CN106148203A - 一种蓝色犁头霉及其应用技术 - Google Patents
一种蓝色犁头霉及其应用技术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106148203A CN106148203A CN201610706221.XA CN201610706221A CN106148203A CN 106148203 A CN106148203 A CN 106148203A CN 201610706221 A CN201610706221 A CN 201610706221A CN 106148203 A CN106148203 A CN 106148203A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cultivate
- fermentation
- solution
- seed
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/65—Absidia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/06—Hydroxylating
- C12P33/08—Hydroxylating at 11 position
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高产甾体发酵蓝色犁头霉(Absidia coerulea)新菌株LJYHL20130405‑3及其在以甾体中间体RSA为底物生产氢化可的松中的应用。所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏时间为2013年6月8日,保藏号为:CGMCC No.7688。本发明所述的蓝色犁头霉菌株,其用于甾体化合物(薯蓣皂甙)为原料生产植物激素的转化过程中,以甾体中间体RSA(17α‑hydroxypregn‑4‑en‑3,20‑dione‑21‑acetate)为底物生产氢化可的松(Hydrocortisone)。其生产氢化可的松具有转化率高(68~72%)、收率高(48~50%),而且生物学性状比较稳定等特点。本发明可以为以薯蓣皂甙为原料的植物甾体激素生产提高产量、降低生产成本提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于工业真菌技术领域,具体设计一种高产甾体发酵蓝色犁头霉菌株及其甾体化合物发酵的应用技术。
背景技术
1甾体化合物C11β-羟化微生物发酵
甾体化合物是一类含有环戊烷多氢菲核的化合物,由于母核上取代基、双键位置或立体构型的不同,形成了一系列具有独特生理功能的化合物。与甾体化合物有关的激素类药物主要为:肾上腺皮质激素(Adrenocorticosteroids)、性激素(Sex Hormone)、蛋白同化激素(Anabolic steroids)。
氢化可的松(hydrocortisone,HC)是人工合成也是天然存在的糖皮质激素,抗炎作用为可的松的1.25倍,具有免疫抑制作用、抗毒作用、抗休克及一定的盐皮质激素活性等,并有留水、留钠及排钾作用。1948年,美国风湿病专家Hench在风湿病关节炎的治疗中发现可的松在体内转化HC才具有疗效。因 发 现 可 的 松 和HC的药理作用,Hench、Reichstein和Kendal一起获得了1950年的诺贝尔奖,并从此掀起了开发皮质激素的高潮。Wendler等用化学法合成了HC,但由于步骤多、收率低 ,导致药品价格昂贵而难以工业化。此后,人们开始把目光转向生物转化方法。Fieser首先采用微生物转化方法使HC工业化生产成为可能。为提高转化率和收率,国内外研究人员做出了不懈努力,并取得较大进展。由于在甾体C11位周围没有活性功能基团的影响,常规化学法很难氧化非活泼碳氢键,而生物催化法却能对它立体选择性氧化。有效的菌种是黑根霉和犁头霉。前者可专一性的在C11位引入α-羟基,引入构型恰恰相反,故还需将其氧化为酮得醋酸可的松,再用钾硼氢对其进行不对称还原,得C11位β-羟基物,即HC;犁头霉却能在化合物S(RSA)的C11位上直接引入β-羟基,后者就缩短了合成HC的工艺路线。
羟化反应是甾体微生物转化反应中最重要和最广泛被应用的反应:一方面,羟基化能够为进一步的化学合成提供中间体;另一方面,用微生物进行羟基化反应可以达到一般化学反应达不到的部位,并羟基化后的甾体化合物具有消炎等方面的活性。C11羟基对于甾体化合物抗炎的活性是必不可少的。甾体的微生物羟化反应是利用微生物内的羟化酶对甾体特定部位引入羟基,由于羟化酶的不稳定性,在提取过程中极易失活,因此通常采用微生物菌体细胞转化。转化过程通常分两个阶段。第一阶段是菌体的培养,第二阶段是加入甾体底物进行转化。由于甾体化合物的疏水性,在底物浓度较高时,产物在发酵液中呈结晶析出,属于拟结晶发酵。
目前国内生产HC的菌种主要是蓝色犁头霉(AbsidiacoeruleaBainier),但由于蓝色犁头霉氧化专一性低,HC的收率受到限制。国外大都是用新月弯孢霉进行工业化生产,国内对用新月弯孢霉进行生物转化生产HC也有相关研究,但工业化生产较少。因此选育出具有转化率和得率较高、性状稳定的蓝色犁头霉菌种,对我国甾体微生物发酵具有重大意义。
2犁头霉属分类地位及利用现状
