KR100517757B1 - 에스큘레틴유도체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그것의 적당한 염 또는 수화물 및 그 합성에 관한 것이다:
화학식 Ⅰ
상기 식 중,
R1 및 R2는 각각 수소 또는 할로겐 원자를 나타내거나 또는 후속의 철 킬레이트화를 방해하지 않는 또 다른 기이고,
R3 및 R4는 각각 수소원자 또는 (C1-C8)알킬 또는 (C6 또는 C10)아릴(C1-C8)알킬이거나 또는 화학식 -CH2(CH2)nCOX(식 중, n은 0 내지 3의 수이고, X는 히드록실기 또는 또 다른 친수성기임)의 임의 변성된 카르복실 함유 기이고,
R3은 선택적으로 화학식 -COR(식 중, R은 (C1-C8)알킬, (C6 또는 C10)아릴 (C1-C8)알킬 또는 (C5-C8)시클로알킬기를 나타냄)의 아실기를 나타내고,
단, R3및 R4의 사이에는 세개 이상의 탄소원자가 존재해야 하거나, 또는
R3 및 R4는 그것에 결합된 탄소원자와 함께 (C5-C8)시클로알켄 고리를 형성하고,
Y 및 Z 중의 하나는 효소에 의해 분해될 수 있는 기를 나타내고, Y 및 Z 중의 다른 하나는 수소 원자를 나타낸다.
본 발명의 화합물은 화학식 Ⅰ의 화합물을 효소에 의해 분해하여 유색의 형광 발생소 마커를 방출하므로써 시료 중의 미생물을 감지하는데 적용된다.
Description
본 발명은 신규한 에스큘레틴 유도체 및 이것을 미생물을 특이적으로 감지하기 위한 기질로서 사용하는 방법에 관한 것이다.
에스큘레틴(esculetin)은 에스큘린의 아글리콘(aglycon)이자 시코린의 아글리콘으로서, 이들 분자를 가수분해함으로써 제조될 수 있다. 에스큘레틴은 하기 화학식으로 표시된다.
에스큘레틴의 정식 화학명은 6,7-디히드록시-2H-1-벤조피란-2-온(6,7-디히드록시쿠마린 또는 시코리게닌으로도 공지됨)이다.
β-D-글루코시다아제의 존재는 오래 전부터 미생물 동정(同定)시 중요한 진단용 마커로 간주되어 왔다. 이 효소를 감지하기 위해 가장 흔히 사용되는 기질은 다음과 같은 천연 글리코사이드 에스큘린(6,7-디히드록시쿠마린-6-글루코사이드 또는 6-(β -D-글루코피라노실옥시)-7-히드록시-2H-1벤조피란-2-온)이다.
에스큘린을 가수분해하면 β -D-글루코스 및 에스큘레틴(6,7-디히드록시쿠마린)이 생성되는데 후자인 에스큘레틴 화합물은 철 염의 존재하에서 갈색/흑색 착물을 형성함으로써 감지된다. 이러한 시험은 처음에는 엔테로코시(enterococci)의 동정에 적용되었으며 이제까지 기타 속(genera)의 동정에 광범위하게 사용되어 왔다[문헌 : Swan, A. J. Clinical Pathology 7 160-163(1954), Trepeta 등 Antonie van Leewenhoek 53 273-277(1987)]. 이 기질의 주 단점은, 이 기질이 한천내로 삽입되는 경우에 형성되는 착물이 배지 전체에 퍼진다는 것이다[문헌 : James 등 Zbl. Bakt. Hyg. A267 188-193(1987)]. 이로 인해 혼합 배지 내에 존재하는 경우 β -글루코시다제 형성 콜로니를 구별하기가 어렵게 된다.
또한, 합성 기질은 가수분해시 발색성(發色性) 화합물 또는 형광(螢光) 화합물 중의 하나를 생성하는 β -D-글루코시다아제를 감지하는 데 사용할 수 있다[문헌: Manafi 등 Microbiol. Reviews 55 335-348(1991)]. 예컨대, 형광발생소(螢光發生索) 화합물, 즉 4-메틸엄벨리페릴-β-D-글루코사이드는 한천 배지내로 혼입되는 경우 몇 가지 단점을 보임에도 불구하고 광범위하게 사용되어 왔다. 즉, 콜로니 인식이 오로지 장파 자외선의 존재하에서만 수행될 수 있으며, 또한 가수분해에 의해 기질로부터 방출된 글루코스는 산을 생성하는 미생물에 의해 이용될 수 있다는 사실을 포함한다. 이러한 사실은, 상기 분자는 낮은 pH에서는 해리되지 않은 형태가 우세하기 때문에 4-메틸엄벨리페론에 의해 생성되는 형광성의 감소를 야기하게 된다. 또한, 방출된 엄벨리페론은 한천 전체에 확산기 쉬우므로 목적 효소를 생성하는 각각의 콜로니를 구별해 내는 것을 어렵게 만든다. 기타 통용되는 기질에는 니트로페놀의 β -D-글루코사이드 유도체가 있다[문헌 : Trepeta 등 Antonie van Leewenhoek 53 273-277(1987)]. 그러나, 광범위한 확산은 상기 기질을 고체 배지내로 혼입하는 경우 또 다시 심각한 제한 인자로 작용한다[문헌 : Manafi 등 Microbiol. Reviews 55 335-348(1991)].
β -갈락토시다아제 또한 미생물 동정에 사용되는 중요한 진단용 마커이다. 이것은 아마도 모든 미생물 효소 중에 가장 광범위하게 연구되어진 것이며 이것의 존재는 오랫동안 중요한 분류용 마커로서 인식되어 왔다. 이는 박테리아과 엔테로박테리아시아(Enterobacteriaceae)에 특히 적용되는 데, 여기에는 서행성 락토스 발효인자(fermenter) 또는 후기성 락토스 발효인자로부터 비락토스 발효 종을 구별하기 위해 수년 동안 β -갈락토시다아제의 분석법이 사용되어 왔다[문헌 : James, A. L., In Chemical Methods in Prokaryotic Systematics, 471-492, ed. Goodfellow and O'Donnell, Wiley ＆ Sons(1994)]. β -갈락토시다아제의 감지에는 많은 기질들이 이용될 수 있다. 그중 가장 통용되는 것은 오르토-니트로페닐 β-D-갈락토사이드(ONPG)로서, 이는 가수분해시 황색의 o-니트로페놀을 방출한다[문헌 : Lowe, G. H., J. Medical Laboratory Technology 19 21(1962)]. 또한 형광발생소 기질은 레조루핀, 플루오레세인 및 4-메틸엄벨리페론과 같은 표식(label)을 이용하면서 사용되어 왔다[문헌 : Manafi 등 Microbial. Reviews 55 335-348(1991), Plovins 등 Applied and Environmentol Microbiol. 60 4638-4641(1994)].
β -갈락토시다아제 분석법의 중요한 용도는 물 시료 및 음식 시료에서 "대장균군(大腸菌郡; coliform)"을 감지하는 것이다. 이로 인해 β -갈락토시다아제의 직접적인 감지에 사용되는 적당한 기질을 혼입시키는 멤브레인 여과 기법을 개발하게 되었다[문헌 : Brenner 등 Applied and Environmentol Microbiol. 59 3534-3544(1993), Ceneci 등 Microbios 76 47-54(19 )]. 이 목적을 위해 가장 광범위하게 사용되는 기질은 4-메틸엄벨리페론 β-D-갈락토사이드이다. 예컨대, 이 기질은 6 시간내에 100 ㎖당 1 개의 분변(賁便) 대장균군 만큼의 소량을 감지하는 신속한 분석법에 사용된다[문헌 : Berg 등 Applied and Environmental Microbiol. 54 2118-2122(1988)]. 이 기질의 제한 인자는 방출된 4-메틸엄벨리페론이 여과기를 통해 쉽게 확산된다는 것과 생성된 형광물질이 자외선하에서만 가시화된다는 것이다.
β -글루코시다아제 및 β -갈락토시다아제의 동정에 있어서 이들 기질의 전술한 제한 인자로 인해, 가수분해시 불용성 생성물을 형성하는 발색성 화합물이 사용되어 왔다. 이들 기질은 방출된 발색성 물질이 배지 전체에 확산되지 않고 박테리아 콜로니 주변에 편재된다는 잇점을 제공한다[문헌 : Kodaka 등 J. Clinical Microbiol. 33 199-201(1995)]. β -글루코시다아제를 감지하기 위한 이들의 예로는, 인독실 β -D-글루코사이드 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β -D-글루코사이드를 들 수 있으며, β -갈락토시다아제를 감지하기 위한 이들의 예로는 인독실의 갈락토사이드 및 이들의 할로겐화된 유도체(예, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β -D-갈락토사이드(X-gal))를 들 수 있다[문헌 : Kodaka, 등 J. Clinical Microbiol. 33 199-201(1995)]. 가수분해에 의해 이들 기질로부터 방출된 아글리콘은 공기에 의해 빠르게 산화하여 상기 콜로니 무리상에 자주색/청색 인디고이드 염료를 형성한다[문헌 : James, A, L., In Chemical Methods in Prokaryotic Systematics, 471-492, ed. Goodfellow and O'Donnell, Wiley ＆ Sons(1994)]. 이들 기질이 매우 효과적이기는 하나 이들은 제조하기가 비교적 어렵다. 또 시판하기는 하지만 매우 비싸므로 대규모 진단용으로는 사용하기 어렵다. 또한 8-히드록시퀴놀린 β -D-글루코사이드를 사용하는 것은 β -글루코시다제를 감지하기 위한 에스큘린의 대용물로 기재되어 왔다[문헌 : James 등 Zbl. Bakt. Hyg. A267 188-193(1987)]. 이를 사용하면 탁월한 결과를 얻을 수는 있으나, 그람 양성 미생물에 대해서는 특히 독성 문제가 발생하여 왔다[문헌 : Albert 등 British Journal of Experimental Pathology 34 119-130(1953)].
