CN111235186B - 微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法，包括如下步骤：步骤一、取六叶茜的成熟茜根，然后将其粉碎成40‑60目的茜根颗粒；步骤二、将茜根颗粒经过微生物培养，使得茜根颗粒培养生成茜草苷和少量游离茜草素，得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根；步骤三、将附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵，从而切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根；步骤四、将附有茜草素的茜根提取并浓缩茜草素，得到无色的提取液，将无色提取液浓缩至比重为1.05‑1.2的高浓浓缩液，所述高浓浓缩液为植物染料，本发明用于植物染色，大幅提高得色量与色牢度。

Description

微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法

技术领域

本发明涉及微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法。

背景技术

国内外的茜草品种多达几十种，并且每种茜草的成分差异很大，主要分为中草药用的药用茜草-四叶茜草，以及植物染色用的六叶茜两大类别。六叶茜根部(Rubiacordifolia root)不含或仅含微量茜紫素，但含有芦西定(lucidin)或芦西定苷，不能做中药材使用，但自古以来一直用于植物染色。而国内及日本常见的四叶茜草根(Rubia akaneroot)，含大量的茜紫素，不含芦西定(lucidin)或芦西定苷，主要用于中药材使用，不能作为植物染色的染材。

在帕米尔高原地区生长的六叶茜(Rubia cordifolia)为适应长时间的紫外线日照、昼夜温差大的恶劣自然环境，受到逆境胁迫时会在根部积累次生代谢产物，而在国内非高原地区的林下黑果茜草(Rubia cordifolia)生长环境较好，在其根部积累的次生代谢产物远不如帕米尔高原地区生长的六叶茜(Rubia cordifolia)。国内非高原地区的林下黑果茜草(Rubia cordifolia)经过进化更接近于四叶茜草。帕米尔高原地区生长的六叶茜(Rubia cordifolia)在对环境胁迫的适应、竞争中不断进化，而四叶茜草根(Rubiaakane)、国内非高原地区的林下黑果茜草(Rubia cordifolia)多生长在河南、陕西、日本等气候、土壤等自然环境相对较好的地区，因此六叶茜(Rubia cordifolia)与四叶茜草(Rubia akane)为适应不同的自然环境而产生了不同的次生代谢产物。

四叶茜草(Rubia akane)多用于中草药，是药店的一种常见中药，并且国内的植物染料提取及染色也多用四叶茜草(Rubia akane)，其本身含有较多的不利于植物染色的茜紫素等成分，而导致难以染出艳红色，不但染不深，而且上染的茜紫素耐光性很差，导致日晒牢度极差。直至目前国内还没有只用生长在阿米尔高原的六叶茜(Rubia cordifolia)作为植物染料使用的先例。

国内的草木染研究及应用，主要是以中草药用的四叶茜草为主，并且采用水提方法，即使是一部分采用乙醇水提取，但没有切断茜草苷的糖苷键工序，提取出的色素无法染出鲜艳的深红色，因此无法得到规模化推广应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法，包括如下步骤：

步骤一、取六叶茜的成熟茜根，然后将其粉碎成40-60目的茜根颗粒；

步骤二、将茜根颗粒经过微生物培养，使得茜根颗粒培养生成茜草苷和少量游离茜草素，得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根；

步骤三、将附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵，从而切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根；

步骤四、将附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素，得到无色的提取液，将无色提取液浓缩至比重为1.05-1.2的高浓浓缩液，所述高浓浓缩液为植物染料。

作为优选，步骤一中，取日照时间长、紫外线强烈、昼夜温差大的帕米尔高原地区的六叶茜的2年生以上的成熟茜根。

作为优选，步骤二中，茜根颗粒经过微生物培养包括如下步骤：

步骤a1、按重量份称取10-15份的茜根颗粒，然后加入到气升式生物反应器中；步骤a2、按重量份称取经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液0.1-0.5份、脯氨酸0.01-0.1份、甲基茉莉酸0.002-0.05份、纯净水30-90份，并将它们加入到气升式生物反应器中；

步骤a3、控制气升式生物反应器中的通风的气体流速在1.8-4.2cm/S之间，温度为25-27℃之间，使其体积氧传质系数大于8％，然后向气升式生物反应器中加入放线菌，使得茜根颗粒进行羟基化反应，经过一段时间的反应使得放线菌微生物将茜根颗粒转化生成茜草苷和少量游离茜草素，然后经过过滤得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根和反应残液，所述反应残液用于下次茜根颗粒的微生物培养。

