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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie enzymatischer Substrate
und deren Anwendungen insbesondere zur Detektion von Mikroorganismen.
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Die
Detektion und Identifizierung von Bakterien ist in der Medizin oder
in der Nahrungsmittelindustrie sehr wichtig, da bekanntermaßen diese
Mikroorganismen sich nicht nur als pathogene Agenzien erweisen können, sondern
auch auf bestimmte Arten einer Kontamination hinweisen können.
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Neuere
Verfahren, die mit diesem Ziel entwickelt wurden, machen von der
Verwendung farbiger oder fluoreszierender Verbindungen Gebrauch,
und die Verwendungen dieser Verbindungen wurden beispielsweise in
den Übersichtartikeln
von M. Manafi et al., Microbiological Reviews, 55(3), S. 335–348, 1991,
oder kürzlicher,
M. Manafi, De Ware(n) Chemicus, 28, S. 12–17, 1998 beschrieben.
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Im
Allgemeinen können
vier Gruppen von Verbindungen unterschieden werden:
- – fluoreszierende
Marker, wie bspw. Akrindinorange, die ein Anstieg in der Fluoreszenz
hervorrufen, wenn der Marker an Nukleinsäuren oder an Proteine der Zellen
der Mikroorganismen absorbiert;
- – pH-abhängige Indikatoren,
wie bspw. Akridin oder 7-Hydroxycumarin, die in Abhängigkeit
des pH-Wertes und daher in Abhängigkeit
der biochemischen Aktivität
der Mikroorganismen in der Intensität oder im Farb- bzw. Fluoreszenzspektrum
variieren;
- – Verbindungen,
die gegenüber
der oxido-reduktiven Natur eines Mediums sensitiv sind, wie bspw.
Methylenblau, und welche aufgrund der Wirkung eines reduzierenden
Mediums eine Farbe erzeugen;
- – farbige
oder fluoreszierende Substrate von Enzymen, die jeweils eine Farbe
oder eine Fluoreszenz aufgrund einer hydrolytischen Wirkung in Gegenwart
eines Enzyms erzeugen, welches für
einen Mikroorganismus oder eine Gruppe von Mikroorganismen spezifisch
ist.
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In
letzterer Kategorie wurden eine gewisse Anzahl von Substraten beschrieben,
die insbesondere die Detektion von β-D-Glucosidase oder β-D-Galactosidase ermöglichen,
welche wichtige taxonomische Marker für Mikroorganismen darstellen,
und insbesondere für
Enterobacteriaceae. Bezüglich
dieser Substrate können bspw.
Ortho-Nitrophenyl-Derivate erwähnt
werden, die nach Hydrolyse gelbes o-Nitrophenol produzieren, oder fluoreszierende
Substrate, wie bspw. Derivate von Fluoreszin oder von 4-Methylumbelliferon,
welche einen fluoreszierenden Marker produzieren. Eine beträchtliche
Einschränkung
dieser Substrate ist das Phänomen
der Diffusion in das Kulturmedium, wodurch es schwerer wird, zwischen
der Kolonie und einem Hintergrund zu unterscheiden.
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Um
dieses Problem zu lösen,
wurden andere Substrate eingesetzt, die nach der Hydrolyse zu einem unlöslichen
Produkt führen.
Diese Substrate bleiben um die Bakterienkolonie herum lokalisiert,
ohne in den Kulturträger
zu diffundieren, was die Auswertung des Tests erleichtert.
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Unter
diesen Substraten wurden Indoxylderivate (siehe bspw. Kodaka et
al., J. Clin. Microbiol., 33, S. 199–201, 1995 oder die Patente
US 5,358,854 und
US 5,364,767 ) oder Äsculetinderivate
(siehe bspw.
WO 97/41138 )
entwickelt. Zum einen steigert die schwierige Synthese die Kosten
extrem, was die Entwicklung industrieller Anwendungen in großem Maßstab beschränkt, und
darüber
hinaus sind diese Substrate sensitiv gegenüber den Inkubationsbedingungen
des Mediums. Zweitens ist die Notwendigkeit, einen Komplexbildner
auf Eisenbasis zu dem Medium hinzuzufügen, um eine Farbreaktion zu
erzielen, für
bestimmte Mikroorganismen ein Problem, da dies deren Stoffwechsel
stören
kann, insbesondere derjenigen, die untersucht wurden.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Familie enzymatischer
Substrate, die die oben erwähnten
Nachteile nicht aufweisen, da die Synthese dieser Verbindungen einfach
auszuführen
ist, die Substrate nach der Hydrolyse unlöslich sind, sie nicht in das
Medium diffundieren und nicht die Hinzufügung eines Komplexbildners
wie bspw. Eisen benötigen
oder besondere Oxidations-Reduktions-Bedingungen.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Familie von Verbindungen
der allgemeinen Formel (I) zu beschreiben:
in welcher
X ein mit
einer Phenylgruppe substituiertes Stickstoff- oder Kohlenstoffatom darstellt, wobei
die Phenylgruppe wahlweise in meta- oder para-Position substituiert
ist,
Y und Z ein Wasserstoffatom darstellen, wenn X ein Kohlenstoffatom
darstellt, oder Y und Z gemeinsam eine Ether-, Thioether- oder eine
Amin-Bindung darstellen, wahlweise substituiert mit einer Alkyl-
oder Arylgruppe;
R
1 und R
2 jeweils
unabhängig
voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich
sein können,
oder R
1 und R
2 gemeinsam
einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring
darstellen;
R
3 und R
4 jeweils
unabhängig
voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich
sein können;
R
eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym
hydrolysierbar ist.
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Die
Enzyme, die in der vorliegenden Erfindung von Interesse sind, sind
Enzyme, deren Vorliegen eine Information bereitstellt, durch welche
die Detektion und/oder Identifizierung und/oder Quantifizierung
von einem oder mehreren Mikroorganismen oder eines Analyten ermöglicht wird,
wie bspw. einem Protein, einem Peptid oder einer Nukleinsäure. Insbesondere
ist das Enzym aus der Familie der -Osidasen wie bspw. β-Glucuronidase, β-Galactosidase,
6-Phosphogalactohydrolase, α-Galactosidase, α-Amylase, α-Glucosidase, β-Glucosidase
oder Hexosaminidasen, wie bspw. N-Acetyl-β-glucosaminidase oder N-Acetyl-β-galactosaminidase,
oder aus der Familie der Esterasen, der Lipasen, der Phosphatasen,
der Sulfatasen, der DNasen, der Peptidasen und der Proteasen. Vorzugsweise
ist das Enzym aus der Familie der -Osidasen, wie bspw. β-D-Glucosidase, β-Glucuronidase,
oder β-D-Galactosidase,
oder aus der Familie der Sulfatasen, Phosphatasen oder Esterasen.
