+或Cu2+。
为了能够检测至少两种不同的酶活性，如果使用了至少上述两种底物，所述用途在于：
-将至少两种底物与怀疑含有至少一种微生物的样品接触，加入至少一种阳离子，所述底物的靶部分与需要进行分析的两种(至少)酶活性相匹配，所述微生物表达需要测定的酶活性，和
-监测至少两种不同颜色或第三种颜色的形成。
根据最后的实例，所述底物被引进至少一种阳离子，优选地一种单一类型的阳离子，所述阳离子适于由酶活性释放的标记部分。
在所有的实施例中，上述至少一种底物检测酶活性的用途，或者与一种前面已经描述的用途平行进行的该用途在于：
-将至少一种底物与怀疑含有至少一种微生物的样品在具有合适pH的反应介质中接触，所述底物的靶部分与需要进行分析的酶活性相匹配，所述微生物表达需要测定的酶活性，和
-监测至少一种颜色的形成。
优选地，当使用了至少两种底物时，只能使用一种单一类型的的阳离子，该阳离子适合于由酶活性释放的所有标记部分。
按照优选的技术方案，上述用途包括一种中间步骤，该中间步骤在于使得所述微生物能够在一种添加了所述底物的培养基上生长。
如果需要检测的是糖苷酶，所使用的靶部分可以是(在其它的可能性之中)：
·葡萄糖，
·半乳糖，
·甘露糖，
·木糖，
·葡糖醛酸，或
·N-乙酰氨基葡萄糖。
如果需要检测的是磷酸酯酶活性，所用靶部分可以是(在其它的可能性之中)磷酸或其一种取代的衍生物。
如果需要检测的是硫酸酯酶活性，所用靶部分可以是(在其它的可能性之中)硫酸或其一种取代的衍生物。
如果需要检测的是脂酶、磷脂酶或酯酶活性，所用靶部分可以是(在其它的可能性之中)：
·一种脂肪酸(饱和的或不饱和的)，或其一种取代的衍生物，
·醋酸，或其一种取代的衍生物，
·丁酸，或其一种取代的衍生物，
·辛酸或其一种取代的衍生物，或
·一种酯化的磷酸基团如肌醇-1-磷酸。
本发明还涉及一种检测至少一种微生物菌株和/或微生物菌种的制剂，该制剂包括至少一种上述底物和一种培养基。
如果所述制剂含有至少两种底物，所形成的反应产物应具有不同的颜色以便区分不同酶活性，所述酶活性是由至少一种微生物菌株和/或微生物菌种表达的。
优选地，所述制剂的表现形式是液体、半固体或固体(例如，一种适合于再悬浮在一种适当溶液中的干燥物形式)。
更优选地是，所述底物的浓度在10至500mg/l之间，优选地在30至150mg/l之间，以及更优选地是50mg/l。
因此，该发明涉及一种新型底物，该底物起初颜色不明显，一方面在一种需要进行检测的微生物或一种酶存在的条件下，另一方面(在某些实例中)在一种阳离子存在的条件下，所述底物呈现出明显的颜色。本发明还涉及这种底物的用途以及含有这种底物的制剂。
尽管不是绝对必需，但是阳离子的存在特别有利；在后面的实例中，所用制剂优选地具有碱性pH。还有可能将该两种条件结合起来，即阳离子的存在和碱性pH。
如果使用不同的阳离子，检测的微生物菌落呈不同颜色。为了防止或降低检测样品中的游离离子对生长的抑制作用，以非常低的浓度使用阳离子如铁、锰、锡和铝。
然而，高浓度的某些金属离子诱导选择性抑制，该抑制可以被用来选择微生物菌种，因而具有附加的优点。
底物合成：
1°)茜素-2-β-D-葡糖苷的合成：
按照Robertson等的方法(学协会杂志(J.Chem.Soc.)(1930)，1136 et(1933)，1167)，茜素在位置2上的羟基被特异性糖基化，尽管这种添加也可以在位置1上进行。然而位置2上的结合更容易些。
利用Robertson(1933)所述方法的改进方法制备所述底物。将质量为6g的茜素再悬浮在70ml的丙酮中并且与70ml的氢氧化钾(0.28mol/l)溶液混合以便形成一种盐。向该溶液中加入一种40ml的含有6.6g乙酰-溴-葡萄糖的混合物，该混合物是含有1∶1醚和丙酮的混合物。将所述混合物搅拌大约14小时。然后，加入7ml的氢氧化钾溶液(1.25mol/l)，随后加入15ml的乙酰-溴-葡萄糖(0.6mol/l)的丙酮溶液。将该预混合物继续搅拌10小时。在低压下蒸发掉所述的醚和丙酮并且采用冰醋酸将pH调到约5.5。将含有某些未反应的茜素的混合物过滤后用水冲洗，然后在50℃下过夜干燥。
得到的黄色固体被重新悬浮在70ml的丙醋酸中和///在其中震荡5分钟。过滤前将其冷却下来然后用醋酸冲洗。将所述滤出物搁置1小时，使得与残余茜素分离开来。然后在10℃下重复该过程以便产生一种暗绿色的滤出物。
将所述产品进行干燥并溶解在200ml的二氯甲烷中，然后加入2ml的三乙胺。将氧化铝预混合到所述的溶液中直到测试样品的薄层色谱(TLC)结果表明没有残留的茜素存在。除去所述的氧化铝并且采用旋转蒸发器蒸发掉残留溶液，从而产生一种黄色固体。该固体从含有几滴醋酸的热乙醇中再结晶出来。由此产生2.02g的茜素四-乙酰-葡糖苷。
将质量为1.1g的茜素四-乙酰-葡糖苷重新悬浮在60ml的乙醇中，然后加入30ml的含水氢氧化钠(0.125mol/l)从而得到一种红色溶液。该混合物在65℃下保持10分钟后被冷却到0℃。然后通过真空过滤除去所述的红色糖基化茜素钠盐，采用醚冲洗并且最终进行干燥。所述过程产生了0.9g的茜素-2-β-D-葡糖苷的钠盐。利用本技术领域技术人员熟悉的技术进一步纯化该产物以便得到茜素-2-β-D-葡糖苷。
2°)茜素-2-β-D-半乳糖苷的合成：
还是利用Robertson(1933)所述方法的改进方法制备该底物。将质量为6g的茜素重新悬浮在70ml的丙酮中并且与70ml的氢氧化钾(0.28mol/l)溶液混合以便形成一种盐。向该溶液中加入一种40ml的含有6.6g乙酰-溴-半乳糖的混合物，该混合物是含有1∶1醚和丙酮的混合物。将所述混合物搅拌大约14小时。然后，加入7ml的氢氧化钾溶液(1.25mol/l)，随后加入15ml的乙酰-溴-半乳糖(0.6mol/l)的丙酮溶液。将该预混合物继续搅拌10小时。在低压下蒸发掉所述的醚和丙酮并且采用冰醋酸将pH调到约5.5。将含有某些未反应的茜素的混合物过滤后用水冲洗，然后在50℃下过夜干燥。
将所述产品进行干燥并溶解在200ml的二氯甲烷中，然后加入2ml的三乙胺。将氧化铝预混合到所述的溶液中直到测试样品的薄层色谱(TLC)结果表明没有残留的茜素存在。除去所述的氧化铝并且采用旋转蒸发器蒸发掉残留溶液，从而产生一种黄色固体。该固体从含有几滴醋酸的热乙醇中再结晶出来。由此产生1.96g的茜素四-乙酰-半乳糖苷。