본 발명은 에스큘레틴 (6,7-디히드록시쿠마린)의 신규한 6-치환 유도체 또는 7-치환 유도체에 관한 것이다. 이는 미생물에 의해 가수분해 되어 전술한 모든 단점을 나타내지 않으면서 한천 또는 기타 수성 환경을 통해 확산되는 경향이 낮은, 형광성의 철-킬레이트화 에스큘레틴이 될 수 있다.
본 발명의 제1면은 하기 화학식 1의 화합물 또는 그것의 적당한 염이나 수화물이다.
[화학식 1]
상기 식 중,
R1 및 R2는 각각 수소 또는 할로겐 원자를 나타내거나 또는 후속의 철 킬레이트화를 방해하지 않는 기타 기이고,
R3 및 R4는 각각 수소원자 또는 (C1-C8)알킬 또는 (C6 또는 C10)아릴(C1-C8)알킬이거나 또는 화학식 -CH2(CH2)nCOX(식 중, n은 0 내지 3의 수이고, X는 히드록실기 또는 기타 친수성기임)의 임의 변성된 카르복실 함유기이고,
R3은 선택적으로 화학식 -COR(식 중, R은 (C1-C8)알킬, (C6 또는 C10)아릴 (C1-C8)알킬 또는 (C5-C8)시클로알킬기를 나타냄)의 아실기를 나타내고,
단, R3 및 R4의 사이에는 세 개 이상의 탄소원자가 존재해야 하거나 또는
R3 및 R4는 그것에 결합된 탄소원자와 함께 (C5-C8)시클로알켄 고리를 형성하고,
Y 및 Z 중의 하나는 효소에 의해 분해될 수 있는 기를 나타내고, Y 및 Z 중의 다른 하나는 수소 원자를 나타낸다.
특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이하 "화합물"이란 용어는 "염" 또는 "수화물"을 포함하는 것이다.
본 명세서에서 "할로겐" 이란 용어 또는 그 약어 "할로"란 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 의미한다.
"철 킬레이트화를 방해하지 않는 원자 또는 기"란 표현은 화학식 I의 아글리콘이 쿠마린 고리계의 6 위치 및 7 위치에서의 히드록실기에 의한 킬레이트화에 의한 것인 경우, 주된 감지 수단 중의 하나라는 사실을 언급하는 것이다. 이 킬레이트화를 방해하지 않는 기는 R1 및/또는 R2에서 치환될 수 있다. 그 예로는 수소, 히드록실, 할로겐 또는 (C1-C6)알킬을 들 수 있다. 할로겐 원자는 플루오르 원자 또는 염소 원자일 수 있으며 저급 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 벤질일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "(C1-C8)알킬"이란 용어는 탄소원자수가 1 개 내지 8개인 직쇄 탄화수소 또는 분지쇄 탄화수소를 말한다. 이러한 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, s-부틸, f-부틸, 펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸 및 옥틸을 들 수 있다. 탄소원자는 1 개 내지 4 개인 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "(C1-C10)알킬"이란 용어는 탄소원자수가 1 개 내지 10개인 직쇄 탄화수소 또는 분지쇄 탄화수소를 말한다. 이러한 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, s-부틸, t-부틸, 펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 및 데실을 들 수 있다. 탄소원자는 1 개 내지 6 개인 것이 바람직할 수 있다.
상기 용어 "(C6 또는 C10)아릴"이란 용어는 페닐 및 나프틸을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "(C5-C8)시클로알킬"이란 용어는 탄소원자수가 5 개 내지 8 개인 알리시클릭기를 말한다. 이러한 시클로알킬기의 예로는 시클로펜틸 및 시클로헥실이 있다.
본 명세서에서 사용된 "(C5-C8)시클로알켄 고리"란 용어는 탄소원자수가 5 개 또는 8 개이며 하나 이상의 이중 결합을 추가로 함유하는 알리시클릭 고리를 말한다. 이러한 시클로알케닐기의 예로는 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 시클로헵테닐 및 시클로옥테닐을 들 수 있다.
본 발명의 화합물에서 하나의 비대칭 탄소원자가 존재하면 거울상 이성질체(enantiomer)가 만들어진다. 비대칭 탄소원자가 여러 개 존재하면 부분입체 이성질체(diastereoisomer)가 만들어지는데, 이들 각각은 각각의 키랄성 중심에서 적당한 R 입체화학 또는 S 입체화학을 보이는 두 개의 거울상 이성질체로 이루어진다. 본 발명은 이들 부분입체 이성질체, 광학적으로 활성인 거울상 이성질체 및 이들의 혼합물 모두를 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
상기 용어 "적당한 염"이란 화학식 I의 화합물을 산 또는 염기와 접촉시키므로서 제조되는 염을 말하는 것으로서, 상기 산 또는 염기의 짝이온은 화학식 I의 화합물의 소정의 용도를 방해하지 않는 것이어야 한다. 그 예로는 포스페이트 유도체의 나트륨염 또는 마그네슘염이거나 또는 화학식 I의 화합물이 카르복실산인 경우 일차 아민, 이차 아민 또는 삼차 아민으로부터 형성된 염을 포함한다. 일차 아민염의 예로는 시클로헥실암모늄염을 들 수 있으며, 적당한 이차아민염은 피페리딘염을 들 수 있으며, 삼차 아민염은 트리에틸아민염을 들 수 있다.
화학식 I의 바람직한 화합물에는,
R1은 염소이거나 또는 바람직하게는 수소이고,
R2은 염소이거나 또는 바람직하게는 수소이고,
R3은 (C1-C4)알킬, 특히 부틸 또는 벤질이고,
R4은 (C1-C4)알킬이거나 또는 화학식 -CH2(CH2)nCOX(식 중, n은 0 내지 3의 수이고, X는 히드록실기 또는 이하의 친수성기들,
-NHCH2CONHCH2CO2H
-NHCH2CONHCH2CONHCH2CO2H
-NHCH2CH2SO3H
-N(CH2CO2H)2 또는
중 하나임)이고,
R3 및 R4는 그것에 결합된 탄소원자와 함께 (C5-C8)시클로알켄 고리, 바람직하게는 시클로펜테닐 고리 또는 시클로헥세닐 고리를 형성하고,
R3가 화학식 -CH2(CH2)nCOX(식 중, n은 0 내지 3의 수이고, X기는 전술한 바와 같음)인 경우, Y 또는 Z로 표시되는 효소에 의해 분해될 수 있는 기는 α -연결된 당 잔기이거나 또는 바람직하게는 β -연결된 당 잔기로서, 예컨대 β -D-글루코스, β -D-갈락토스, β -D-크실로스, β -D-글루큐론산 또는 N-아세틸-β -D-글루코스아민이거나, 또는 포스페이트기 또는 카르복실레이트(R5COO-)기(식 중, R5는 (C1-C10)알킬기를 나타냄)인 것이 독립적으로 또는 임의의 상용성인 조합으로 있다. 당 잔기, 특히 글루코스 및 갈락토스로부터 유도된 것이 가장 바람직한 화합물이다.
R3 및 R4는 이들에 결합된 탄소 원자와 함께 시클로펜텐 고리 또는 시클로헥센 고리를 형성하는 화합물이 특히 바람직하다.
화학식 Ⅰ의 아글리콘 부분은 치환된 에스큘레틴이다. Y가 글루코스 부분이고 Z가 수소(즉, 에스큘레틴 고리계가 7-위치에서 치환된 것)인 경우, 화학식 Ⅰ의 화합물은 시코린이다. Y가 수소원자이고 Z가 글루코스 부분(즉, 에스큘레틴 고리계가 6-위치에서 치환된 것)인 경우, 화학식 Ⅰ의 화합물은 에스큘린이다. 글루코스 이외의 당 잔기가 7-히드록실기 위치에 치환되어 있는 경우, 시코린 및 시코린의 동족체가 바람직하다. 이는 에스큘레틴 고리계의 형광 성능이 7-위치에서의 당 치환체의 존재에 의해 억제되기 때문이다. 그러므로, 형광 시코린(또는 기타 당 동족체)과는 달리, 형광발생소 시코린 (또는 기타 당 동족체)이 가수분해되어 에스큘레틴이 방출된다는 것은 형광이 증가하는 것으로 관찰될 수 있다. 에스큘린(및 기타 당 동족체)는 이미 7-히드록시 치환체를 함유하지 않기 때문에, 공역(共役) 상태에서 조차 형광을 발한다. 따라서 어떠한 차별화 형태인 유리 아글리콘이라도 형광에 의해서만 관찰되지 않는다.
화학식 I의 화합물이 유기 에스테르인 경우, Y 또는 Z 각각은 독립적으로 (C1-C10)알킬카르보닐기를 나타낼 수 있다. 바람직한 에스테르로는 옥타노에이트 에스테르 및 부티레이트 에스테르가 있다. 에스테르 유도체는 미생물 효소가 에스테라아제인 경우 유용하다.