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Die
Gruppe R ist als eine Funktion des zu detektierenden Enzyms ausgewählt. R ist
bspw. ein Rest vom Typ eines α-
oder β-Zuckers,
wie bspw. die Derivate der Xylose, Glucose, Galactose, Glucuronsäure, Glucosamin
oder ein Phosphat, ein Sulfat, ein Carboxylat (R6COO–),
in welchem R6 eine Alkylgruppe mit 1 bis
16 Kohlenstoffatomen ist, ein Nukleotid oder ein Peptid. Die Gruppe
R ist vorzugsweise β-D-Glucose
oder β-D-Galactose, β-D-Glucuronat,
ein Phosphat, ein Sulfat oder ein Acetat.
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Wenn
R
1 und R
2 gemeinsam
einen fusionierten Benzolring darstellen, ist die folgende Struktur
(Ia) beabsichtigt, welche die entwickelte Formel für R
1 und R
2 zeigt:
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Wenn
Y und Z gemeinsam eine Ether-Bindung darstellen, ist eine Bindung
wie in der allgemeinen Formel (Ib) dargestellt beabsichtigt:
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Wenn
Y und Z gemeinsam eine Thioether-Bindung darstellen, ist eine Bindung
wie in der allgemeinen Formel (Ic) dargestellt, beabsichtigt:
-
Wenn
Y und Z gemeinsam eine Amin-Bindung darstellen, die wahlweise mit
einer Aryl- oder Alkylgruppe substituiert ist, ist eine Bindung
wie in der allgemeinen Formel (Id) dargestellt, beabsichtigt:
in welcher A eine Aryl- oder
Alkylgruppe darstellt.
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Besondere
Substrate der allgemeinen Formel (I) sind in den allgemeinen Formeln
(II), (III), (IVa), (IVb) und (IVc) wie nachstehend gezeigt wiedergegeben:
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Die
allgemeine Formel (II), in welcher,
R1 und
R2 jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F,
I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder
R1 und R2 gemeinsam
einen fusionierten Benzolring darstel len, der wahlweise substituiert
sein kann. R1 und R2 stellen
vorzugsweise einen fusionierten Benzolring dar, der nicht substituiert
ist,
R3 und R4 jeweils
unabhängig
voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich
sein können.
Vorzugsweise stellen R3 und R4 H
dar,
R5 H, NO2,
CF3, CN, OCH3, F,
I, Cl, Br, SO3H, oder CO2H
in meta- oder para-Position darstellt. R5 stellt
vorzugsweise H dar,
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die
O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist. Insbesondere stellt R
einen Rest vom Typ eines α-
oder β-Zuckers
dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose,
oder ein Acetat oder ein Sulfat.
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Die
allgemeine Formel (III), in welcher,
R1 und
R2 jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F,
I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder
R1 und R2 gemeinsam
einen fusionierten Benzolring darstellen, der wahlweise substituiert
sein kann. R1 und R2 stellen
vorzugsweise einen fusionierten Benzolring dar, der nicht substituiert
ist,
R3 und R4 jeweils
unabhängig
voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich
sein können.
Vorzugsweise stellen R3 und R4 H
dar,
R5 H, NO2,
CF3, CN, OCH3, F,
I, Cl, Br, CO2H oder SO3H,
in meta- oder para-Position darstellt. R5 stellt
vorzugsweise H dar,
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die
O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist. Insbesondere stellt R
einen Rest vom Typ eines α-
oder β-Zuckers
dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose.
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Die
allgemeine Formel (IVa), in welcher,
R1 und
R2 jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F,
I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder
R1 und R2 gemeinsam
einen fusionierten Benzolring darstellen, der wahlweise substituiert
sein kann. Vorzugsweise stellt R1 H und
R2 Cl dar,
R3 und
R4 jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F,
I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise
stellen R3 und R4 H
dar,
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung
durch ein Enzym hydrolysierbar ist. R stellt insbesondere einen Rest
vom Typ eines α-
oder β-Zuckers
dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose
oder ein Acetat oder ein Sulfat.
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Die
allgemeine Formel (IVb), in welcher,
R1 und
R2 jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F,
I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder
R1 und R2 gemeinsam
einen fusionierten Benzolring darstellen, der wahlweise substituiert
sein kann. Vorzugsweise stellt R1 H und
R2 Cl dar,
R3 und
R4 jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F,
I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise
stellen R3 und R4 H
dar,
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung
durch ein Enzym hydrolysierbar ist. R stellt insbesondere einen
Rest vom Typ eines α-
oder β-Zuckers
dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose
oder ein Acetat oder ein Sulfat.
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Die
allgemeine Formel (IVc), in welcher,
A eine Aryl- oder Alkylgruppe
darstellt,
R1 und R2 jeweils
unabhängig
voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich
sein können,
oder R1 und R2 gemeinsam
einen fusionierten Benzolring darstellen, der wahlweise substituiert
sein kann. Vorzugsweise stellt R1 H und
R2 Cl dar,
R3 und
R4 jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F,
I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise
stellen R3 und R4 H
dar,
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung
durch ein Enzym hydrolysierbar ist. R stellt insbesondere einen
Rest vom Typ eines α-
oder β-Zuckers
dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose
oder ein Acetat oder ein Sulfat.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Synthese des enzymatischen
Substrats der allgemeinen Formel (I), in welchem eine Zwischenverbindung
hergestellt wird, die die allgemeine Formel (V) aufweist
in welcher,
X ein mit
einer Phenylgruppe substituiertes Stickstoff- oder Kohlenstoffatom darstellt, wobei
die Phenylgruppe wahlweise in meta- oder para-Position substituiert
ist,
Y und Z ein Wasserstoffatom darstellen, wenn X ein Kohlenstoffatom
darstellt, oder Y und Z gemeinsam eine Ether-, Thioether- oder eine
Amin-Bindung darstellen, wahlweise substituiert mit einer Alkyl-
oder Arylgruppe,
R
1 und R
2 jeweils
unabhängig
voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich
sein können,
oder R
1 und R
2 gemeinsam
einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring
darstellen,
R
3 und R
4 jeweils
unabhängig
voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich
sein können,
und
an das Hydroxyl eine Gruppe R angefügt wird, passenderweise eine
Schutzgruppe.
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Das
Anfügen
findet insbesondere über
eine Glycosylierungs-, Veresterungs- oder Phosphorylierungsreaktion
statt.