作为优选，壳聚糖溶液的酸化和超声波降解包括如下步骤：

步骤s1：按重量份称取2份分子量大于80万、脱乙酰度大于90％的壳聚糖、94.6-95.8份纯净水中、2-3份柠檬酸、0.2-0.4份的27％浓度双氧水，然后将它们加入到超声波反应器内；

步骤s2：开启频率为40KHZ超声波，声强为100-150W/cm2超声波，运行1分钟再间隔为1分钟的间隔循环运行方式，在温度为40-46℃的条件下反应60-90分钟，从而得到经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液。

作为优选，步骤三中，附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵的步骤为：向附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根中加入黑曲霉β-葡萄糖苷酶，不断搅拌，搅拌速度为150r/min，温度为40-45℃之间，然后发酵1-12小时，使得黑曲霉β-葡萄糖苷酶切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根。

作为优选，步骤四中，附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素包括如下步骤：

步骤b1：按重量份称取附有茜草素的茜根10-16份、乙醇84-90份，然后将它们加入到连续真空减压回流设备中，在真空的负压条件下于60-80℃提取60-120分钟，然后过滤，得到提取液；

步骤b2：将提取液抽入浓缩罐中，控制温度40-80℃，压力20-50Kpa，进行浓缩；

步骤b3：将上次浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根的表面，新溶剂由上而下通过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出；

步骤b3：重复若干次步骤b2、步骤b3，直到提取液无色为止，得到无色提取液。

作为优选，乙醇的体积浓度为90％。

本发明的有益效果如下：

本发明选用六叶茜的成熟茜根，并用微生物转化法定向培养以茜草苷为主的植物次生代谢产物，并采用生物酶发酵方式切断其糖苷键，使溶于水的大分子苷类转换成不溶于水的小分子量苷元，使其用于植物染色，大幅提高得色量与色牢度；

本发明的微生物转化是一种成本低成本、高效的酶催化系统，其选择性强、反应条件易控制、操作简单，能够产生一些化学合成法难以生成的物质，微生物转化的羟基化反应是最重要的反应，可以生成多种羟基化衍生物，采用微生物转化可使六叶茜的成熟茜根内的茜草苷及茜草素的含量提高3倍左右，使其成本大幅降低，而采用微生物转化法，针对四叶茜草根难以定向生成茜草素，生成的次生代谢产物是以茜紫素为主，而采用微生物转化经过六叶茜的成熟茜根，可培养生成大量的茜草素，使茜草素含量提高1-3倍；

本发明在气升式生物反应器内加入经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液，由于壳聚糖经过超声波氧化降解可生产出白度较高、分子量分布较窄的低分子量壳聚糖，有利于促进微生物转化反应，提高茜草苷产物达一倍以上，并且酸化和超声波降解的壳聚糖溶液有助于缓冲体系的PH。

本发明加入脯氨酸、甲基茉莉酸，使得起到催化与促进作用，提高菌类的转化效率；

本发明经过微生物培养转化后的六叶茜的成熟茜根颗粒不经过干燥工序，直接利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶进行生物酶发酵，茜草苷只有经过切断糖苷键，才能减少上染过程的空间位阻效应，提高上染率3-5倍，切断糖苷键可使用硝酸、硫酸在高温下切断糖苷键，但高浓度的硫酸容易造成环境污染，同时在高温下也容易导致碳化变黑，本发明利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶的专一性，生物发酵方式切断糖苷键，可在低温下生产，节能环保。由于六叶茜的成熟茜根经过了微生物培养后已经处于蓬松状态，不需要加入渗透剂进行细胞渗透，稳定性较好的黑曲霉β-葡萄糖苷酶比较容易水解茜草苷的糖苷键使之生成茜草素，酶解后不需要经过高温杀酶工序，可直接进行下到续真空减压回流提取工序，利用连续真空减压回流提取的高温来杀灭生物酶；

本发明将经过黑曲霉β-葡萄糖苷酶发酵切断茜草苷的糖苷键后的附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流设备，在真空状态下进行提取，真空负压条件下使乙醇溶剂迅速进入细胞内部，将提取液抽入浓缩罐，控制温度40-80℃，进行浓缩，浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根表面，新溶剂由上而下通过过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出，直到提取液无色为止，将提取液浓缩至比重为1.05-1.2的高浓浓缩液，高浓浓缩液可直接用于植物染色。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案作进一步说明：

实施例1：

微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法，包括如下步骤：

步骤一、取日照时间长、紫外线强烈、昼夜温差大的帕米尔高原地区的六叶茜的2年生以上的成熟茜根，然后将其粉碎成40-60目的茜根颗粒；

步骤二、将茜根颗粒经过微生物培养，使得茜根颗粒培养生成茜草苷和少量游离茜草素，得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根；

