JP2003516157A - アリザリンをベースにした新規色原体基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生物学的診断の分野で適用されるアリザリンをベースにした新規な色原体基質、この基質の利用方法及びこのような基質を含む組成物を提供する。 【解決手段】 酵素活性の存在を検出できる、一般式（Ｉ）（式中、中央の環における二つのケトンは、場合によっては、上位位置のケトンは基Ｒ_１１により、下位のケトンはＯＨにより代えられてもよく、Ｒ_１は標的部分またはＨ、Ｒ_２は標的部分またはＨであり、Ｒ_１とＲ_２のうち少なくとも一方は標的部分である）の基質により成る。 【化１４】

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、有効性のある色原体基質を用いて、ヒドロラーゼ型の酵素、特にオ
シダーゼ、エステラーゼまたはペプチダーゼを明らかにすることに関する。

【０００１】

【従来の技術】

かなり以前から、微生物の特徴的な酵素活性の有無を決定するために特別な基
質が用いられてきた。基質を選択することで、反応の有無から、微生物の属の種
類を特徴づける、またはある特定の微生物属の株および／または種を識別するこ
とが可能である。

【０００２】 酵素の合成基質は二つの部分から成り、明らかにすべき酵素活性の特異的な第
１部分を下記で標的部分と呼び、マーカーの代用となる第２部分を下記でマーカ
ー部分と呼ぶ。

【０００３】 これらの特殊な基質は蛍光体または色原体であってもよい。実際には、これは
第２マーカー部分、または一つまたは複数のその他の化合物とのその反応による
生成物であり、この第２部分が第１の標的部分ともはや結合しない場合に、蛍光
体または色原体である。この件については、本出願人の名において登録されてい
る特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９９／００７８１を参照されたい。

【０００４】 本件の場合、これはアリザリンまたはアントラロビン（Ａｎｔｈｒａｒｏｂｉ
ｎｅｓ）をベースにした色原体基質であり、一般にこの基質の形態下に僅かに着
色される。しかしながら、マーカー部分による着色は、ヒドロラーゼにより、し
たがって前記マーカー部分に対する標的部分の分離により強化されるおよび／ま
たは変化する。好ましくは、金属塩、アルカリ性ｐＨのような検出体の存在が、
得られた生成物の着色特性を向上させる。

【０００５】 着色された金属キレートを形成するアリザリンの能力は１９世紀に発見された
。アリザリンが初めて植物 Ｒｕｂｉａ ｔｉｎｃｔｏｒｕｍ（アカネ科セイヨ
ウアカネ）から単離された１８２６年以来、その着色特性が衣服の染色に使われ
てきた。

【０００６】 アリザリンの全面的な合成は、ＧｒａｅｂｅおよびＬｉｅｂｅｒｍａｎｎによ
り１８６９年に記載されている。同年、Ｗ．Ｈ．Ｐｅｒｋｉｎは、下記の式のア
ントラセン核のＲ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８の各位置上のさまざまな置
換基を提案することで、合成することのできるアリザリンの数を拡大した。

【０００７】

【化３】

【０００８】 アリザリンは着色剤でないが、金属性酸化物を伴う不溶性の染料を形成する。
たとえば、位置Ｒ_３がスルフォン基により置換されている場合、アルミニウム塩
とのキレート化により鮮やかな深紅色になり、クロムとのキレート化では赤紫色
になる。その他の例では、３−ニトロアリザリンおよび４−ニトロアリザリンは
、それらに結合した金属塩に応じてさまざまな着色キレートを産出する。染色に
おいてアリザリンによりもたらされるメリットは、大部分、このように形成され
た金属キレートの、石鹸、酸、水酸化アルカリ金属等に対する安定性である。

【０００９】 簡単に合成できる各種アリザリンの中で、特に３−ニトロアリザリンおよび４
−ニトロアリザリンから得られる４−アミノアリザリンに注目する。４−アミノ
アリザリンは下記の式で表される。

【００１０】

【化４】

【００１１】 この分子はアルミニウムの存在下に赤紫色を出すため、特に興味深い分子であ
る。さらにこの分子は、アルザリンキノリン（その一例、緑色のアリザリンα−
キノリンは下記の式で表される）の当業者に公知のＳｋｒａｕｐ反応を使った合
成の出発点として使用される。

【００１２】

【化５】

【００１３】 置換反応および環化反応によって、さまざまな性質を有する修飾された広い範
囲のアリザリンを得ることができる。

【００１４】 技術明細書にはまた、生物学的および生物医学的適用がすでに存在することが
示されている。キレートの存在下のヒドロキシアントラキノンは素早く反応する
ため、生物学的試料における金属の有無の判断テストに優先的に用いられている
。

【００１５】 デソキシアリザリンまたはアントラセン−１，２，１０−トリオールとも呼ば
れる、アリザリンの還元生成物であるアントラビンはすでに当業者に公知である
。この還元は、水酸化亜鉛またはアンモニア水、２価のスズを含む酸塩化物、等
の反応により起こる。この化合物の一般式は次の通りである。

【００１６】

【化６】

【００１７】 しかし、酵素活性の検出基質としてのアリザリン、アントラキノン誘導体また
はアントラビンの使用については今のところ明らかな情報はまったくない。した
がってアリザリンに対して少なくとも一つの標的部分を固定するための基質の合
成が必要である。これらの基質は、マーカーと標的の二つの部分において加水分
解が起こらなくなった瞬間から、金属イオンの存在下には反応しないという利点
がある。一方不溶性キレートの形成は次のような本質的な利点がある。 ・低濃度であっても感度は非常に高く、そのための基質は少量でよい、 ・反応媒質の組成物、および特に多価カチオン（その定義は本明細書の終わりの
特別項目に示されている）および／または使用されるｐＨにより容易に適用の要
求に適合させることが可能な加水分解生成物の色、 ・必要な基質が簡単に合成でき、しかも（上記で言及した高い感受性のため）量
も少なくてすみ、このため製造価格を低く抑えることができる、 ・色の拡散が非常に僅かで、このためコロニーを容易に分離および識別できる、
・（上記で言及した高い感受性のおかげで）使用する基質は少量であるので阻害
は僅かである。

【００１８】 したがってアリザリンの各誘導体は、Ｋｏｅｎｉｇｓ−Ｋｎｏｒｒ（Ｋｏｅｎ
ｉｎｇｓ，Ｗ．ａｎｄ ＫｎｏｒｒＥ．，３４，９５７，１９０１）というかな
り古典的な方法を用いて合成され、主にグリコシドに結合されてきた。α−グリ
コシドに関しては、これらの合成はＨｅｌｆｅｒｉｃｈ法により行われる（Ｈｅ
ｌｆｅｒｉｃｈ Ｂ．ら、Ｂｅｒ．，６６，３７８（１９３３）およびＢｅｒ．
，７７，１９４（１９４４）。その他の誘導体は、脂肪酸の短い鎖を有するエス
テル、およびリン酸エステルまたは硫酸エステルに結合されている。

【００１９】 今日使用されている基質は、たとえば、下記で本発明による基質の一つである
アリザリン−β−Ｄ−ガラクトシドとの比較研究の対象になる５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドである。

【００２０】 本発明に準じて、本発明による基質は技術明細書に記載されている基質よりも
著しく有効である。このようにこれらの基質は、研究対照となる同一の酵素活性
に対してより多くの微生物の種および／または株を検出する。

【００２１】 本発明による基質は多少なりと他の文献にも記載されている。 たとえば、マサワキ・テルユキらの論文「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｏｌｖｅｎ
ｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｂｅｒｙｔｈｒｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏ
ｍ ｍａｄｄｅｒ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｈｙｄｒｏｌ
ｙｓｉｓ ｗｉｔｈ −ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ≫，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉ
ｏｅｎｇ．（１９９６），８１（６）， ５６７−５６９，」は、これらを着色
料として使用するために、選択溶媒を使ってアカネの根からアントラキノンを抽
出することに関するものである。その目的は特に糖に結合したアリザリン−２−
ｏ−プリメベロシド等のアントラキノンの中からアリザリンを抽出することであ
る。このためにβ−グルコシダーゼを介してアリザリン−２−ｏ−プリメベロシ
ドを加水分解する。