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Im
Falle der Glycosylierung ist es notwendig, die Hydroxylgruppen des
Zuckers zu schützen,
wie bspw. mit einer Acetylgruppe. Die tetra-acetylierten Derivate
des β-D-Glucosids
oder β-D-Galactosids
werden aus dem korrespondierenden α-Acetobromhexose-Derivat erhalten.
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Die
Deprotektion der Hydroxylgruppen des Zuckers wird – nach dem
Anfügen – in Gegenwart
eines alkalischen Agens durchgeführt,
wie bspw. Natriummethoxid in Methanol für ein acetyliertes Derivat.
Die Bedingungen für
die Glycosilierung werden durch Fachleute bestimmt, und insbesondere
durch die Wirkung des Kaliumhydroxids in Aceton.
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Die
Bildung von organischen Estern, wie bspw. Acetat, wird ausgeführt durch
das Reagieren lassen – bezüglich des
Derivats der allgemeinen Formel (V) – von Essigsäureanhydrid
in Pyridin unter kalten Bedingungen. Die Bildung eines Esters vom
Typ CH3(CH2)n COOR wird durchgeführt durch Reagieren lassen
eines Säurechlorids-Derivats
in einer Lösungsmittelmischung
vom Typ Pyridin/Dimethylformamid, wahlweise in Gegenwart eines Katalysators
wie 4-Dimethylaminopyridin.
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Die
Phosphatbildung wird durchgeführt
durch Behandeln des Derivats der allgemeinen Formel (V) in Gegenwart
von POCl3, in Gegenwart von Pyridin.
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Die
Sulfatbildung wird durchgeführt
durch Behandeln des Derivats der allgemeinen Formel (V) mit Chlorsulfonsäure in Pyridin
unter kalten Bedingungen. Die Substrate der vorliegenden Erfindung,
im Falle der Phosphate und Sulfate, liegen in Form eines Salzes
vor, wie einem Kalium- oder Natriumsalz.
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Vorzugsweise
wird eine Zwischenverbindung hergestellt, die irgendeiner der nachstehenden
Formeln (Va), (Vb) und (Vc) entspricht:
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Die
Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung zur Detektion und/oder
Identifizierung und/oder Quantifizierung von zumindest einem Mikroorganismus,
mit mindestens einem enzymatischen Substrat der allgemeinen Formel
(I) und einem Reaktionsmedium für
diesen Mikroorganismus oder diese Mikroorganismen.
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In
der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck „Reaktionsmedium" ein Medium bedeuten,
welches die Entwicklung zumindest einer enzymatischen Aktivität von zumindest
einem Mikroorganismus zulässt,
wie bspw. ein Kulturmedium.
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Das
Reaktionsmedium ist fest, halbfest oder flüssig. Der Ausdruck „festes
Medium" soll bspw.
ein Agarmedium bedeuten. Agar ist das übliche feste Medium in der
Mikrobiologie zur Kultivierung von Mikroorganismen, es ist jedoch
auch möglich,
Gelatine oder Agarose zu verwenden. Eine gewisse Anzahl an Zubereitungen sind
verfügbar,
wie bspw. Columbia-Agar, Trypcase-Soja-Agar, Mac Conkey-Agar, Sabouraud-Agar,
ferner diejenigen, die in „Livret
technique MILIEUX DE CULTURE" [Technisches
Handbuch KULTURMEDIEN] der Anmelderin beschrieben sind, oder, allgemeiner,
diejenigen, die im Handbuch der Mikrobiologischen Medien (CRC Press)
beschrieben sind.
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Das
Reaktionsmedium ist vorzugsweise ein Agar-Medium, welches zwischen
2 und 40 g/l, vorzugsweise zwischen 9 und 25 g/l Agar enthält.
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Die
Substrate der vorliegenden Erfindung können in einem breiten pH-Bereich
eingesetzt werden, insbesondere zwischen pH 5,5 und 10,0, und vorzugsweise
zwischen pH 6,0 und 8,5.
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Das
Reaktionsmedium kann ferner ein oder mehrere Elemente in Kombination
miteinander enthalten, wie bspw. Aminosäuren, Peptone, Kohlenhydrate,
Nucleotide, Mineralien, Vitamine, Antibiotika, Tenside, Puffer,
oder Phosphat-, Ammonium-, Natrium- oder Metallsalze. Beispiele der Medien
sind in den folgenden Patenten der Anmelderin beschrieben,
EP 0 656 421 oder
WO 99/09207 .
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In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung weist das Reaktionsmedium
zumindest zwei enzymatische Substrate auf: ein erstes enzymatisches
Substrat aus der Familie der Erfindung und zumindest ein weiteres
enzymatisches Substrat aus der Familie der Erfindung und/oder ein
weiteres enzymatisches Substrat aus einer anderen Substratfamilie.
Die enzymatische Hydrolyse des oder der weiteren Substrat(e) bewirkt
ein detektierbares Signal, das von dem Signal, das durch das erste
Substrat bewirkt wird, unterschiedlich ist, wie bspw. unterschiedlich
farbige oder fluoreszierende Produkte, um ein Aufzeigen – wie die
Detektion und/oder Identifizierung und/oder Quantifizierung – eines
oder mehrerer Mikroorganismen zu ermöglichen.
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Beispielhaft
können
die folgenden Kombinationen in Erwägung gezogen werden:
- – ein β-Glucuronidase-Substrat
gemäß der Erfindung
und X-β-D-Glucosid
(X ist 5-Brom-4-chlor-3-indolyl) für ein Medium für Urinproben
(Typ CPS ID2, bioMérieux,
Marcy l'Etoile,
Frankreich);
- – ein β-Galactosidase-Substrat
gemäß der Erfindung
und X-β-D-Glucosid
für ein
Medium für
Urinproben (Typ CHROMagar Orientation (eingetragene Marke), verkauft
von der Firma CHROMagar, Paris, Frankreich oder Oxoid UTI, verkauft
von der Firma OXOID, Hampshire, England);
- – ein β-Glucuronidase-Substrat
gemäß der Erfindung
und X-β-D-Galactosid
für ein
Medium für
Escherichia coli und Coliforme (Typ Coli ID, bioMérieux,
Marcy l'Etoile,
Frankreich).
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Als
Beispiele kann ein Hexosaminidase-Substrat gemäß der Erfindung für Hefen
und für
die Identifizierung von Candida albicans verwendet werden.
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Substrat
gemäß der vorliegenden
Erfindung können
insbesondere zu den Medien CPS ID2, SM ID, Albicans ID2, Coli DI
und O157:H7 ID zugefügt
werden, welche durch bioMérieux
(Marcy l'Etoile,
Frankreich) vertrieben werden und alle oder einige von deren enzymatischen
Substraten aufweisen, und auch zu den Medien, die Äsculin aufweisen,
wie Galle-Äsculin-Agar,
mit oder ohne selektive Agenzien.