将质量为1.1g的茜素四-乙酰-半乳糖苷重新悬浮在60ml的乙醇中，然后加入30ml的含水氢氧化钠(0.125mol/l)从而得到一种红色溶液。该混合物在65℃下保持10分钟后被冷却到0℃。然后通过真空过滤除去所述的红色糖基化茜素钠盐，采用醚冲洗并且最终进行干燥。所述过程产生了0.86g的红色晶状粉末形式的茜素-2-β-D-半乳糖苷的钠盐。
3°)茜素-2-醋酸酯的合成：
利用本技术领域的技术人员熟知的方法制备所述底物。将2克的茜素溶解在5ml的吡啶中并用2.5ml的醋酸酐与5ml的吡啶的混合物进行处理。室温下16小时后，将所述黄色溶液倒入100ml的含冰盐酸中。通过抽滤回收沉淀的醋酸酯，然后用水冲洗。从丙酮中再结晶后产生1.4g的茜素-2-醋酸酯的黄色晶体。
4°)茜素-2-硫酸盐的合成：
通过在10ml的含有4g吡啶-硫三氧化物复合物的吡啶中加热2.4g的茜素(即10mmol)制备所述底物。60℃下2小时后，低压除去吡啶。通过将氢氧化钾仔细加入到甲醇中直到pH达到9，硫酸酯以与钾盐相同的方式再结晶。逐渐形成所述钾盐并且通过抽滤进行回收，然后用醚冲洗以便产生1.2g的白色晶状粉末，茜素-2-硫酸盐。
5°)茜素-1-半乳糖苷的合成：
由茜素-2-醋酸酯制备所述底物(其合成见本章3°)。将质量为2,82g的酯(即10mmol)混合到75ml的二氯甲烷中并向该混合物添加2至3ml的2，4，6-三甲基吡啶或2，6-二甲基吡啶从而产生深紫色的溶液。1小时后，加入碳酸银，然后加入5g(即12.5mmol)的乙酰-溴-半乳糖，所述碳酸银是按照Wolfrom and Lineback的″碳水化合物化学2中的方法(Methods in Carbohydrate Chemistry 2)″(1963)，342-43制备的。所述反应在一个恒定搅拌器中于室温(即10至15℃)下进行两天。薄层层析表明发生了向四-乙酰半乳糖苷(在板上快速迁移)的稳定转化。所述溶液通过二氧化硅或硅藻土床进行过滤并且利用足量(即大约100ml)的二氯甲烷冲洗所述助滤剂。然后用0.2M的盐酸(3×100ml)在水(×2)中的溶液冲洗所述化合物在二氯甲烷中的溶液。干燥后(MgSO4)，在低压下蒸发淡褐色提取物，然后溶解在一种新等分甲醇中。薄层层析(醋酸乙酯/甲苯)的结果表明含有快速迁移样品和硫酸，所述快速迁移样品在紫外线辐射下产生阳性信号。然后利用甲醇钠的甲醇溶液按照已经记载的方法将受保护的半乳糖苷去乙酰基化，结果产生1.32g的茜素-1-半乳糖苷。
6°)茜素-1-磷酸-2-辛酸酯：
通过100ml二氯甲烷中的2.4g(即10mmol)与3ml的三乙胺发生反应来制备该底物。室温下将1.62g的辛酰氯(10mmol)缓慢添加到该溶液中，整个添加过程需要30分钟并且需要搅拌。按照已有方法利用铝进行处理来纯化所述辛酸酯，然后除去溶剂并将所述产物从甲醇中再结晶出来以便回收所述的辛酸酯。冷却到-12℃后，30ml干乙腈中的质量为1.84g的辛酸酯(5mmol)继续采用下列物质进行处理：
·3.6g的四氯化碳，
·1.6g的二异丙乙胺，和
·80mg的4-二甲基氨基吡啶。
低温下大约2分钟后，将含有2.2g的二苄基亚磷酸盐的溶液加到8ml的乙腈中以防止温度升得过高。1小时后，按照Silverberg L.J.，DillonJ.L.et Vermeshetti P.在Tet.Lett.，37 N°6(1996)中描述的方法处理所述混合物，并且以30ml的醋酸乙酯作溶剂，在有0.4g的钯/碳催化剂(10％w/w)存在的条件下，利用氢裂解所述的二苄基磷酰酯。通过将所述溶液与甲醇混合来去除醋酸酯并小心加入pH为8的碳酸钾含水甲醇溶液，然后，再以与钾盐相同的方式回收磷酸酯。回收茜素-1-磷酸-2-辛酯的沉淀钾盐，用甲醇冲洗，将2.05g的酯进行真空干燥并且不需要进一步纯化就可以使用。
7°)脱氧茜素的合成：
通过采用由Liebermann-Ber.，21 444(1888)给出的途径制备这种底物。为了合成还原蒽醌的9-和10-O-甲基衍生物，首先利用甲基按照适当的方法(本技术领域的技术人员熟悉的)或者利用乙醛二甲基醋酸酯(通过亚乙基保护)将所有的1，2-二醇基团保护起来，其中所述方法包括按照Scheline-Acta.Chem.Scand.20 1182(1966)中的记载与硼酸形成复合物。
应用
许多应用是可能的：
1.在半固体培养基或在膜上检测和鉴定特定的微生物菌种。
2.在含有来源于组织活细胞的提取物的溶液中或在真核或原核细胞的悬浮液中检测酶活性。
3.基于它们表达的酶活性鉴定生物体。
4.如在ELISA方法中，目测和定位抗原与抗体之间的特异性反应。例如，在分析标记酶过程中进行β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酯酶活性检测的方法中可以使用茜素-β-半乳糖苷或茜素-磷酸酯。在这种情况下，所述酶底物首先被用于涉及一种酶活性(涉及那些碱性磷酸酯酶或β-半乳糖苷酶)的检测反应中，如在一种ELISA-型版本中的检测抗体或抗原的反应中，所述ELISA-型版本，例如由Y.Barbier编辑的并由ACOMEN，Lyon出版的″免疫分析(Immunoassays)：(从理论到实践from Theory toPractice)″109至133页(1988)；或者，所述酶底物首先被用于核酸的检测中，例如由Keller G.H.，Manak，M.M.撰写的″DNA probes″，第二版，Stockton出版社，5至9节(1993)。
5.测定基因，例如编码β-半乳糖苷酶的基因存在的分子生物学技术及其用途″分子克隆(Molecular cloning)：实验室指南(alaboratorymanual)″第二版，Sambrook，Fritsch，Maniatis，冷泉港实验室出版社Cold Spring Harbor Laboratory Press)，16.56节和1.85节(1989)。
6.组织化学、细胞化学和流式血细胞计数的技术。这种在医学诊断和其它领域，例如水质检测、环境检测、食品工业等中具有重要应用价值的酶特异性底物的用途。
7.利用聚丙酰胺凝胶或其它用于电泳和其它分离方法中的物质进行酶检测的方法。
实施例
实施例1：茜素-2-β-D-半乳糖苷浓度对检测由半固体培养基中的微生物产生的β-半乳糖苷酶活性的影响
