NO313010B1 - Eskuletinderivater, fremgangsmåte for fremstilling derav, preparat, kulturskål og sett, samt fremgangsmåte for påvisningog/eller identifikasjon av en mikroorganisme i en pröve - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye eskuletinderivater, fremgangsmåte for fremstilling derav og deres anvendelse som substrater for den spesifikke påvisning av mikroorganismer, i form av preparat, kulturskål og sett, samt fremgangsmåte for påvisning og/eller identifikasjon av en mikroorganisme i en prøve.

Eskuletin er aglykonet av eskulin og av cichoriin, og kan fås ved hydrolyse av disse molekylene. Eskuletin har den følgende kjemiske formel:

Det fullstendige kjemiske navn for eskuletin er 6,7-dihydroksy-2H-l-benzo-pyran-2-on (også kjent som 6,7-dihydroksykumarin eller cichorigenin).

Tilstedeværelsen av P-D-glukosidase har lenge vært ansett som en viktig

diagnostisk markør ved mikrobeidentifikasjon. Det mest vanlig brukte substrat for påvisning av dette enzymet er det naturlig forekommende glykosid eskulin (6,7-dihydroksykumarin-6-glukosid eller 6-((3-D-glukopyranosyloksy)-7-hydroksy-2H-1 - benzopyran-2-on).

Hydrolyse av eskulin gir P-D-glukose og eskuletin (6,7-dihydroksykumarin), idet den sistnevnte forbindelse påvises ved dannelsen av et brunt/sort kompleks i nærvær av

jernsalter. Denne testen ble først anvendt ved identifikasjon av enterokokker og har siden funnet bred anvendelse ved identifikasjonen av andre slekter (Swan, A., J. Clinical Pathology 7, s. 160-163 (1954), Trepeta et al, Antonie van Leewenhoek 53, s. 273-277 (1987)). Hovedulempen ved dette substratet er at når det resulterende kompleks som dannes inkorporeres i agar, spres det utover i mediet (James et al, Zbl. Bakt. Hyg. A267, s. 188-193 (1987)). Dette skaper vanskeligheter med å skjelne mellom P-glukosidaseproduser-ende kolonier når det er til stede i en blandet kultur.

Syntetiske substrater er også tilgjengelige for påvisning av P-D-glukosidase, hvorved man får enten kromogene eller fluorescerende forbindelser etter hydrolyse

(Manafi et al, Microbiol. Reviews 55, s. 335-348 (1991)). F eks har den fluorogene forbindelse 4-metylumbelliferyl-(3-D-glukosid vært mye anvendt selv om den har flere ulemper når den inkorporeres i et agarmedium. Disse omfatter det faktum at gjenkjen-nelsen av kolonier bare kan utføres under tilstedeværelsen av langbølget ultrafiolett lys, og også glukosen som frigjøres fra substratet ved hydrolyse, kan benyttes av organismene til å produsere syre. Dette forårsaker en reduksjon i fluorescensen som fremstilles av 4-metylumbelliferon på grunn av dominansen til den udissosierte form av molekylet ved lav pH. I tillegg er det frigjorte umbelliferon tilbøyelig til å diffundere gjennom agarenog skape vanskeligheter med å skjelne mellom individuelle kolonier som produserer mål-enzymet. Andre substrater som vanligvis anvendes, omfatter P-D-glukosidderivatene av nitrofenol (Trepeta et al, Antonie van Leewenhoek 53, s. 273-277 (1987)). Omfattende diffusjon er imidlertid igjen en alvorlig begrensende faktor når det inkorporeres slike substrater i faste medier (Manafi et al, Microbiol. Reviews 55, s. 335-348 (1991)).

P-galaktosidase er også en viktig diagnostisk markør ved mikrobeidentifikasjon. Den er kanskje den mest omfattende studerte av alle mikrobielle enzymer og dens tilste-deværelse har lenge vært ansett som en verdifull taksonomisk markør. Dette gjelder spesielt i bakteriefamilien Enterobacteriaceae hvor analyse av P-galaktosidase er blitt brukt i mange år for differensieringen mellom ikke-laktosefermenterende arter fra sakte eller sene laktosefermentorer (James, A.L., I Chemical Methods in Prokaryotic Systematics, s. 471-492, red. Goodfellow and 0'Donnel, Wiley & Sons (1994)). Et stort antall substrater er tilgjengelige for p-galaktosidase, idet det vanligste er orto-nitrofenyl-P-D-galaktosid (ONPG), som frigjør gul o-nitrofenol etter hydrolyse (Lowe, G.H., J. Medical Laboratory Technology 19, s. 21 (1962)). Det er også blitt anvendt fluorogene substrater som utnytter slike markører som resorufm, fluorescein og 4-metylumbelliferon (Manafi et al, Microbiol. Reviews 55, s. 335-348 (1991), Plovins et al, Applied and Environmental Microbiol. 60, s. 4638-4641 (1994)).

En viktig anvendelse av P-galaktosidaseanalysen er påvisningen av "coliformer" i vann og matprøver. Dette har ført til utviklingen av membranfiltreringsteknikker som - omfatter et egnet substrat for den direkte påvisning av P-galaktosidase (Brenner et al, Applied and Environmental Microbiol. 59, s. 3534-3544 (1993), Ceneci et al, Microbios 76, s. 47-54 (19 )). Det mest anvendte substrat for dette formålet er 4-metylumbelliferon-P-D-galaktosid. For eksempel ble substratet brukt i en hurtiganalyse som muliggjorde påvisning av så lite som 1 faececoliform pr 100 ml i løpet av 6 timer (Berg et al, Applied and Environmental Microbiol. 54, s. 2118-2122 (1988)). Begrensningene ved dette substratet er at det frigjorte 4-metylumbelliferon lett diffunderer over filteret og det frem-brakte fluorescens kan bare visualiseres under ultrafiolett lys.

På grunn av begrensningene til disse substratene for identifikasjon av P-glukosidase og P-galaktosidase, har det blitt anvendt kromogene forbindelser som gir uopp-løselige produkter etter hydrolyse. Slike substrater gir den fordel at det frigjorte kromogen forblir lokalisert rundt bakteriekolonien uten å diffundere gjennom mediet (Kodaka et al, J. Clinical Microbiol. 33, s. 199-201 (1995)). Eksemplene på disse for påvisningen av P-glukosidase omfatter indoksyl-P-D-glukosid og 5-brom-4-klor-3-indolyl-å-D-glukosid og eksempler for påvisningen av å-galaktosidase omfatter galakto-sider av indoksyl og dets halogenerte derivater, slik som 5-brom-4-klor-3-indolyl- P-D-galaktosid (X-gal) (Kodaka et al, J. Clinical Microbiol. 33, s. 199-201 (1995)). Aglykonet frigjort ved hydrolyse fra disse substratene oksideres hurtig av luft, slik at det dannes et fiolett/blått indigoidfargestoff på kolonimassen (James, A.L., I Chemical Methods in Prokaryotic Systematics, s. 471-492, red. Goodfellow and 0'Donnel, Wiley & Sons

(1994)). Selv om disse substratene er svært effektive, er de forholdsvis vanskelige å fremstille, og selv om de er kommersielt tilgjengelige, har deres svært høye kostnad vist seg å være uoverkommelig for storskaladiagnostisk anvendelse. Bruken av 8-hydroksy-kinolin-P-D-glukosidet er også blitt beskrevet som et alternativ til eskulin for påvisningen av p-glukosidase (James et al, Zbl. Bakt. Hyg. A267, s. 188-193 (1987)). Selv om over-bevisende resultater ble oppnådd, har man støtt på toksisitetsproblemer, særlig med grampositive organismer (Albert et al, British Journal of Experimental Pathology 34, s. 199-130(1953)).