茜根颗粒经过微生物培养包括如下步骤：

步骤a1、按重量份称取10-15份的茜根颗粒，然后加入到气升式生物反应器中；

步骤a2、按重量份称取经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液0.1-0.5份、脯氨酸0.01-0.1份、甲基茉莉酸0.002-0.05份、纯净水30-90份，并将它们加入到气升式生物反应器中；

步骤a3、控制气升式生物反应器中的通风的气体流速在1.8-4.2cm/S之间，温度为25-27℃之间，使其体积氧传质系数大于8％，然后向气升式生物反应器中加入放线菌，使得茜根颗粒进行羟基化反应，经过一段时间的反应使得放线菌微生物将茜根颗粒转化生成茜草苷和少量游离茜草素，然后经过过滤得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根和反应残液，所述反应残液用于下次茜根颗粒的微生物培养。

壳聚糖溶液的酸化和超声波降解包括如下步骤：

步骤s1：按重量份称取2份分子量大于80万、脱乙酰度大于90％的壳聚糖、94.6-95.8份纯净水中、2-3份柠檬酸、0.2-0.4份的27％浓度双氧水，然后将它们加入到超声波反应器内；

步骤s2：开启频率为40KHZ超声波，声强为100-150W/cm2超声波，运行1分钟再间隔为1分钟的间隔循环运行方式，在温度为40-46℃的条件下反应60-90分钟，从而得到经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液。经间歇式超声波氧化降解可生产出白度较高、分子量分布较窄的低分子量壳聚糖，有利于促进微生物转化反应，提高茜草苷产物达一倍以上。

步骤三、将附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵，从而切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根；

附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵的步骤为：向附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根中加入黑曲霉β-葡萄糖苷酶，不断搅拌，搅拌速度为150r/min，温度为40-45℃之间，然后发酵1-12小时，使得黑曲霉β-葡萄糖苷酶切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根。步骤四、将附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素，得到无色的提取液，将无色提取液浓缩至比重为1.05-1.2的高浓浓缩液，所述高浓浓缩液为植物染料。

附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素包括如下步骤：

步骤b1：按重量份称取附有茜草素的茜根10-16份、体积浓度90％的乙醇84-90份，然后将它们加入到连续真空减压回流设备中，在真空的负压条件下于60-80℃提取60-120分钟，然后过滤，得到提取液；在真空的负压条件下使乙醇溶剂迅速进入细胞内部。

步骤b2：将提取液抽入浓缩罐中，控制温度40-80℃，压力20-50Kpa，进行浓缩；

步骤b3：将上次浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根的表面，新溶剂由上而下通过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出；

步骤b3：重复若干次步骤b2、步骤b3，直到提取液无色为止，得到无色提取液。

本发明选用六叶茜的成熟茜根，并用微生物转化法定向培养以茜草苷为主的植物次生代谢产物，并采用生物酶发酵方式切断其糖苷键，使溶于水的大分子苷类转换成不溶于水的小分子量苷元，使其用于植物染色，大幅提高得色量与色牢度；

本发明的微生物转化是一种成本低成本、高效的酶催化系统，其选择性强、反应条件易控制、操作简单，能够产生一些化学合成法难以生成的物质，微生物转化的羟基化反应是最重要的反应，可以生成多种羟基化衍生物，采用微生物转化可使六叶茜的成熟茜根内的茜草苷及茜草素的含量提高3倍左右，使其成本大幅降低，而采用微生物转化法，针对四叶茜草根难以定向生成茜草素，生成的次生代谢产物是以茜紫素为主，而采用微生物转化经过六叶茜的成熟茜根，可培养生成大量的茜草素，使茜草素含量提高1-3倍；

本发明在气升式生物反应器内加入经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液，由于壳聚糖经过超声波氧化降解可生产出白度较高、分子量分布较窄的低分子量壳聚糖，有利于促进微生物转化反应，提高茜草苷产物达一倍以上，并且酸化和超声波降解的壳聚糖溶液有助于缓冲体系的PH。