向一种哥伦比亚基的培养基(46.37g/l)中添加含有含氨柠檬酸铁(0,05g/l)的茜素-2-β-D-半乳糖苷(0,01g/l，0,03g/l，0,05g/l和0,08g/l)，或添加不含含氨柠檬酸铁的6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(0,2g/l)。采用这四种不同的培养基(每一培养皿20ml培养基)制备培养皿。将这些培养皿分成三个区域，然后在每一区域接种上细菌悬浮液(密度＝0.5 McFarland)。所述培养皿在37℃下培养48小时。接种18、24和48小时后，通过目测观测长出的菌落。记录颜色和颜色的强度。所述结果见下表1。
| 菌株 | 培养时间 | 6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷 | 茜素-2-β-D-半乳糖苷 | ||
| 0.2g/l | 0.01g/l | ||||
| 颜色 | 强度 | 颜色 | 强度 | ||
| 大肠杆菌115 | 18H24H48H | 粉红色粉红色粉红色 | 3.53.53.5 | 紫色紫色紫色 | 0.30.30.5 |
| 肺炎克雷伯氏菌023 | 18H24H48H | --粉红色 | --0.3 | --- | --- |
| 粪肠球菌117 | 18H24H48H | --- | --- | 紫色紫色紫色 | 0.30.60.6 |
| 粘质沙雷氏菌042 | 18H24H48H | 粉红色粉红色粉红色 | 0.30.83.5 | --紫色 | --0.3 |
| 普通变形菌087 | 18H24H48H | --- | --- | --- | --- |
| 摩氏摩根氏菌060 | 18H24H48H | --- | --- | --- | --- |
| 菌株 | 培养时间 | 茜素-2-β-D-半乳糖苷 | |||||
| 0.03g/l | 0.05g/l | 0.08g/l | |||||
| 颜色 | 强度 | 颜色 | 强度 | 颜色 | 强度 | ||
| 大肠杆菌115 | 18H24H48H | 紫色紫色紫色 | 2.72.73 | 紫色紫色紫色 | 3.53.53.5 | 紫色紫色紫色 | 444 |
| 肺炎克雷伯氏菌023 | 18H24H48H | 紫色紫色紫色 | 0.30.30.5 | 紫色紫色紫色 | 0.811 | 紫色紫色紫色 | 1.51.51.7 |
| 粪肠球菌117 | 18H24H48H | 紫色紫色紫色 | 2.733.5 | 紫色紫色紫色 | 444 | 紫色紫色紫色 | 444 |
| 粘质沙雷氏菌042 | 18H24H48H | 紫色紫色紫色 | 0.511.7 | 紫色紫色紫色 | 12.53 | 紫色紫色紫色 | 22.53.5 |
| 普通变形菌087 | 18H24H48H | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 摩氏摩根氏菌060 | 18H24H48H | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
表1：底物浓度对由半固体培养基中的微生物产生的β-半乳糖苷酶活性
测定的影响
表1中，符号″-″表示无色。没有产生任何颜色而只给出阴性结果的菌株被用作阴性对照。
从表1中可以看到浓度为0.03g/l的茜素-2-β-D-半乳糖苷产生的颜色强度近似于采用大约7倍浓度的6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷所产生的颜色强度。产生有效颜色强度的茜素-2-β-D-半乳糖苷的浓度范围为0.03g/l至0.08g/l，优选地为0.05g/l.。因此茜素基的底物比吲哚酚基的底物的敏感度高。
实施例2：利用茜素2-β-D-半乳糖苷检测半固体培养基上的微生物产生
的β-半乳糖苷酶活性
按照以下方法制备添加了茜素-2-β-D-半乳糖苷的半固体培养基：将46.37g的哥伦比亚琼脂与诱导β-半乳糖苷酶活性的50mg的茜素-2-β-D-半乳糖苷，500mg的含氨柠檬酸铁和30mg的异丙基1-β-D-硫代半乳糖苷一起加到1升蒸馏水中。将所述培养基在116℃下高压灭菌10分钟。然后将其缓慢冷却到55℃，在该温度下将其倒入20ml的培养皿中。将该培养基与以同样方式采用46.37g的哥伦比亚琼脂与80mg的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷和30mg的异丙基1-β-D-硫代半乳糖苷制备的另一种半固体培养基进行比较。
利用20E API(注册商标)条(strips)(bioMérieux，法国)按照参考方法鉴定从临床和环境样本中收集的三百六十七(367)株不同的菌株。利用哥伦比亚琼脂将所有菌株在37℃下培养24小时，然后针对每一菌株制备大约108微生物/ml(相当于0,5的McFarland示度)的接种液。利用一种Denley接种器，每种培养基的一个培养皿接种1毫升的每种悬浮液，即如上述制备的添加了茜素-2-β-D-半乳糖苷的培养基以及含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-如糖苷的培养基。所有培养皿在37℃下培养18小时。
培养后，目测长出的菌落。在含有茜素-2-β-D-半乳糖苷的培养基上，表达β-半乳糖苷酶活性的菌落是紫色而在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷的培养基上，菌落是绿松石色。显示这些颜色中的一种颜色的任何菌株被认为对β-半乳糖苷酶和相应底物是阳性的。所述结果结果如下表2所示。
| 菌种 | 每一菌种检测菌株的数目 | 茜素-2-β-D-半乳糖苷 | 5-溴-4-氯-3-吲哚基-2-β-D-半乳糖苷 |
| 不动杆菌属. | 53 | 0 | 0 |
| 豚鼠气单胞菌 | 7 | 86 | 86 |
| 嗜水气单胞菌 | 3 | 100 | 100 |
| 差异柠檬酸杆菌 | 9 | 89 | 89 |
| 弗氏柠檬酸杆菌 | 16 | 100 | 100 |
| 产气肠杆菌 | 9 | 100 | 100 |
| 成团肠杆菌 | 1 | 100 | 100 |
| 阴沟肠杆菌 | 21 | 100 | 100 |
| 大肠杆菌 | 41 | 95 | 95 |