Den foreliggende oppfinnelse vedrører visse nye 6- eller 7-substituerte derivater av eskuletin (6,7-dihydroksykumarin) som er mikrobielt hydrolyserbare til fluorescerende, jernchelaterende eskuletinrester som har en liten tilbøyelighet til å diffundere gjennom agar eller andre vandige miljøer, uten å lide av alle de ulempene som det er hen-vist til ovenfor.

Ifølge et første aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en forbindelse med den generelle formel I:

hvor

R<1>og R<2>er et hydrogenatom;

hver av R3 og R<4>uavhengig av hverandre er en (Ci-Cg)alkyl- eller fenyl(Ci-Cg)-alkylgruppe, eller karboksy-(Ci-C4)alkyl-aminokarbonyl-(CrC4)akyl; eller

R<3>og R<4>danner sammen med karbonatomene som de er bundet til, en (C5-C8)sykloalkenring; og

én av Y og Z er en sukkerrest, en glukuronid-, glukoamidin-, glukuronsyre- eller glykuronsyrerest, en fosfatgruppe eller R<5>C02- hvor R<5>er (CrCi0)alkyl, og den andre av Y og Z er et hydrogenatom; eller et egnet salt eller et hydrat derav.

Heretter omfatter i denne beskrivelsen uttrykket "forbindelse" "salt" eller "hydrat" med mindre sammenhengen krever noe annet.

Slik det her er brukt viser uttrykket "(Ci-C8)alkyl" til rettkjedete eller forgrenede hydrokarbongrupper som har fra ett til åtte karbonatomer. Illustrerende for slike alkylgrupper er metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sek-butyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, heksyl, heptyl og oktyl. Fra ett til fire karbonatomer kan være foretrukket.

Slik det her er brukt viser uttrykket "(Ci-Cio)alkyl" til rettkjedete eller forgrenede hydrokarbongrupper med fra ett til ti karbonatomer. Illustrerende for slike alkylgrupper er metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sek-butyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, heksyl, heptyl, oktyl, nonyl og decyl. Fra ett til seks karbonatomer kan være foretrukket.

Slik det her er brukt henviser uttrykket "(C5-C8)-sykloalkenring" til en alisyklisk ring som har fra 5 til 8 atomer, og som i tillegg har én eller flere dobbeltbindinger. Illustrerende for slike sykloalkenylgrupper er syklopentenyl, sykloheksenyl, sykloheptenyl og syklooktenyl.

I forbindelser ifølge denne oppfinnelsen gir tilstedeværelsen av et asymmetrisk karbonatom opphav til enantiomerer. Tilstedeværelsen av flere asymmetriske karbonatomer gir opphav til diastereoisomerer som hver består av to enantiomerer, med en passende R- eller S-stereokjemi i hvert kiralt sentrum. Oppfinnelsen skal forstås å omfatte slike diastereoisomerer, optisk aktive enantiomerer og blandinger derav.

Uttrykket "egnet salt" henviser til et salt fremstilt ved å bringe en forbindelse med formel I i kontakt med en syre eller base som har et motion som ikke virker inn på den påtenkte bruk av forbindelsen. Eksempler omfatter natriumsaltet eller magnesium-saltet av et fosfatderivat eller saltet dannet fra et primært, sekundært eller tertiært amin hvor forbindelsen med den generelle formel I er en karboksylsyre. Et eksempel på et primært aminsalt kan være sykloheksylammoniumsaltet, et egnet sekundært aminsalt kan være piperidinsaltet og et tertiært aminsalt kan være trietylaminsaltet.

Foretrukne forbindelser med den generelle formel I omfatter de hvori, uavhengig eller i enhver forenlig kombinasjon: R<1>er hydrogen;

R2 er hydrogen;

R<3>er (Ci-C4)alkyl, særlig butyl, eller benzyl;

R<4>er (d-C4)alkyl;

den enzymatisk avspaltbare gruppe representert ved Y eller Z, er en a- eller fortrinnsvis (5-bundet sukkerrest, slik som p-D-glukose, p-D-galaktose, P-D-xylose, p-D-glukuronsyre eller N-acetyl-P-D-glukosamin, eller en fosfat- eller karboksylatgruppe

(R<5>COO-), hvor R<5>er en (Ci-Cio)alkylgruppe. Sukkerrester, særlig de som er avledet fra glukose og galaktose, er de mest foretrukne forbindelser.

Forbindelser hvor R<3>og R<4>sammen med karbonatomene som de er bundet til, danner en syklopenten- eller sykloheksenring, er spesielt foretrukket.

Aglykonresten med den generelle formel I er et substituert eskuletin. Når Y er en glukoserest og Z er hydrogen (dvs. når eskuletinringsystemet er substituert i 7-stillingen), er forbindelsene med den generelle formel I cichoriiner. Når Y er et hydrogenatom og Z er en glukoserest (dvs. når eskuletinringsystemet er substituert i 6-stillingen), er forbincF eisene med den generelle formel I eskuliner. Cichoriiner og analoger av cichoriiner når de andre sukkerrestene enn glukose er substituert i 7-hydroksylgruppestillingen, er foretrukket. Dette skyldes at de fluorescerende egenskapene til eskuletinringsystemet slukkes ved tilstedeværelsen av sukkersubstituentene i 7-stillingen; hydrolyse av det fluorogene, i motsetning til det fluorescerende, cichoriin (eller annen sukkeranalog) for å frigjøre eskuletin kan derfor observeres ved en økning i fluorescens. Ettersom eskuliner (og andre sukkeranaloger) allerede ikke har noen 7-hydroksysubstituent, fluorescerer de selv i den konjugerte tilstand, så ingen forskjell fra det frie aglykon kan observeres ved hjelp av fluorescens alene.

Når forbindelsen med den generelle formel I er en organisk ester, kan hver av Y og Z uavhengig av hverandre være en (CpC^alkylkarbonylgruppe. Foretrukne estere omfatter oktanoat- og butyratesterne. Esterderivatene kan anvendes når det mikrobielle enzym er en esterase.

Foretrukne forbindelser med den generelle formel I er: 3,4-sykloheksenoeskuletin-P-D-galaktosid, 3,4-sykloheksenoeskuletin-p-D-glukosid, 3,4-sykloheksenoeskuletm-p-D-glukuronid, 3-benzyl-4-metyleskuletin-(3-D-glukosid, 3,4-sykloheksenoeskuletin-N-acetyl-(5-glukosaminid, 3,4-sykloheksenoeskuletin- (5-D-xylosid, 3-n-butyl-4-metyleskuletin-P-D-galaktosid, 3-n-butyl-4-metyleskuletin-P-D-glukosid, 3,4-sykloheksenoeskuletin-6(7)-fosforsyre,

Ifølge et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstillingen av forbindelsene definert i generell formel I, som omfatter å derivatisere en eventuelt beskyttet forbindelse med generell formel II i 6- eller 7-stilling, og deretter eventuelt omdanne forbindelsen med generell formel I som derved dannes, til en annen forbindelse med generell formel I.

Derivatisering av forbindelsen med generell formel II til en forbindelse med generell formel I omfatter glykosylering, fosforylering og forestring.

Glykosidderivatet av forbindelsene med generell formel II kan dannes ved å behandle forbindelsen med et glykosid under egnede betingelser. Glykosylering av et eskuletinderivat inntrer i 7-stillingen på kumarinringen med mindre denne stillingen er blokkert, i hvilket tilfelle glykosylering kan finne sted i 6-stillingen. Et eksempel på en egnet blokkeringsgruppe er et benzylsyrehalogenid, slik som benzylklorid, benzylbromid eller benzyljodid, eller annen gruppe slik som benzylcyanid (Greene Protective Groups in Organic Synthesis, publ. Wiley-Interscience, s. 97-99 (1981)). Glykosylering etterfølges så av debenzylering ved hjelp av egnet behandling.