바람직한 화학식 I의 화합물로는 다음과 같은 것들이 있다.
3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-갈락토사이드,
3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-글루코사이드,
3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-글루큐로나이드,
3-벤질-4-메틸에스큘레틴-β -D-글루코사이드,
3,4-시클로헥세노에스큘레틴-N-아세틸-β -글루코스아미나이드,
3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-크실로사이드,
3-n-부틸-4-메틸에스큘레틴-β -D-갈락토사이드,
3-n-부틸-4-메틸에스큘레틴-β -D-글루코사이드,
N(-7(6)-옥타노일옥시-6(7)-히드록시쿠마린-4-아세틸)글리실글리신,
N(-7(6)-부티릴옥시-6(7)-히드록시쿠마린-4-아세틸)글리실글리신,
3,4-시클로헥세노에스큘레틴-6(7)-인산,
시클로헥실암모늄 3-아세테이트-6-히드록시-7-옥타노일 쿠마린.
본 발명의 두 번째 면에 따르면, 화학식 Ⅰ로 정의된 화합물의 제조방법이 제공되는데, 상기 방법은 6 위치 또는 7 위치가 임의로 보호된 하기 화학식 Ⅱ의 화합물을 유도체화하는 단계와 이어서, 임의로 이렇게 형성된 화학식 Ⅰ의 화합물을 화학식 Ⅰ의 또 다른 화합물로 전환시키는 단계를 포함한다.
[화학식 Ⅱ]
화학식 Ⅱ의 화합물을 유도체화하여 화학식 I의 화합물을 형성시키는 단계는 글리코실화, 인산화 및 에스테르화를 포함한다.
화학식 Ⅱ의 화합물의 글리코사이드 유도체는 상기 화합물을 적당한 조건하에서 글리코사이드로 처리하므로써 형성할 수 있다. 에스큘레틴 유도체의 글리코실화는 쿠마린 고리의 7 위치가 차단되지 않았다면 이 7 위치에서 일어나는데, 이 경우 글리코실화는 6 위치에서도 일어날 수 있다. 적당한 차단기의 예로는 벤질 할라이드(예, 염화벤질, 브롬화벤질, 요오드화벤질) 또는 시안화벤질과 같은 기타 기이다[문헌 : Greene Protective Groups in Organic Synthesis, publ. Wiley Interscience 97-99(1981)]. 글리코실화에 이어 적당한 처리에 의해 탈벤질화가 일어난다.
글리코사이드의 히드록실기는 아세틸 부분과 같은 제거가능한 보호기를 첨가함으로써 보호되는 것이 바람직하다. 보호된 글리코사이드 화합물의 예로는 β -글루코사이드 또는 β -갈락토사이드의 테트라아세틸 형태가 적당하다. 테트라아세틸 유도체는 대응하는 α-아세토브로모헥소스로부터 유도될 수 있다. 히드록실기의 탈보호는 어떠한 특정 시점에서도 실행할 수 있으나, 실제로 이는 목적 화합물의 형성에 있어서 마지막 단계일 것이다. 탈보호는 보호기가 아세틸 부분인 경우 메탄올중의 나트륨 메톡사이드의 용액으로 처리하는 단계로 이루어질 수 있다. 글리코실화를 위한 조건은 당업자에 의해 많은 실험을 거치지 않고도 선택될 수 있다. 그러나, 적당한 조건으로는, 수산화칼륨 용액 중의 에스큘레틴의 보호된 글리코사이드를 수성 아세톤 중에 처리하고, 이어서 탈보호하는 과정으로 이루어질 수 있다. 화학식 Ⅱ의 적당한 6,7-디히드록시쿠마린 카르복실산으로부터 유기 에스테르를 형성할 수 있다. 상기 디히드록시쿠마린 카르복실산을 먼저 임의로 아세틸화하여 6-히드록실기 및 7-히드록실기를 보호하고 이어서 염화티오닐을 첨가하므로써 산 클로라이드로 전환시킬 수 있다. 모노아미노아실, 디아미노아실 또는 트리아미노아실은 산 클로라이드를 적당한 아미노아실 화합물과 결합(conjugation)시키므로써 형성될 수 있다. 아미노아실 결합체는 피리딘 존재하에서 (C1-C10)알킬 카르보닐할라이드로 처리하므로써 에스테르화될 수 있다. 적당한 알킬 카르보닐할라이드의 예로는 옥타노일 클로라이드 또는 부티릴 클로라이드가 있다.
포스페이트 에스테르 유도체의 형성은 피리딘 (또는 기타 적당한 모노인산화용 시약)의 존재하에 염화인(POCl3)으로 에스큘레틴 유도체를 처리하므로써 얻어질 수 있다.
전술한 바와 같이, 화학식 I의 화합물은 임의로 화학식 I의 또 다른 화합물로 변성될 수 있다. 예컨대, 글리코사이드 잔류물과 같이, Y 또는 Z 중의 하나가 효소에 의해 분해될 수 있는 기인 경우, 글리코사이드는 현장에서 바로 변성될 수 있다. 예를 들면, 글루코스 잔류물을 백금 촉매 및 탄소의 존재하에서 산소로 처리하여 글루큐론산 잔류물로 변성시킬 수 있다. 이와 유사하게, 기타 글리코사이드는 그것의 6-카르복실 유도체(글리큐론산)로 산화될 수 있다. 또한, 7-치환된 기질, 예를 들면 Y가 글루코스인 화학식 Ⅰ의 β -글루코사이드는 비어있는 페놀기(6-히드록실)에서 적당한 반응에 의해 기타의 기질, 예컨대 카르복실 에스테르를 생성할 수 있으며, 이어서 7-치환체를 스위트 알몬드(Sweet Almond) β -글루코시다아제로 탈보호시킨다. 이로 인해 에스큘린 계열의 유도체가 생성된다.
화학식 Ⅱ의 화합물은 하기 화학식 Ⅲ의 (치환 및 비치환된) 적당한 직쇄형 β -케토에스테르 또는 고리형 β -케토에스테르를 페크맨(Pechmann) 축합법으로 하기 화학식 Ⅳ의 화합물로 처리하므로써 제조될 수 있다.
화학식 Ⅲ의 β -케토에스테르의 구조는 다음과 같다:
[화학식 Ⅲ]
상기 식 중,
R6 및 R7 각각은 아세틸(CH3CO-) 또는 화학식 X(CH2)nCO-(식 중, n은 0 내지 6의 수이고, X는 (i) 수소, (C1-C8)알킬, (C5-C8)시클로알킬 또는 (C6 또는 C10)아릴(C1-C8)알킬, (ii) -CO2CH3 또는 -CO2C2H5 또는 (iii) n이 1인 경우, C2H5OOCCH2CO-을 나타냄)의 아실기를 나타내거나 또는
R7은 수소, (C1-C8)알킬, (C5-C8)시클로알킬, (C6 또는 C10)아릴(C1-C8)알킬 또는 (C6 또는 C10)아릴(C1-C8)알킬 아로일기를 나타내거나 또는,
R6 및 R7은 함께 시클릭 케톤 -(CH2)nCO-(식 중, n은 4 내지 7임)을 형성하고,
R8은 (C1-C8)알킬, 페닐 또는 메틸페닐을 나타낸다.
화학식 Ⅲ의 β -케토에스테르 중, R6 및 R7이 시클릭 케톤, 시클로펜타논 및 시클로헥사논을 형성하는 것이 바람직하다. 또한 R8이 부틸 또는 메틸페닐인 것이 바람직하다.
화학식 IV의 화합물은 다음과 같다:
[화학식 IV]
상기 식 중, R9는 각각 수소 또는 (C1-C8)알킬-CO를 나타내고,
R1 및 R2은 전술한 바와 같다.
화학식 IV의 바람직한 화합물로는 하기 구조식의 1,2,4-트리히드록시벤젠유도체,
또는 하기 구조식의 1,2,4-트리아세톡시벤젠 유도체가 있다.
상기 식 중, R1 및 R2은 전술한 바와 같다.
그러나, 실제로 1,2,4-트리히드록시벤젠은 비교적 불안정하므로 바람직한 출발물질은 1,2,4-트리아세토히드록시벤젠이다. 1,2,4-트리아세토히드록시벤젠은 대응하는 벤조퀴논 화합물을 티엘-빈터(Thiele-Winter) 아세틸화하여 합성될 수 있다.
바람직한 β -케토에스테르는 다음과 같다.
에틸-2-n-부틸아세토아세테이트,
에틸-2-벤질아세토아세테이트,
에틸-2-시클로헥사논 카르복실레이트 및
에틸-2-시클로펜타논 카르복실레이트.
이 단계의 생성물은 전술한 바와 같은 화학식 Ⅱ의 화합물이다. 언급된 기타 화합물은 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 보편적으로 합성할 수 있다.
화학식 Ⅱ 내에 6,7-디히드록시쿠마린 카르복실산을 형성하는 것은 화학식 Ⅲ의 적당한 β -케토에스테르(식 중, X는 (a) -CO2CH3 또는 -CO2C2H5(식 중, n은 0 내지 6의 수임) 또는 (b) C2H5OOCCH2CO-(식 중 n은 1임)임)를 전술한 화학식 IV의 화합물로 처리하므로써 수행될 수 있다.