本发明加入脯氨酸、甲基茉莉酸，使得起到催化与促进作用，提高菌类的转化效率；

本发明经过微生物培养转化后的六叶茜的成熟茜根颗粒不经过干燥工序，直接利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶进行生物酶发酵，茜草苷只有经过切断糖苷键，才能减少上染过程的空间位阻效应，提高上染率3-5倍，切断糖苷键可使用硝酸、硫酸在高温下切断糖苷键，但高浓度的硫酸容易造成环境污染，同时在高温下也容易导致碳化变黑，本发明利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶的专一性，生物发酵方式切断糖苷键，可在低温下生产，节能环保。由于六叶茜的成熟茜根经过了微生物培养后已经处于蓬松状态，不需要加入渗透剂进行细胞渗透，稳定性较好的黑曲霉β-葡萄糖苷酶比较容易水解茜草苷的糖苷键使之生成茜草素，酶解后不需要经过高温杀酶工序，可直接进行下到续真空减压回流提取工序，利用连续真空减压回流提取的高温来杀灭生物酶；

本发明将经过黑曲霉β-葡萄糖苷酶发酵切断茜草苷的糖苷键后的附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流设备，在真空状态下进行提取，真空负压条件下使乙醇溶剂迅速进入细胞内部，将提取液抽入浓缩罐，控制温度40-80℃，进行浓缩，浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根表面，新溶剂由上而下通过过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出，直到提取液无色为止，将提取液浓缩至比重为1.05-1.2的高浓浓缩液，高浓浓缩液可直接用于植物染色。

实施例2：

微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法，包括如下步骤：

步骤一、取日照时间长、紫外线强烈、昼夜温差大的帕米尔高原地区的六叶茜的2年生以上的成熟茜根，然后将其粉碎成40-60目的茜根颗粒；

步骤二、将茜根颗粒经过微生物培养，使得茜根颗粒培养生成茜草苷和少量游离茜草素，得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根；

茜根颗粒经过微生物培养包括如下步骤：

步骤a1、按重量份称取10份的茜根颗粒，然后加入到气升式生物反应器中；

步骤a2、按重量份称取经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液0.1份、脯氨酸0.01份、甲基茉莉酸0.002份、纯净水30份，并将它们加入到气升式生物反应器中；步骤a3、控制气升式生物反应器中的通风的气体流速在1.8-4.2cm/S之间，温度为25℃之间，使其体积氧传质系数大于8％，然后向气升式生物反应器中加入放线菌，使得茜根颗粒进行羟基化反应，经过一段时间的反应使得放线菌微生物将茜根颗粒转化生成茜草苷和少量游离茜草素，然后经过过滤得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根和反应残液，所述反应残液用于下次茜根颗粒的微生物培养。

壳聚糖溶液的酸化和超声波降解包括如下步骤：

步骤s1：按重量份称取2份分子量大于80万、脱乙酰度大于90％的壳聚糖、95.8份纯净水中、2份柠檬酸、0.2份的27％浓度双氧水，然后将它们加入到超声波反应器内；

步骤s2：开启频率为40KHZ超声波，声强为100-150W/cm2超声波，运行1分钟再间隔为1分钟的间隔循环运行方式，在温度为40℃的条件下反应60分钟，从而得到经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液。经间歇式超声波氧化降解可生产出白度较高、分子量分布较窄的低分子量壳聚糖，有利于促进微生物转化反应，提高茜草苷产物达一倍以上。

步骤三、将附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵，从而切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根；

附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵的步骤为：向附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根中加入黑曲霉β-葡萄糖苷酶，不断搅拌，搅拌速度为150r/min，温度为40℃，然后发酵1-12小时，使得黑曲霉β-葡萄糖苷酶切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根。

步骤四、将附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素，得到无色的提取液，将无色提取液浓缩至比重为1.05的高浓浓缩液，所述高浓浓缩液为植物染料。

附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素包括如下步骤：

步骤b1：按重量份称取附有茜草素的茜根10份、体积浓度90％的乙醇84份，然后将它们加入到连续真空减压回流设备中，在真空的负压条件下于60℃提取60-120分钟，然后过滤，得到提取液；

步骤b2：将提取液抽入浓缩罐中，控制温度40℃，压力20Kpa，进行浓缩；

步骤b3：将上次浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根的表面，新溶剂由上而下通过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出；

步骤b3：重复若干次步骤b2、步骤b3，直到提取液无色为止，得到无色提取液。

高浓浓缩液检测--直接染精梳棉：取20克精梳棉，加入200ML清水，在常温下加入高浓浓缩液2ML，在红外线染样机中升温到75℃保温70分钟，再加6ML入天然染色助剂继续保温30分钟，染色后排液，用95℃热水水洗，再冷水清洗后烘干，染得粉红色，染色后的精梳棉经过5g/l(总液体量的比例)标准皂片于40度皂洗30分钟，测得皂洗牢度大于3.5级。