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Die
Konzentration des enzymatischen Substrats im Reaktionsmedium beträgt zwischen
0,02 imd 1 g/l, vorteilhafterweise zwischen 0,03 und 0,30 g/l und
vorzugsweise zwischen 0,04 und 0,10 g/l.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Diagnosekit mit einer Zusammensetzung
wie oben definiert und einem Behälter
für das
Reaktionsmedium. Der Ausdruck „Behälter" soll jeglichen festen
Träger
umfassen, wie bspw. eine Flasche, ein Röhrchen, eine Schale, eine Mikrotiterplatte
oder ein Verbrauchsprodukt für
automatische Maschinen, wie bspw. API Galeries oder VITEK-Karten (eingetragenen
Marken, bioMérieux,
Marcy l'Etoile,
Frankreich).
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Detektion und/oder Identifizierung und/oder Quantifizierung
von zumindest einem Mikroorganismus in einer Probe, in welchem der
aus der Probe stammende Mikroorganismus mit einem Reaktionsmedium
in Kontakt gebracht wird, welches ein enzymatisches Substrat der
allgemeinen Formel (I) enthält,
und in welchem das farbige oder fluoreszierende Produkt, welches
durch die Hypolyse des enzymatischen Substrats gebildet wird, detektiert
wird.
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Die
Substrate der allgemeinen Formel (I) haben den Vorteil, dass sie
unabhängig
von den Bedingungen für
die Atmosphäre
der Inkubation verwendet werden können. Die Detektion kann daher
dadurch ausgeführt
werden, dass das Reaktionsmedium mit dem enzymatischen Substrat
inkubiert und mit zumindest einem Mikroorganismus unter einer kontrollierten
Atmosphäre
beimpft wird, bspw. unter aeroben, anaeroben, microaerophilen Bedingungen
oder unter einer CO2-Atmosphäre, und
vorzugsweise unter aeroben oder microaerphilen Bedingungen oder
unter einer CO2-Atmosphäre.
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Die
zu analysierende Probe ist eine klinische Probe, wie bspw. Speichel,
Blut, Urin, eine Stuhlprobe oder irgendeine andere Probe, deren
Analyse einem Mediziner bei der Diagnoseerstellung helfen kann.
Die Probe kann auch eine Probe eines Produkts sein, welches ein
Grundprodukt der Nahrungsmittel- und/oder pharmazeutischen
Industrie ist, oder von diesem abstammt, bei welchem es notwendig
ist, entweder die Abwesenheit von pathogenen Mikroorganismen zu
garantieren, oder eine kontaminierende Flora auszuzählen oder
spezifische Mikroorganismen zu detektieren. Die Probe kann entweder
direkt auf einem Medium kultiviert werden, welches ein Substrat
der allgemeinen Formel (I) enthält,
oder aber nach einem Vorkultivierungsschritt, bspw. im Falle einer
Nahrungsmittelprobe.
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Der
oder die Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung identifiziert,
detektiert oder quantifiziert werden können, sind Bakterien, Hefen
oder Pilze, und gehören
insbesondere zu den folgenden Gruppen oder Taxa: Enterobacteriaceae,
Pseudomonadaceae, Neisseriaceae, Vibrionaceae, Pasteurellaceae,
Campylobacter, Micrococcaceae, Streptococcaceae, Bacillus, Lactobacillus,
Listeria, Corynebacterium, Gardnerella, Nocardia, Candida, Cryptococcus,
Aspergillus und genauer Escherichia coli, E. coli O157:H7, Shigella,
Salmonella, Proteeae, Pseudo monas aeruginosa, Neisseria meningitidis,
Enterococcus, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes,
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Hefen, wie Candida
albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans
und Aspergillus fumigatus. Diese Mikroorganismen können aerob,
aeroanaerob, micropaerophil oder anaerob sein.
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In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die enzymatischen
Substrate in Reaktionen zur Detektion eines Analyten eingesetzt,
in welchen eine enzymatische Aktivität (insbesondere alkalische Phosphatase
oder β-Galactosidase)
verwendet wird, wie bspw.: Reaktionen zur Detektion eines Antikörpers oder
Antigens, oder einer Nukleinsäure,
im Rahmen eines ELISA-Test (siehe bspw. „les immunodosages de la théorie la
pratique") [Immunoessays,
von der Theorie zur Praxis] gesammelt durch Y. Barbier, ACOMEN Veröffentlichungen,
Lyon, S. 109–133,
1988); bei molekularbiologischen Techniken zum Nachweis eines Gens vom β-Galactosidase-Typ
(siehe bspw. „Molecular
cloning: a laboratory manual",
2. Ausgabe, Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Kapitel 16.56 und Kapitel 1.85, 1989); zur Detektion von
Nukleinsäuren
(siehe bspw. „DNA-Sonden", 2. Auflage, G.
H. Keller, Manak, M. M., Stockton Press, Kapitel 5–9, 1993);
oder bei histochemischen, cytochemischen oder durchflusszytometrischen
Techniken.
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Die
folgenden Beispiele sollen einige Vorteile der Erfindung aufzeigen. Beispiel
1: Synthese von p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid, PNB-gal-Produkt
(1)
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p-Naphtholbenzein
wurde von Acros Organics (Geel, Belgien) erworben. Die anderen Reagenzien wurden
von Sigma Aldrich Chemie (St. Quentin Fallavier, Frankreich) erhalten.
p-Naphtholbenzein (1,87 g, 5 mmol) wurde in 20 ml Aceton unter starkem
Rühren
gelöst.
5 ml Kaliumhydroxid mit einer Konzentration von 1,4 mol/l wurden
zu dieser Lösung
hinzugefügt,
gefolgt von 10 ml Aceton. Anschließend wurden 5 ml Wasser tropfenweise
hinzugefügt,
um eine stark blaue Lösung
zu bilden. 10 mmol α-Acetobromgalactose
(4,1 g) in 10 ml Aceton wurden zu der Lösung hinzugefügt. Um den
pH-Wert größer als
11 zu halten, wurden 2 ml einer Kaliumhydroxidlösung mit 20 mol/l zum ersten
Mal nach 30 min Rühren
hinzugefügt
und ein weiteres Mal nach 90 min Rühren. Ein drittes Mal wurde
die alkalische Lösung
nach 3,5 Std. hinzugefügt,
gefolgt von der Hinzufügung
von 5 ml α-Acetobromgalactose
in Aceton mit der gleichen Konzentration wie zuvor. Nach 4,5 Std.
wurde die alkalische Lösung
ein letztes Mal hinzugefügt
und die Lösung über Nacht
gerührt.