바람직한 출발 화합물로는 디에틸아세톤 디카르복실레이트, 디메틸 2-아세틸 글루타레이트 또는 디에틸 아세틸글루타레이트를 들 수 있다. 디에틸아세톤 디카르복실레이트를 1,2,4-트리아세톡시벤젠으로 처리하는 경우, 그 생성물을 가수분해하면 하기 화학식의 6,7-디히드록시쿠마린-4-아세트산이 된다.
이미 기재되지 않은 출발물질은 당해기술 분야에 공지된 방법으로 보편적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 세 번째 면에 따르면, 화학식 1의 화합물 및 임의로 미생물학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 기질을 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 기질은 고체 증식 지지 배지, 반고체 증식 지지 배지 또는 액체 증식 지지 배지일 수 있다.
한천은 미생물 성장을 위해 미생물 분야에서 사용되는 전형적인 지지 배지이다. 이것은 탈수시킨 한천을 물 중에서 필요에 따라 기타 성분들과 합께 고압증기멸균(autoclave)시키므로써 제조된다. 100℃ 이상 온도에서의 고압증기멸균 공정은 한천의 재수화를 일으켜서 젤라틴질의 액체 한천 용액을 형성한다. 형성된 액체 한천을 약하게 냉각시키고 이어서 여전히 액체상태로서 배양 플레이트 또는 페트리 접시와 같은 적당한 용기에 붓는다. 한천은 겔화하여 추가 냉각시 지지 배지를 형성한다. 한천은 성장시키고자 하는 미생물 균주에 따라 선택되나 다음과 같은 제제 중의 하나로부터 선택될 수 있다: 박테리아성 한천, 콜롬비아 한천, 노블 한천, 선택 한천, 브레인 하트 인퓨죤(brian-heart infusion) 한천, LB 한천 또는 레녹스 브로쓰(Lennox Broth) 한천, 루리아 한천, 이스트 추출물 뜨는 트립톤 소화물. 기타 배지의 선택은 문헌[Sambrook 등 Molecular Cloning, 2판, A1-A3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) 및 in Difco Manual 10판, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA]에 기재되어 있다.
본 발명의 화합물은 별개의 성분들로서 탈수된 한천과 배합될 수 있거나 또는 경우에 따라 결합 입자들로서 제조될 수 있다.
전형적으로, 선택된 증식 배지는 1 종 이상의 필수 영양소, 미네랄, 비타민 및/또는 항생제를 포함할 수도 있는데, 이들은 특정 미생물의 증식을 선별하거나, 촉진하거나 또는 보조하거나 또는 특정한 미생물의 동정 또는 목록화를 보조한다. 미생물 증식 배지에 보편적으로 사용되는 항생제로서는 암피실린, 클로람페니콜, D-시클로세린, 겐타마이신, 카나마이신, 날리딕산, 리팜피신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신 및 테트라시클린이 있다. 필수 영양소는 증식시키고자 하는 미생물이 증식 결핍성인 경우에 대해서는 아미노산을 포함하거나 또는 탄화수소와 같은 발효가능한 탄소 공급원을 포함한다. 또한, 예를 들면 마그네슘, 칼슘, 나트륨, 칼륨 또는 철과 같은 특정한 미네랄을 적당한 염 형태로 첨가하거나, 또는 암모늄염 또는 포스페이트염을 첨가하는 것이 필요할 수 있다.
한천과 같은 고체 지지 배지상에서의 미생물 증식은 적당한 용기내에서 수행될 수 있으며, 실제적으로 이는 페트리 접시 또는 배양 플레이트가 될 것이다. 전형적으로 용기는 상기 플레이트를 배양할 때 호기성 박테리아에 산소를 공급하기 위해 위에 뚜껑이 달린 기제를 포함한다. 혐기성 박테리아를 배양시킨 경우에는 상기 기제를 밀봉하거나 또는 플레이트를 혐기성 배양기에서 배양시킬 수 있다.
본 발명의 네 번째 면에 따르면, 시료내 미생물을 감지 및/또는 동정하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 화학식 Ⅰ의 화합물을 함유하는 증식 지지 배지 상에서 시료로부터 분리된 미생물을 증식시키고, 화학식 I의 화합물을 가수분해한 후 동정가능한 발색성 마커 또는 형광발생소 마커의 방출을 감지하는 단계(a)를 포함한다. 또한 미생물은 액체 증식 지지 배지 또는 분석하고자 하는 액체 시료 중에 존재할 수도 있다.
본 발명의 방법은 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아를 모두 감지하는 데 사용할 수 있다. 이 방법은 다음 속들을 감지하는 데 적용되나, 이것에 한정하는 것은 아니다 : 엔테로코커스(Enterococcus), 리스테리아(Listeria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 시트로박터(Citrobacter), 엔테로박터(Enterobacter), 에스케리치아(Escherichia), 하프니아(Hafnia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 프로비덴시아(Providencia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아 (Serratia), 쉬겔라(Shigella) 및 예르시니아(Yersinia).
상기 방법에서 감지되는 형광색 마커 또는 철과 조합되는 경우의 색을 띠는 마커는 에스큘레틴 부분을 유리시키는 화학식 I의 화합물의 가수분해의 결과이다. 이 화합물의 가수분해를 통해 감지하고자 하는 미생물의 존재를 규명할 수 있다.
미생물의 특이적 감지법은 임상학적 진단을 보조하고 적당한 의학적 치료 과정의 효과적인 평가를 보조하기 위해 병원에서 필요로 한다. 임상학자들이 그 미생물 내역에 대해 분석하기를 원하는 공통의 생물학적 시료는 침, 뇨, 혈액, 분변, 위 내용물 또는 생검(biopsy) 시료이다. 또한 음식 산업 및 음료 산업은 제품의 품질 및 안전성을 모니터하고 유지하기 위해 미생물의 특이적 감지를 필요로 한다. 유사하게, 식수 산업 또한 공급수 중에 존재하는 미생물의 존재 및 양을 모니터할 수 있을 것을 필요로 하고 있다. 그러므로, 본 발명의 방법으로 분석하기 위한 적당한 시료는 식이성 물질, 물 또는 기타 음용 가능한 액체이다.
이 방법의 바람직한 형태는 다양한 신규의 에스클레틴 유도체를 한천 배지중에 혼입시키므로써 상기 유도체를 특정한 효소 활성의 지시약으로 이용한다. 생성된 철 킬레이트는 본질적으로 비확산성을 보이기 때문에, 콜로니들을 시각적으로 확인할 수 있으며, 배지가 적당히 선택된 경우에는 콜로니들을 동정할 수도 있다. 이 방법은 셀룰로스 니트레이트 멤브레인 여과기를 사용하는 경우에 효과적으로 적용되며 이로써 콜로니 계수에 적용된다.
본 발명의 화합물은 성장 지지 배지 중에 0.1 ㎎/㎖ 내지 2 ㎎/㎖, 적합하게는 0.2 ㎎/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.4 ㎎/㎖ 내지 0.8 ㎎/㎖의 유효 농도로 존재할 수 있다. 증식 지지 배지가 콜롬비아 한천인 경우, 0.5 ㎎/㎖의 농도가 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물을 함유하는 증식 배지를 포함하는 키트에까지 확장시킬 수도 있다. 키트는 페트리 접시 또는 배양 접시와 같은 용기를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 두 번째, 그리고 후속의 특성으로서 바람직한 특성은 본 발명의 번째 일면에 필요한 변경을 가한 것이다.
다음은 설명을 위해 첨부된 실시예를 참고로 실시예에 의해 본 발명을 설명하고자 한다. 그러나, 이것에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 내지 4 : 치환된 에스큘레틴(6,7-디히드록시쿠마린)의 합성
재료
Lab M, Bury, UK.로부터 콜롬비아 한천을 얻었다. 에스큘레틴 유도체의 합성에 관련된 화학약품 모두를 영국, 길링햄에 소재한 앨드리치 케미칼 컴패니 리미티드로부터 구입하였다.
실시예 1 : 6,7-디히드록시-3,4-시클로헥세노쿠마린의 합성
1,2,4-트리아세톡시벤젠(6.3 g, 25 mmol)과 에틸시클로헥사논-2-카르복실레이트(4.25 g, 25 mmol)을 균질한 점성 액체가 얻어질 때까지 소형 플라스크에서 함께 가열하였다. 가능한한 최저 온도를 사용하였다. 그 고온 액체를 어느 정도 냉각시킨 후, 자기 교반기를 도입하였다. 30℃ 미만으로 냉각시키면 고화가 일어나므로 30℃에서 10℃로 냉각된 75% w/w 황산(35 ㎖)을 상기 교반한 용액에 신속하게 첨가하였다. 이로써 균일성을 유지함과 동시에 온도를 낮추었다. 상온에서 6 시간동안 반응을 지속시켰다. 약 3 시간 후에 백색 현탁액이 형성되었다.
그 현탁액을 얇은 스트림 형태로 고속 교반된 얼음/물(300 ㎖)에 부어서 크림색 고체의 현탁액을 얻었다. 10 분간 교반한 후, 고체를 진공 여과에 의해 제거하여 다량의 물로 세척하고 흡인 건조시킨 후 40℃ 내지 50℃에서 공기 건조하였다. 고온 에탄올로부터 미정제 물질을 재결정하였다. 냉각시, 연황색 침상 형태가 분리되었다. 이것을 진공여과에 의해 분리하고 공기 건조시켰다(5.2 g(89%)).