本发明选用六叶茜的成熟茜根，并用微生物转化法定向培养以茜草苷为主的植物次生代谢产物，并采用生物酶发酵方式切断其糖苷键，使溶于水的大分子苷类转换成不溶于水的小分子量苷元，使其用于植物染色，大幅提高得色量与色牢度；

本发明的微生物转化是一种成本低成本、高效的酶催化系统，其选择性强、反应条件易控制、操作简单，能够产生一些化学合成法难以生成的物质，微生物转化的羟基化反应是最重要的反应，可以生成多种羟基化衍生物，采用微生物转化可使六叶茜的成熟茜根内的茜草苷及茜草素的含量提高3倍左右，使其成本大幅降低，而采用微生物转化法，针对四叶茜草根难以定向生成茜草素，生成的次生代谢产物是以茜紫素为主，而采用微生物转化经过六叶茜的成熟茜根，可培养生成大量的茜草素，使茜草素含量提高1-3倍；

本发明在气升式生物反应器内加入经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液，由于壳聚糖经过超声波氧化降解可生产出白度较高、分子量分布较窄的低分子量壳聚糖，有利于促进微生物转化反应，提高茜草苷产物达一倍以上，并且酸化和超声波降解的壳聚糖溶液有助于缓冲体系的PH。

本发明加入脯氨酸、甲基茉莉酸，使得起到催化与促进作用，提高菌类的转化效率；

本发明经过微生物培养转化后的六叶茜的成熟茜根颗粒不经过干燥工序，直接利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶进行生物酶发酵，茜草苷只有经过切断糖苷键，才能减少上染过程的空间位阻效应，提高上染率3-5倍，切断糖苷键可使用硝酸、硫酸在高温下切断糖苷键，但高浓度的硫酸容易造成环境污染，同时在高温下也容易导致碳化变黑，本发明利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶的专一性，生物发酵方式切断糖苷键，可在低温下生产，节能环保。由于六叶茜的成熟茜根经过了微生物培养后已经处于蓬松状态，不需要加入渗透剂进行细胞渗透，稳定性较好的黑曲霉β-葡萄糖苷酶比较容易水解茜草苷的糖苷键使之生成茜草素，酶解后不需要经过高温杀酶工序，可直接进行下到续真空减压回流提取工序，利用连续真空减压回流提取的高温来杀灭生物酶；

本发明将经过黑曲霉β-葡萄糖苷酶发酵切断茜草苷的糖苷键后的附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流设备，在真空状态下进行提取，真空负压条件下使乙醇溶剂迅速进入细胞内部，将提取液抽入浓缩罐，控制温度40-80℃，进行浓缩，浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根表面，新溶剂由上而下通过过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出，直到提取液无色为止，将提取液浓缩的高浓浓缩液可直接用于植物染色。

实施例3：

微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法，包括如下步骤：

步骤一、取日照时间长、紫外线强烈、昼夜温差大的帕米尔高原地区的六叶茜的2年生以上的成熟茜根，然后将其粉碎成40-60目的茜根颗粒；

步骤二、将茜根颗粒经过微生物培养，使得茜根颗粒培养生成茜草苷和少量游离茜草素，得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根；

茜根颗粒经过微生物培养包括如下步骤：

步骤a1、按重量份称取15份的茜根颗粒，然后加入到气升式生物反应器中；

步骤a2、按重量份称取经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液0.5份、脯氨酸0.1份、甲基茉莉酸0.05份、纯净水90份，并将它们加入到气升式生物反应器中；步骤a3、控制气升式生物反应器中的通风的气体流速在1.8-4.2cm/S之间，温度为27℃，使其体积氧传质系数大于8％，然后向气升式生物反应器中加入放线菌，使得茜根颗粒进行羟基化反应，经过24-96小时的反应使得放线菌微生物将茜根颗粒转化生成茜草苷和少量游离茜草素，然后经过过滤得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根和反应残液，所述反应残液用于下次茜根颗粒的微生物培养。

壳聚糖溶液的酸化和超声波降解包括如下步骤：

步骤s1：按重量份称取2份分子量大于80万、脱乙酰度大于90％的壳聚糖、94.6份纯净水中、3份柠檬酸、0.4份的27％浓度双氧水，然后将它们加入到超声波反应器内；

步骤s2：开启频率为40KHZ超声波，声强为100-150W/cm2超声波，运行1分钟再间隔为1分钟的间隔循环运行方式，在温度为46℃的条件下反应90分钟，从而得到经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液。经间歇式超声波氧化降解可生产出白度较高、分子量分布较窄的低分子量壳聚糖，有利于促进微生物转化反应，提高茜草苷产物达一倍以上。