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Das
Aceton wurde unter reduzierendem Druck entfernt und die restliche
Lösung
in 300 ml einer Natriumkarbonatlösung
mit 0,06 mol/l bei einer Temperatur von 0°C unter Rühren eingeführt. Das kastanienbraune Präzipitat
wurde unter Vakuum filtriert, mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet.
Der Feststoff wurde in 100 ml Dichlormethan gelöst und gründlich mit einer Kaliumhydroxidlösung bei
0°C gewaschen,
um überschüssiges p-Naphtholbenzein
zu entfernen. Das restliche p-Naphtholbenzein wurde durch Rühren auf
einem Dowex Marathonharz in 100 ml Wasser bei pH 11 für 2 bis
3 Std. entfernt. Auf diesen Reinigungsschritt folgte eine Dünnschicht-Chromatographie
unter Verwendung eines Ethylacetat/Toluol (3:1) Laufmittels, wobei
für die Entwicklung
wässriges
Ammoniak verwendet wurde. Die dunkelgelbe Lösung wurde über Nacht auf wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet, unter reduzierendem Druck verdampft,
mit Methanol neu gebildet und anschließend wieder verdampft, um einen
Schaum zu erhalten. Dieser Schaum wurde in 50 ml Methanol gelöst und das
Produkt 5 Std. lang unter Verwendung von 20 ml Natriummethoxid in
Methanol bei 0,4 mol/l deprotektiert. Die Lösung wurde dann unter Verwendung
eines IR120 (H+) auf pH 6,5 gebracht, durch
Absetzen getrennt, und das Lösungsmittel
unter reduziertem Druck entfernt. Das gebildete Glycosid, p-Naphtholbenzein-β-D-galactosidase (1,5
g), liegt in Form eines gelbbraunen Pulvers vor.
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Beispiel 2: Synthese des Acetatderivates
von p-Naphtholbenzein
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Das
p-Naphtholbenzein wurde in wasserfreiem Pyridin gelöst und anschließend auf
0°C gekühlt, wonach
zu dieser Lösung
Essigsäureanhydrid
(5facher molarer Überschuss),
gelöst
in Pyri din, unter kalten Bedingungen hinzugefügt wurde. Nach 24 Std. bei
Raumtemperatur wurde kaltes Wasser tropfenweise unter Rühren hinzugefügt, um das überschüssige acetylierende
Agens zu dissoziieren. Erhalten wurde ein Präzipitat in Esterform, welches
durch Filtrierung unter Vakuum entfernt, mit Essigsäure gewaschen
und in Essigsäure unter
heißen
Bedingungen umkristallisiert wurde.
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Beispiel 3: Synthese des Sulfat-Derivat
in Kaliumsalzform, von p-Naphtholbenzein.
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Ein
1,2 molarer Überschuss
an Chlorsulfonsäure
wurde bei –15°C unter Rühren zu
einer kalten Lösung
von p-Naphtholbenzein in wasserfreiem Pyridin hinzugefügt. Nach
1 Std. bei –15°C und 30
min bei Raumtemperatur wurde das überschüssige Pyridin unter reduziertem
Druck verdampft, und das Pyridiniumsalz wurde durch Lösen in Ethanol
und Behandeln mit einer Natriumhydroxidlösung in Ethanol disoziiert,
bis ein pH-Wert von 10 erreicht wurde. Das Kaliumsalz wurde unter
Vakuum gefiltert und mit Ethanol und dann Diethylether gewaschen. Beispiel
4: Synthese von 8-Chlor-1,2-benzoresorufin-β-D-glucosid, (CBR-glu) Produkt (2).
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6-Nitroso-4-chlorresocinol
(2,94 g, 20 mmol) und 1,3-Dihydroxynaphthalen
(3,20 g, 20 mmol) wurden jeweils getrennt in 1-Butanol (30 ml) gelöst und gemischt.
Die Reaktionsmischung wurde zwischen 50 und 60°C unter Verwendung eines Wasserbades
erhitzt und anschließend
Schwefelsäure
(1,0 g) tropfenweise unter Rühren
für 30
Sekunden hinzugefügt.
Die Lösung
wurde dunkelrot und es bildeten sich rasch Kristalle. Nach 15 min
bei 50°C
und einer 1 Std. bei Raumtemperatur wurde das Produkt unter Vakuum
gefiltert und aus heißem
1-Butanol umkristallisiert, wodurch 2,8 g an leuchtenden dunkelroten
Kristallen aus 8-Chlor-1,2-benzoresorufin gewonnen wurden.
-
Das
Glucosid-Derivat (2) wurde durch eine Koenings-Knorr-Reaktion hergestellt,
wie zuvor für
das p-Naphtholbenzein-Derivat
beschrieben. Das Glucosid in tetra-acetyliserter Schutzform wurde
durch Rotationsverdampfung aus Dichlormethan isoliert und unter
Verwendung einer katalytischen Menge an Natriummethoxid in wasserfreiem
Methanol direkt deprotektiert. Das Glycosid lag in Form eines orangegelben
Pulvers vor.
-
Beispiel 5: Synthese von 8-Chlor-1,2-benzoresorufin-β-D-galactosid, (CBR-gal)
Produkt (3).
-
Das
Verfahren zur Herstellung des β-D-Galactosids-Derivats
(3) ist identisch mit dem in Beispiel 4 beschriebenen, wobei das β-D-Galactosid-Derivat
in tetra-acetylierter Schutzform anstelle des Glucosid-Äquivalents
verwendet wurde. Beispiel
6: Synthese von 3-Hydroxy-9-phenyl-1,2:7,8-dibenzo-6-fluoron-β-D-galactosid, Produkt (4).
-
3-Hydroxy-9-phenyl-1,2:7,8-dibenzo-6-fluoron
wurde aus 1,3-Dihydroxynaphthalen (Aldrich, 14529-7) durch Kondensation
unter heißen
Bedingungen mit α,α,α-Trifluortoluol
(Aldrich, T6370-3) in Gegenwart einer Lewis-Säure hergestellt, wie bspw.
SnCl
4 oder ZnCl
2,
und zwar in einen Lösungsmittel
mit einem hohen Siedepunkt, wie bspw. Chlorbenzol oder Xylen. Nach
Hydrolyse der Lewis-Säure
und Reinigung der Zwischenverbindung, wurde das Galactosid-Derivat
(4) wie unter Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Beispiel
6 bis: Synthese von Naphthosafranol (9-Hydroxy-7-phenol-5-benzo[a]phenazinon):
-
Eine
Mischung aus 50 g Schwefelsäure
und 130 ml Wasser wurden langsam unter Rühren zu einer bei 0°C gehaltenen
Lösung
aus Phenol (20 g), Natriumnitrit (18 g) und Natriumhydroxid (9 g)
in 500 ml Wasser hinzugefügt.