실시예 2 : 6,7-디히드록시-3-벤질-4-메틸 쿠마린의 합성
1,2,4-트리아세톡시벤젠(6.3 g, 25 mmol)과 에틸 2-벤질아세토아세테이트(5.5 g, 25 mmol)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 함께 가열하였다. 75% 황산(35 ㎖)을 상기 교반한 용액에 첨가하고 16 시간동안 교반을 지속시켰다. 그 진한색 현탁액을 잘 교반하면서 얼음/물(350 ㎖)에 붓고 회색 현탁액을 여과한 후 잔류물을 다량의 물로 세척하였다. 잔류한 고체를 공기 건조시키고, 고온 에탄올로부터 재결정하는데, 소량의 물을 연속적으로 첨가하여 결정화를 도왔다. 에스큘레틴 유도체는 소량의 백색 침상 형태를 형성하였다(5.5 g, 75.3%).
실시예 3 : 6,7-디히드록시-3-아세틸-4-메틸쿠마린의 합성
1,2,4-트리아세톡시벤젠(6.3 g, 25 mmol)과 에틸 디아세토아세테이트(4.3 g, 25 mmol)을 전술한 바와 같이 함께 가열하고 75% 황산(35 ㎖)으로 처리하였다. 16시간 후, 이것을 얼음/물에 부어서 미정제 생성물을 분리하였다. 공기 건조된 물질을 고온 에탄올로부터 결정화하였으며 결정화 시점까지 고온 물을 첨가하였다. 냉각시, 연황색 침상 형태를 형성하였다(3.5 g, 60%).
실시예 4 : 6,7-디히드록시-4-메틸쿠마린-3-프로피온산의 합성
1,2,4-트리아세톡시벤젠(6.3 g, 25 mmol)과 디메틸 2-아세틸글루타레이트(5.75 g, 25 mmol)을 전술한 바와 같이 함께 가열하고 75% 황산(35 ㎖)으로 처리하였다. 20 시간 동안 교반한 후, 이것을 얼음/물에 부어서 미정제 물질을 분리하고 그 생성물을 물로 세척한 후 회수하였다. 상기 생성물(에틸 6,7-디히드록시-4-메틸쿠마린 3-프로피오네이트)를 고온 에탄올로부터 결정화하였다(4.1 g, 56%).
상기 에스테르는 물(90 ㎖) 및 에탄올(10 ㎖)를 함유하는 수산화칼륨(3% w/v)의 수용액과 함께 교반함으로써 가수분해되었다. 몇 시간 후, 시험 시료는 잔류 에스테르를 나타내지 않았다(에틸 아세테이트 : 톨루엔(3:1)을 사용하는 TLC - u.v. 검사). 그 알칼리성 용액을 교반하고 염산(2 M)을 사용하여 pH 2 내지 3으로 산성화시켰다. 침전된 산을 진공 여과에 의해 제거하여, 물로 세척한 후 고온 메탄올/물 혼합물(1:1)로 재결정하였다(2.95 g, 44.6%).
동족(cognate)의 제조 : 6,7-디히드록시쿠마린-4-아세트산
이 화합물은 앞에서 사용된 에스테르를 디에틸 아세톤 디카르복실레이트(5.05 g, 25 mmol)로 치환함으로써 실시예 4에서와 같이 제조하였다. 20 시간 동안 반응의 온도를 10℃ 내지 15℃로 유지하여 가수분해 및 탈카르복실화를 막는다. 분리된 산은 2.4 g(47%)이었다.
전술한 합성 과정에 사용된 트리아세톡시벤젠은 시판하는 것(Lancaster Synthesis Ltd, Morecambe, Lancs)이거나 또는 아세트산 무수물을 사용하는 p-벤조퀴논의 티엘-빈터 아세틸화에 의해 제조된 것이다.
실시예 5 내지 10 : 글루코사이드 및 관련 화합물의 합성
실시예 5 : 3,4-시클로헥세노에스큘레틴 β -D-글루코피라노사이드의 합성
3,4-시클로헥세노에스큘레틴(6,7-디히드록시-3,4-시클로헥세노쿠마린)(3.5 g, 15 mmol)을 수산화칼륨 수용액(10% w/v KOH(29 mmol) 16 ㎖) 중에 용해시켰다. 교반을 통해, 에스큘레틴을 빠르게 용해시켰다. 이것에 아세톤(18 ㎖) 중에 용해시킨 α -아세토브로모글루코스(6.25 g, 15 mmol)을 첨가하였다. 그 용액은 균질하였으며 교반시 더 밝은 색상이 되었다. 10℃ 내지 15℃에서 18 시간 후 황색 침전물이 형성되었다. 이것을 여과에 의해 제거하여 황색 케이크를 얻었다(건조 중량 3.0 g).
그 여과액을 교반한 얼음-물(200 ㎖)에 서서히 부었다. 형성된 침전물을 뷰크너(Buchner) 깔대기상에서 여과하여 물로 세척한 후 건조시켜 검상태(gummy)의 괴체를 얻었다. 이것을 가온하면서 디클로로메탄(50 ㎖) 중에 용해하였다. 냉각시 형성된 약간의 침전물을 제거하였다. TLC에 의해 이것이 3,4-시클로헥세노에스큘레틴이라는 것을 알아내었다. 그 여과액은 미량의 에스큘레틴과 함께 테트라아세틸 글리코사이드를 함유하였다.
상기 황색 케이크는 분말화하여 고온 디클로로메탄으로 추출하고, 에스큘레틴 잔류물(1.4 g)이 여과되는 현탁액은 장래 글루코시드화에 사용하기 위해 보관하였다. 이로부터 얻은 여과액을 전술한 디클로로메탄 추출물과 합하여 (무수) 황산마그네슘으로 건조시키고 회전 증발시킨 후, 옅은색 고체를 얻었다. 이것을 고온 메탄올 중에 용해하고 이로부터 재결정하여 순수한 테트라아세틸 화합물의 무색 결정을 소량(2.5 g, 29%) 얻었다.
메탄올 중의 나트륨 메톡사이드를 사용하여 탈아세틸화를 수행하였다. 새로운 분급분인 나트륨 1.0 g을 메탄올(100 ㎖) 중에 용해시켰다.
테트라아세틸 화합물(2.5 g)을 메탄올(50 ㎖) 중에 용해하고 나트륨 메톡사이드 용액(20 ㎖)으로 처리하였다. 탈아세틸화가 전개된 후 기준선 물질(용매 - 에틸아세테이트/톨루엔, 3:1)만이 남을 때까지 TLC처리 하였다. 분석 등급 앰버라이트(Amberlite) 1R120(H+)의 분획을 첨가하여 메탄올성 용적의 pH를 6.5로 만들고, 산으로 처리한 후 세척하였다. 그 상청액을 수지로부터 경사 분리하고 수지를 메탄올로 세척하였다(3 × 10 ㎖). 메탄올을 30℃ 내지 40℃에서 회전 증발시켜 제거하고 잔류 고체를 메탄올/물(1.5 g, 86%)로부터 재결정하였다.
실시예 6 : 3-벤질-4-메틸 에스큘레틴-β -D-글루코피라노사이드의 합성
3-벤질-4-메틸 에스큘레틴(실시예 2)(4.25 g, 15.6 mmol)을 수산화칼륨 수용액(10% w/v KOH(29 mmol) 16.5 ㎖) 중에 교반하면서 용해시켰다. 즉시, 황색 고체인 칼륨염이 분리되었다. 아세톤(20 ㎖) 중에 용해된 α -아세토브로모글루코스(6.6 g, 16 mmol) 용액을 전술한 교반 용액에 첨가하였다. 아세톤(3 ㎖ 내지 4 ㎖)을 추가로 첨가하여 더욱 균질하게 하였다. 밝은 갈색 용액을 하룻밤동안(16 시간) 교반하였다. 얻어진 페이스트(paste)를 흡인 여과하여 잔류물을 흡인 건조시킨 후 실온에서 공기 건조시켰다. 테트라아세틸글루코사이드를 고온 클로로포름(3 × 30 ㎖)내로 추출시키고, 얻은 현탁액을 얼마 안 되는 침전물로부터 여과하였다. 클로로포름 용액을 저온의 탄산나트륨 희석(3%) 용액(3× 30 ㎖)으로 세척한 후, 물로 세척하였다. 무수 황산 마그네슘을 사용하여 유기상을 건조시키고 회전 증발시켜 백색고체를 얻었다. 이것을 고온 에탄올(100 ㎖) 중에 용해하고 하룻밤 동안 0℃로 냉각시켰다. 그 결정을 흡인 여과에 의해 제거하고 가압하였다. 진공 건조시킨 후 생성물 3.0 g(32%)을 얻었다. 실시예 5에서 기술한 대로, 메탄올성 나트륨 메톡사이드를 사용하여 테트라아세틸글루코사이드(3.0 g)를 탈아세틸화하여, β -글루코사이드(1.8 g, 81.4%)를 얻었다.