| 赫氏埃希氏菌 | 1 | 100 | 100 |
| 蜂房哈夫尼菌 | 10 | 80 | 80 |
| 产酸克雷伯氏菌 | 13 | 100 | 100 |
| 肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种 | 3 | 100 | 67 |
| 肺炎克雷伯氏菌 | 19 | 100 | 100 |
| 摩氏摩根氏菌 | 12 | 0 | 0 |
| 奇异变形菌 | 16 | 0 | 0 |
| 彭氏变形菌 | 1 | 0 | 0 |
| 普通变形菌 | 4 | 0 | 0 |
| 产碱普罗威登斯菌 | 3 | 0 | 0 |
| 雷氏普罗威登斯菌 | 3 | 0 | 0 |
| 斯氏普罗威登斯菌 | 10 | 0 | 0 |
| 沙门氏菌属. | 64 | 0 | 0 |
| 气味沙雷氏菌 | 1 | 100 | 100 |
| 沙雷氏菌属. | 14 | 86 | 79 |
| 鲍氏志贺氏菌 | 1 | 0 | 0 |
| 痢疾志贺氏菌 | 2 | 0 | 0 |
| 弗氏志贺氏菌 | 2 | 0 | 0 |
| 索氏志贺氏菌 | 10 | 100 | 100 |
| 霍乱弧菌 | 1 | 100 | 100 |
| 小肠批肠炎耶尔森氏菌 | 14 | 64 | 29 |
| 甲结核耶尔森氏菌 | 3 | 67 | 0 |
表2：添加了茜素-2-β-D-半乳糖苷的半固体培养基上的微生物产生的
β-半乳糖苷酶活性的检测
茜素-2-β-D-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷两栏中给出的数字对应于阳性菌株的百分比。大多数的菌株(96.5％)以完全相同的方式—即阳性地或阴性地—与两种底物发生反应。八个菌株选择性地水解茜素-2-β-D-半乳糖苷。然而，所有这八个菌株具有β-半乳糖苷酶活性，该β-半乳糖苷酶活性通过在有底物4-甲基繖形基(umbelliferyl)-β-D-半乳糖苷存在的条件下产生荧光信号来进行显示。因此该表中的结果表明所述底物针对β-半乳糖苷酶活性是一种灵敏度高于参照底物5-溴-4-氯-3-吲哚基--β-D-半乳糖苷的有效标记。因此，这些底物及其灵敏并且能以非常底的浓度进行使用。
实施例3：不同金属盐对标记部分颜色的影响
向添加了茜素-2-β-D-葡萄糖苷(50mg/l)的哥伦比亚基培养基(46.37g/l)中以50mg/l的浓度加入氯化锰、含氨柠檬酸铁、氯化锡或硫酸铝。并列检测不含金属盐的对照培养基。高压灭菌后，这些不同的培养基被用来制备培养皿(每块板20ml)。将这些培养皿分成三个区域，然后每个区域接种上从申请人保藏中心取来的微生物悬浮液(密度＝0.5 McFarland)。所述培养皿在37℃下培养48小时。接种24和48小时后通过目测检测长出的菌落。记录颜色和颜色强度。结果如下表3所示。应当指出强度读数是任意单位。给出这些数值的唯一目的使得一个菌株与另一菌株在这方面进行比较成为可能。对于后面的实施例也是同样的。类似地，检测的菌株取自申请人保藏并且给出的编码代表该保藏特有的内部索引号。所述相同的内部编码系统也用于以后给出的一些实施例中。
| 菌株 | 培养时间 | 对照 | 氯化锰 | 柠檬酸铁 | |||
| 颜色 | 强度 | 颜色 | 强度 | 颜色 | 强度 | ||
| 单核细胞增生利斯特氏菌023 | 24H48H | 紫色紫色 | 22 | 紫色紫色 | 2.72.7 | 紫色紫色 | 44 |
| 单核细胞增生利斯特氏菌079 | 24H48H | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 2.72.7 | 紫色紫色 | 44 |
| 单核细胞增生利斯特氏菌081 | 24H48H | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 2.32.7 | 紫色紫色 | 44 |
| 伊氏利斯特氏菌018 | 24H48H | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 2.72.7 | 紫色紫色 | 44 |
| 伊氏利斯特氏菌020 | 24H48H | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 2.72.7 | 紫色紫色 | 44 |
| 伊氏利斯特氏菌032 | 24H48H | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 44 |
| 无害利斯特氏菌036 | 24H48H | 紫色紫色 | 2.32.7 | 紫色紫色 | 2.32.7 | 紫色紫色 | 44 |
| 无害利斯特氏菌029 | 24H48H | 紫色紫色 | 22.3 | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 44 |
| 无害利斯特氏菌077 | 24H48H | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 44 |
| 斯氏利斯特氏菌011 | 24H48H | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 2.72.7 | 紫色紫色 | 44 |
| 威氏利斯特氏菌023 | 24H48H | 紫色紫色 | 2.32.3 | 紫色紫色 | 2.32.7 | 紫色紫色 | 44 |
| 格氏利斯特氏菌078 | 24H48H | 紫色紫色 | 22.3 | 紫色紫色 | 22 | 紫色紫色 | 44 |
| 菌株 | 培养时间 | 氯化锡 | 硫酸铝 | ||
| 颜色 | 强度 | 颜色 | 强度 | ||
| 单核细胞增生利斯特氏菌023 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
| 单核细胞增生利斯特氏菌079 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 3.54 | 红色红色 | 44 |
| 单核细胞增生利斯特氏菌081 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