【００２２】 もう一つの論文は「Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌａｓ，Ｌｉｎｕｓ Ｈ．Ｗ．らの
≪Ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｄ
ｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ ｃｅｌｌ ｓ
ｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ≫
，Ｊ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（１９９８），１５２（２／３），２３
５−２４１，」に由来するものであり、糖の存在に対する植物の細胞内のグリコ
シル化したプリメベロシドの生物学的解釈を提案している（２４０頁、第１欄、
第３段落）。この始まりはある種のアントラキノンの加水分解に因る。

【００２３】 最後の文献は、Ｍａｔｅｊｕ．Ｊ．らの突然変異種 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ Ｂ９６の『グリコシド化』活性に関する「Ｍｉ
ｃｒｏｂｉａｌ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｔｉｏｎ ｉｆ ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎ
ｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｓ． Ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ
ｇｌｕｃｏｓｉｄａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ 」，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．（Ｐｒａｇｕｅ）（１９７４），１９（４），３０７−３１６」に由来す
るものである。

【００２４】

【発明が解決しようとする課題】

しかしながら、これらの論文は本出願人の発明とは間接的なつながりしかない
。確かにこれらすべての論文がアリザリン（またのその他のアントラキノン）を
ベースにした基質について論じているが、多様性において限界があり（言及され
ている分子も僅かである）、すべてが生合成により得られている（最初の二つの
論文では、プリメベロシドと植物による生成物を結合させた基質、３番目の論文
では、多種のグリコシドとバクテリア Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅ
ｕｓによる生成物を結合させた基質）。 さらにこれらの基質は酵素検出のため
の診断テストの役目は果たさない。

【００２５】

【課題を解決するための手段】

この目的のために、本発明は、下記の一般式、

【００２６】

【化７】 （式中、 −Ｒ_１は標的部分またはＨ、Ｒ_２は標的部分またはＨ、Ｒ_１およびＲ_２の少なく
とも一つは標的部分である、 −Ｒ_３はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミノであ
り、アルキル、アリールおよびアラルキルまたはアラニンのようなα-アミノ酸
残基に等しいＸを伴う、 −Ｒ_４はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
ＯＨ、アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミ
ノであり、アルキル、アリールおよびアラルキルまたはアラニンのようなα-ア
ミノ酸残基に等しいＸを伴う、 −異なる別の方法により、Ｒ_３およびＲ_４は互いに連結して少なくとも５員環、
好ましくは６員環を形成する、 −Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれ次の原子または原子団、すなわちＨ、ハロ
ゲン、特にＣｌまたはＢｒ、ＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、アルキルまたはアルコキシの一つ
から成る。 −Ｒ_９およびＲ_１０は、それぞれ独立して、メチル、アルキル、アリール、アラ
ルキルから成り、または一方で、Ｒ_９またはＲ_１０は環（ピペリジン、ピロリジ
ン、モルフォリン、等）を構成し、他方でＲ_１０またはＲ_９は水素原子である）
の酵素活性の有無を検出することができる色原体基質に関する。

【００２７】 特別な場合において、中央環のケトンは水酸化物原子団の形態下に還元されて
おり、水酸化物原子団において水素原子の少なくとも一つは場合によってはメチ
ル、アルキル、アリール、アラルキル原子団により代えられている。

【００２８】 本発明はまた、下記の一般式

【００２９】

【化８】 （式中、 −Ｒ_１は標的部分またはＨ、Ｒ_２は標的部分またはＨ、Ｒ_１およびＲ_２の少なく
とも一つは標的部分である、 −Ｒ_３はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミノであ
り、アルキル、アリールおよびアラルキルまたはアラニンのようなα-アミノ酸
残基に等しいＸを伴う、 −Ｒ_４はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
ＯＨ、アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミ
ノであり、アルキル、アリールおよびアラルキルまたはアラニンのようなα-ア
ミノ酸残基に等しいＸを伴う、 −異なる別の方法により、Ｒ_３およびＲ_４は互いに連結して少なくとも５員環、
好ましくは６員環を形成する、 −Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれ次の原子または原子団の一つから成る。す
なわちＨ、ハロゲン、特にＣｌまたはＢｒ、ＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、アルキルまたはア
ルコキシ、 −Ｒ_９およびＲ_１０は、それぞれ独立して、メチル、アルキル、アリール、アラ
ルキルから成り、または一方で、Ｒ_９またはＲ_１０は環（ピペリジン、ピロリジ
ン、モルフォリン、等）を構成し、他方でＲ_１０またはＲ_９は水素原子である、
−Ｒ_１１は次の原子または原子団の一つから成る。すなわち、Ｈ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃ
ｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、アルキル、アリール、アラ
ルキル、アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルア
ミノであり、アルキル、アリール、アラルキルまたはα-アミノ酸残基に等しい
Ｘを伴う、 −Ｒ_１２はＨ、メチル、アルキル、アリール、アラルキルから成る） の、酵素活性の有無を検出することができる色原体基質に関する。

【００３０】 上記基質の一つが加水分解されている特殊な例では、マーカー部分は、位置１
および２で二つの水酸基を有するアリザリンから成る。この分子は別名１，２−
ジヒドロキシアントラキノン−α−Ｄ−ガラクトシドであり、その一般式は、ガ
ラクトースによって成る標的部分に結合しており、以下の通りである。

【００３１】

【化９】

【００３２】 βカラクトシダーゼによるその加水分解生成物は、以下の構造式の、鉄塩の存
在下の、キレートを形成している。

【００３３】

【化１０】

【００３４】 上記の展開されたすべてのモデルケースにおいて好ましくは、Ｒ_１はＨ、Ｒ_２ は標的部分である。

【００３５】 より詳しくは、標的部分は以下の分子の一つから成る。 −水酸基にαまたはβにおいて連結しているモノ−、ジ−および／またはポリサ
ッカリドから成るグルコシド、 −α-アミノ酸またはペプチド、 −−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３のような有機酸、ｎは０〜２０、 −硫酸塩、燐酸塩、ピロ硫酸塩、ピロ燐酸塩または燐酸ジエステル。

【００３６】 特殊な場合において、Ｒ_３およびＲ_４は、好ましくはＲ_３またはＲ_４に隣接す
るＮと共に置換されたまたはされていないＣ_３Ｎの鎖により構成され、互いに連
結して６員環を形成している。

【００３７】 前記のような、酵素活性の有無を検出するための少なくとも一つの基質の第１
使用方法により、本方法は、 −標的部分が、検出すべき酵素活性と関連している少なくとも一つの基質を、そ
のそのような酵素活性を有する少なくとも一つの微生物を含んでいると思われる
試料および少なくとも一つのカチオン型の存在下に配置する、 −不溶性の着色されたキレートの形成を観察する、 工程から成る。

【００３８】 好ましくは、基質は、酵素活性により解放されるマーカー部分に対して適応し
た少なくとも一つのカチオン型の存在下に配置される。

【００３９】 さらに好ましくは、不溶性キレートを形成するために用いられてもよいカチオ
ン型にはＦｅ^２＋、Ａｌ^３＋、Ｍｎ^２+、Ｓｎ^２＋またはＣｕ^２＋がある。

【００４０】 少なくとも二つの異なる酵素活性の存在を検出することができるように、上記
のような少なくとも二つの基質を使用する場合、使用方法は、 −その標的部分が、検出すべき少なくとも二つの酵素活性と関連している少なく
とも二つの基質を、このような酵素活性を有する少なくとも一つの微生物を含ん
でいると思われる試料、および少なくとも一つのカチオン型の存在下に配置する
、 −少なくとも二つの異なる着色または第３の着色の出現を観察する、 工程から成る。