Det er foretrukket at hydroksylgruppene i glykosidet beskyttes ved tilsetning av en fjernbar beskyttelsesgruppe, slik som en acetylrest. Et eksempel på en egnet, beskyttet glykosidforbindelse er tetraacetylformen av P-glukosidet eller P-galaktosidet. Tetraace-tylderivatet kan avledes fra den tilsvarende p-acetobromheksose. Avbeskyttelse av hydroksylgruppene kan gjennomføres på hvilket som helst bestemt tidspunkt, men i praksis vil dette være sluttrinnet i dannelsen av den ønskede forbindelse. Avbeskyttelse<*>" kan omfatte behandling med en oppløsning av natriummetoksid i metanol når beskyttel-sesgruppen er en acetylrest. Betingelser for glykosylering kan velges av fagfolk innen teknikken uten unødig eksperimentering. Egnede betingelser kan imidlertid omfatte behandling av det beskyttede glykosid av eskulinet i en oppløsning av kaliumhydroksid i vandig aceton etterfulgt av avbeskyttelse. ;Organiske estere kan dannes fra den passende 6,7-dihydroksykumarinkarbok-sylsyre med generell formel II. Dihydroksykumarinkarboksylsyren kan eventuelt først acetyleres for å beskytte 6- og 7- hydroksylgruppene, og kan så omdannes til syrekloridet ved tilsetning av tionylklorid. Mono-, di- eller triaminoacylet kan dannes ved konjugasjon av syrekloridet med den passende aminoacylforbindelse. Aminoacylkon-jugatet kan forestres ved behandling med et (CrCi0)alkylkarbonylhalogenid i nærvær av pyridin. Eksempler på egnede alkylkarbonylhalogenider omfatter oktanoylklorid eller butyrylklorid. ;Dannelse av fosfatesterderivater kan oppnås ved behandling av eskuletinderivatet med fosforklorid (POCI3) i nærvær av pyridin (eller annet passende monofosforylerings-middel). ;Som nevnt ovenfor kan en forbindelse med generell formel I eventuelt modifiseres til en annen forbindelse med generell formel I. For eksempel kan, når enten Y eller Z er en enzymatisk avspaltbar gruppe, slik som en glykosidrest, glykosidet modifiseres in situ; for eksempel kan en glukoserest modifiseres til en glukuronsyrerest med oksygen i nærvær av platinakatalysator og karbon. Likeledes kan andre glykosider oksideres til deres 6-karboksylderivater (glukuronsyrer). I tillegg kan 7-substituerte substrater, f eks å-glukosider med generell formel I hvor Y er glukose, gi andre substrater ved passende om-setninger av den ledige fenolgruppe (6-hydroksyl), f eks karboksylestere, etterfulgt av avbeskyttelse av 7-substituenten med søtmandel-å-glukosidase. Dette gir derivater av ;eskulinsyreserien. ;Forbindelsene med generell formel II kan fremstilles ved å behandle en passende lineær eller syklisk P-ketoester (substituert eller usubstituert) med generell formel III med en forbindelse med generell formel IV i en Pechmann-kondensasjon. ;P-ketoesterne med generell formel III er som følger: ; ; hvor ;hver av R og R uavhengig av hverandre er en acetyl-(CH3CO-) eller acylgruppe med formel X(CH2)nCO-, hvor n er et tall fra 0 til 6 og X er: (i) hydrogen, (CrC8)alkyl, eller fenyl (C,-C8)alkyl, ;(ii) -C02CH3eller -C02C2H5, eller ;(iii) C2H5OOCCH2CO-, hvor n er 1; eller ;R er hydrogen, en (Ci-C8)alkyl- eller en fenyl (CrC8)alkylgruppe; eller ;R og R danner tilsammen et syklisk keton -(CH2)nCO-, hvor n er et tall mellom 4 og ;7; og ;R<8>er (Ci-Cg)alkyl, fenyl eller metylfenyl. ;Av P-ketoesterne med generell formel III hvor R og R danner et syklisk keton, er syklopentanon og sykloheksanon foretrukket. Det er også foretrukket at R<8>er butyl eller metylfenyl. ;Forbindelsene med generell formel IV er: ; ; hvor ;hver R<9>uavhengig av hverandre er hydrogen eller (CrC8)alkyl-CO; R<1>og R<2>er som beskrevet tidligere. ;De foretrukne forbindelser med generell formel IV er 1,2,4-trihydroksybenzenderivater eller, 1,2,4-triacetoksybenzenderivater ; hvor R<1>og R<2>er som beskrevet tidligere. ;I praksis er imidlertid 1,2,4-trihydroksybenzen forholdsvis ustabilt og det foretrukne utgangsmateriale er derfor 1,2,4-triacetohydroksybenzen. 1,2,4-triacetoksy-hydrobenzen kan syntetiseres ved hjelp av Thiele-Winter-acetylering av den tilsvarende benzokinonforbindelse. ;Foretrukne (i-ketoestere er: ;etyl-2-n-butylacetoacetat, ;etyl-2-benzylacetoacetat, ;etyl-2-sykloheksanonkarboksylat, og ;etyl-2-syklopentanonkarboksylat. ;Produktet fra dette trinnet er en forbindelse med generell formel II som definert ovenfor. Andre forbindelser som er nevnt, er trivielt syntetiserbare ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent innen teknikken. ;Dannelsen av 6,7-dihydroksykumarinkarboksylsyrer innenfor generell formel II kan utføres ved å behandle en egnet (3-ketoester med generell formel III, hvor X er ;(a) -CO2CH3, eller C02C2H5hvor n er et tall mellom 0 og 6, eller ;(b) C2H5OOCCH2CO-, hvor n er 1, ;med en forbindelse med generell formel IV som definert ovenfor. ;Foretrukne utgangsforbindelser omfatter dietylacetondikarboksylat, dimetyl-2-acetylglutarat eller dietylacetylglutarat. Når dietylacetondikarboksylat behandles med 1,2,4-triacetoksybenzen, er produktet etter hydrolyse 6,7-dihydroksykumarin-4-eddiksyre. ; Utgangsmaterialer som ikke allerede er beskrevet, er lett syntetiserbare ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent innen teknikken. ;Ifølge et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt et preparat som omfatter en forbindelse med generell formel I og eventuelt et fortynningsmiddel, en eksipiens eller et substrat som alle er mikrobiologisk aksepterbare. Substratet kan være et fast eller halvfast vekstunderstøttelsesmedium eller et flytende vekstunderstøttelses-medium. ;Agar er det tradisjonelle understøttelsesmedium som brukes innen mikrobiologi ;til veksten av mikroorganismer. Det fremstilles ved å autoklavere den dehydratiserte agar i vann med andre komponenter om nødvendig. Autoklaveringsprosessen ved temperatur-er over 100 °C forårsaker at agaren rehydratiseres slik at det dannes en gelatinøs, flytende agaroppløsning. Den dannede flytende agar får avkjøles litt og helles så, mens den fortsatt er flytende, over i egnede beholdere, slik som kulturplater eller Petri-skåler. Agaren vil gelere slik at det dannes et understøttelsesmedium etter ytterligere avkjøling. Valget av agar vil avhenge av stammen av mikroorganismer som skal dyrkes, men kan velges fra én av de følgende preparater: bakteriologisk agar, Columbia-agar, edelagar, utvelgelses-agar, hjerne-hjerte-infusjonsagar, LB-agar eller Lennox næringsagar, luria-agar, gjær-ekstrakt eller tryptonfordøyelsesprodukt, Andre valg av medium er beskrevet i Sambrook et al, Molecular Cloning, 2. utgave, A1-A3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), og i Difco Manual, 