步骤三、将附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵，从而切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根；

附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵的步骤为：向附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根中加入黑曲霉β-葡萄糖苷酶，不断搅拌，搅拌速度为150r/min，温度为45℃，然后发酵12小时，使得黑曲霉β-葡萄糖苷酶切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根。

步骤四、将附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素，得到无色的提取液，将无色提取液浓缩至比重为1.2的高浓浓缩液，所述高浓浓缩液为植物染料。

附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素包括如下步骤：

步骤b1：按重量份称取附有茜草素的茜根16份、体积浓度90％的乙醇90份，然后将它们加入到连续真空减压回流设备中，在真空的负压条件下于80℃提取120分钟，然后过滤，得到提取液；

步骤b2：将提取液抽入浓缩罐中，控制温度80℃，压力50Kpa，进行浓缩；

步骤b3：将上次浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根的表面，新溶剂由上而下通过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出；

步骤b3：重复若干次步骤b2、步骤b3，直到提取液无色为止，得到无色提取液。

高浓浓缩液检测--直接染精梳棉：取20克精梳棉，加入200ML清水，在常温下加入高浓浓缩液2ML，在红外线染样机中升温到75℃保温70分钟，再加6ML入天然染色助剂继续保温30分钟，染色后排液，用95℃热水水洗，再冷水清洗后烘干，染得粉红色，染色后的精梳棉经过5g/l(总液体量的比例)标准皂片于40度皂洗30分钟，测得皂洗牢度大于3.5级。

本发明选用六叶茜的成熟茜根，并用微生物转化法定向培养以茜草苷为主的植物次生代谢产物，并采用生物酶发酵方式切断其糖苷键，使溶于水的大分子苷类转换成不溶于水的小分子量苷元，使其用于植物染色，大幅提高得色量与色牢度；

本发明的微生物转化是一种成本低成本、高效的酶催化系统，其选择性强、反应条件易控制、操作简单，能够产生一些化学合成法难以生成的物质，微生物转化的羟基化反应是最重要的反应，可以生成多种羟基化衍生物，采用微生物转化可使六叶茜的成熟茜根内的茜草苷及茜草素的含量提高3倍左右，使其成本大幅降低，而采用微生物转化法，针对四叶茜草根难以定向生成茜草素，生成的次生代谢产物是以茜紫素为主，而采用微生物转化经过六叶茜的成熟茜根，可培养生成大量的茜草素，使茜草素含量提高1-3倍；

本发明在气升式生物反应器内加入经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液，由于壳聚糖经过超声波氧化降解可生产出白度较高、分子量分布较窄的低分子量壳聚糖，有利于促进微生物转化反应，提高茜草苷产物达一倍以上，并且酸化和超声波降解的壳聚糖溶液有助于缓冲体系的PH。

本发明加入脯氨酸、甲基茉莉酸，使得起到催化与促进作用，提高菌类的转化效率；

本发明经过微生物培养转化后的六叶茜的成熟茜根颗粒不经过干燥工序，直接利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶进行生物酶发酵，茜草苷只有经过切断糖苷键，才能减少上染过程的空间位阻效应，提高上染率3-5倍，切断糖苷键可使用硝酸、硫酸在高温下切断糖苷键，但高浓度的硫酸容易造成环境污染，同时在高温下也容易导致碳化变黑，本发明利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶的专一性，生物发酵方式切断糖苷键，可在低温下生产，节能环保。由于六叶茜的成熟茜根经过了微生物培养后已经处于蓬松状态，不需要加入渗透剂进行细胞渗透，稳定性较好的黑曲霉β-葡萄糖苷酶比较容易水解茜草苷的糖苷键使之生成茜草素，酶解后不需要经过高温杀酶工序，可直接进行下到续真空减压回流提取工序，利用连续真空减压回流提取的高温来杀灭生物酶；

本发明将经过黑曲霉β-葡萄糖苷酶发酵切断茜草苷的糖苷键后的附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流设备，在真空状态下进行提取，真空负压条件下使乙醇溶剂迅速进入细胞内部，将提取液抽入浓缩罐，控制温度40-80℃，进行浓缩，浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根表面，新溶剂由上而下通过过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出，直到提取液无色为止，高浓浓缩液可直接用于植物染色。