【００４１】 この後者の場合、基質は、酵素活性により解放されるマーカー部分に対して適
応した少なくとも一つの、好ましくは唯一つのカチオン型の存在下に配置される
。

【００４２】 これらすべてのモデルケースにおいて、酵素活性の存在の検出を可能とするた
めの、上記のような少なくとも一つの基質の使用、またはすでに上記した使用と
組み合わせたこの使用は、 −その標的部分が、検出すべき酵素活性と関連している少なくとも一つの基質を
、このような酵素活性を有する少なくとも一つの微生物を含んでいると思われる
試料の存在下に、適切なｐＨを有する反応媒質内に配置する、 −少なくとも一つの着色の出現を観察する、 工程から成る。

【００４３】 好ましくは、少なくとも二つの基質を使用する場合、酵素活性により解放され
るマーカー部分に対して適応した唯一つのカチオン型を使用する。

【００４４】 好ましい使用方法により、上記の各使用では、一つまたは複数の微生物を一つ
または複数の基質を含む培地に押し出す中間工程が含まれる。

【００４５】 グリコシダーゼ酵素活性を検出することが望まれる場合は、標的部分には特に
次を用いる。 ・グルコース、 ・ガラクトース ・マンノース ・キシロース ・グルクロン酸、または ・Ｎ−アセチルグルコサミン。

【００４６】 ホスファターゼ酵素活性を検出することが望まれる場合は、標的部分として特
に燐酸または置換誘導体を用いる。

【００４７】 スルファターゼ酵素活性を検出することが望まれる場合は、標的部分として特
に硫酸または置換誘導体を用いる。

【００４８】 リパーゼまたはホスファリパーゼ酵素活性を検出することが望まれる場合は、
標的部分として特に次のものを用いる。 ・飽和または不飽和脂肪酸、または置換誘導体、 ・酢酸または置換誘導体、 ・酪酸または置換誘導体、 ・オクタン酸または置換誘導体、または ・イノシトール−１−燐酸のようなエステル化された燐酸基。

【００４９】 本発明はまた、上記で定義されたような少なくとも一つの基質および培地を含
む、微生物の少なくとも一つの株および／または種を検出することができる組成
物にも関する。

【００５０】 組成物が少なくとも二つの基質を含む場合、反応後の生成物は、微生物の少な
くとも一つの株または種の顕現されたさまざまな酵素活性を識別できる異なる色
を呈している。

【００５１】 好ましくは組成物は、液体、ゲル化されたまたは固体（たとえば適当な液体中
で戻すことができる乾燥したもの）の培地により構成される。

【００５２】 さらに好ましくは、基質の濃度は１０〜５００ｍｇ／リットル、好ましくは３
０〜１５０ｍｇ／リットル、さらにより好ましくは５０ｍｇ／リットルである。

【００５３】 したがって本発明は、一方で存在を検出することが望まれる微生物または酵素
の存在下に、他方でさらに場合によってはカチオンの存在下に、特殊な色を呈す
る、初期に僅かに着色される新規の基質に関する。本発明はまたこの基質によっ
て行われうる使用、ならびにこの基質を含む組成物にも関する。

【００５４】 カチオンの存在は特に興味深いものであるが、しかしながらこれなしで済ます
ことも可能である。その場合は、好ましくはアルカリｐＨを有する組成物を使用
することも可能である。また二つの条件、すなわちカチオンとアルカリ性ｐＨ両
方を合わせてもよい。

【００５５】 使用するカチオンが異なると、テストされた微生物のコロニーは異なる色にな
る。鉄、マンガン、スズ、アルミニウム等のこれらのカチオンは、テストされる
試料中に存在する自由イオンによる阻害を避けるまたはこれを最小限にするため
に、きわめて低い濃度で使用される。

【００５６】 しかし、ある種の金属イオンはより高い濃度で、特別な微生物種を選別するこ
とができる選択的な阻害性をもち、これは付加的な有利点となる。

【００５７】

【発明の実施の形態】

基質の合成 １）アリザリン−２−β−Ｄ−グルコシド ロバートソンら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９３０），１１３６および（１
９３３），１１６７）により、アリザリンは位置２の水酸基のレベルで特異的に
グリコシル化されており、位置１での固定も可能であるが、位置２での共役がよ
り容易である。

【００５８】 この基質はロバートソンにより記載された（１９３３年）、しかし変更されて
いる方法を用いて調製される。６ｇのアリザリン試料がアセトン７０ｍｌ内で懸
濁され、０．２８ｍｏｌ／リットルの水酸化カリウム７０ｍｌと混合されて、塩
を形成する。これに、アセト−ブロモ−グルコース６．６ｇを含み、エーテルお
よびアセトンを１：１の割合で含む混合物４０ｍｌを会合させる。約１４時間撹
拌する。続いてアセトン中に、１．２５ｍｏｌ／リットルの水酸化カリウム７ｍ
ｌ、次にアセト−ブロモーグルコース０．６モル／リットル１５ｍｌを添加する
。予備混合物をさらに約１０時間撹拌する。エーテルおよびアセトンを減圧下に
抽出し、冷却させた酢酸を添加してｐＨを約５．５に戻す。混合物および反応し
なかったアリザリンを濾過し、水で洗浄して、一晩かけて５０℃で乾燥する。

【００５９】 このようにして黄色の固体を得、これを冷却した酢酸７０ｍｌ中に懸濁状態に
して、５分間環流させる。これにより冷却し、濾過する、さらに酢酸により洗浄
することができる。続いて濾過物を１時間別にしておき、残留アリザリンから分
離する。この手順を１０℃で繰り返し、濃い黄色の濾過物を得る。

【００６０】 こうして得られたものを乾燥させて、二塩化メタン２００ｍｌ中に溶解し、続
いてトリエチルアミン２ｍｌを添加する。酸化アルミニウムを溶液中であらかじ
め混合し、試料テストを行って、薄層クロマトグラフィー（ＣＣＭ）によりアリ
ザリンが残っていないことが示されるまで混合を続ける。酸化アルミニウムを抽
出し、残留溶液を回転にかけて蒸発させ、黄色の固体を生成する。この固体を、
数滴の酢酸の存在下に、加熱したエタノールから再結晶化し、アリザリンテトラ
アセチル−グルコシド２．０２ｇを得る。

【００６１】 アリザリンテトラアセチル−グルコシド１．１ｇをエタノール６０ｍｌ中に懸
濁状態にして、そこへ０．１２５ｍｏｌ／リットルの水性水酸化ナトリウム３０
ｍｌを添加して、赤色の溶液を生成する。この状態を６５℃で１０分間維持して
、次いで０℃まで冷却する。次にグリコシル化された赤色のアリザリンのナトリ
ウム塩を真空濾過で抽出し、エーテルで洗浄して、乾燥する。この方法でアリザ
リン−２−β−グルコシドのナトリウム塩を０．９ｇ得ることができる。この生
成物を当業者に公知の技術により精製して、アリザリン−２−β−Ｄ−グルコシ
ドを得ることも可能である。

【００６２】 ２）アリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシドの合成 この基質もまた、ロバートソンにより記述され（１９３３年）、しかし修正さ
れている方法を用いて調製される。アリザリン６ｇである試料をアセトン７０ｍ
ｌ中に懸濁状態にして、０．２８ｍｏｌ／リットルの水酸化カリウム７０ｍｌと
混合して塩を形成させる。これに、エーテルおよびアセトンを１：１の割合で含
み、アセト−ブロモ−ガラクトース６．６ｇを含む混合物４０ｍｌを会合させる
。約１４時間撹拌する。続いてアセトン中に、１．２５ｍｏｌ／リットルの水性
水酸化カリウム７ｍｌ、続いてアセト−ブロモ−ガラクトシド１０．６モル／リ
ットル５ｍｌを添加する。さらにこの予備混合物を約１０時間撹拌する。エーテ
ルおよびアセトンを減圧下に抽出し、冷却した酢酸を添加することでｐＨを約５
．５に戻す。混合物および反応しなかったアリザリンを濾過し、水で洗浄して、
５０℃で一晩かけて乾燥させる。