10. utgave, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA. ;Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan blandes med den dehydratiserte agar som separate komponenter eller fremstilles som kombinerte partikler etter hva som passer. ;Vanligvis kan det utvalgte dyrkningsmedium også omfatte ett eller flere essensielle næringsstoffer, mineral, vitamin og/eller antibiotikum for å velge ut, fremme eller hjelpe til i veksten av en bestemt mikroorganisme, eller for å hjelpe til ved identifikasjonen eller nummereringen av en bestemt mikroorganisme. Antibiotika som vanligvis anvendes i mikrobiologiske dyrkningsmedier, omfatter: ampicillin, kloramfenikol, D-sykloserin, gentamicin, kanamycin, nalidinsyre, rifampicin, spektinomycin, streptomycin og tetrasyklin. Essensielle næringsstoffer omfatter aminosyrer som mikroorganismen som skal dyrkes, er vekstmangelfull på, eller en slik fermenterbar karbonkilde som et karbo-hydrat. Det kan også være nødvendig å tilsette visse mineraler, slik som f eks magnes-ium, kalsium, natrium, kalium eller jern, i form av et passende salt, eller ammonium-eller fosfatsalter. ;Dyrkingen av mikroorganismer på et fast understøttelsesmedium, slik som agar, kan utføres i en egnet beholder og denne vil i praksis være Petri-skålen eller kulturplaten. Vanligvis omfatter beholderen en base med et overhengende lokk for å la oksygen tilføres til aerobe bakterier når platen inkuberes. Når det dyrkes anaerobe bakterier, kan lokket være forseglet til basen eller platen kan inkuberes i en anaerob inkubator. ;Ifølge et fjerde aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for påvisning og/eller identifikasjon av mikroorganismer i en prøve, som omfatter trinnet med (a) å dyrke en mikroorganisme isolert fra prøven på et vekstunder-støttelsesmedium som inneholder en forbindelse med generell formel I, og (b) påvise frigjørelsen av en identifiserbar, kromogen eller fluorogen markør etter hydrolyse av forbindelsen med generell formel I. Mikroorganismene kan også være til stede i et flytende vekstunderstøttelsesmedium eller flytende prøve som skal analyseres. ;Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes til å påvise både gram-negative og gram-positive bakterier. Fremgangsmåten har anvendelse, men er ikke begrenset til påvisningen av de følgende slekter: Enterococcus, Listeria, Streptococcus, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Proteus, Providencia, Salmo-nella, Serratia, Shigella og Yersinia. ;Den fluorescerende eller, sammen med jern, fargede markør som påvises ved fremgangsmåten, er resultatet av hydrolysen av forbindelsen med generell formel I som frigjør eskuletinresten. Hydrolyse av forbindelsen kan være karakteristisk for tilstedeværelsen av en mikroorganisme som skal påvises. ;Spesifikk påvisning av mikroorganismer er påkrevet på sykehus for å hjelpe til ved klinisk diagnose og effektiv fastleggelse av et passende forløp for medisinsk behandling. Vanlige biologiske prøver som en lege vil ønske å analysere med hensyn på mikro-organismeinnholdet, er spytt, urin, blod, avføring, innholdene i magesekken eller en biopsiprøve. Matvare- og drikkevareindustriene krever også spesifikk påvisning av mikroorganismer for å overvåke og opprettholde produktkvalitet og -sikkerhet. Likeledes trenger også vannindustrien å være i stand til å overvåke tilstedeværelsen og kvantiteten av mikroorganismer som er til stede i vanntilførselen. Egnede prøver for analyse ved fremgangsmåten ifølge dette aspektet av oppfinnelsen vil derfor være et spiselig stoff, vann eller annen drikkevare. ;Fremgangsmåten gjør i sin foretrukne form bruk av de forskjellige nye eskuletinderivatene som indikatorer for bestemte enzymatiske aktiviteter ved inkor-porering av agarmedium. På grunn av den hovedsakelig ikke-spredende karakter til jernchelatet som fremstilles, kan kolonier visualiseres og, forutsatt at mediet er passende selektivt, identifiseres. Fremgangsmåten tilpasses godt til bruken av cellulosenitrat-membranfilteret og derved til kolonitelling. ;Ifølge foreliggende oppfinnelse kan forbindelsene være til stede i vekstunder-støttelsesmediet ved en effektiv konsentrasjon som kan være fra 0,1 mg/ml til 2 mg/ml, passende fra 0,2 mg/ml til 1 mg/ml, og fortrinnsvis fra 0,4 mg/ml til 0,8 mg/ml. Det er foretrukket at en konsentrasjon på 0,5 mg/ml anvendes når vekstunderstøttelsesmediet er Columbia-agar. ;Følgelig omfatter foreliggende oppfinnelse også et sett som omfatter et vekstmedium inneholdende en forbindelse med generell formel I. Settet kan i tillegg omfatte en slik beholder som en Petri- eller kulturskål. ;Foretrukne trekk for det andre og etterfølgende aspekt av oppfinnelsen er som for det første aspekt mutatis mutandis. ;Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet ved eksemplifisering under henvisning til de ledsagende eksempler som er tilveiebrakt for illustrasjonsformål. ;Eksempler 1- 4: ;Syntese av substituerte eskuletiner (6,7-dihydroksykumariner) ;Materialer ;Columbia-agar ble erholdt fra Lab M, Bury, Storbritannia. Kjemikalier involvert i syntesen av eskuletinderivatene ble alle erholdt fra Aldrich Chemical Company Ltd, Gillingham, Storbritannia. ;Eksempel 1: ;Syntese av 6,7-dihydroksy-3,4-sykloheksenokumarin ; ; 1,2,4-triacetoksybenzen (6,3 g, 25 mmol) og etyl- sykloheksanon-2-karboksylat (4,25 g, 25 mmol) ble varmet opp sammen i en liten kolbe inntil det ble erholdt en homogen, viskøs væske. Den lavest mulige temperatur ble anvendt. Den varme væsken ble avkjølt noe og en magnetrører innført. Avkjøling under 30 °C forårsaket størkning og derfor ble det ved denne temperaturen hurtig tilsatt 75 vekt% svovelsyre (35 ml) avkjølt til 10 °C til den omrørte væske. Dette senket temperaturen samtidig som homogeniteten ble opprettholdt. Reaksjonen fikk fortsette ved omgivelsestemperatur i 6 timer, idet det etter ca 3 timer ble dannet en hvit suspensjon. ;Suspensjonen ble i en tynn strøm helt over i hurtig omrørt is/vann (300 ml) og ga en suspensjon av kremgult fast stoff. Etter omrøring i 10 minutter ble det faste stoff fjernet ved vakuumfiltrering, vasket med rikelig vann og sugd tørt, og så lufttørket ved 40-50 °C. Råmaterialet ble krystallisert fra varm etanol. Etter avkjøling skiltes det ut lysegule nåler. Disse ble fjernet ved vakuumfiltrering og lufttørket (5,2 g (89 %)). ;Eksempel 2: ;Syntese av 6,7-dihydroksy-3-benzyl-4-metylkumarin ; 1,2,4-triacetoksybenzen (6,3 g, 25 mmol) og etyl-2-benzylacetoacetat (5,5 g, 25 mmol) ble varmet opp sammen som beskrevet i eksempel 1. 