Nach 2-stündiger
Reaktion wurde das Produkt gesammelt und mit eiskaltem Wasser gewaschen. Nach
Umkristallisierung auf Wasser wurde das p-Nitrosophenol-Produkt
in reiner Form isoliert (13,4 g).
-
Das
auf diese Weise hergestellt p-Nitrosophenol (12,3 g, 0,1 mol) und
auch N-Phenyl-2-naphthylamin (14,5 g, 0,067 mol, Aldrich, 17,805-5)
wurden in Ethanol (400 ml) gelöst
und die Mischung auf 15°C
gekühlt. Anschließend wurde
konzentriertes HCl (15 g) zu dieser Lösung hinzugefügt. Die
Temperatur erhöhte
sich spontan und das Isorosindon-Produkt (in Form eines Hydrochloridsalzes)
wurde durch Filtration getrennt und aus einer Ethanol-Wasser-Mischung
(50%–50%)
umkristallisiert. Das Umkristallisierungsprodukt kann dadurch in
seine freie Base umgewan delt werden, dass es zunächst in Ethanol gelöst wird,
dann Ammoniumhydroxid hinzugefügt
wird und schließlich
die Lösung
zu heißem
Wasser zugefügt
wird.
-
Die
freie Base (Isorosindon) fällt
nach Abkühlen
der Lösung
in Form dunkelbrauner Kristalle aus. Eine Filtration unter Vakuum
führte
zu 15 g des reinen Produkts.
-
Das
Zielprodukt (5) wurde durch Reflux des Isorosindons in einer konzentrierten
Lösung
auf KOH in 1-Butanol gewonnen. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie
auf Silikamaterial mit Ethylacetat als Eluierungsmittel gereinigt.
-
Beispiel 6 ter: Das Galactosid-Derivat
von Naphthosafranol wurde nach dem gleichen Protokoll wie für Beispiel 1
beschrieben hergestellt.
-
Beispiel 7: Verwendung von p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid
(PNB-gal) zur Detektion von Mikroorganismen mit β-Galactosidase-Aktivität.
-
Ein
festes Agar-Medium mit PNB-gal wurde wie folgt hergestellt: 41 g
Columbia-Agar wurden zu 1 Liter destilliertem Wasser mit 100 mg
PNB-gal und 30 mg IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) hinzugefügt, um die Induktion
der β-Galactosidase-Aktivität zu erleichtern.
Der Agar wurde durch Autoklavieren bei 116°C für 10 min sterilisiert. Das
Medium wurde langsam auf 55°C
abgekühlt,
bevor es auf 20 ml Petrischalen verteilt wurde.
-
367
unterschiedliche Stämme,
einschließlich
303 Enterobacteriaceae, wurden aus Klinik- und Umweltproben gesammelt
und unter Verwendung der API 20E Galerie (bioMérieux, Frankreich) als Referenzverfahren identifiziert.
Die Stämme
wurden auf einen Columbia-Agar-Medium bei 37°C für 24 Std. kultiviert, anschließend wurden
ungefähr
10
8 Organismen/ml (entspricht einem McFarland-Standard
von 0,5) je Stamm angeimpft. Unter Verwendung eines Denley-Inokulators
wurden 1 Mikroliter jeder Suspension in das wie oben hergestellte PNB-gal-Medium
angeimpft, mit 20 Stämmen/Petrischale.
Alle Petrischalen wurden bei 37°C
für 18
Std. inkubiert. Nach Inkubation wurden die Petrischalen auf Gegenwart
einer purpurroten Kolonie untersucht, im Vergleich mit Wachstum
auf dem Columbia-Agar-Medium. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben. Tabelle 1
Gramnegative
Spezies | Anzahl
der Stämme
getestet für die
Spezies | Positive
Ergebnisse mit dem PNB-gal-Substrat
(%) |
Acinetobacter
ssp. | 53 | 0 |
Aeromonas
caviae | 7 | 86 |
Aeromonas
hydrophila | 3 | 100 |
Citrobacter
diversus | 9 | 89 |
Citrobacter
freundii | 16 | 100 |
Enterobacter
aerogenes | 9 | 100 |
Enterobacter
agglomerans | 1 | 100 |
Enterobacter
cloacae | 21 | 100 |
Escherichia
coli | 41 | 95 |
Escherichia
hermannii | 1 | 100 |
Hafnia
alvei | 10 | 30 |
Klebsiella
oxytoca | 13 | 100 |
Klebsiella
ozaenae | 3 | 67 |
Klebsiella
pneumoniae | 19 | 100 |
Morganella
morganii | 12 | 0 |
Proteus
mirabilis | 16 | 0 |
Proteus
penneri | 1 | 0 |
Proteus
vulgaris | 4 | 0 |
Providencia
alcalifaciens | 3 | 0 |
Providencia
rettgeri | 3 | 0 |
Providencia
stuartii | 10 | 0 |
Salmonella
spp. | 64 | 0 |
Serratia
odorifera | 1 | 100 |
Serratia
spp. | 14 | 79 |
Shigella
boydii | 1 | 0 |
Shigella
dysenteriae | 2 | 0 |
Shigella
flexneri | 2 | 0 |
Shigella
sonnei | 10 | 100 |
Vibrio
cholerae | 1 | 100 |
Yersinia
enterocolitica | 14 | 7 |
Yersinia
pseudotuberculosis | 3 | 0 |
-
Diese
Tabelle zeigt, dass das Substrat als Indikator für die β-Galactosidase-Aktivität sehr effektiv
ist. Es wurde kein Stamm ohne β-Galactosidase-Aktivität detektiert,
was bedeutet, dass es keine Falsch-Positiven gibt, und die Sensitivität bezüglich der
Enterobacteriaceae-Stämme
liegt bei 95,1% im Vergleich mit der API 20E-Referenzmethode.
-
Beispiel 8: Einfluss des pH-Werts auf
die Offenbarung der β-D-Galactosidase
in Gegenwart des p-Naphtholbenzein-β-D-galactosids, PNB-gal.