| 伊氏利斯特氏菌018 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
| 伊氏利斯特氏菌020 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
| 伊氏利斯特氏菌032 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
| 伊氏利斯特氏菌036 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
| 伊氏利斯特氏菌029 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
| 伊氏利斯特氏菌077 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
| 斯氏利斯特氏菌011 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
| 威氏利斯特氏菌023 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
| 格氏利斯特氏菌078 | 24H48H | 桔黄色桔黄色 | 34 | 红色红色 | 44 |
表3：不同金属盐对标记部分颜色的影响
所述底物水解产生的颜色随着使用的金属盐发生变化。即使在没有金属盐存在的条件下(即对照培养基)也能观察到颜色。然而，所述颜色不如有金属盐如铁盐(其不影响真实颜色)存在的条件下观察到的颜色强度强。
这意味着为了适应特定的需要，可以改变颜色及其强度(例如，当与其它酶底物或pH指示剂一起使用时)。
实施例4：在有茜素-2-β-D-半乳糖苷存在的条件下pH对检测β-D-半
乳糖苷酶的影响
向十八支含有5ml透析纯净水的试管中的每一支中加入茜素-2-β-D-半乳糖苷(0.05g/l)和5μl的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23Sigma)。向这些试管中的一半试管中加入含氨柠檬酸铁(0.05g/l)。将所有18支试管在37℃下培养4小时，然后不含含氨柠檬酸铁的试管呈浅粉红色，而添加了含氨柠檬酸铁的试管中的粉红色看起来颜色更深一些。最后，在24℃下将这些试管的pH调到不同值(2-3-4-5-6-7-8-9-10)。在不同值pH下所观察到的颜色见下表4。
| pH | 不含铁的试管 | 添加了铁的试管 |
| pH 2 | 黄色 | 黄色 |
| pH 3 | 黄色 | 黄色 |
| pH 4 | 黄色 | 黄色 |
| pH 5 | 黄色-桔黄色 | 黄色-粉红色 |
| pH 6 | 粉红色-桔黄色 | 粉红色 |
| pH 7 | 粉红色-桔黄色 | 粉红色 |
| pH 8 | 粉红色 | 紫色 |
| pH 9 | 紫色 | 紫色 |
| pH 10 | 淡紫色 | 淡紫色 |
表4：在有2-茜素-β-D-半乳糖苷存在的条件下pH对β-D-半乳糖苷酶
检测的影响
颜色随着pH而变化。作为一般的规律，低pH时呈黄色，而较高pH时呈粉红色或紫色。这意味着颜色可以进行变化以便满足需要或检测不同的代谢参数(例如，酶水解和pH变化)。该实验还表明可以利用一个宽范围变化的pH值。
实施例5：在一种半固体培养基中将基于茜素的底物与另外一种底物相
结合-检测至少两种不同的酶活性
下列培养基：
·哥伦比亚基(46.37g/l)，
·茜素-2-β-D-葡糖苷(0.05g/l)，
·含氨柠檬酸铁(0.05g/l)，
·5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(0.05g/l)，和
·异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(30mg/l)诱导β-半乳糖苷酶活性，被用来灌注培养皿(每块板30ml)。将这些培养皿分成三个区域，然后将每个区域接种上取自申请人保藏的微生物悬浮液(密度＝0.5 McFarland)。将这些培养皿在37℃下培养48小时。
培养24和48小时后通过目测观察长出的菌落。记录颜色和颜色强度。结果见下表5：
| 菌株 | 培养时间 | 茜素-2-β-葡糖苷加上5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷 | |
| 颜色 | 强度 | ||
| 大肠杆菌115 | 24H48H | 绿松石色绿松石色 | 3.54 |
| 大肠杆菌206 | 24H48H | 绿松石色绿松石色 | 3.54 |
| 弗氏柠檬酸杆菌136 | 24H48H | 绿松石色绿松石色 | 3.53.5 |
| 粪肠球菌117 | 24H48H | 紫色紫色 | 44 |
| 粪肠球菌066 | 24H48H | 紫色紫色 | 44 |
| 屎肠球菌039 | 24H48H | 紫色紫色 | 44 |
| 肺炎克雷伯氏菌023 | 24H48H | 淡蓝紫色淡蓝紫色 | 44 |
| 阴沟肠杆菌059 | 24H48H | 淡蓝紫色淡蓝紫色 | 44 |
| 差异柠檬酸杆菌002 | 24H48H | 淡蓝紫色淡蓝紫色 | 44 |
| 摩氏摩根氏菌035 | 24H48H | -- | -- |
| 铜绿假单胞菌054 | 24H48H | -- | -- |
| 奇异变形菌154 | 24H48H | -- | -- |
表5：同步检测两种底物：茜素-2-β-D-葡糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚
基-β-D-半乳糖苷
在表5中，符号″-″表示无色。不产生任何颜色而只产生阴性结果的菌株被用作阴性对照。
通过利用两种不同底物的混合物可以辨别四组不同的微生物：
·第一组，产生绿松石色的成员代表只表达β-半乳糖苷酶活性的菌种，
·第二组，产生紫色的成员代表只表达β-葡糖苷酶活性的菌种，
·第三组的成员表示一种上述两种模式的组合，也就是说一种蓝色或淡紫色，代表表达两种待分析酶活性的菌种，和
·第四组，无色组代表没有上述任何一种酶活性的菌种。
因此有可能通过茜素基底物与其它酶底物的结合，在微生物表达生化活性的基础上来辨别一组或多组微生物。