실시예 7 : 3,4-시클로헥세노에스큘레틴 β -D-갈락토피라노사이드의 합성
3,4-시클로헥세노에스큘레틴(6.95 g, 30 mmol)을 수산화칼륨 수용액(10% w/v KOH(62.5 mmol) 35 ㎖) 중에 용해시켰다. α -아세토브로모갈락토스(13.6 g, 33 mmol)을 아세톤(36 ㎖) 중에 용해시키고 이 용액을 교반한 에스큘레틴 수용액에 첨가하였다. 균질한 용액을 얻기 위해서는 약간 더 많은 양의 아세톤을 첨가할 것을 요한다. 반응 혼합물을 10℃ 내지 15℃에서 하룻밤 교반하였다. 4 시간 후 침전이 시작되었다. 16 시간 후 그 현탁액을 여과하였다. 1 g 미만의 잔류물은 주로 변하지 않은 에스큘레틴을 나타내는 것으로서 이것을 제거하였다. 그 여과액은 저부의 점성상 및 상부의 수성층의 2상으로 이루어진다. 분리 후 저부의 점성상을 잘 교반한 얼음/물(250 ㎖) 중에 서서히 부어서 다량의 백색 침전물을 얻었다. 이것을 흡인 여과에 의해 제거하고 냉각수로 세척한 후 건조시켰다. 건조 고체를 디클로로메탄 중에 용해시켰다. TLC를 실시하여 테트라아세틸 갈락토사이드의 하나의 커다란 빠른 유동점과 에스큘레틴이 매우 소량이라는 것을 알아내었다.
반응 혼합물로부터 얻은 상부의 수성층을 30℃ 내지 40℃에서 회전 증발에 의해 농축하고 얼음물에 부었다. 그 생성물은 저부의 층에서 얻은 것보다 훨씬 적은 양이었으나 여전히 상당량의 목적 화합물을 함유하고 있었다. 침전된 고체를 흡인 여과에 의해 제거하고, 건조시킨 후 디클로로메탄 중에 용해하였다.
혼합된 디클로로메탄 용액을 탄산나트륨 희석 수용액(2 × 50 ㎖)으로 세척한 후, 물로 세척하였다. 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 30℃에서 회전 증발에 의해 용매를 제거하여 고화되지 않는 점성의 오일을 얻었다.
그 오일상의 테트라아세틸 갈락토사이드를 메탄올 중의 용액에 의해 탈보호시킨 후 실시예 5에서 기술한 바와 같이 메탄올성 나트륨 메톡사이드 용액(1% 용액 30 ㎖)을 첨가하였다. 메탄올을 증발시킨 후, 갈락토사이드는 백색 결정 괴체로 빠르게 고화되는 오일을 형성하였다(5.2 g, 44.8%).
실시예 8 : 3,4-시클로헥세노 에스큘레틴 β -D-글루큐로나이드의 합성
새롭게 증류된 퀴놀린(20 ㎖) 중의 3,4-시클로헥세노에스큘레틴(2.32 g, 10 mmol) 및 메틸 2,3,4-트리-O-아세틸 글루코피라노실 브로마이드 유로네이트(3.97 g, 10 mmol)의 교반한 용액에 새롭게 제조한 은(Ⅰ)산화물(1.86 g, 15 mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 빛이 들어가지 않게 하여 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 얻어진 슬러리를 흡인 여과하였으며 그 잔류물을 밝은 회색이 될 때까지 저온 아세톤으로 세척하였다. 교반한 저온 염산(200 ㎖, 2 M)에 서서히 여과기를 첨가하여 조밀한 회색 침전물을 얻었으며 이를 흡인여과에 의해 회수하고 더 많은 양의 2 M 염산(2 × 30 ㎖)으로 세척하여 그 잔류물을 흡인 건조시킨 후 상온의 진공 건조오븐에서 건조시켰다. 메탄올로부터 재결정하여 회백색 고체(0.82 g, 15%)를 얻었다.
아세틸화된 메틸 유로네이트를 메탄올 중에 용해하고 메탄올성 수산화나트륨 1/5몰비(95% 메탄올/5% 물)를 첨가하므로써 탈보호하였다. 5 시간동안 교반한 후, 회전증발에 의해 메탄올을 제거하였다. 물(10 ㎖)을 첨가하고 그 용액을 2 M 염산으로 중화시켰다. 60℃에서 회전 증발에 의해 물을 제거하였으며 잔류물을 현탁시키고 1 시간동안 아세톤 중에 교반하였다. 그 현탁된 글루큐로나이드를 흡인 여과에 의해 제거하고 회전 증발에 의해 아세톤을 제거하여 밝은 갈색의 무정형 분말을 얻었다(0.41 g, 65% ).
3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-크실로피라노사이드 및 3,4-시클로헥세노에스큘레틴-N-아세틸-β -D-글루코스아미나이드
전술한 바와 유사한 과정을 사용하여, 순수한 상태로 분리되지는 않지만 다음과 같은 글리코사이드를 합성하였다.
3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-크실로피라노사이드
3,4-시클로헥세노에스큘레틴-N-아세틸-β -D-글루코스아미나이드
실시예 9 : 3,4-시클로헥세노에스큘레틴-6(7)-인산의 합성
피리딘(5 ㎖) 및 톨루엔(10 ㎖) 중의 3,4-시클로헥세노에스큘레틴(2.32 g, 10 mmol)의 교반한 용액에 염화포스포릴(1.84 g, 12 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 그 교반한 용액을 실온으로 가온하고 이어서 오일 배쓰에서 2 시간 동안 60℃에서 가열하였다. 냉각한 반응 혼합물을 잘 교반하면서 물에 붓고 2 M 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 알칼리성(pH 12)으로 만들었다.
5℃에서 하룻밤 방치한 후, 디클로로메탄 추출에 의해 톨루엔을 제거하고 염산으로 수성 층의 pH를 8로 하였으며 50℃ 내지 60℃에서 회전 증발시켜 연황색 잔류물을 얻었다. 이것을 고온수 중에 용해하고 0℃로 냉각하여 포스페이트의 나트륨염을 회백색 분말로 분리하였다. TLC(용매 - 에틸 아세테이트/톨루엔, 3:1)을 통해 기준선 물질(u.v. 흡수)이 주된 물질이나 약간의 오염용 에스큘레틴이 여전히 잔류한다는 것을 알아내었다. 이는 반복하여 에테르로 추출하므로써 대부분 제거될 수 있다.
실시예 10 : N(-7(6)-옥타노일옥시-6(7)-히드록시쿠마린-4-아세틸)글리실글리신의 합성
6,7-디히드록시쿠마린-4-아세트산(2.04 g, 10 mmol)을 과량의 무수 아세트산(10 ㎖) 중에 용해시키므로써 아세틸화하고, 약간 가온하면서 황산(d=1.84) 두세 방울을 첨가하였을 때 약한 발열반응이 일어났다. 추가로 40℃에서 30 분간 가열한 후, 반응 혼합물을 냉각시키고 얼음/물(100 ㎖)에 부었다. 서서히 형성되는 백색 고체를 흡인 여과에 의해 제거하고 저온수로 세척한 후 상온의 진공 오븐에서 건조시켰다.
생성물(디아세테이트)를 재결정하지 않고 염화티오닐(10 ㎖)를 첨가하고 1 시간 동안 다시 혼합하므로써 산 클로라이드로 전환시켰다. 과량의 염화티오닐을 감압하에서 제거하고 마른 에테르로 반복하여 증발시키므로써 미량의 염화티오닐도 제거하였다.
오일상의 산 클로라이드를 테트라히드로푸란(20 ㎖) 중에 직접 용해시키고 염기로 작용하도록, 물(20 ㎖) 및 피리딘(2 ㎖)의 혼합물 중에 용해시킨 글리실글리신(1.32 g, 10 mmol)의 잘 교반한 용액내에 저속 스트림으로 도입시켰다. 3 시간 후, 그 용액을 회전 증발시켜서 테트라히드로푸란을 제거하고 농축 암모니아(5 ㎖)를 첨가하여 탈보호시켰다. 1 시간 후, 탈아세틸화를 완결하고 50℃ 내지 60℃의 감압하에서 회전 증발에 의해 용매를 제거하였다. 생성물을 과량의 글리실글리신 및 염으로 오염시켰으므로 메탄올/물로부터 재결정하여 생성물 N(6,7-디히드록시쿠마린-4-아세틸)글리실글리신을 얻었다.
에스테르화
글리시리글리신 결합체(1.68 g, 5 mmol)을 피리딘(10 ㎖) 중에 용해하였으며 이 교반한 용액에 염화옥타노일(0.9 g, 5.5 mmol)을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 2 시간동안 교반하고 이어서 효과적으로 교반하면서 얼음/물(90 ㎖) 및 농축 염산(10 ㎖)의 혼합물에 부었다. 분리된 검상태(gummy)의 고체를 에틸아세테이트 중에 용해하고 농축 염화나트륨 용액으로 세척하였다. 유기 상을 분리하여, 건조시키고(무수 황산나트륨), 회전 증발시킨 후 친수성 에스큘레틴의 옥타노에이트 에스테르로 이루어진 왁스형 고체를 얻었다.
N(7(6)-부티릴옥시-6(7)-히드록시쿠마린-4-아세틸)글리실글리신
유사한 과정을 사용하되, 에스테르화 단계에서 부티릴클로라이드(0.58 g, 5.5 mmol)를 치환하여 대응하는 부티레이트 에스테르(N(7(6)-부티릴옥시-6(7)-히드록시쿠마린-4-아세틸)글리실글리신)을 얻었다.
실시예 11 : 실시예 1 내지 10에서 전술한 것과 같은 방법으로 합성한 화합물을 사용하는 시험 과정
글리코사이드 또는 변성된 에스큘레틴의 기타 유도체를 혼입시킨 한천 플레이트상에서의 세균학적 연구를 실시하였다. 그람 양성 스트렙토코시(sterptococci)와 관련 유기체를 구별하고, 에스큘린-양성 콜로니를 가시화하기 위해 3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-글루코사이드를 사용하는 이하의 설명은 이들 신규 화합물의 포괄적인 용도를 설명하는 데 사용된다.