【００６３】 得られたものを二塩化メタン２００ｍｌ中に溶解し、次いでトリエチルアミン
２ｍｌを添加する。酸化アルミニウムを、試料テストを行ってＣＣＭによりアリ
ザリンが残っていないことが示されるまで溶液中に添加する。酸化アルミニウム
を抽出し、残留溶液を回転させることで蒸発し、黄色の固体を生成する。この固
体を数滴の酢酸の存在下に加熱したエタノールから再結晶化して、アリザリンテ
トラアセチル−ガラクトシド１．９６ｇを得る。

【００６４】 アリザリンテトラアセチル−ガラクトシド１．１ｇをエタノール６０ｍｌ中に
再懸濁化して、そこへ０．１２５ｍｏｌ／リットルの水性水酸化ナトリウム３０
ｍｌを添加して赤色の溶液を生成する。この状態を６５℃で１０分間維持し、次
いで０℃まで冷却する。次にグリコシル化された赤色のアリザリンのナトリウム
塩を真空濾過により抽出して、エーテルで洗浄して、乾燥する。この方法により
、赤色の微晶質粉末形態下のアリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシドのナトリウ
ム塩０．８６ｇを得ることができる。

【００６５】 ３）アリザリン−２−酢酸塩の合成 この基質は当業者に公知の技術により調製する。アリザリン２グラムをピリジ
ン５ｍｌ中に溶解し、無水酢酸２．５ｍｌおよびピリジン５ｍｌの混合物で処理
する。室温に１６時間放置した後、黄色の溶液を、氷を入れた塩酸１００ｍｌ中
に注ぐ。酢酸塩の沈殿物を吸込み濾過により抽出し、水で洗浄する。水性のアセ
トンを再結晶化することで、黄色の結晶形態下のアリザリン−２−酢酸塩１．４
ｇを得ることができる。

【００６６】 ４）アリザリン−２−硫酸塩の合成 この基質は、ピリジン−三酸化硫化物錯体４ｇを含むピリジン１０ｍｌ中に、
アリザリン２．４ｇ、すなわち１０ミリモルを加熱して調製する。６０℃で２時
間放置した後、ピリジンを減圧下に抜き取る。ｐＨ９のメタノールカリウムを細
かく分けて添加することで、カリウム塩のように、硫酸エステルを結晶化する。
カリウム塩が徐々に形成されていき、これを吸込み濾過で抜き取り、エーテルで
洗浄して白色の微晶質粉末であるアリザリン−２−硫酸塩１．２ｇを産出する。

【００６７】 ５）アリザリン−１−ガラクトシドの合成 この基質は、上記第３章に記載されたアリザリン−２−酢酸塩から調製する。こ
れらのエステル２．８２ｇ、すなわち１０ミリモルを二塩化メタン７５ｍｌの存
在下に混合し、この混合物に２，４，６−コリジンまたは２，６−ルチジンを２
〜３ｍｌ添加して、深い赤紫色の溶液を得る。１時間放置した後、Ｗｏｌｆｒｏ
ｍおよびＬｉｎｅｂａｃｋ《Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ》（１９６３），３４２−４３に従って調製した炭酸銀、
次いでアセト−ブロモ−ガラクトース５ｇ、すなわち１２．５ミリモルを添加す
る。反応は室温、すなわち１０〜１５℃で、二日間容器中で撹拌しながら続けら
れる。薄層クロマトグラフィーにより、クロマトグラフィー上を急速に移動する
テトラ−アセチル−ガラクトシドの段階的変換が示される。懸濁液はシリカまた
は粗珪藻岩床で濾過され、濾過添加物を、必要量の、すなわち約１００ｍｌのジ
クロロメタンで洗浄する。次にジクロロメタン化合物の溶液を、塩化水素酸０．
２Ｍ（３×１００ｍｌ）の存在下に、水（×２）で洗浄する。乾燥後（ＭｇＳＯ _４ ）、澄んだ褐色の抽出物を減圧下で気化させ、メタノール中に再び溶解する。
薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル／トルエン３：１）は急速に移動する成分
の存在を示し、紫外線および硫酸に対して陽性反応を示す。次に保護されたガラ
クトシドは、すでに記述されたようにメタノール中でナトリウムメトキシドを使
用して脱アセチル化を行い、アリザリン−１−ガラクトシド１．３２ｇを産出す
る。

【００６８】 ６）アリザリン−１−燐酸塩−２−オクタン酸塩の合成 この基質は、ジクロロメタン１００ｍｌおよびトリエチルアミン３ｍｌ中に２
．４ｇ、すなわち１０ｍｍｏｌを反応させて調製する。さらにこの溶液に、塩化
オクタノイル （Ｃｈｌｏｒｕｒｅ ｄ’ｏｃｔａｎｏｙｌ）１．６２ｇ、すな
わち１０ｍｍｏｌを、室温でゆっくりと３０分かけて混合しながら添加する。オ
クタン酸塩をすでに記載されているようにアルミナで処理して純化し、メタノー
ル中で溶媒および結晶体を抽出して単離する。−１２℃まで冷却した後、オクタ
ン酸塩１．８４ｇ、すなわち５ｍｍｏlを、乾燥アセトニトリル３０ｍl中で、 ・四塩化炭素３．６ｇ、 ・ジイソプロピルエチルアミン１．６ｇ、 ・４−ジメチルアミノピリジン８０ｍｇ、 により連続して処理する。 低温で約２分間放置した後、ジベンジル−亜燐酸塩２．２ｇを含む溶液をアセト
ニトリル８ｍｌ中に加える。これにより著しく温度が上昇するのを避ける。１時
間後、混合物は、Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ Ｌ．Ｊ．，Ｄｉｌｌｏｎ Ｊ．Ｌ．お
よび Ｖｅｒｍｅｓｈｅｔｔｉ Ｐ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，３７ No.６（１
９９６年）により記載されているように使用し、ジベンジル−ホスホリルエステ
ルは、溶媒として酢酸エチル３０ｍｌをパラジウム／炭素触媒（１０％ｗ／ｗ）
０．４ｇと共に用いることで、水素により破壊する。次に、酢酸エチルをメタノ
ール中に溶液に戻すことで抜き取り、ｐＨ８の水性メタノール中に炭酸カリウム
溶液を慎重に添加した後、カリウム塩と同じく燐酸エステルを単離する。アリザ
リン−１−燐酸−２−オクタン酸塩のカリウム塩沈殿物を収集して、メタノール
で洗浄し、エステル２．０５ｇを真空下に乾燥して、さらなる純化は行わず使用
する。

【００６９】 ７）デオキシアリザリンの合成 このタイプの基質は、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ−Ｂｅｒ．，２１ ４４４（１８
８８）に開示された合成に従って調製される。還元されたアントラキノンの９−
および１０−Ｏ−メチル誘導体の合成については、１，２−ジオル全体を、当業
者に公知の、すなわち Ｓｃｈｅｌｉｎ−Ａｃｔａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．２
０ １１８２（１９６６）に記載されているような、ホウ酸との錯体 （ｃｏｍ
ｐｌｅｘｉｏｎ）による、またはアセトアルデヒドジメチル酢酸塩の使用（エチ
リデンによる保護）による適切なプロセスを用いてメチル化によりあらかじめ保
護する。