75 % svovelsyre (35 ml) ble tilsatt til den omrørte oppløsning og omrøring ble fortsatt i 16 timer. Den mørkt fargede suspensjon ble helt over i is/vann (350 ml) med god omrøring og den grå suspensjonen filtrert og resten vasket med rikelig vann. Det gjenværende faste stoff ble lufttørket og rekrystallisert fra varm etanol med etterfølgende tilsetning av litt vann for å hjelpe til ved krystallisasjon. Eskuletinderivatet dannet små hvite nåler (5,5 g, 75,3 %). ;Eksempel 3: ;Syntese av 6,7-dihydroksy-3-acetyl-4-metylkumarin ; ; 1,2,4-triacetoksybenzen (6,3 g, 25 mmol) og etyldiacetoacetat (4,3 g, 25 mmol) ble varmet opp sammen som beskrevet tidligere og behandlet med 75 % svovelsyre (35 ml). Etter 16 timer ble råproduktet isolert ved å helle det over i is/vann. Det lufttørkede materialet ble krystallisert fra varm etanol med tilsetning av varmt vann inntil krystallisa-sjonspunktet. Etter avkjøling ble det dannet lysegule nåler (3,5 g, 60 %). ;Eksempel 4: ;Syntese av 6,7-dihydroksy-4-metylkumarin-3-propionsyre ; ; 1,2,4-triacetoksybenzen (6,3 g, 25 mmol) og dimetyl-2-acetylglutarat (5,75 g, 25 mmol) ble varmet opp sammen og behandlet med 75 % svovelsyre (35 ml) som beskrevet tidligere. Etter omrøring i 20 timer ble råmaterialet isolert ved å helle det over i is/vann og produktet ble samlet opp etter vasking med vann. Produktet (etyl-6,7-dihydroksy-4-metylkumarin-3-propionat) ble krystallisert fra varm etanol (4,1 g, 56 %). ;Esteren ble hydrolyser! ved omrøring med en vandig oppløsning av kaliumhydroksid (3 % vekt/volum) som omfatter vann (90 ml) og etanol (10 ml). Etter flere timer avslørte en testprøve ikke noen gjenværende ester (TLC under anvendelse av etylacetat: toluen (3:1), u.v.-inspeksjon). Den alkaliske oppløsning ble omrørt og surgjort til pH 2-3 under anvendelse av saltsyre (2M). Den utfelte syre ble fjernet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og rekrystallisert fra en blanding av varm metanol og vann (1:1) (2,95 g,44,6%). ;Beslektet preparat: ;6,7-dihydroksykumarin-4-eddiksyre ; ; Dette ble fremstilt som i eksempel 4 ved utbytting av den anvendte ester med dietylacetondikarboksylat (5,05 g, 25 mmol). Temperaturen i den 20 timer lange reaksjonen ble holdt ved 10-15 °C for å forhindre mulig hydrolyse og dekarboksylering. Den isolerte syre utgjorde 2,4 g (47 %). ;Triacetoksybenzenet som ble anvendt ved de ovenfor nevnte, syntetiske fremgangsmåter, var enten innkjøpt (Lancaster Synthesis Ltd, Morecambe, Lancs) eller laget ved hjelp av Thiele-Winter-acetylering av p-benzokinon under anvendelse av et eddiksyreanhydrid. ;Eksempler 5- 10: ;Syntese av glykosider og beslektede forbindelser ;Eksempel 5: ;Syntese av 3,4-sykloheksenoeskuletin-P-D-glukopyranosid ; ; 3,4-sykloheksenoeskuletin (6,7-dihydroksy-3,4-sykloheksenokumarin (3,5 g, 15 mmol) ble oppløst i en vandig oppløsning av kaliumhydroksid, 16 ml 10 % vekt/volum KOH (29 mmol). Med omrøring oppløstes eskuletinet hurtig. Til dette ble det tilsatt a-acetobromglukose (6,25 g, 15 mmol) oppløst i aceton (18 ml). Oppløsningen var homogen og ble lysere i farge etter omrøring. Etter 18 timer ved 10-15 °C ble det dannet en gul utfelling. Denne ble fjernet ved filtrering hvorved man fikk en gul kake (3,0 g tørrvekt). ;Filtratet ble helt sakte over i omrørt isvann (200 ml). Utfellingen som ble dannet, ble filtrert på en Buschner-trakt, vasket med vann og tørket, hvorved man fikk en gummi-masse. Denne ble oppløst i diklormetan (50 ml) med oppvarming. Den svake utfelling som ble dannet etter avkjøling, ble fjernet. TLC viste at denne var 3,4-sykloheksenoeskuletin. Filtratet inneholdt tetraacetylglykosidet med et spor av eskuletinet. ;Den gule kake ble oppmalt og ekstrahert med varmt diklormetan og suspensjonen filtrert, idet resten (1,4 g) av eskuletinet ble beholdt for fremtidig glykosidering. Filtratet fra dette ble slått sammen med den tidligere diklormetanekstrakt, tørket med magnesiumsulfat (vannfritt) og rotasjonsinndampet, hvorved man fikk et lyst, fast stoff. Dette ble oppløst i varm metanol og rekrystallisert fra denne, hvorved man fikk små fargeløse krystaller av den rene tetraacetylforbindelsen (2,5 g, 29 %). ;Deacetylering ble utført ved å anvende natriummetoksid i metanol). Nyoppkuttet natrium (1,0 g) ble oppløst i metanol (100 ml). ;Tetraacetylforbindelsen (2,5 g) ble oppløst i metanol (50 ml) og behandlet med natriummetoksidoppløsning (20 ml). Forløpet av deacetylering ble fulgt ved hjelp av TLC inntil bare grunnlinjematerialet (oppløsningsmidlet - etylacetat/toluen, 3:1) var tilbake. Den metanoliske oppløsning ble brakt til pH 6,5 ved tilsetning av aliquoter av Amberlite IRI20 (H<+>), analytisk finhetsgrad, vasket etterbehandling med syre. Super-natantvæsken ble dekantert fra harpiksen og den sistnevnte vasket med metanol (3x10 ml). Metanol ble fjernet ved rotasjonsfordampning ved 30-40 °C og det gjenværende faste stoff krystallisert fra metanol/vann (1,5 g, 86 %). ;Eksempel 6: ;Syntese av 3-benzyl-4-metyleskuletin-(3-D-glukopyranosid ; ; 3-benzyl-4-metyleskuletin (eksempel 2) (4,25 g, 15,6 mmol) ble oppløst i en vandig oppløsning av kaliumhydroksid (16,5 ml 10 % vekt/volum KOH (29 mmol)) med omrøring. Det skiltes snart ut et gult, fast stoff, kaliumsaltet. En oppløsning av a-aceto-bromglukose (6,6 g, 16 mmol), oppløst i aceton (20 ml), ble tilsatt til den omrørte opp-løsning. Ytterligere tilsetning av aceton (3-4 ml) sikret homogenitet. Den lysebrune oppløsning ble omrørt over natten (16 timer). Den resulterende pasta ble frafiltrert med sug og resten sugetørket og så lufttørket ved romtemperatur. Tetraacetylglukosidet ble ekstrahert over i varm kloroform (3 x 30 ml) og den resulterende suspensjon filtrert fraen sparsom utfelling. Kloroformoppløsningen ble vasket med kald, fortynnet (3 %) natrium-karbonatoppløsning (3 x 30 ml) etterfulgt av vann. Den organiske fase ble tørket under anvendelse av vannfritt magnesiumsulfat og rotasjonsinndampet, hvorved man fikk et hvitt, fast stoff. Dette ble oppløst i varm etanol (100 ml) og avkjølt til 0 °C over natten. Krystallene ble fjernet ved sugefiltrering og pressing. Etter tørking i en vakuumovn veide produktet 3,0 g (32 %). Deacetylering av tetraacetylglukosidet (3,0 g) under anvendelse av metanolnatirummetoksid ble oppnådd som beskrevet i eksempel 5, og ga p-glukosidet (1,8 g,81,4%). ;Eksempel 7: ;Syntese av 3,4-sykloheksenoeskuletin-p-D-galaktopyranosid ; ; 3,4-sykloheksenoeskuletin (6,95 g, 30 mmol) ble oppløst i en vandig oppløsning - av kaliumhydroksid (35 ml, 10 % vekt/volum KOH (62,5 mmol)). a-acetobromgalaktose (13,6 g, 33 mmol) ble oppløst i aceton (36 ml) og denne oppløsningen ble tilsatt til den omrørte vandige eskuletinoppløsning. Tilsetning av litt mer aceton var nødvendig for å få en homogen oppløsning. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten (10-15 °C). Utfelling stanset ?? (commenced betyr startet) etter 4 timer. Suspensjonen ble filtrert etter 16 timer. Resten < 1 g ble påvist å være hovedsakelig det uendrede eskuletin og ble kassert. Filtratet var tofaset, bestående av en nedre viskøs fase og et øvre vannlag. Den nedre fase ble etter separasjon helt over i en brønn med is/vann (250 ml) under omrøring, hvorved man fikk et rikelig hvitt bunnfall. Dette ble fjernet ved sugefiltrering, vasket med kaldt vann og tørket. Det tørkede faste stoff ble oppløst i diklormetan. TLC viste en stor, hurtig bevegende flekk av tetraacetylgalaktosidet og svært lite av eskuletinet. ;Det vandige øvre lag fra reaksjonsblandingen ble konsentrert ved rotasjons-inndamping ved 30-40 °C og helt over i isvann. Produktet var mye mindre enn fra det nedre lag, men inneholdt fortsatt en vesentlig mengde av det ønskede produkt. Det utfelte stoff ble fjernet ved sugefiltrering, tørket og oppløst i diklormetan. ;De kombinerte diklormetanoppløsninger ble vasket med fortynnet vandig na-triumkarbonat (2 x 50 ml) og så med vann. Etter tørking med vannfritt magnesiumsulfat ble oppløsningsmidlet fjernet ved rotasjonsfordampning ved 30 °C, hvorved man fikk en viskøs olje som ikke størknet. ;Det oljeaktige tetraacetylgalaktosid ble avbeskyttet ved oppløsning i metanol og tilsetning av metanolisk natriummetoksid (30 ml 1 % oppløsning) som beskrevet i eksempel 5. Etter avdamping av metanol dannet galaktosidet en olje som hurtig størknet til en masse av hvite krystaller (5,2 g, 44,8 %). ;Eksempel 8: ;Syntese av 3,4-sykloheksenoeskuletin-P-D-glukuronid ; Til en omrørt oppløsning av 3,4-sykloheksenoeskuletin (2,32 g, 10 mmol) og metyl-2,3,4-tri-0-acetylglukopyranosylbromiduronat (3,97 g, 10 mmol) i nydestillert kinolin (20 ml) ble det tilsatt nyfremstilt sølv (I)-oksid (1,86 g, 15 mmol). Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 24 timer i fravær av lys. Den resulterende oppslem-ming ble filtrert med sug, idet resten ble vasket med kald aceton inntil den var lysegrå av farge. Filteret ble sakte tilsatt til omrørt kald saltsyre (200 ml, 2M), hvorved man fikk en tett, grå utfelling som ble samlet opp ved sugefiltrering og vasket med mer 2M saltsyre (2 x 30 ml), resten ble sugd tørr og tørket i en vakuumtørkeovn ved omgivelsestemperatur. Rekrystallisasjon fra metanol ga et gråhvitt fast stoff (0,82 g, 15 %). ;Det acetylerte metyluronat ble avbeskyttet ved oppløsning i metanol og tilsetning av en femtedels molforhold av metanolisk natriumhydroksid (95 % metanol/5 % vann). Etter omrøring i 5 timer ble metanol fjernet ved rotasjonsfordampning. Vann (10 ml) ble tilsatt og oppløsningen nøytralisert med 2M saltsyre. Vann ble fjernet ved rotasjonsfordampning ved 60 °C og resten oppslemmet og omrørt i aceton i 1 time. Det opp-slemmede glukuronid ble fjernet ved sugefiltrering og aceton fjernet ved rotasjonsfordampning, hvorved man fikk et amorft, lysebrunt pulver (0,41 g, 65 %). ;3,4-sykloheksenoeskuletin-P-D-xylopyranosid og 3,4-sykloheksenoeskuletin-N-acetyl-P-D-glukosaminid ;Ved hjelp av lignende fremgangsmåter som de som er beskrevet, ble de følgende glykosider syntetisert, selv om de ikke ble isolert i ren tilstand. ;3,4-sykloheksenoeskuletin-p-D-xylopyranosid ; 3,4-sykloheksenoeskuletin-N-acetyl- p-D-glukosaminid ; Eksempel 9: ;Syntese av 3,4-sykloheksenoeskuletin-6(7)-fosforsyre ; Til en omrørt oppløsning av 3,4-sykloheksenoeskuletin (2,32 g, 10 mmol) i pyridin (5 ml) og toluen (10 ml) ble tilsatt fosforylklorid (1,84 g, 12 mmol) ved 0 °C. Den omrørte oppløsning fikk varmes opp til romtemperatur og ble deretter varmet opp på et oljebad ved 60 °C i 2 timer. Den avkjølte reaksjonsblanding ble helt over i vann med god omrøring og gjort alkalisk (pH 12) ved tilsetning av 2M hydroksidoppløsning. ;Etter lagring over natten ved 5 °C ble toluenet fjernet ved hjelp av diklor-metanekstraksjon og vannlaget ble regulert til pH 8 med saltsyre og rotasjonsinndampet ved 50-60 °C, hvorved man fikk en lysegul rest. Denne ble oppløst i varmt vann og etter avkjøling til 0 °C skiltes natriumsaltet av fosfatet ut som et gråhvitt pulver. TLC (oppløs-ningsmiddel - etylacetat/toluen, 3:1) viste hovedsakelig grunnmaterialet (u.v.-absor-berende), men fortsatt med noe forurensende eskuletin til stede. Dette kunne stort sett fjernes ved gjentatt ekstraksjon med eter. ;Eksempel 10: ;Syntese av N(-7(6)-oktanoyloksy-6(7)-hydroksykumarin-4-acetyl)-glysylglysin ; 6,7-dihydroksykumarin-4-eddiksyre (2,04 g, 10 mmol) ble acetylert ved opp-løsning i overskudd av eddiksyreanhydrid (10 ml) og tilsetning av 2-3 dråper svovelsyre (d = 1,84). Etter forsiktig oppvarming inntrådte en svak eksoterm og etter ytterligere 30 min ved 40 °C ble reaksjonsblandingen avkjølt og helt på is/vann (100 ml). Det hvite faste stoff som sakte ble dannet, ble fjernet ved sugefiltrering og vasket med kaldt vann og tørket i en vakuumovn ved omgivelsestemperatur. ;Produktet (diacetatet) ble ikke rekrystallisert, men ble omdannet til syrekloridet ved tilsetning av tionylklorid (10 ml) og etterfølgende ny blanding i 1 time. Overskuddet av tionylklorid ble fjernet under redusert trykk og sporene ble eliminert ved gjentatt inn- - damping med tørr eter. ;Det oljeaktige syreklorid ble oppløst direkte i tetrahydrofuran (20 ml) og innført i en sakte strøm i en godt omrørt oppløsning av glysylglysin (1,32 g, 10 mmol) oppløst i en blanding av vann (20 ml) og pyridin (2 ml) for å virke som base. Etter 3 timer ble opp-løsningen rotasjonsinndampet for å fjerne tetrahydrofuran og avbeskyttet ved tilsetning av konsentrert ammoniakk (5 ml). Etter 1 time var deacetylering fullstendig og oppløs-ningsmidler ble fjernet ved rotasjonsfordamping under redusert trykk ved 50-60 °C. Produktet var forurenset med overskudd av glysylglysin og salter, og ble derfor rekrystallisert fra metanol/vann, hvorved man fikk produktet N(6,7-dihydroksykumarin-4-acetyl)glysylglysin. ;Forestring ;Glysylglysinkonjugatet (1,68, 5 mmol) ble oppløst i pyridin (10 ml) og til den omrørte oppløsning ble det tilsatt oktanoylklorid (0,9 g, 5,5 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og så helt over i en blanding av is/vann (90 ml) og konsentrert saltsyre (10 ml) med effektiv omrøring. Det gummiaktige faste stoff som skiltes ut, ble oppløst i etylacetat og vasket med konsentrert natrium-kloridoppløsning. Den organiske fase ble fraskilt, tørket (vannfritt natriumsulfat) og rotasjonsinndampet, hvorved man fikk et voksaktig fast stoff av oktanoatesteren av det"* hydrofile eskuletin.