다음과 같이 에스큘린 한천을 제조하였다. 콜롬비아 한천(45 g), 시트르산 철암모늄(0.5 g) 및 에스큘린(1.0 g)을 증류수(1 ℓ )중에 비등시키므로써 용해한 후 이 배지의 pH를 7.5로 조절하고 그 배지를 116℃에서 10 분간 고압증기멸균법에 의해 멸균시켰다. 그 배지를 55℃로 냉각시킨 후, 20 ㎖ 부피로 따라내었다. 에스큘린 대신 신규한 글루코사이드(CHE-β -D-gluc)(0.5 g)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 유형으로 3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-글루코사이드 함유 한천을 제조하였다.
광범위한 임상학적 시료 및 환경적 시료로부터 회수한 엔테로코시(enterococci)의 균주 150 개를 Facklam 및 Collins(J. Clinical Microbiol. 27 731-734(1989))의 개요를 사용하여 동정하였다. 이들 균주 각각을 생리학적 염수 중에서 접종하여 1 ㎖당 약 108개의 유기체 종균을 생성하였다. 이는 맥팔래인 표준물(McFarlane Standard) 0.5와의 비교를 통해 얻어진다. 다중점 접종기(Denley)를 사용한 후, 각각의 현탁액 1 ㎕를 양 시험 배지상에 접종하여 플레이트 하나마다 12 이하의 균주를 접종시켰다. 엔테로코시(enterococci)외에도 40 개의 스트렙토코시(streptococci) 및 리스테리아 종(Listeria sp.)의 균주 12개를 선별 회수하고 지시에 따른 상보성 시험에서 API 32 STREP을 사용하여 동정하였다. 이는 또한 동일한 유형으로 접종하였다. 엔테로박테리아시아 균주 250 개를 광범위한 공급원으로부터 회수하고 그것의 실체를 API 20 E 시스템(Biomerieux)에 의해 확인하였다. 이들을 전술한 바와 같이, 에스큘린 및 CHE-β -D-글루코사이드 배지 둘 모두에 대해 접종하였다.
마지막으로, 엔테로코시의 균주 7 개 및 스트렙토코시의 균주 2 개를 런던에 소재한 유형 배양물의 국립 회수기관(NCTC)으로부터 얻었다. 이들은 다음과 같다.
엔테로코커스 파에시엄(Enterococcus faecium) NCTC 7171, 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) NCTC 755, 엔테로코커스 갈리나륨(Enterococcus gallinarum) NCTC 11428, 엔테로코커스 먼티(Enterococcus mundtii) NCTC 12343, 엔테로코커스 카셀리플라브스(Enterococcus casseliflavus) NCTC 12341, 엔테로코커스 듀란스(Enterococcus durans) NCTC 8307, 엔테로코커스 라피노시스(Enterococcus raffinosis) NCTC 12192, 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae) NCTC 8181 및 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis) NCTC 8177. 10 개의 균주로 된 현탁액을 1 ㎖당 108 개의 유기체를 사용하여 전술한 바와 같이 제조하고 표준 방법에 의해 멸균 증류수 중에 희석하여 1 ㎖당 약 1 개의 유기체로 이루어진 현탁액을 생성하였다. 이어서, 각각의 현탁액 3 × 100 ㎖ 부피를 표준 여과법을 사용하는 3 개의 셀룰로스 니트레이트 멤브레인 여과기(Sartorius 제품) 상에서 여과하였다. 이 여과기 중의 하나를 CHE-β -D-글루코사이드 플레이트상에 놓고, 두 번째 것을 에스큘린의 플레이트상에 놓았으며, 세 번째 것을 콜롬비아 한천 플레이트 상에 기질 없이 놓았다. 모든 플레이트를 공기 중에 정확히 18시간 동안 37℃에서 배양시키되, 단 공기 중에서 배양된 스트렙토코시로 접종시킨 플레이트는 5% 이산화탄소로 보충시켰다. 배양 후, 플레이트에 검은색 혹은 갈색의 콜로니가 존재하는가를 조사하고 멤브레인 여과기 상에서 콜로니를 계수하였다.
결과
본 연구에 사용된 모든 균주는 CHE-β -D-글루코사이드 배지와 에스큘린 함유 배지상에서 모두 잘 증식하였다. 이 두 기질은 한천내 확산의 측면에 있어서, 매우 상이하였다. 에스큘린을 가수분해하면 넓게 확산되는 검은색 착물을 얻는 반면, CHE-β -D-글루코사이드를 가수분해하면 박테리아의 증식이 크게 제한되는 검은색 착물을 형성하였다. 표 1로부터 CHE-β -D-글루코사이드의 가수분해는 에스큘린의 가수분해와 매우 밀접한 상관관계를 이룬다는 것을 알 수 있다. 이는 특히 그람 양성 박테리아의 경우에 그러하였다(시험된 모든 균주가 두 기질간에 완전한 상관관계를 보임). 예컨대, 150 개의 엔테로코시와 12 개의 리스테리아 종의 균주 전부가 CHE-β -D-글루코사이드 및 에스큘린을 둘다 분해하여 검은색 균주를 생성하였다. 시험된 그람 음성 박테리아에 대해서는 이들 두 기질간에 탁월한 상관 관계가 얻어졌다. 이에 대한 하나의 예외는 4 개의 균주(10%)가 CHE-β -D-글루코사이드를 가수분해하나 에스큘린을 가수분할 수 없는 것으로 보이는 E. coli인 경우이다.
멤브레인 여과 실험에서는, 엔테로코시의 NCTC 균주 및 에스. 보비스(S. bovis)의 균주는 모두 CHE-β -D-글루코사이드 배지 상에서 검은색 콜로니를 생성하였다. 에스큘린 배지상에 놓인 여과기 상에서 모든 균주는 연갈색 확산성 착물을 형성하였다. 이 착물은 여과기의 표면을 가로질러 확산되며 또한 상기 멤브레인 아래의 한천내로도 확산된다. 시험된 어떠한 종류의 유기체에 대해서도 CHE-β -D-글루코사이드, 에스큘린 또는 브레인 하트 인퓨죤 상의 콜로니 계수 간에는 어떠한 통계학적 차이도 없었다(데이타는 도시하지 않았음). 에스. 아갈락티애(S. agalactiae) NCTC는 음성 대조군으로서 사용되었으며 어떠한 물질의 가수분해도 입증하지 않았다.
CHE-β -D-글루코사이드의 주된 잇점은 방출된 시클로헥세노에스큘레틴이 철과 결합하는 경우에 얻어지는 검은색 착물은 매우 불용성이고 한천 배지를 통해 확산되지 않는다는 것이다. 결과적으로, 혼합 배양액 내에서 쉽게 구별될 수 있는 뚜렷한 검은색 콜로니가 형성되었다. 대조적으로 에스큘린이 가수분해되는 경우, 방출된 에스큘레틴은 철과 결합하여 갈색/검은색 착물을 형성하는데 이는 한천을 통해 빠르게 확산된다. 이 확산 현상은 혼합 배양액 중에서 에스큘린-양성 콜로니를 구별하는 것을 어렵게 만들 수 있다. 두 기질간의 차이는 CHE-β -D-글루코사이드 배지 상의 리스테리아 모노시토겐(Listeria monocytogenes)(NCTC 11994)의 균주 및 전형적인 에스큘린 계 선택 한천을 보여주는 도 1에서 두드러진다. 또한 CHE-β -D-글루코사이드를 사용하는 경우 검은색 착물의 확산이 일어나지 않는다는 것은 다량의 균주를 각각의 플레이트에 도포할 때 다중점 접종법을 사용하여 박테리아를 동정하는 경우에 상당히 유리하다.
본 연구로부터 밝혀진 CHE-β -D-글루코사이드의 또 다른 매우 유용한 속성은 파에칼 스트렙토코시/엔테로코시(faecal streptococci/enterococci)에 대한 멤브레인 여과 연구에서 효과적으로 사용된다. 이를 위해 에스큘린은 오랫동안 잠재적으로 유용한 기질로서 간주되어 왔다. 그러나, 에스큘레틴 착물의 확산과 연관한 문제는 많은 노력을 해왔음에도 불구하고 해결되지 않았었다(문헌 : Daoust 등 Applied Microbiology 29 584-589(1975)). 이러한 확산의 문제는 특히 다량의 엔테로코시가 존재하며 전체 멤브레인이 황갈색 에스큘레틴-착물로 염색되는 경우 특히 심각하다(문헌 : Brodsky 등 Applied and Environmental Microbiology 31 695-699(1976)). CHE-β -D-글루코사이드를 기질로서 사용하는 경우, 엔테로코시는 멤브레인 상에서 뚜렷한 검은색 콜로니로 증식하는데 이는 혼합 개체군내에서 쉽게 구별될 수 있다. 이는 콜로니 내에 형성된 검은색 착물이 상기 멤브레인 및 한천 내로는 확산될 수 없기 때문이며, 그러므로 형성된 어떤 색이라도 실제 콜로니에 대해서는 크게 제한된다. 에스큘린의 경우, 형성된 착물이 작을수록 멤브레인을 통해 한천내로 쉽게 확산되며 갈색화는 광범위하게 확산되므로 시각적으로 불량하게 보인다. 두 기질간의 이같은 차이는 도 2에서 두드러진다. 에스큘린의 가수분해는 철염의 존재하에서 가수분해하는 도중, 천연 기질의 형광성이 사라지는 것을 모니터하므로써 빠르게 감지될 수 있다(문헌 : Edberg 등 J. Clinical Microbiology 4 180-184(1976)). 에스큘린과는 달리, CHE-β -D-글루코사이드는 시클로헥세노에스큘레틴 분자의 7-히드록실기의 치환으로 인해 형광을 발하지 않는다. 그러나, 이 기질이 가수분해되는 경우, 방출된 시클로헥세노에스큘레틴은 형광을 발한다. 그러므로, CHE-β -D-글루코사이드를 사용한 형광 분석에 대한 대안의 방법은 철염이 존재하지 않는 경우에 형광 발생을 찾는 것이다. 결론적으로, CHE-β -D-글루코사이드는 철의 존재하에서 β -D-글루코시다제에 의해 가수분해될 때 검은색의 비확산성 생성물을 생성하는 고도로 유용한 기질이다. 이 기질은 비억제성으로 보이며 그것의 합성은 비교적 간단하다.