【００７０】 適用 数多くの適用が可能である。 １．固体培地におけるまたは薄膜上の特殊微生物種の検出および位置決定。 ２．組織または細胞抽出物から、または真核細胞または原核細胞浮遊液から、溶
液状態での酵素活性の検出。 ３．酵素活性の存在に基づく有機体の特定。 ４．ＥＬＩＳＡ技法のような、抗原および抗体との間の特殊反応の視覚化および
位置決定。指標酵素としてβ−ガラクトシダーゼまたはアルカリ性ホスファター
ゼ活性を明らかにする技術に対して、たとえばアリザリン−β−ガラクトシドま
たはアリザリン−燐酸塩を使用してもよい。この場合、酵素基質は、たとえばＡ
ＣＯＭＥＮ版，Ｌｙｏｎ，１０９〜１３３頁（１９８８年）のＹ．Ｂａｒｂｉｅ
ｒにより統括された「理論から実践への免疫調合」のように、酵素活性（特にア
ルカリ性ホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）をＥＬＩＳＡフォーマッ
トによる抗体または抗原検出反応のように作用させる、検出反応おいて、あるい
はたとえば「ＤＮＡプローブ」第２版、Ｋｅｌｌｅｒ Ｇ．Ｈ．，Ｍａｎａｋ，
Ｍ．Ｍ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ，第５〜９節（１９９３年）のような
核酸検出において最初に使用される。 ５．たとえばβ−ガラクトシダーゼの遺伝子の存在を証明する必要がある分子生
物学技術およびその使用「分子クローニング実験室マニュアル」第２版、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第１６．５６、１．８５節（１９８９年）。 ６．組織化学、細胞化学技術またはフロー細胞数測定による技術。特殊な酵素活
性と関連のあるこのような基質は医学診断、さらに水質、環境、食物等の分析と
いったその他の分野に用途がある。 ７．ポリアクリルアミドゲル、または電気泳動またはその他の分離方法を行うた
めに使用されるその他の素材の断面上における酵素の顕現。

【００７１】 実施例 実施例１：ゲル化培地上の微生物β−ガラクトシダーゼ活性の顕現に対するア
リザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシドの濃度の影響

【００７２】 濃度４６．３７ｇ／リットルの Ｃｏｌｕｍｂｉａベースである下記の培地に
おいて、０．０５ｇ／リットルのアンモニアクエン酸鉄の存在下に０．０１ｇ／
リットル、０．０３ｇ／リットル、０．０５ｇ／リットル、０．０８ｇ／リット
ルのアリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシド、あるいはアンモニアクエン酸鉄な
しに０．２ｇ／リットルの６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
を添加した。これら４つの培地をペトリ箱に一箱につき培地２０ｍｌの割合で分
配した。微生物をこの培地にマクファーランド０．５濁度の菌浮遊液から、三面
に分離して植え付けた。各箱を３７℃で４８時間インキュベートした。インキュ
ベーションの１８時間、２４時間、４８時間後に、形成されたコロニーを目視に
より観察する。これらのコロニーの着色ならびにこの着色の強度を評価した。結
果は下記の表１に示している。

【００７３】

【表1】 表１：ゲル化培地上の微生物のβ−ガラクトシダーゼ活性顕現に対する基質濃度
の影響

【００７４】 この表１で、記号《−》はコロニーの不在を表す。このようにテストを行った
、陰性結果しか示さない株は陰性検査の代用とされる。

【００７５】 この表１から、０．０３ｇ／リットル以降のアリザリン−２−β−Ｄ−ガラク
トシドで得られた強度が、濃度がおよそ７倍に当たる６−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシドで観察された結果にほぼ等しいことが注目される。興
味深い着色強度を得ることができるアリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシドの濃
度は０．０３ｇ／リットル〜０．０８ｇ／リットル、好ましくは０．０５ｇ／リ
ットルである。 したがってアリザリンベースの基質はインドキシルベースの基質よりも高感度で
ある。

【００７６】 実施例２：ゲル化培地上の微生物のβ−ガラクトシダーゼ活性の顕現−アリザン
−２−β−Ｄ−ガラクトシドの使用

【００７７】 アリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシドを含むゲル化培地を次のように調製す
る。すなわちＣｏｌｕｍｂｉａ寒天４６．３７ｇを、アリザリン−２−β−Ｄ−
ガラクトシド５０ｍｇ、アンモニアクエン酸鉄（Ｃｉｔｒａｔｅ ｄｅ Ｆｅｒ
Ａｍｍｏｎｉａｃａｌ）５００ｍｇ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシ
ド３０ｍｇと共に蒸留水１リットルに加え、β−ガラクトシダーゼの活性の誘導
を行いやすくする。寒天はオートクレーブにより１１６℃で１０分間殺菌する。
培地をゆっくりと５５℃まで冷やして、２０ｍｌのペトリ箱に分配する。この培
地を、 ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天４６．３７ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトシド８０ｍｇ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシド３０ｍｇを含み、同じ方法で調製された固体培地と比較する。

【００７８】 ３６７種の異なる株を臨床・環境サンプルから収集して、参照方法としてギャ
ラリーＡＰＩ（登録商標）２０Ｅ（ＢｉｏＭeｒｉｅｕｘ、フランス）により識
別した。株を ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天培地上で、３７℃、２４時間培養し、約１
０^８有機体／ｍｌ（標準マクファーランド０．５に同等）の接種体を株毎に作る
。植え付け器Ｄｅｎｌｅｙを使用して、各浮遊液につき１マイクロリットルをこ
れら培地のそれぞれ、すなわち上記で調製されたアリザリン−２−β−Ｄ−ガラ
クトシドを含む培地、および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシドを含む培地の箱に接種する。すべての箱を３７℃で１８時間イン
キュベートする。

【００７９】 インキュベートの後、形成されたコロニーを目視で観察する。アリザリン−２
−β−Ｄ−ガラクトシドを含む培地上で、β−ガラクトシダーゼ活性を示すコロ
ニーは赤紫色であり、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシドを含む培地上では、コロニーはトルコ石色である。これら二つの色を呈
するすべての株は、対応する基質でのβ−ガラクトシダーゼ活性に対して陽性で
あると見なされる。結果を下記の表２に示す。

【００８０】

【表２】 表２：アリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシドを含むゲル化培地上の微生物β−
ガラクトシダーゼ活性の顕現

【００８１】 アリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシドおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドに関連する欄に示されている数字は陽性株の
パーセンテージに対応するものである。株の大部分、すなわち９６．５％は、陽
性、陰性にかかわらず二つの基質に対して等しい反応性を有している。８つの株
はアリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシドしか加水分解しない。これら８つの株
は、４−メチルアンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド （４−ｍｅｔｈｙｌ
−ｕｍｂｅｌｌｉｆeｒｙｌ−β −Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）基質の存在
下において蛍光が検出されるので、β−ガラクトシダーゼ活性を有している。し
たがってこの表は、参照基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトシドで観察された感度よりも高い感度を有するβ−ガラクトシ
ダーゼ活性の指標指標としての基質の優れた有効性を表すものである。したがっ
てこれらの基質は低濃度で、きわめて感度が高く、利用価値が高いことになる。

【００８２】 実施例 3：マーカー部分の着色に対するさまざまな金属塩の効果

【００８３】 培地内に、 Ｃｏｌｕｍｂｉａベース（４６．３７ｇ／リットル）およびアリ
ザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシド（５０ｍｇ／リットル）を、塩化マンガンあ
るいはアンモニアクエン酸鉄、あるいは塩化スズ、あるいは硫化アルミニウム５
０ｍｇ／リットルの濃度に対して添加した。金属塩の無い比較対照培地もまた研
究された。これらのさまざまな培地を、オートクレーブに通した後、ペトリ箱に
、一箱に付き培地２０ｍｌの割合で分配した。本出願人のコレクションに由来す
る微生物を、０．５マクファーランド浮遊液からそれぞれの培地上へ、三面ずつ
分離して植え付けた。各箱を３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベ
ーションの２４時間後と４８時間後に、形成されたコロニーを目視により観察し
た。コロニーの着色ならびにこの着色の強度を採点した。結果を下記の表３に示
した。強度値は任意の方法で示されており、株同士の強度を比較することだけを
目的としているいることに注意する必要がある。このことは下記に続く各実施例
に対しても同じである。同じく、本出願人のコレクションに由来する、テストを
行った株は、このコレクションのおける内部番号が付されている。この内部の番
号付けは下記に開示されている実施例のいくつかにおいても同様に使用される。