实施例6：利用茜素-2-β-D-葡糖苷检测半固体培养基上的微生物所产
生的β-葡糖苷酶活性
向一种API(注册商标，bioMérieux，法国)带(strip)的一个孔中加入3μl茜素-2-β-D-葡糖苷(0.12g/l)与含氨柠檬酸铁(0.05g/l)的混合物，然后进行干燥。同时建立一个含有终浓度为0.4g/l的6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷的对照孔。然后将50μl的哥伦比亚基加到所述两种孔中，随后接种上100μl的细菌悬浮液(密度＝2McFarland)。在37℃下培养4和24小时后，记录孔中产生的颜色。所述结果见下表6。
| 菌株 | 培养时间 | 采用茜素-2-β-D-葡糖苷观察到的颜色 | 采用6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷观察到的颜色 |
| 单核细胞增生利斯特氏菌022 | 4H | 紫色 | 粉红色 |
| 24H | 紫色 | 粉红色 | |
| 伊氏利斯特氏菌018 | 4H | 紫色 | 粉红色 |
| 24H | 紫色 | 粉红色 | |
| 无害利斯特氏菌036 | 4H | 紫色 | 粉红色 |
| 24H | 紫色 | 粉红色 | |
| 斯氏利斯特氏菌080 | 4H | 紫色 | - |
| 24H | 紫色 | 粉红色 | |
| 苏云金芽孢杆菌072 | 4H | - | - |
| 24H | 紫色 | - | |
| 肺炎克雷伯氏菌023 | 4H | 紫色 | 粉红色 |
| 24H | 紫色 | 粉红色 | |
| 金黄色葡萄球菌062 | 4H | - | - |
| 24H | - | - | |
| 屎肠球菌009 | 4H | 紫色 | 粉红色 |
| 24H | 紫色 | 粉红色 |
表6：检测添加了茜素-2-β-D-葡糖苷的半固体培养基上的微生物产生
的β-葡糖苷酶活性
在表6中，符号″-″表示无色。这些不产生任何颜色而只产生阴性结果的菌株被用作阴性对照。
茜素基底物检测8个测试菌种中的7个菌种有该活性，而6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷只检测这些菌种中6个菌种有该种活性。而且，其中的两种菌种(苏云金芽孢杆菌和斯氏利斯特氏菌)，其活性在利用茜素基底物的较早时间点就显示出来了。因此，这些底物不但可以用于肉汤培养基，而且还比吲哚酚基底物更灵敏。
实施例7：茜素-1-β-D-葡糖苷与茜素-2-β-D-葡糖苷在半固体培养基
中的比较
向哥伦比亚基质中加入任一：
·0.05g/l的茜素-2-β-D-葡糖苷和0.05g/l的含氨柠檬酸铁，
·0.05g/l和0.1g/l的茜素-1-β-D-葡糖苷，对于该两种浓度，加0.05g/l的含氨柠檬酸铁，
·0.15g/l的6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷而不加入含氨柠檬酸铁。
利用这四种培养基制备培养皿(每只皿20ml的培养基)。将这些培养皿分成三个区域并且将每个区域接种上细菌悬浮液(密度＝0.5 McFarland)。将所述培养皿在37℃下培养48小时。培养18，24和48小时后通过目测检测长出的菌落。记录菌落的颜色和颜色强度。所述结果见下表7。
| 菌株 | 培养时间 | 6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷 | 2-茜素-β-D-葡糖苷 | ||
| 颜色 | 强度 | 颜色 | 强度 | ||
| 大肠杆菌115 | 18H | - | - | - | - |
| 24H | - | - | - | - | |
| 48H | - | - | - | - | |
| 差异柠檬酸杆菌059 | 18H | 粉红色 | 0.5 | 淡紫色 | 2 |
| 24H | 粉红色 | 1 | 淡紫色 | 3 | |
| 48H | 粉红色 | 2 | 淡紫色 | 3.5 | |
| 粪肠球菌117 | 18H | 粉红色 | 1.5 | 紫色 | 3.5 |
| 24H | 粉红色 | 2 | 紫色 | 4 | |
| 48H | 粉红色 | 2.5 | 紫色 | 4 | |
| 肺炎克雷伯氏菌023 | 18H | 粉红色 | 2 | 紫色 | 3.5 |
| 24H | 粉红色 | 2.5 | 紫色 | 4 | |
| 48H | 粉红色 | 3 | 紫色 | 4 | |
| 奇异变形菌008 | 18H | - | - | - | - |
| 24H | - | - | - | - | |
| 48H | - | - | - | - | |
| 表皮葡萄球菌024 | 18H | - | - | - | - |
| 24H | - | - | - | - | |
| 48H | - | - | - | - | |
| 菌株 | 培养时间 | 1-茜素1-β-D-葡糖苷(0.05g/l)， | 1-茜素1-β-D-葡糖苷(0.1g/l)， | ||
| 颜色 | 强度 | 颜色 | 强度 | ||
| 大肠杆菌115 | 18H | - | - | - | - |
| 24H | - | - | - | - | |
| 48H | - | - | - | - | |
| 差异柠檬酸杆菌059 | 18H | 淡紫色 | 1.5 | 淡紫色 | 2.5 |
| 24H | 淡紫色 | 2 | 淡紫色 | 3 | |
| 48H | 淡紫色 | 2.5 | 淡紫色 | 4 | |
| 粪肠球菌117 | 18H | 紫色 | 3.5 | 紫色 | 3.5 |
| 24H | 紫色 | 4 | 紫色 | 4 | |
| 48H | 紫色 | 4 | 紫色 | 4 | |
| 肺炎克雷伯氏菌023 | 18H | 紫色 | 2.5 | 紫色 | 3.5 |
| 24H | 紫色 | 3 | 紫色 | 4 | |
| 48H | 紫色 | 3.5 | 紫色 | 4 | |
| 奇异变形菌008 | 18H | - | - | - | - |
| 24H | - | - | - | - | |
| 48H | - | - | - | - | |
| 表皮葡萄球菌024 | 18H | - | - | - | - |