[표 1a]
다양한 박테리아에 의한 에스큘린 및 CHE-글루코사이드의 가수분해
[표 1b]
[표 1c]
[표 1d]
실시예 12 : 혈액 한천 내애서의 CHE-글루코사이드
시클로헥세노에스큘레틴-글루코사이드(CHE-글루코사이드)를 용혈현상을 일으키는 유기체 및 글루코시다제의 감지 및 동정을 위해 혈액 한천 베이스내로 혼입하였다. 유기체를 혐기적으로 배양시키는 경우, CHE-글루코사이드 혈액 한천 염기를 사용하여 글루코시다아제를 생성하는 박테리아 프라질리스(Bact. fragilis)와 같은 혐기성 박테리아의 존재를 감지할 수 있다.
콜롬비아 한천 염기 41 g(Lab 1)의 무게를 달아, CHE-글루코사이드 0.5g, 글루콘산 제이철 0.95 g 및 아세트산 아연 0.05 g과 함께 플라스크에 넣었다. 물 1ℓ 를 첨가하여, 혼합한 후, 121℃에서 15 분간 고압증기멸균(autoclave)시켰다. 플라스크를 47℃로 냉각시키고 말 혈액 100 ㎖를 첨가하여 혼합한 후 페트리 접시에 부었다.
시험된 박테리아 :
스트렙트. 피라노겐스(Strept. pyrogenes) - 3개의 균주
스트렙트. 밀레리(Strept. milleri) - 1 개의 균주
엔테로코시 종들(Enterococci spp.) - 5 개의 균주
그룹 C의 스트렙토코시(Group C Streptococci) - 2개의 균주
스트렙. 산구이스(Strep. sanguis) - 1 개의 균주
슈도. 아에루기노사(Ps. aeruginosa) - 1 개의 균주
이. 콜리(E. coli) - 1 개의 균주
클로스트. 페르프린젠스(Clost. perfringens) - 1 개의 균주
박테리아. 프라질리스(Bact. fragilis) - 1 개의 균주
결과 :
다음 균주들을 검은색 콜로니를 형성하였다.
엔테로코시의 모든 균주, 스트렙. 산구이스, 스트렙트. 밀레리 그룹 F, 박테리아. 프라질리스
스트렙트 피로겐스 모든 균주, 군 B, 군 C 및 군 F에 속하는 스트렙토코시 및 일부 엔테로코시는 약간의 용혈현상을 보였다.
요약하면, 혈액 한천내에 혼입된 CHE-글루코사이드는 용혈 패턴을 방해하지 않고 글루코시다제 효소를 확실하게 감지하였다. 이러한 2 종의 지시약 및 적당히 선택적인 시약을 사용하면, 이들 중요한 병원균을 분리할 수 있으며 일차 배양 플레이트상에서 잠정적으로 동정할 수 있다.
Claims (19)
- 하기 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그것의 염이나 수화물:화학식 I상기 식 중,R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, 히드록실, 할로겐 원자 또는 (C1-C6)알킬기를 나타내고,R3 및 R4는 각각 독립적으로 (C1-C8)알킬 또는 (C6 또는 C10)아릴(C1-C8)알킬이거나 또는 화학식 -CH2(CH2)nCOX(식 중, n은 0 내지 3의 수이고, X는 히드록실기 또는 또 다른 친수성기를 나타냄)의 기를 나타내고,R4는 대안적으로 수소 원자를 나타내고, R3은 대안적으로 화학식 -COR(식 중, R은 (C1-C8)알킬, (C6 또는 C10)아릴(C1-C8)알킬 또는 (C5-C8)시클로알킬기를 나타냄)의 아실기를 나타내고,단, R3 및 R4의 사이에는 세 개 이상의 탄소 원자가 존재하거나, 또는R3 및 R4는 그들이 결합된 탄소 원자와 함께 (C5-C8)시클로알켄 고리를 형성하고,Y 및 Z 중의 하나는 α -D-글루코스, α -D-갈락토스, α -D-크실로스, α -D-글루큐론산, N-아세틸-α -D-글루코스아민, β -D-글루코스, β -D-갈락토스, β -D-크실로스, β -D-글루큐론산, N-아세틸-β -D-글루코스아민, 및 포스페이트기 및 카르복실레이트(R5COO-)기(식 중, R5는 (C1-C10)알킬기를 나타냄)로 구성된 군으로부터 선택되는 기를 나타내고, Y 및 Z 중의 다른 하나는 수소 원자를 나타낸다.
- 제1항에 있어서, 독립적으로 또는 임의의 상용성 조합으로서:R1이 염소 또는 수소이고,R2가 염소 또는 수소이고,R3이 (C1-C4)알킬 또는 벤질이고,R4가 (C1-C4)알킬이거나 또는 화학식 -CH2(CH2)nCOX(식 중, n은 0 내지 3의 수이고, X는 히드록실기 또는 이하의 친수성기들,-NHCH2CONHCH2CO2H-NHCH2CONHCH2CONHCH2CO2H-NHCH2CH2SO3H-N(CH2CO2H)2 또는중 하나를 나타냄)이고,R3 및 R4는 그들이 결합된 탄소원자와 함께 (C5-C8)시클로알켄 고리를 형성하는 것인 화합물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-갈락토사이드,3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-글루코사이드,3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-글루큐로나이드,3-벤질-4-메틸에스큘레틴-β -D-글루코사이드,3,4-시클로헥세노에스큘레틴-N-아세틸-β -글루코스아미나이드,3,4-시클로헥세노에스큘레틴-β -D-크실로사이드,3-n-부틸-4-메틸에스큘레틴-β -D-갈락토사이드,3-n-부틸-4-메틸에스큘레틴-β -D-글루코사이드, 및3,4-시클로헥세노에스큘레틴-6(7)-인산으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물.
- 6 위치 또는 7 위치에서 임의로 보호된 하기 화학식 Ⅱ의 화합물을 글리코실화, 인산화 및/또는 에스테르화하는 유도체화 단계 및 이어서, 이렇게 하여 얻은 화학식 Ⅰ의 화합물을 화학식 Ⅰ의 또 다른 화합물로 전환시키는 임의 단계를 포함하는 제1항에 기재한 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법 :화학식 Ⅱ
- 화학식 Ⅰ의 화합물 및 임의로 미생물학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 기질을 포함하는, 시료 중의 미생물을 감지 및/또는 동정하기 위한 조성물로서, 상기 미생물은 엔테로코커스(Entercoccus), 리스테리아(Listeria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 시트로박터(Citrobacter), 엔테로박터(Enterobacter), 에스케리치아(Escherichia), 하프니아(Hafnia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 프로비덴시아(Providencia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 쉬겔라(Shigella) 및 예르시니아(Yersinia)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 기질이 증식 지지 배지인 것인 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 증식 지지 배지는 고체, 반고체 또는 액체인 것인 조성물.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 증식 지지 배지는 한천인 것인 조성물.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 증식 지지 배지는 1 종 이상의 필수 영양소, 미네랄, 비타민 및/또는 항생제를 더 포함하는 것인 조성물.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재한 조성물을 함유하는 배양 접시.
- 하기 (a)단계 및 (b)단계를 포함하여 시료 중의 미생물을 감지 및/또는 동정하는 방법 :(a) 화학식 Ⅰ의 화합물을 함유하는 증식 지지 배지 상에서 시료로부터 분리한 미생물을 증식시키는 단계, 및(b) 화학식 Ⅰ의 화합물을 가수분해한 후 동정 가능한 유색 마커 또는 형광마커의 방출을 감지하는 단계.
- 제11항에 있어서, 상기 시료는 생물학적 시료, 식이성 물질, 물 또는 기타 음용 가능한 액체인 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 침, 뇨, 혈액, 분변, 위 내용물 또는 생검(biopsy) 시료인 것인 방법.
- 화학식 Ⅰ의 화합물을 함유하는 증식 배지를 포함하는 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 증식 지지 배지는 1 종 이상의 필수 영양소, 미네랄, 비타민 및/또는 항생제를 더 포함하는 것인 조성물.
- 제8항에 기재한 조성물을 함유하는 배양 접시.
- 제9항에 기재한 조성물을 함유하는 배양 접시.
- 제15항에 기재한 조성물을 함유하는 배양 접시.
- 배양 접시 및 화학식 Ⅰ의 화합물을 함유하는 증식 배지를 포함하는 키트.
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