【００８４】

【表３】 表３：マーカー部分の着色に対するさまざまな金属塩の効果

【００８５】 テストした金属塩に従って、基質の加水分解後に得られる色はさまざまである
。金属塩が無くても着色を観察することはできる。しかし得られる着色の強度は
、たとえば鉄塩で観察されるものよりも低く、この塩で色が変化することはない
。

【００８６】 塩を用いた方法は、必要に応じて色および強度を調製することができる（他の
酵素基質との結合、ｐＨ指標）。

【００８７】 実施例４：アリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシドの存在下におけるβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼに対するｐＨの影響

【００８８】 ｐＨ７の浸透水５ｍｌを含む１８本のガラス管内に、０．０５ｇ／リットルの
アリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシド、０．０５ｇ／リットルアンモニアクエ
ン酸鉄を半分のガラス管に、５マイクロリットルのβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ
３．２．１．２３シグマ）を各ガラス管に添加した。これら１８本のガラス管を
３７℃で４時間インキュベートした。インキュベート後、得られた着色はアンモ
ニアクエン酸鉄を含まないガラス管は薄いピンク色、アンモニアクエン酸鉄を含
む管は濃いピンク色である。これらのガラス管を２４℃でさまざまなｐＨ（２−
３−４−５−６−７−８−９−１０）に調整した。調整後に得られた着色を下記
の表４に示した。

【００８９】

【表４】 表４：２−アリザリン−β−Ｄ−ガラクトシドの存在下におけるβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ顕現に対するｐＨの影響

【００９０】 色はｐＨに応じて変化する。一般に酸性ｐＨでは黄色、アルカリｐＨではピン
クから赤紫である。このため必要に応じて色を調整することが可能で、複数の代
謝（酵素加水分解およびｐＨの変化）を明らかにすることができる。

【００９１】 実施例５：ゲル化培地におけるアリザリンベース基質と他の酵素基質との結合−
少なくとも二つの異なる酵素活性の検出

【００９２】 次の培地、 ・濃度４６．３７ｇ／リットルの Ｃｏｌｕｍｂｉａベース、 ・０．０５ｇ／リットルのアリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシド、 ・０．０５ｇ／リットルのアンモニアクエン酸鉄、 ・０．０５ｇ／リットルの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトシド ・β−ガラクトシダーゼ活性の誘導を容易にするための３０ｍｇ／リットルのイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド、 をペトリ箱に一箱に培地２０ｍｌの割合で分配した。本出願人のコレクションに
由来する微生物を、マクファーランド濁度０．５浮遊液からこの培地上に三面に
分離して植え付けた。各箱を３７℃で４８時間インキュベートした。

【００９３】 インキュベーションの２４時間後と４８時間後に、形成されたコロニーを目視
により観察した。これらのコロニーの着色およびこの着色の強度を採点した。結
果を下記の表５に示した。

【００９４】

【表５】 表５：二つの基質、アリザリン−２−β−Ｄ−ガラクトシドと５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドとの結合

【００９５】 この表５における記号《−》は、色がないことを表している。このようにテス
トされた、陰性の結果のみを有する株は陰性検査の代用にされる。

【００９６】 これら二つの基質の結合により、異なる４つの微生物群を検出することができ
る。 ・トルコ石色を示す第１群はガラクトシダーゼ活性しかもたない種に対応する、
・赤紫色を示す第２群はグルコシダーゼ活性しかもたない種に対応する、 ・先の二つの色が混合した、すなわちブルーから薄紫に変化する第３群は検出さ
れた二つの酵素活性を有する種に対応する、 ・無色の第４群は、先に挙げた二つの活性のいずれももたない種に対応する。

【００９７】 したがってアリザリンをベースにしたこれら基質を他の酵素活性基質と組み合
わせることで、これら微生物中に存在する生物化学活性に応じて一つまたは複数
の微生物群を識別することができる。

【００９８】 実施例６：液体培地における微生物のβ−ガラクトシダーゼ活性の顕現−アリザ
リン−２−β−グルコシドの使用

【００９９】 ＡＰＩ（登録商標、ｂｉｏＭeｒｉｅｕｘ、フランス）型ギャラリーキャップ
内に、０．１２ｇ／リットルのアリザリン−２−β−Ｄ−グルコシドと０．０５
ｇ／リットルのアンモニアクエン酸鉄との混合物３マイクロリットルを沈殿させ
て、乾燥した。最終濃度０．４ｇ／リットルの６−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−グルコシドを含む比較対照キャップを作成した。次にこれら二つのキャッ
プに、寒天の無い Ｃｏｌｕｍｂｉａベース５０マイクロリットルおよびマクフ
ァーランド濁度２のバクテリア浮遊液１００マイクロリットルを共に接種した。
３７℃で４時間および２４時間のインキュベーション後に、キャップ内で得られ
た着色を採点した。結果は下記の表６に示した。

【０１００】

【表６】 表６：アリザリン−２−β−Ｄ−グルコシドを含む液体培地における微生物のβ
グルコシダーゼ活性の顕現

【０１０１】 この表６での記号《−》は色がないことを表している。このようにテストされ
た、陰性結果のみを有する株は陰性検査の代用とされる。

【０１０２】 アリザリンベースの基質はテストした８種のうち７種の活性を検出できるの
に対して、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコシドはこれらの種のう
ち６種しか活性を検出できない。また、二つの株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒ
ｉｎｇｉｅｎｓｉｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）については
、活性がアリザリンベースの基質ではより早期に検出される。したがってこれら
の基質は、一方で、液体培地で使用することができ、他方で、インドキシルベー
スの基質よりも高感度である。

【０１０３】 実施例７：固体培地におけるアリザリン−１−β−Ｄ−グルコシドとアリザリン
−２−β−Ｄ−グルコシドとの比較

【０１０４】 濃度４６．３７ｇ／リットルのＣｏｌｕｍｂｉａベースを含む培地に、 ・０．０５ｇ／リットルのアリザリン−２−β−Ｄ−グルコシドおよび０．０５
ｇ／リットルのアンモニアクエン酸鉄、 ・０．０５ｇ／リットルまたは０．１ｇ／リットルのアリザリン−１−β−Ｄ−
グルコシドおよびこれら２種の濃度に対して０．０５ｇ／リットルのアンモニア
クエン酸鉄、 ・アンモニアクエン酸鉄なしの０．１５ｇ／リットルの６−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−グルコシド、 を添加する。

【０１０５】 これら４種類の培地をペトリ箱に、一箱につき培地２０ｍｌの割合で分配した
。微生物を、マクファーランド濁度０．５浮遊液から、この培地上に３面ずつ分
離して植え付けた。各箱を３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベー
ションの１８時間および４８時間後に、形成されたコロニーを目視により観察し
た。これらのコロニーの着色ならびにこの着色の強度を採点した。結果を下記の
表７に示す。

【０１０６】

【表７】 表７：固体培地でのアリザリン−１−β−Ｄ−グルコシドとアリザリン−２−β
−Ｄ−グルコシドとの比較

【０１０７】 この表７の記号−は着色がないことを表している。このようにテストされた、
陰性結果のみ有する株は陰性検査の代わりとなる。

【０１０８】 同じ０．０５ｇ／リットルの濃度で、活性を示す３種のうち２種の株に対して
、二つの基質は同じ着色強度を得ることができない。アリザリン−２−β−Ｄ−
グルコシドはアリザリン−１−β−Ｄ−グルコシドよりも僅かに感度が高い。し
かし、０．１ｇ／リットルでは、アリザリン−１−β−Ｄ−グルコシドはアリザ
リン−２−β−Ｄ−グルコシドで観察されたものよりも高い着色強度を得ること
ができる。