实施例4：

微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法，包括如下步骤：

步骤一、取日照时间长、紫外线强烈、昼夜温差大的帕米尔高原地区的六叶茜的2年生以上的成熟茜根，然后将其粉碎成40-60目的茜根颗粒；

步骤二、将茜根颗粒经过微生物培养，使得茜根颗粒培养生成茜草苷和少量游离茜草素，得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根；

茜根颗粒经过微生物培养包括如下步骤：

步骤a1、按重量份称取12份的茜根颗粒，然后加入到气升式生物反应器中；

步骤a2、按重量份称取经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液0.3份、脯氨酸0.06份、甲基茉莉酸0.03份、纯净水40份，并将它们加入到气升式生物反应器中；

步骤a3、控制气升式生物反应器中的通风的气体流速在1.8-4.2cm/S之间，温度为26℃，使其体积氧传质系数大于8％，然后向气升式生物反应器中加入放线菌，使得茜根颗粒进行羟基化反应，经过一段时间的反应使得放线菌微生物将茜根颗粒转化生成茜草苷和少量游离茜草素，然后经过过滤得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根和反应残液，所述反应残液用于下次茜根颗粒的微生物培养。

壳聚糖溶液的酸化和超声波降解包括如下步骤：

步骤s1：按重量份称取2份分子量大于80万、脱乙酰度大于90％的壳聚糖、95份纯净水中、2.5份柠檬酸、0.3份的27％浓度双氧水，然后将它们加入到超声波反应器内；

步骤s2：开启频率为40KHZ超声波，声强为100-150W/cm2超声波，运行1分钟再间隔为1分钟的间隔循环运行方式，在温度为43℃的条件下反应70分钟，从而得到经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液。经间歇式超声波氧化降解可生产出白度较高、分子量分布较窄的低分子量壳聚糖，有利于促进微生物转化反应，提高茜草苷产物达一倍以上。

步骤三、将附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵，从而切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根；

附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵的步骤为：向附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根中加入黑曲霉β-葡萄糖苷酶，不断搅拌，搅拌速度为150r/min，温度为43℃，然后发酵10个小时，使得黑曲霉β-葡萄糖苷酶切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根。

步骤四、将附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素，得到无色的提取液，将无色提取液浓缩至比重为1.1的高浓浓缩液，所述高浓浓缩液为植物染料。

附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素包括如下步骤：

步骤b1：按重量份称取附有茜草素的茜根13份、体积浓度90％的乙醇88份，然后将它们加入到连续真空减压回流设备中，在真空的负压条件下于70℃提取100分钟，然后过滤，得到提取液；

步骤b2：将提取液抽入浓缩罐中，控制温度60℃，压力30Kpa，进行浓缩；

步骤b3：将上次浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根的表面，新溶剂由上而下通过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出；

步骤b3：重复若干次步骤b2、步骤b3，直到提取液无色为止，得到无色提取液。

本发明选用六叶茜的成熟茜根，并用微生物转化法定向培养以茜草苷为主的植物次生代谢产物，并采用生物酶发酵方式切断其糖苷键，使溶于水的大分子苷类转换成不溶于水的小分子量苷元，使其用于植物染色，大幅提高得色量与色牢度；

本发明的微生物转化是一种成本低成本、高效的酶催化系统，其选择性强、反应条件易控制、操作简单，能够产生一些化学合成法难以生成的物质，微生物转化的羟基化反应是最重要的反应，可以生成多种羟基化衍生物，采用微生物转化可使六叶茜的成熟茜根内的茜草苷及茜草素的含量提高3倍左右，使其成本大幅降低，而采用微生物转化法，针对四叶茜草根难以定向生成茜草素，生成的次生代谢产物是以茜紫素为主，而采用微生物转化经过六叶茜的成熟茜根，可培养生成大量的茜草素，使茜草素含量提高1-3倍；

本发明在气升式生物反应器内加入经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液，由于壳聚糖经过超声波氧化降解可生产出白度较高、分子量分布较窄的低分子量壳聚糖，有利于促进微生物转化反应，提高茜草苷产物达一倍以上，并且酸化和超声波降解的壳聚糖溶液有助于缓冲体系的PH。