| 24H | - | - | - | - | |
| 48H | - | - | - | - | |
表7：茜素-1-β-D-葡糖苷与茜素-2-β-D-葡萄苷在半固体培养基中的
比较
在表7中，符号″-″表示无色。没有产生任何颜色而只产生阴性结果的菌株被用作阴性对照。
在相同的浓度0.05g/l下，所述两种底物针对3个表达活性菌株中的两个菌株产生的颜色不相同。茜素-2-β-D-葡糖苷比茜素-1-β-D-葡糖苷的灵敏度略高些。然而，在0.1g/l的浓度下，茜素-1-β-D-葡糖苷比茜素-2-β-D-葡糖苷产生的颜色深。
从该表可以看出，利用0.05g/l浓度的茜素-1-β-D-葡糖苷针对所有测试菌株观察到的颜色强度比利用三倍浓度的6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷产生的颜色深。
因此茜素基底物比吲哚酚基底物的灵敏度高。
对使用茜素-1-β-D-葡糖苷还是使用茜素-2-β-D-葡萄苷的选择还受其它因素的影响，诸如生产成本、稳定性，应用领域的特殊性等。
特点
一种通过目测检验来鉴别菌落的细菌种类的方法包括在添加了至少一种如上述合成的底物的半固体培养基上以及在有至少一种适当的痕量阳离子存在的条件下培养所述细菌。长出的菌落呈现出一种取决于所用底物以及与其结合的阳离子的强烈颜色(红色，紫色，蓝色等颜色)。底物与阳离子之间存在的比值在1/100至100/1之间，优选地在1/10至10/1之间，更优选地在1/2至2/1之间。
在某些条件下，所述底物R3位置上的SO3H基团有助于克服与底物类型有关的稳定性和溶解性问题。
术语“多价阳离子”是指Xn+型的多价金属阳离子，其中n＝2，3或4。可以使用的金属离子是：Mg，Al，Ca，Ti，V，Cr，Mn，Fe，Co，Ni，Cu，Zn，Sr，Zr，Sn，Sb，Ba，La和Hf，以及镧系元素Ce，Sm，Eu，Gd和Tb。
由茜素产生的所述蒽三酚(也被称作脱氧茜素或蒽-1，2，10-三醇)对于本技术领域的技术人员来说已经非常熟悉。还原反应通过氢氧化锌，氨，酸性氯化锡等的作用来介导。该化合物的通式如下所示：
由于不存在蒽醌的中心醌型环，1，2-二醇体系的金属螯合络合物的反应性不同，例如亚铁螯合络合物是黑颜色。由于茜素铁螯合络合物是红色，所以检测两种不同酶活性的两种不同底物可以与相同的金属离子一起使用。这对底物可以是，例如：
·检测糖酶活性的茜素-2-β-D-葡糖苷，和
·检测磷酸酶的脱氧茜素-2-β-D-磷酸酶。
还有可能将蒽三酚位置10上羟基保护起来，其中例如，氢原子可以被甲基取代从而产生具有下列结构的化合物：
类似地，所述茜素还可以通过还原酮基从而生成一种9，10-二醇结构而得到保护；然后所述醇基可以被烷基化，例如，生成如下所示的1，2-二羟基-9，10-二甲氧基蒽：
这些烷基化蒽三酚和茜素不易自发氧化生成茜素因而成为底物糖苷化(优选地在位置2上糖苷化)的出色候选物质。
Claims (40)
1.具有以下通式的显色底物用于检测酶活性的存在的用途：
其中：
-R1是一个靶部分或H，而R2是一个靶部分或H，并且R1和R2中的至少一个是靶部分，
-R3是H，SO3H，Cl，Br，F，I，NO2，NH2，NR9R10，或酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基团，其中X是烷基、芳基或芳烷基基团或α-氨基酸残基，
-R4是H，SO3H，Cl，Br，F，I，NO2，NH2，NR9R10，OH或酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基团，其中X是烷基、芳基或芳烷基基团或α-氨基酸残基，
-按照一种修饰的方式，R3和R4互相形成键从而创建一个具有至少五条边的环，
-R5，R6，R7和R8各自由下列一种原子或原子基团组成：H，一种卤素，OH，SO3H，或一个烷基或烷氧基团，而
-R9，R10各自独立地是甲基，烷基，芳基，芳烷基团，或R9和R10中的一个是一个环状结构而另一个是一个氢原子。
2.如权利要求1所述的用途，其中X为丙氨酸残基。
3.如权利要求1所述的用途，其中R3和R4互相形成键从而创建一个具有六条边的环。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述中心环的酮基团被还原成其中至少一个氢原子可以被甲基，烷基，芳香基或芳烷基基取代的羟基。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于R1是H而R2是一个靶部分。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述靶部分由下列化合物中的一种化合物组成：
-一种糖苷，由单-、双-或多糖亚单位组成，通过α或β键与所述羟基连接，
-一种α-氨基酸或一种肽，
-一种有机酸，如-O-CO-(CH2)n-CH3，其中n的值在0至20之间，或
-硫酸酯，磷酸酯，焦硫酸酯，焦磷酸酯或磷酸二酯。
7.具有以下通式的显色底物用于检测酶活性的存在的用途：
其中：
-R1是一个靶部分或H，而R2是一个靶部分或H，并且R1和R2中的至少一个是靶部分，
-R3是H，SO3H，Cl，Br，F，I，NO2，NH2，NR9R10，或酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基团，其中X是烷基、芳基或芳烷基基团或α-氨基酸残基，
-R4是H，SO3H，Cl，Br，F，I，NO2，NH2，NR9R10，OH或酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基团，其中X是烷基、芳基或芳烷基基团或α-氨基酸残基，
-按照一种修饰的方式，R3和R4互相形成键从而创建一个具有至少五条边的环，
-R5，R6，R7和R8各自由下列一种原子或原子基团组成：H，一种卤素，OH，SO3H，或一个烷基或烷氧基团，而
-R9，R10各自独立地是一个甲基，烷基，芳基，芳烷基团，或R9和R10中的一个是一个环状结构而另一个是一个氢原子，
-R11由下列一种原子或原子基团组成：H，SO3H，Cl，Br，F，I，NO2，NH2，NR9R10，或一个烷基，芳基，芳烷基，酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基团，其中X是一种烷基、芳基或芳烷基基团或一种α-氨基酸残基，而