【０１０９】 この表により、テストを行ったすべての株に対して、０．０５ｇ／リットルの
アリザリン−１−β−Ｄ−グルコシドで得られた強度は、濃度がアリザリン−１
−β−Ｄ−グルコシドの濃度よりも３倍高い６−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−グルコシドで観察された強度よりも高いことも指摘することができる。

【０１１０】 したがってアリザリンベースの基質はインドキシルベースの基質よりも高感度
である。

【０１１１】 アリザリン−１−β−Ｄ−グルコシドとアリザリン−２−β−Ｄ−グルコシド
との間の選択は、合成コスト、適用における特殊性、安定性等のその他の基準を
元に判断されることになろう。

【０１１２】 特別項目 目視方法、すなわちコロニー状態におけるバクテリア種の識別法は、少なくと
も一つの適切な微量のカチオンの存在下に上記のように合成された少なくとも一
つの基質を混入して、寒天ベースの培地上で行われる。このとき顕現するコロニ
ーは、基質およびこれに結合さされたカチオンの選択に応じて、非常に着色され
た（赤、赤紫、ブルー、等）統一体を形成している。基質とカチオンとの間のこ
の比率が存在する場合、１００分の１〜１分の１００，好ましくは１０分の１〜
１分の１０、さらにより好ましくは２分の１〜１分の２である。

【０１１３】 条件によっては、Ｒ３におけるＳＯ_３Ｈの基質の存在により、この型の基質に
関連する不安定性および不溶性の問題を避けることができる。

【０１１４】 多価カチオンとは、Ｘ^ｎ＋（ｎ＝２、３または４）形態の多価金属カチオンで
ある。使用可能な金属はＭｇ、Ａｌ、Ｃａ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ
、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｓｒ、Ｚｒ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｂａ、Ｌａ、Ｈｆ、ならびにラ
ンタノイドＣｅ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂである。

【０１１５】 デオキシ（デソキシ）アリザリンまたはアントラセン−１，２，１０−チオル
とも呼ばれる、アリザリンの還元生成物であるアントラロビンはすでに当業者に
公知である。この還元は、水酸化亜鉛またはアンモニア水、酸塩化スズ（ｃｈｌ
ｏｒｕｒｅ ｓｔａｎｎｅｕｘ ｄ'ａｃｉｄｅ）等の作用により行われる。こ
の化合物の一般式は次の通りである。

【０１１６】

【化１１】

【０１１７】 アントラキノンの中央のキノン状環がないため、１，２−ジオル系統の金属キ
レートは反応性が異なり、たとえば鉄キレートは黒色となる。アリザリンの鉄キ
レートは赤であるため、同じ型のカチオンで異なる二つの基質を使用することが
可能で、二つの異なる酵素活性を検出することができる。これらの二つの基質は
たとえば以下のものであってもよい。 ・オシダーゼ活性を検出するためのアリザリン−２−β−Ｄ−グルコシド、 ・ホスファターゼ活性を検出するためのデソキシアリザリン−２−β−Ｄ−ホス
ファターゼ。

【０１１８】 アントラロビンの位置１０における水酸基を保護することも可能で、この位置
は水素原子がたとえばメチル基により代えられてもよく、その場合次の形態の分
子になる。

【０１１９】

【化１２】

【０１２０】 同じくアリザリンは、アルコール官能基であるアルコール９，１０−ジオルの形
態下のケトンを還元することで保護されてもよく、このアルコール官能基は次に
たとえば、下記のように表される、１，２−ジヒドロキシ−９，１０−ジメトキ
シアントラセンの形態下にアルキル化される。

【０１２１】

【化１３】

【０１２２】 これらのアルキル化されたアントラロビンおよびアリザリンは自由空気の酸化
によって引き続き自然にアリザリンに変換されないため、基質の、好ましくは位
置２のグルコシド化のための優れた候補物質である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年３月１９日（２００２．３．１９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【化１】 （式中、 −Ｒ_１は標的部分またはＨ、Ｒ_２は標的部分またはＨ、Ｒ_１およびＲ_２の少なく
とも一つが標的部分、 −Ｒ_３はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミノであ
り、アルキル、アリール、アラルキル、またはアラニンのようなα−アミノ酸残
基に等しいＸを伴う、 −Ｒ_４はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
ＯＨ、アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミ
ノであり、アルキル、アリール、アラルキル、またはアラニンのようなα−アミ
ノ酸基に等しいＸを伴う、 −異なる方法により、Ｒ_３およびＲ_４は互いに連結して、５員環、好ましくは６
員環を形成する、 −Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれ、次の原子または原子団、すなわちＨ
、ハロゲン、特にＣｌまたはＢｒ、ＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、アルキルまたはアルコキシ
のうちの一つより成る、 −Ｒ_９およびＲ_１０は独立して、メチル、アルキル、アリール、アラルキルから
成り、かつ一方でＲ_９またはＲ_１０は環（ピペリジン、ピロリジン、モルフォリ
ン、等）、他方でＲ_１０またはＲ_９は水素原子である） の色原体基質の使用。

【化２】 （式中、 −Ｒ_１は標的部分またはＨ、Ｒ_２は標的部分またはＨであり、Ｒ_１またはＲ_２の
少なくとも一方が標的部分である、 −Ｒ_３はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミノであ
り、アルキル、アリール、アラルキル、またはアラニンのようなα−アミノ酸残
基に等しいＸを伴う、 −Ｒ_４はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
ＯＨ、アシルアミノ、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミノであり、アルキ
ル、アリール、アラルキル、またはアラニンのようなα−アミノ酸残基に等しい
Ｘを伴う、 −異なる方法により、Ｒ_３およびＲ_４は互いに連結し、少なくとも５員環、好ま
しくは６員環を形成する、 −Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれ、次の原子または原子団、すなわちＨ
、ハロゲン、特にＣｌまたはＢｒ、ＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、アルキルまたはアルコキシ
の一つにより成る、 −Ｒ_９およびＲ_１０は独立して、メチル、アルキル、アリール、アラルキルから
成り、または一方でＲ_９およびＲ_１０は環（ピペリジン、ピロリジン、モルフォ
リン、等）、他方でＲ_１０またはＲ_９は水素原子である、 −Ｒ_１１は次の原子または原子団、すなわちＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ
、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、アルキル、アリール、アラルキル、アシルア
ミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミノであり、アル
キル、アリール、アラルキル、またはアラニンのようなα−アミノ酸残基に等し
いＸを伴う、 −Ｒ_１２はＨ、メチル、アルキル、アリール、アラルキルから成り、酵素活性の
存在を検出する） の色原体基質の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジェイムズ，アーサー 英国、ニューカッスル アプオン タイン エヌイー21 エイチアール、ジェスモン ド、ウルズリー ガーデンズ、12 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ01 QQ32 QQ33 QQ35 QQ36 QR66 QS02 QS28 QX02