N(7(6)-butyryloksy-6(7)-hydroksykumarin-4-acetyl)glysylglysin

Ved hjelp av en lignende fremgangsmåte, men ved å bytte ut med butyrylklorid (0,58 g, 5,5 mmol) i forestringsfremgangsmåten, ble det erholdt den tilsvarende butyratester (N(7(6)-butyryloksy-6(7)-hydroksykumarin-4-acetyl)-glysylglysin).

Eksempel 11:

Testfremgangsmåter under anvendelse av forbindelser som er tidligere syntetisert i eksemplene 1-10

Bakteriologiske undersøkelser ble utført på agarplater med glykosider eller andre derivater av de modifiserte eskuletiner inkorporert. Den følgende beskrivelse, hvor det anvendes 3,4-sykloheksenoeskuletin-å-D-glukosid til differensiering av gram-positive streptokokker og beslektede organismer, og til visualisering av eskulin-positive kolonier, tjener til å illustrere den generiske anvendelse av disse nye forbindelsene. - -

Eskulinagar ble fremstilt på følgende måte: Columbia-agar (45 g), jern(III)am-moniumsitrat (0,5 g) og eskulin (1,09 g) ble oppløst ved koking i destillert vann (1 liter). pH i dette mediet ble så regulert til 7,5 og mediet sterilisert ved autoklavering i 10 min ved 116 °C. Mediet fikk avkjøles til 55 °C før det ble helt over i 20 ml volumer. Agar inneholdende 3,4-sykloheksenoeskuletin-P-D-glukosid ble fremstilt på en identisk måte, bortsett fra at eskulin ble byttet ut med dette nye glykosidet (CHE-å-D-gluk) (0,5 g).

150 stammer av enterokokker samlet opp fra et bredt spekter av sykehus- og miljøprøver ble identifisert under anvendelse av fremgangsmåten til Facklam og Collins (J. Clinical Microbiol. 27, s. 731-734 (1989)). Hver av disse stammene ble inokulert i fysiologisk saltoppløsning for å fremstille et inokulum av omtrent IO<8>organismer pr ml. Dette ble oppnådd ved å utføre en sammenligning med en McFarlane Standard 0,5. Ved å

anvende en flerpunktsinokulator (Denley) ble så 1 il av hver suspensjon inokulert på begge testmediene, idet man sikret at ikke mer enn 12 stammer ble inokulert pr plate. I tillegg til disse enterokokkene ble et utvalg av 40 streptokokker og stammer av Listeria

sp. samlet inn og identifisert med API 32 STREP med supplerende tester der hvor det ble angitt. Disse ble også inokulert på identisk måte. 250 stammer av Enterobacteriaceae ble også samlet inn fra et bredt spekter av kilder, og deres identitet bekreftet ved hjelp av API 20 E-systemet (Biomerieux). Disse ble inokulert på både eskulin- og CHE-P-D-glukosid-medium som beskrevet ovenfor.

Til sist ble 7 stammer av enterokokker og to stammer av streptokokker erholdt fra National Collection of Type Cultures (NCTC), London. Disse var: Enterococcus faecium NCTC 7171, Enterococcus faecalis NCTC 755, Enterococcus gallinarum NCTC 11428, Enterococcus mundtii NCTC 12343, Enterococcus casselijlavus NCTC 12341, Enterococcus durans NCTC 8307, Enterococcus raffinosis NCTC 12192, Streptococcus agalactiae NCTC 8181 og Streptococcus bovis NCTC 8177. Suspensjoner av disse 10 stammene ble fremstilt som ovenfor ved 10<8>organismer pr ml og fortynnet i sterilt, destillert vann ved hjelp av standardmetoder for å fremstille suspensjoner med omtrent 1 organisme pr ml. 3 x 100 ml volumer av hver suspensjon ble så filtrert på 3 cellulose-nitratmembranfiltere (Sartorius) under anvendelse av en standard filtreringsmetode. Ett av disse filtrene ble plassert på en CHE-P-D-glukosidplate, den andre på en eskulinplate og den tredje på en Columbia-agarplate uten substrat. Alle platene ble inkubert ved 37 °C i luft i nøyaktig 18 timer, bortsett fra platene inokulert med streptokokker som ble inkubert i luft supplert med 5 % karbondioksid. Etter inkubasjon ble platene undersøkt med henblikk på tilstedeværelsen av sorte eller brune kolonier, og kolonitellinger ble utført på membranfiltrene.

Resultater:

Alle stammer som ble brukt i denne undersøkelsen, vokste godt på både CHE-{3- - D-glukosid- og eskulinholdige medier. De to substratene var merkbart forskjellige når det gjelder diffusjon i agaren. Hydrolyse av eskulin resulterte i et sort kompleks som dif-funderte i stor grad, mens hydrolyse av CHE-P-D-glukosid ga et sort kompleks svært begrenset til bakterieveksten. Det kan ses i tabell 1 at hydrolysen av CHE-P-D-glukosid korrelerte svært nært til hydrolyseeskulin. Dette gjaldt spesielt for de gram-positive bak-teriene hvor hver stamme som ble testet, viste fullstendig korrelasjon mellom de to substratene. Av 150 stammer av enterokokker og 12 stammer av Listeria sp. hydrolyserte hver stamme både eskulin og CHE-P-D-glukosid, hvorved det ble fremstilt sorte kolonier. Utmerket korrelasjon ble også oppnådd med disse to substratene for de gram-negative bakterier som ble testet. Ett unntak fra dette var i tilfellet med E. coli hvor stammer (10 %) viste seg å hydrolysere CHE-p-D-glukosid, men var ute av stand til å hydrolysere eskulin.

I membranfiltreringsforsøket ga alle NCTC-stammene av enterokokker og stammen av S. bovis sorte kolonier på CHE-P-D-glukosid-medium. På filtrene plassert på eskulinmedium ga alle stammene et lysebrunt, diffunderbart kompleks som spredte seg utover overflaten til filteret og også inn i agaren under membranen. Det var ingen statistisk forskjell mellom koloniantallene på CHE-P-D-glukosid, eskulin eller hjerne-hjerte-infusjon for noen av organismene som ble testet (data ikke vist). S. agalactiae NCTC tjente som en negativ kontroll og oppviste ikke hydrolyse av noen av stoffene.

Hovedfordelen ved CHE-P-D-glukosid er at når det frigjorte sykloheksenoeskuletin kombineres med jern, er det resulterende sorte kompleks svært uoppløselig og diffunderer ikke gjennom agarmediet. Dette resulterer i dannelsen av atskilte sorte kolonier som det lett kan skjelnes mellom i en blandet kultur. Når eskulin hydrolyseres, kombineres det frigjorte eskuletin derimot med jern slik at det dannes et brunt/sort kompleks som diffunderer hurtig gjennom agar. Denne diffusjonen kan føre til vanskeligheter med å skille ut eskulinpositive kolonier i en blandet kultur. Forskjellen mellom de to substratene trer sterkt frem i fig. 1 som viser en stamme av Listeria monocytogenes (NCTC 11994) på CHE-p-D-glukosidmedium og en tradisjonell eskulinbasert selektiv agar. Fraværet av enhver diffusjon av det sorte kompleks når det anvendes CHE-p-D-glukosid, vil også kunne gi en betydelig fordel når bakterier identifiseres under anvendelse av en flerpunkts inokulasjonsteknikk dersom det anvendes store antall stammer på hver plate.

En annen svært nyttig fordel ved CHE-P-D-glukosid som har fremkommet fra denne undersøkelsen, er dets mulige anvendelse i membranfiltreringsundersøkelser med hensyn på faecestreptokokker/enterokokker. Eskulin har lenge vært ansett som et potens-ielt anvendbart substrat for et slikt formål, problemene som er forbundet med diffusjonen av eskuletinkomplekset, har imidlertid ikke blitt overvunnet til tross for store anstreng-elser. (Daoust et al, Applied Microbiology 29, s. 584-589 (1975)). Dette problemet med - diffusjon er særlig akutt når store antall enterokokker er til stede og hele membranen far-ges med det gyllenbrunfargede eskuletinkompleks (Brodsky et al, Applied and Environmental Microbiology 31, s. 695-699 (1976)). Når CHE-p-D-glukosid anvendes som substrat, vokser enterokokker som atskilte sorte kolonier på membranen, og som lett kan skilles ut i blandet populasjon. Dette skyldes at dette sorte kompleks som dannes i kolonien, ikke er i stand, til å diffundere gjennom membranen og inn i agaren, og følgelig er en eventuelt fremstilt farge svært begrenset til den aktuelle koloni. I tilfellet med eskulin diffunderer det mindre komplekset som dannes lett gjennom membranen og inn i agaren, og den brune fargen som fremstilles, er lite synlig på grunn av omfattende diffusjon. Denne forskjellen mellom de to substratene fremkommer godt i fig. 2.