-R12由H，或甲基，烷基，芳基或芳烷基团组成。
8.如权利要求7所述的用途，其中X为丙氨酸残基。
9.如权利要求7所述的用途，其中R3和R4互相形成键从而创建一个具有六条边的环。
10.如权利要求7所述的用途，其特征在于R1是H而R2是一个靶部分。
11.如权利要求7所述的用途，其中R5、R6、R7和R8各自为Cl或Br。
12.如权利要求7所述的用途，其特征在于所述靶部分由下列化合物中的一种化合物组成：
-一种糖苷，由单-、双-或多糖亚单位组成，通过α或β键与所述羟基连接，
-一种α-氨基酸或一种肽，
-一种有机酸，如-O-CO-(CH2)n-CH3，其中n的值在0至20之间，或-硫酸酯，磷酸酯，焦硫酸酯，焦磷酸酯或磷酸二酯。
13.如权利要求1至12中的任一权利要求所述的用途，其特征在于R3和R4是这样的，当R3和R4通过取代或不取代的C3N链互相连接时，则形成了一个六边环。
14.如权利要求1至12中的任一权利要求所述的用途，其中用一种或两种底物检测一种酶活性的存在，其特征在于其包括：
-将一种或两种底物与怀疑含有至少一种微生物的样品以及一种能够用来形成不溶性螯合络合物的阳离子接触，所述底物的靶部分与需要进行分析的酶活性相匹配，所述微生物表达需要测定的酶活性，和
-监测不溶性、有色螯合络合物的形成。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于所述底物被引进一种阳离子，当底物的标记部分被酶活性释放时，该阳离子能够用来与所述标记部分形成不溶性螯合络合物。
16.如权利要求14所述的用途，其特征在于能够用来形成不溶性螯合络合物的一种阳离子包括Fe2+，Al3+，Mn2+，Sn2+或Cu2+。
17.如权利要求1至12中的任一权利要求所述的用途，其中用两种底物检测至少两种不同酶活性的存在，其特征在于其包括：
-将两种底物与怀疑含有至少一种微生物的样品接触，加入一种能够用来形成不溶性螯合络合物的阳离子，所述底物的靶部分与需要进行分析的至少两种酶活性相匹配，所述微生物表达需要测定的酶活性，和
-监测至少两种不同颜色或第三种颜色的形成。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于当底物的标记部分被酶活性释放时，该阳离子能够用来与所述标记部分形成不溶性螯合络合物。
19.如权利要求1至12中的任一权利要求所述的用途，其特征在于其包括：
-将一种或两种底物与怀疑含有至少一种微生物的样品在具有合适pH的反应介质中接触，所述底物的靶部分与需要进行分析的酶活性相匹配，所述微生物表达需要测定的酶活性，和
-监测至少一种颜色的形成。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于两种底物的使用包括使用一种类型的阳离子，当底物的标记部分被酶活性释放时，该阳离子能够用来与所述标记部分形成不溶性螯合络合物。
21.如权利要求14所述的用途，其特征在于它包括进行一种涉及所述微生物在添加了所述底物的培养基上生长的中间步骤。
22.如权利要求17所述的用途，其特征在于它包括进行一种涉及所述微生物在添加了所述底物的培养基上生长的中间步骤。
23.如权利要求14所述的用途，其特征在于利用下列物质中的一种作为靶部分来检测糖苷酶活性：
·葡萄糖，
·半乳糖，
·甘露糖，
·木糖，
·葡糖醛酸，或
·N-乙酰氨基葡萄糖。
24.如权利要求17所述的用途，其特征在于利用下列物质中的一种作为靶部分来检测糖苷酶活性：
·葡萄糖，
·半乳糖，
·甘露糖，
·木糖，
·葡糖醛酸，或
·N-乙酰氨基葡萄糖。
25.如权利要求14所述的用途，其特征在于利用磷酸或包含磷酸官能团的化合物作为靶部分来检测磷酸酯酶活性。
26.如权利要求19所述的用途，其特征在于利用磷酸或包含磷酸官能团的化合物作为靶部分来检测磷酸酯酶活性。
27.如权利要求14所述的用途，其特征在于利用硫酸或包含硫酸官能团的化合物作为靶部分检测硫酸酯酶活性。
28.如权利要求19所述的用途，其特征在于利用硫酸或包含硫酸官能团的化合物作为靶部分来检测硫酸酯酶活性。
29.如权利要求14所述的用途，其特征在于利用选自下列的物质作为靶部分检测脂酶、磷脂酶或酯酶活性：
·一种饱和的或不饱和的脂肪酸，或包含脂肪酸官能团的化合物，
·酯酸或包含醋酸官能团的化合物，
·丁酸或包含丁酸官能团的化合物，
·辛酸或包含辛酸官能团的化合物，或
·一种酯化的磷酸基团。
30.如权利要求17所述的用途，其特征在于利用选自下列的物质作为靶部分检测脂酶、磷脂酶或酯酶活性：
·一种饱和的或不饱和的脂肪酸，或包含脂肪酸官能团的化合物，
·酯酸或包含醋酸官能团的化合物，
·丁酸或包含丁酸官能团的化合物，
·辛酸或包含辛酸官能团的化合物，或
·一种酯化的磷酸基团。
31.如权利要求19所述的用途，其特征在于利用选自下列的物质作为靶部分检测脂酶、磷脂酶或酯酶活性：
·一种饱和的或不饱和的脂肪酸，或包含脂肪酸官能团的化合物，
·酯酸或包含醋酸官能团的化合物，
·丁酸或包含丁酸官能团的化合物，
·辛酸或包含辛酸官能团的化合物，或
·一种酯化的磷酸基团。
32.如权利要求29所述的用途，其中所述酯化的磷酸基团为肌醇-1-磷酸。
33.如权利要求30所述的用途，其中所述酯化的磷酸基团为肌醇-1-磷酸。
34.如权利要求31所述的用途，其中所述酯化的磷酸基团为肌醇-1-磷酸。
35.一种检测至少一种微生物菌株和/或微生物菌种的制剂，该制剂包括一种或两种权利要求1至12中任一权利要求所述的用途中所使用的显色底物和一种培养基。
36.如权利要求35所述的制剂，其特征在于其含有两种底物，该底物产生具有不同的颜色的反应产物以便鉴别由至少一种微生物菌株和/或微生物菌种表达的不同酶活性。
37.如权利要求35或36所述的制剂，其特征在于其由液体、半固体或固体培养基组成。
38.如权利要求35或36所述的制剂，其特征在于所述底物的浓度在10至500mg/l之间。
39.如权利要求38所述的制剂，其特征在于所述底物的浓度在30至150mg/l之间。
40.如权利要求39所述的制剂，其特征在于所述底物的浓度是50mg/l。
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