-
Das
hierbei verwendete Medium, Columbia-Basis mit einer Konzentration
von 46,37 g/l, Isopropyl-β-D-thiogalactosid
(IPTG) mit 0,03 g/l, p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid mit 0,1 g/l, wurde
bei 24°C
auf verschiedene pH-Werte (5,5–6,0–6,5–7,0–7,5–8,0–8,5) eingestellt,
nachdem das Medium autoklaviert worden war. Diese verschiedenen
Medien wurden nach Aufteilung auf Petrischalen jeweils einzeln und
als 3fach-Set unter Verwendung einer Suspension mit 0,5 McFarland
beimpft, wobei die Suspension hinreichend charakterisierte Mikroorganismen
auf der ATCC oder NCTC Artensammlung enthielt. Die Petrischalen
wurden bei 37°C für 48 Std.
inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden visuell nach 24 und nach
48 Std. Inkubation untersucht und die Farbe notiert. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle II nachstehend wiedergegeben: Tabelle II
Getestete
Stämme | TI | pH
5,7 | pH
6,0 | pH
6,5 | pH
7,0 | pH
7,5 | pH
8,0 | pH
8,5 |
E.
coli | 24
H | - | - | - | - | - | - | - |
032 | 48
H | - | - | - | - | - | - | - |
E.
coli | 24
H | orange | orange | orange | orange | orange | orange | orange |
115 | 48
H | orange | orange | orange | orange | braun | braun | braun |
S.
marcescens | 24
H | braun | braun | braun | braun | braun | braun | braun |
217 | 48
H | braun | braun | braun | braun | grün | khaki | khaki |
E.
cloacae | 24
H | orange | orange | orange | orange | braun | braun | braun |
061 | 48
H | braun | braun | braun | grün | grün | khaki | khaki |
S.
typhimurium | 24
H | - | - | - | - | - | - | - |
010 | 48
H | - | - | - | - | - | - | - |
E.
faecalis | 24
H | - | - | - | - | - | - | - |
117 | 48
H | orange | orange | orange | orange | orange | orange | orange |
S.
agalactiae | 24
H | - | - | - | - | - | - | - |
015 | 48
H | - | - | - | - | - | - | - |
S.
aureus | 24
H | - | - | - | - | - | - | - |
008 | 48
H | - | - | - | - | - | - | - |
- „-" bedeutet eine fehlende
Färbung,
TI bedeutet die Inkubationszeit der Petrischalen.
-
Je
nach Stamm und Dauer der Inkubation variiert die Farbe der Kolonien
als Funktion des pH-Werts. Im Allgemeinen ist die Farbe bei einem
sauren pH eher orange bis braun und bei einem alkalischen pH grün bis khaki.
Dies ermöglicht
es, verschiedene Gruppen von Mikroorganismen zu unterscheiden, die
Farbe je nach Bedarf anzupassen (Kombination mit anderen enzymatischen
Substraten, pH-Indikatoren), oder mehrere Stoffwechsel aufzuzeigen
(enzymatische Hydrolyse und pH-Variierung), was ein Vorteil des
PNB-gal-Substrats ist.
-
Beispiel 9: Einfluss des Reaktionsmediums
auf die Offenlegung der β-D-Galactosidase
in Gegenwart von p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid,
PNB-gal.
-
Die
folgende Mischung wurde zu den Columbia, Trypticase Soja (GSA) und
Sorbit MacConkey (SMAC)-Medien hinzugefügt:
Isopropyl-β-D-thio-galactosid | 0,03 g/l |
p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid | 0,1 g/l |
-
Nach
dem Autoklavieren lag der pH-Wert der Medien bei 23°C bei 7,1,
7,1 und 7,2 in Bezug auf jeweils SMAC, GSA und das Columbia-Medium.
Diese verschiedenen Medien wurden – verteilt auf Petrischalten – jeweils
einzeln und mit 3fach-Proben mit einer Suspension mit 0,5 McFarland
beimpft, mit hinreichend charakterisierten Organismen erhalten von
der ATCC oder NCTC-Sortensammlung.
Die Petrischalen wurden bei 37°C
48 Std. lang inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und
48 Std. Inkubation visuell untersucht und die Farbe notiert. Die
Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III wiedergegeben: Tabelle III
Getestete
Stämme | TI | SMAC-Medium | TSA-Medium | Columbia-Medium |
E.
coli | 24
H | - | - | - |
032 | 48
H | - | - | - |
E.
coli | 24
H | orange | orange | braun-orange |
115 | 48
H | orange | orange | braun |
E.
coli | 24
H | orange | braun-orange | braun |
206 | 48
H | orange | braun-orange | braun |
S.
marcescens | 24
H | fuchsia | braun-orange | braun |
217 | 48
H | fuchsia | braun | braun |
E.
cloacae | 24
H | orange | braun-orange | braun |
061 | 48
H | orange | braun | braun |
S.
typhimurium | 24
H | - | - | - |
010 | 48
H | - | - | - |
E.
faecalis | 24
H | - | - | - |
010 | 48
H | - | orange | orange |
S.
agalactiae | 24
H | - | - | - |
015 | 48
H | - | - | - |
S.
aureus | 24
H | - | - | - |
008 | 48
H | - | - | - |
- „-" zeigt eine fehlende
Färbung
an, TI bedeutet die Inkubationszeit einer Petrischale.
-
Je
nach Stamm und Dauer der Inkubation variierte die Farbe der Kolonien
als Funktion des Mediums. Allgemein ist sie orange auf dem SMAC-Medium
und braun auf dem Columbia-Medium, wobei es nicht möglich war,
diesen Unterschied in der Farbe mit dem pH-Wert des Mediums in Verbindung
zu bringen. Auf dem SMAC-Medium
ist es möglich,
Serratia marcescens von den anderen Bakterien zu unterscheiden,
was für
die anderen beiden Medien nicht der Fall ist. Darüber hinaus
kann es vorteilhaft sein, die Farbe der mit p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid
erhaltenen Kolonien in Abhängigkeit
von der Verwendung anderer enzymatischer Substrate, die zu anderen
Farben führen
(pink oder braun zum Beispiel,) einstellen zu können.
-
Beispiel 10: Einfluss der Inkubationsatmosphäre auf die
Offenlegung der β-D-Galactosidase
in Gegenwart von p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid, PNB-gal.