Det er blitt rapportert at hydrolyse av eskulin hurtig kan påvises ved å overvåke bortfallet av det naturlige substratfluorescens under hydrolyse i nærvær av jernsalter (Edberg et al, J. Clinical Microbiology 4, s. 180-184 (1976)). CHE-p-D-glukosid, i motsetning til eskulin, fluorescerer ikke på grunn av utbyttingen av 7-hydroksylgruppen i sykloheksenoeskuletinmolekylet. Når dette substratet hydrolyseres, er imidlertid det frigjorte sykloheksenoeskuletin fluorescerende. En alternativ strategi for en fluorescens-analyse for anvendelse av CHE-p-D-glukosid ville derfor være å se etter generering av fluorescens i fravær av jernsalter. Som konklusjon er CHE-P-D-glukosid et svært nyttig' substrat som gir et sort ikke-diffunderbart produkt etter hydrolyse ved hjelp av P-D-glukosidase i nærvær av jern. Substratet synes å være ikke-inhiberende og dets syntese er forholdsvis lettvint.

Eksempel 12:

CHE-glukosid i blodagar

Sykloheksenoeskuletin-glukosid (CHE-glukosid) ble inkorporert i blodagarbaser for påvisning og identifikasjon av organismer som gir høy hemolyse og produserer glukosidase. Når organismer inkuberes anaerobt, kan CHE-glukosid-blodagarbaser brukes til å påvise tilstedeværelsen av glukosidaseinduserende anaerobe bakterier, slike som Bact. fragilis. 41 g Columbia-agarbase (Lab 1) ble utveid og plassert i en kolbe sammen med 0,5 g CHE-glukosid, 0,95 g jem(III)-glukonat og 0,05 g sinkacetat. En liter vann ble tilsatt, og det ble blandet autoklavert ved 121 °C i 15 min. Kolben ble avkjølt til 47 °C og 100 ml hesteblod ble tilsatt, det ble blandet og helt opp i Petri-skåler.

Bakterier testet:

Strept. pyrogenes - 3 stammer

Strept. milleri - 1 stamme

Enterococci spp. - 5 stammer

Group C Streptococci - 2 stammer

Strep. sanguis - 1 stamme

Ps. aeruginosa - 1 stamme

E. coli - 1 stamme

Clost. perfringens - 1 stamme

Bact. fragilis - 1 stamme

Resultater:

De følgende stammer ga sorte kolonier: Alle stammer av Enterococci, Strep. sanguis, Strept. milleri Group F, Bact. fragilis.

Alle stammer av Strept. pyrogenes, Streptococci som tilhører gruppene B, C og

F, og noen enterokokker ga noe hemolyse.

Den kan oppsummeres med at CHE-glukosid inkorporert i blodagarbaser gir klar påvisning av glykosidaseenzymer uten noen interferens med hemolysemønstre. Ved å anvende disse to indikatorene og passende, selektive midler, kan disse viktige patogenene isoleres og foreløpig identifiseres på primærkulturplater.

Claims (15)

1. Forbindelse, karakterisert vedat den har den generelle formel I:

hvor R<1>og R<2>er et hydrogenatom; hver av R<3>og R<4>uavhengig av hverandre er en (Ci-Cg)alkyl- eller fenyl(Ci-Cg)-alkylgruppe, eller karboksy-(Ci-C4)alkyl-aminokarbonyl-(Ci-C4)akyl; eller R<3>og R<4>danner sammen med karbonatomene som de er bundet til, en (C5-Cg)sykloalkenring; og én av Y og Z er en sukkerrest, en glukuronid-, glukoamidin-, glukuronsyre- eller glykuronsyrerest, en fosfatgruppe eller R<5>C02- hvor R<5>er (Ci-Cio)alkyl, og den andre av Y og Z er et hydrogenatom; eller et egnet salt eller et hydrat derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat, uavhengig av hverandre eller i hvilken som helst forenlig kombinasjon: R<1>er hydrogen; R er hydrogen; R3 er (CrC4)alkyl eller benzyl; R<4>er (Ci-C4)alkyl; den enzymatisk avspaltbare gruppe representert ved Y eller Z, er en a- eller (3-bundet sukkerrest, slik som (3-D-glukose, P-D-galaktose, (5-D-xylose, P-D-glukuronsyre eller N-acetyl-P-D-glukosamin, eller en fosfat- eller en karboksylatgruppe (R<5>COO-), hvor R5 er en (Ci-Cio)alkylgruppe.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert vedat den er 3,4-sykloheksenoeskuletin-P-D-galaktosid,

3,4-sykloheksenoeskuletin-P-D-glukosid, 3,4-sykloheksenoeskuletin-(3-D-glukuronid, 3-benzyl-4-metyleskuletin-P-D-glukosid,

3,4-sykloheksenoeskuletin-N-acetyl-P-glukosaminid, 3,4-sykloheksenoeskuletin-P-D-xylosid, 3-n-butyl-4-metyleskuletin-P-D-galaktosid, 3-n-butyl-4-metyleskuletin-P-D-glukosid,

3,4-sykloheksenoeskuletin-6(7)-fosforsyre,

4. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsene med den generelle formel I som definert i krav 1, karakterisert vedat en eventuelt beskyttet forbindelse med den generelle formel II

derivatiseres i 6- eller 7-stilling, og eventuelt omdannes deretter og den derved dannede forbindelse med den generelle formel I omdannes til en annen forbindelse med den generelle formel I.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat derivatisering av forbindelsen med den generelle formel II til en forbindelse med den generelle formel I er glykosylering, fosforylering og/eller forestring.

6. Preparat, karakterisert vedat det omfatter en forbindelse med den generelle formel I og eventuelt et fortynningsmiddel, en eksipiens eller et substrat som er mikrobiologisk akseptabelt.

7. Preparat ifølge krav 6, karakterisert vedat substratet er et vekstunderstøttelsesmedium.

8. Preparat ifølge krav 7, karakterisert vedat vekstunderstøttelsesmediet er fast, halvfast eller flytende.

9. Preparat ifølge krav 7 eller 8, karakterisert vedat vekstunderstøttelsesmediet er agar.

10. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 7-9, karakterisert vedat vekstunderstøttelsesmediet i tillegg omfatter ett eller flere av essensielt næringsstoff, mineral, vitamin og/eller antibiotikum.

11. Kulturskål, karakterisert vedat den inneholder et preparat ifølge hvilket som helst av kravene 6-10.

12. Fremgangsmåte for påvisning og/eller identifikasjon av en mikroorganisme i en prøve, karakterisert vedde følgende trinn: (a) dyrking av mikroorganismen isolert fra prøven på et vekstunderstøttelsesmedium som inneholder en forbindelse med den generelle formel I, og (b) påvisning av frigjørelsen av en identifiserbar, farget eller fluorescerende markør etter hydrolysen av forbindelsen med den generelle formel I.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert vedat prøven er en biologisk prøve, et spiselig stoff, vann eller annen væske som kan drikkes.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert vedat den biologiske prøve er spytt, urin, blod, avføring, innholdet i magesekken eller en biopsiprøve.

15. Sett, karakterisert vedat det omfatter et vekstmedium som inneholder en forbindelse med den generelle formel I og eventuelt en kulturskål.