本发明加入脯氨酸、甲基茉莉酸，使得起到催化与促进作用，提高菌类的转化效率；

本发明经过微生物培养转化后的六叶茜的成熟茜根颗粒不经过干燥工序，直接利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶进行生物酶发酵，茜草苷只有经过切断糖苷键，才能减少上染过程的空间位阻效应，提高上染率3-5倍，切断糖苷键可使用硝酸、硫酸在高温下切断糖苷键，但高浓度的硫酸容易造成环境污染，同时在高温下也容易导致碳化变黑，本发明利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶的专一性，生物发酵方式切断糖苷键，可在低温下生产，节能环保。由于六叶茜的成熟茜根经过了微生物培养后已经处于蓬松状态，不需要加入渗透剂进行细胞渗透，稳定性较好的黑曲霉β-葡萄糖苷酶比较容易水解茜草苷的糖苷键使之生成茜草素，酶解后不需要经过高温杀酶工序，可直接进行下到续真空减压回流提取工序，利用连续真空减压回流提取的高温来杀灭生物酶；

本发明将经过黑曲霉β-葡萄糖苷酶发酵切断茜草苷的糖苷键后的附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流设备，在真空状态下进行提取，真空负压条件下使乙醇溶剂迅速进入细胞内部，将提取液抽入浓缩罐，控制温度40-80℃，进行浓缩，浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根表面，新溶剂由上而下通过过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出，直到提取液无色为止，将提取液浓缩得到高浓浓缩液，高浓浓缩液可直接用于植物染色。

需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一种具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，总之，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、取六叶茜的成熟茜根，然后将其粉碎成40-60目的茜根颗粒；

步骤二、将茜根颗粒经过微生物培养，使得茜根颗粒培养生成茜草苷和少量游离茜草素，得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根；

步骤三、将附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵，从而切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根；

步骤四、将附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素，得到无色提取液，将无色提取液浓缩至比重为1.05-1.2的高浓浓缩液，所述高浓浓缩液为植物染料；

所述步骤二中，茜根颗粒经过微生物培养包括如下步骤：

步骤a1、按重量份称取10-15份的茜根颗粒，然后加入到气升式生物反应器中；

步骤a2、按重量份称取经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液0.1-0.5份、脯氨酸0.01-0.1份、甲基茉莉酸0.002-0.05份、纯净水30-90份，并将它们加入到气升式生物反应器中；

步骤a3、控制气升式生物反应器中的通风的气体流速在1.8-4.2cm/S之间，温度为25-27℃之间，使其体积氧传质系数大于8％，然后向气升式生物反应器中加入放线菌，使得茜根颗粒进行羟基化反应，经过一段时间的反应使得放线菌微生物将茜根颗粒转化生成茜草苷和少量游离茜草素，然后经过过滤得到附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根和反应残液，所述反应残液用于下次茜根颗粒的微生物培养；

所述壳聚糖溶液的酸化和超声波降解包括如下步骤：

步骤s1：按重量份称取2份分子量大于80万、脱乙酰度大于90％的壳聚糖、94.6-95.8份纯净水、2-3份柠檬酸、0.2-0.4份浓度为27％的双氧水，然后将它们加入到超声波反应器内；

步骤s2：开启频率为40KHZ、声强为100-150W/cm2的超声波，采用运行1分钟再间隔为1分钟的间隔循环运行方式，在温度为40-46℃的条件下反应60-90分钟，从而得到经酸化和超声波降解的壳聚糖溶液；所述步骤三中，附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根经过生物酶发酵的步骤为：向附有茜草苷和少量游离茜草素的茜根中加入黑曲霉β-葡萄糖苷酶，不断搅拌，搅拌速度为150r/min，温度为40-45℃之间，然后发酵1-12小时，使得黑曲霉β-葡萄糖苷酶切断茜草苷的糖苷键，使其转化成茜草素，得到附有茜草素的茜根；

所述步骤四中，附有茜草素的茜根采用连续真空减压回流方式提取并浓缩茜草素包括如下步骤：

步骤b1：按重量份称取附有茜草素的茜根10-16份、体积浓度为90％的乙醇84-90份，然后将它们加入到连续真空减压回流设备中，在真空的负压条件下于60-80℃提取60-120分钟，然后过滤，得到提取液；

步骤b2：将提取液抽入浓缩罐中，控制温度40-80℃，压力20-50Kpa，进行浓缩；

步骤b3：将上次浓缩产生的二次蒸汽经过冷凝器变成冷凝液并作为新的溶剂重新喷洒到附有茜草素的茜根的表面，新溶剂由上而下通过附有茜草素的茜根层到达浓缩罐底部，使得将附有茜草素的茜根的可溶性成分溶出；

步骤b4：重复若干次步骤b2、步骤b3，直到提取液无色为止，得到无色提取液。

2.根据权利要求1所述微生物转化六叶茜用来提取植物染料的方法，其特征在于，所述步骤一中，取日照时间长、紫外线强烈、昼夜温差大的帕米尔高原地区的六叶茜的2年生以上的成熟茜根。