-
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid
(X-gal) oder p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid
(PNB-gal) wurde mit 0,1 g/l zu dem nachstehendem Medium hinzugefügt:
Hefeextrakt | 6 g/l |
Gelatinepepton | 5 g/l |
NaCl | 8 g/l |
Natriumkarbonat | 0,1 g/l |
Isopropyl-β-D-thio-galactosid | 0,03 g/l |
Agar | 13 g/l |
-
Diese
verschiedenen Medien wurden – nach
Verteilung auf Petrischalen – mit
hinreichend charakterisierten Mikroorganismen aus der ATCC oder
NCTC-Sortensammlung beimpft. Die Petrischalen wurden bei 37°C 48 Std.
lang unter verschiedenen Atmosphären
inkubiert: aerobe (AE), mikroaerophil (MAP), anaerob (ANA), CO
2, mit dem GENbox-System (bioMérieux,
Frankreich), zur Kontrolle der Atmosphäre. Die gebildeten Kolonien
wurden nach einer Inkubation von 24 bis 48 Std. visuell untersucht
und die Intensität
der Farbgebung notiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle IV wiedergegeben: Tabelle IV
| X-Gal | PNB-Gal |
AE | MAP | ANA | CO2 | AE | MAP | ANA | CO2 |
Stämme | TI | Test
1 | Test
2 | Test
3 | Test
4 | Test
5 | Test
6 | Test
7 | Test
8 |
E.
Coli | 24
H | 3* | 2 | - | 2 | 3 | 3 | 1 | 3 |
115 | 48
H | 3 | 2 | 1 | 2 | 3 | 3 | 3 | 3 |
E.
Coli | 24
H | 3 | 1 | 1 | 3 | 3 | 3 | 2 | 3 |
206 | 48
H | 3 | 1 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
S.
marcescen | 24
H | - | - | - | - | - | - | - | - |
042 | 48
H | 1 | 1 | - | 2 | 3 | 1 | - | 3 |
E.
cloacae | 24
H | 2 | 1 | - | 2 | 2 | 2 | 1 | 2 |
061 | 48
H | 2 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 3 | 2 |
P.
vulgaris | 24
H | - | - | - | - | - | - | - | - |
140 | 48
H | - | - | - | - | - | - | - | - |
E.
faecalis | 24
H | - | - | - | - | - | - | - | - |
117 | 48
H | - | - | - | - | - | - | - | - |
E.
faeci um | 24
H | 1 | - | - | - | - | - | - | - |
255 | 48
H | 3 | 1 | - | 1 | 3 | - | - | - |
S.
aureus | 24
H | - | - | - | - | - | - | - | - |
008 | 48
A | - | - | - | - | - | - | - | - |
- *: Farbintensität (willkürlicher Maßstab basierend auf visueller
Beobachtung); „-" bedeutet fehlende
Färbung; TI
bedeutet Inkubationszeit.
-
Während es
X-Gal im Unterschied zu PNB-Gal ermöglicht, bei dem E. faecium-Stamm
eine Akvitität zu
detektieren, ermöglicht
es PNB-Gal bei Stämmen,
die X-Gal unter Aerobinse (E. coli, E. cloacae) stark hydrolysieren,
diese β-D-Galactosidase-Aktivität unabhängig von
der Atmosphäre
und intensiver zu detektieren. Denn wenn die Intensitäten unter
den Bedingungen des Tests 3 schwach oder sogar sehr schwach sind,
sind diese unter den Bedingungen des Tests 7 stark.
-
Beispiel 11: Verwendung von 8-Chlor-1,2-benzoresorufin-β-D-galactosid (CBR-gal)
zur Detektion von Mikroorganismen mit β-Galactosidase-Aktivität in einem
festen Medium.
-
Das
CBR-gal-Substrat wurde in Columbia-Agar mit den folgenden Konzentrationen
eingeführt:
2, 6, 10 und 20 mg/100 ml, und das so hergestellte Medium wurde
auf Petrischalen verteilt. Jede Petrischale wurde mit den folgenden
Organismen beimpft: E. coli (NCTC, 10418), K. pneumoniae (NCTC,
10896), P. rettgeri (NCTC, 7475), E. cloacae (NCTC, 11936), S. marcescens
(NCTC, 10211) und S. typhimurium (NCTC, 74). IPTG wurde zu all diesen
Medien mit einer Konzentration von 3 mg pro 100 ml Columbia-Agar hinzugefügt. Alle
Petrischalen werden bei 37°C über Nacht
inkubiert.
-
Die
für β-Galactosidase-Aktivität positiven
Stämme
(E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae und S. marcescens) hydrolysierten
das Substrat nach der Über-Nacht-Inkubation
sehr schnell, was zu einer Pinkfärbung führte, die
nur auf die Bakterienkolonie beschränkt ist. Alle getesteten Konzentrationen
ermöglichen
es, die Spezies zu unterscheiden, jedoch beträgt die optimale Konzentration,
um eine klar sichtbare Pinkfärbung
ohne Hintergrundstörung
zu erhalten, ungefähr
10 mg/100 ml. Eine Wachstumsinhibierung bezüglich der getesteten Konzentrationen
konnte nicht beobachtet werden.
-
Beispiel 12: Verwendung von 8-Chlor-1,2-benzoresorufin-β-D-galactosid (CBR-gal)
zur Detektion von Mikroorganismen mit β-Galactosidase-Aktivität in einem
flüssigen
Medium.
-
Das
CBR-gal-Substrat wurde in einem flüssigen Medium mit verschiedenen
Konzentrationen von 0,5 mg/ml bis 0,0078 mg/ml getestet. Das flüssige Reaktionsmedium,
zu welchem das Substrat zugegeben wird, war aus einem Phosphatpuffer
pH 7,4 mit 0,5% Nähstoffbrühe und 0,5%
NaCl zusammengesetzt. 30 Mikroliter/ml IPTG wurden zu dem Medium
bei allen Substratkonzentrationen hinzugefügt. Die getesteten Stämme sind
E. coli (NCTC, 10418), K. pneumoniae (NCTC, 10896), P. rettgeri
(NCTC, 7475), E. cloacae (NCTC, 11936), S. marcescens (NCTC, 10211)
und S. typhimurium (NCTC, 74) mit einer Beimpfung von 0,5 McFarland.
-
Alle
Stämme
mit β-Galactosidase-Aktivität bewirkten
mit der Zeit eine Pinkfärbung,
wie in der nachstehenden Tabelle V zusammengefasst ist. Tabelle V
| Konzentration
des CBR-gal-Substrats |
Organismen | 0,5 mg/ml | 0,25 mg/ml | 0,125 mg/ml | 0,0625 mg/ml | 0,0313 mg/ml | 0,0156 mg/ml | 0,0078 mg/ml |
E.
coli | 2* | 2 | 4 | 4 | 24 | - | - |
K.
pneumoniae | 2 | 2 | 4 | 4 | 24 | - | - |
P.
rettgeri | - | - | - | - | - | - | - |
E.
cloacae | 2 | 2 | 4 | 4 | 24 | - | - |
S.
marcescens | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | - | - |
S.
typhimurium | - | - | - | - | - | - | - |
- *: Die Ergebnisse sind in Stunden wiedergegeben.
- „-" bedeutet fehlende
Färbung,
selbst nach 24 Std.