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中、 −Ｒ_１は標的部分またはＨ、Ｒ_２は標的部分またはＨであり、Ｒ_１およびＲ_２の
   うちの少なくとも一つが標的部分である、 −Ｒ_３はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
   アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミノであ
   り、アルキル、アリール、アラルキル、またはアラニンのようなα−アミノ酸残
   基に等しいＸを伴う、 −Ｒ_４はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
   ＯＨ、アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミ
   ノであり、アルキル、アリール、アラルキル、またはアラニンのようなα−アミ
   ノ酸残基に等しいＸを伴う、 −異なる方法により、Ｒ_３およびＲ_４は互いに連結して、少なくとも５員環、好
   ましくは６員環を形成する、 −Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれ次の原子または原子団、すなわち、Ｈ、ハ
   ロゲン、特にＣｌまたはＢｒ、ＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、アルキルまたはアルコキシから
   成る、 −Ｒ_９およびＲ_１０は、独立して、メチル、アルキル、アリール、アラルキルか
   ら成り、または一方で、Ｒ_９またはＲ_１０は環（ピペリジン、ピロリジン、モル
   フォリン、等）を構成し、他方でＲ_１０またはＲ_９は水素原子である） の酵素活性の存在を検出することができる色原体基質。
2. 【請求項２】 中央の環のケトンが、少なくとも一つの水素原子が場合によ
   ってはメチル、アルキル、アリール、アラルキル基により代えられている水酸化
   物原子団の形態下に還元されることを特徴とする、請求項１に記載の基質。
3. 【請求項３】 一般式： 【化２】 （式中、Ｒ_１は標的部分またはＨ、Ｒ_２は標的部分またはＨであり、Ｒ_１および
   Ｒ_２のうち少なくとも一方は標的部分である、 −Ｒ_３はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
   アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミノであ
   り、 −Ｒ_４はＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、
   ＯＨ、アシルアミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミ
   ノであり、アルキル、アリール、アラルキルまたはアラニンのようなα−アミノ
   酸残基に等しいＸを伴う、 −異なる方法により、Ｒ_３およびＲ_４は互いに連結して、少なくとも５員環、好
   ましくは６員環を形成する、 −Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれ以下の原子または原子団、すなわちＨ、ハ
   ロゲン、特にＣｌまたはＢｒ、ＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、アルキルまたはアルコキシの一
   つにより成る、 −Ｒ_９およびＲ_１０は独立してメチル、アルキル、アリール、アラルキルから成
   る、または一方でＲ_９またはＲ_１０は環（ピペリジン、ピロリジン、モルフォリ
   ン、等）を、他方でＲ_１０またはＲ_９は水素原子を構成する、 −Ｒ_１１は次の原子または原子団、すなわちＨ、ＳＯ_３Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ
   、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ_９Ｒ_１０、アルキル、アリール、アラルキル、アシルア
   ミノ、アミノアリール、またはＮＨＣＯＸ型のアミノアシルアミノの一つにより
   成り、アルキル、アリール、アラルキル、またはアラニンのようなα−アミノ酸
   残基に等しいＸを伴う、 −Ｒ_１２はＨ、メチル、アルキル、アリール、アラルキルから成る） の酵素活性の存在を検出することができる色原体基質。
4. 【請求項４】 Ｒ_１はＨ、Ｒ_２は標的部分であることを特徴とする、請求項
   １〜３のいずれか１項に記載の基質。
5. 【請求項５】 標的部分が次の各分子、すなわち、 −水酸基にαまたはβにおいて連結しているモノ−、ジ−および／またはポリサ
   ッカリド単位により成るグルコシド、 −α−アミノ酸またはペプチド、 −−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３（ｎは０〜２０）のような有機酸、または
   、 −硫酸塩、燐酸塩、ピロ硫酸塩、ピロ燐酸塩またはホスホジエステル、 の一つにより成ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の基質
   。
6. 【請求項６】 Ｒ_３およびＲ_４は、好ましくはＲ_３およびＲ_４に隣接するＮ
   で置換されたまたは置換されていないＣ_３Ｎ鎖により成り、これによって互いに
   連結して、６員環を形成することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に
   記載の基質。
7. 【請求項７】 −標的部分が、検出すべき酵素活性に関連している少なくと
   も一つの基質を、このような基質活性および少なくとも一つの型のカチオンを有
   する少なくとも一つの微生物を含んでいると思われる試料の存在下に配置する、
   −不溶性の着色されたキレートの形成を観察する、 工程から成ることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
8. 【請求項８】 基質が酵素活性により解放されるマーカー部分に対する適切
   な少なくとも一つのカチオン型の存在下に配置されることを特徴とする、請求項
   ７に記載の使用。
9. 【請求項９】 不溶性キレートを形成するために使用することができるカチ
   オン型は、Ｆｅ^２＋、Ａｌ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｓｎ^２＋またはＣｕ^２＋により成る
   ことを特徴とする、請求項７または８のいずれか１項に記載の使用。
10. 【請求項１０】 −標的部分が、検出すべき少なくとも二つの酵素活性と関
    連している少なくとも二つの基質を、このような酵素活性をおよび少なくとも一
    つのカチオン型を有している少なくとも一つの微生物を含んでいると思われる試
    料の存在下に配置する、 −少なくとも二つの異なる着色または第３の着色形成を観察する、 工程から成ることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の、少なく
    とも二つの基質の使用。
11. 【請求項１１】 基質は、酵素活性により解放されるマーカー部分に対して
    適切な少なくとも一つのカチオン型、好ましくは唯一つのカチオン型の存在下に
    配置されることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
12. 【請求項１２】 −標的部分が、検出すべき酵素活性と関連する少なくとも
    一つの基質を、このような酵素活性を有する少なくとも一つの微生物を含んでい
    ると思われる試料の存在下に適切なｐＨを有する反応培地内に配置する、 −少なくとも一つの彩色形成を観察する、 工程から成ることを特徴とする、酵素活性の存在を検出することができる請求項
    １〜６のいずれか１項に記載の少なくとも一つの基質の使用、または請求項７〜
    １１のいずれか１項に記載の使用と組み合わせた使用。
13. 【請求項１３】 少なくとも二つの基質を使用することで、酵素活性により
    解放されるマーカー部分に対して与えられる唯一つのカチオン型が使用されるこ
    とを特徴とする、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の使用。
14. 【請求項１４】 一つまたは複数の基質を含む培地上に一つまたは複数の微
    生物を押し出す中間工程を行うことを特徴とする、請求項７または１０のいずれ
    か１項に記載の使用。
15. 【請求項１５】 標的部分として特に、 ・グルコース、 ・ガラクトース、 ・マンノース、 ・キシロース、 ・グルクロン酸、 ・Ｎ−アセチルグルコサミン、 を使用して、グルコシダーゼ酵素活性を検出することを特徴とする、請求項７〜
    １４のいずれか１項に記載の使用。
16. 【請求項１６】 標的部分として特に燐酸または置換誘導体を使用して、ホ
    スファターゼ酵素活性を検出することを特徴とする、請求項７〜１４のいずれか
    １項に記載の使用。
17. 【請求項１７】 標的部分として特に硫酸または置換誘導体を使用して、ス
    ルファターゼ酵素活性を検出することを特徴とする、請求項７〜１４のいずれか
    １項に記載の使用。
18. 【請求項１８】 標的部分として、特に、 ・飽和または不飽和脂肪酸、または置換誘導体、 ・酢酸または置換誘導体、 ・酪酸または置換誘導体、 ・オクタン酸または置換誘導体、または、 ・イノシトール−１−燐酸のようなエステル化された燐酸基、 を使用して、リパーゼ、ホスフォリパーゼまたはエステラーゼ酵素活性を検出す
    ることを特徴とする、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の使用。
19. 【請求項１９】 微生物の少なくとも一つの株および／または種の検出を可
    能にする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも一つの基質、および
    培地を含む組成物。
20. 【請求項２０】 少なくとも二つの基質を含み、反応後基質は、微生物の少
    なくとも一つの株および／または種により顕現された様々な酵素活性を検出でき
    る、異なる色を呈することを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
21. 【請求項２１】 液体、ゲル化または固体培地により成ることを特徴とする
    、請求項１９または２０のいずれか１項に記載の組成物。
22. 【請求項２２】 基質の濃度は１０〜５００ｍｇ／リットル、好ましくは３
    ０〜１５０ｍｇ／リットル、さらにより好ましくはは５００ｍｇ／リットルであ
    ることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の組成物。 【発明の属する技術分野】