犁头霉属(AbsidiaTiegh)属于真菌界(Fungi)、接合菌门(Zygomycota)、毛霉目(Mucorales)、小克银汉霉科(Cunninghamellaceae)。这个属报道了79个种和种下分类单元,都为土壤生真菌。最近根据生理学、分子生物学和形态学研究,犁头霉属被分为3组:嗜温的,耐温的和生长缓慢的寄生性种类。其中耐温的种类已经从犁头霉属种分出去,成立了一个新科:Mycocladiaceae。该科目前仅一个属,即Mycocladus。蓝色犁头霉(A. coerulea Bainier)仍然保留在犁头霉属中。
发明内容
本发明目的之一是提供一种蓝色犁头霉新菌株,其用于甾体化合物(薯蓣皂甙)为原料生产植物激素的转化过程中,以甾体中间体为底物生产氢化可的松具有转化率高、收率高的特点。
本发明目的之二是提供上述蓝色犁头霉新菌株,将甾体中间体RSA作为底物,将其转化为氢化可的松产物中的应用。
本发明目的之三是提供上述蓝色犁头霉新菌株在以甾体中间体RSA为底物生产氢化可的松的专用方法。
实现本发明上述目的采取的技术方案是:所述蓝色犁头霉菌株属于真菌界、接合菌门、毛霉目、小克银汉霉科,保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,分类名:蓝色犁头霉,Absidia coerulea),保藏时间为2013年6月8日,保藏号为:CGMCC No.7688。
所述蓝色犁头霉菌株可应用于以甾体中间体RSA为底物制备氢化可的松产物中。
所述的蓝色犁头霉菌株在以甾体中间体RSA为底物生产氢化可的松的方法包括以下步骤:
⑴原种复活:在菌种生长温度条件下,将保存的原种在PDA培养基茄子瓶或者克氏瓶斜面上培养,直到气生菌丝长满斜面;
⑵制备菌悬液:取无菌水倒入培养好菌种的茄子瓶中,用接种针搅拌完全,再取菌悬液稀释后,涂布在PDA平板上,在菌种生长温度条件下培养;
⑶制备茄子瓶或者克氏瓶斜面:在培养的PDA平板上选择单个菌落接种在PDA茄子瓶或者克氏瓶斜面上,在菌种生长温度条件下培养;
⑷制备一级种子液:在培养好的茄子瓶或克氏瓶斜面菌种中加入无菌水制备菌悬液并移入已经灭菌的摇瓶培养液中,在菌种生长温度条件下,在摇床上培养,pH到4.5以下获得一级种子液;
⑸制备二级种子液:培养基以及装量与上一步相同,将一级种子液按照20%移种量移入二级摇瓶培养,在菌种生长温度条件下,在摇床上培养,pH到3.5以下即得二级种子液;
⑹投料发酵:按照0.2wt%的投料量投入RSA酒精溶液到二级种子液中摇瓶发酵培养得到发酵液;
⑺结果检测:将每个摇瓶的发酵液经抽滤后,取滤液加入等量醋酸丁酯进行萃取并浓缩结晶。将结晶物抽滤得到氢化可的松粗品和母液,将氢化可的松粗品烘干称取粗品重量,根据投料量计算粗品收率和转化率;
⑻选取生产菌株:在收率80%以上、转化率70%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株,一方面制成砂土管原种或者牛奶冻干管在4℃条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用,另一方面传代用于甾体发酵生产;
⑼传代培养:在菌种生长温度条件下,将选取的生产菌株接入PDA培养基茄子瓶斜面上培养,直到气生菌丝长满斜面;
⑽培养生产母种:将传代培养后的菌种从茄子瓶斜面上接入PDA培养基克氏瓶斜面上培养,在菌种生长温度条件下培养,使得气生菌丝长满克氏瓶并呈蓝黑色;
⑾培养一级生产种子液:将生产母种接入种子罐中,培养基与摇瓶培养液相同,在菌种生长温度条件下培养,取样镜检确定没有被污染并且PH到4.5以下,菌丝体体积达到85%以上标准后即可移入二级发酵罐中培养;
⑿底物溶液制备:溶解罐中投入RSA,加入水和酒精,密闭后升温回流至RSA溶清,溶液清亮透明,然后保温备用;
⒀培养二级生产种子液:在发酵罐中置入培养液,然后将种子罐中的一级生产种子液移入该发酵罐,在菌种生长温度条件下培养培养后,取样镜检确定没有被污染并且pH到3.5以下,菌丝体体积在40%~60%之间,降温并加片碱水溶液压入底物溶液;
⒁投底物发酵:压入RSA底物溶液,在菌种生长温度下发酵培养,根据取样检测当时的发酵罐中的转化情况决定发酵终止时间;
⒂压滤:在发酵达到终止条件后加硫酸水溶液调节pH至5.4后对发酵罐内发酵液进行压滤,取滤液备用;
⒃滤液提取:将滤液压入提取罐,加入发酵液量1/4~1/5的醋酸丁酯,搅拌,静置分层后取上清液至浓缩罐进行减压浓缩,再打入同样的醋酸丁酯循环搅拌、提取,直至滤液提取干净;
⒄粗品浓缩:将上步的提取液减压浓缩至粥状物,放入结晶锅内用冰盐水降温结晶;
⒅粗品离心:将上步溶液置入离心机离心甩干;
⒆粗品烘干:将上述甩干物分装入烘盘内放入烘箱,烘烤获得粗品;
⒇精制品:进行粗制品的分离,然后采用甲醇进行重结晶得精制品。
本发明所述的蓝色犁头霉菌株以RSA为底物生产氢化可的松的方法包括以下具体步骤:
1原种复活:在27~29℃温度条件下,将保存的原种在PDA培养基茄子瓶或者克氏瓶斜面上培养,直到气生菌丝长满斜面;
2制备菌悬液:取无菌水倒入培养好菌种的茄子瓶中,用接种针搅拌完全,再取菌悬液稀释后,涂布在直径150MM的PDA平板上,在27~29℃温度条件下培养;
3制备茄子瓶或者克氏瓶斜面:在培养的PDA平板上选择单个菌落接种在PDA茄子瓶或者克氏瓶斜面上,在27~29℃温度条件下培养;
4制备一级种子液:在培养好的茄子瓶或克氏瓶斜面菌种中加入无菌水制备菌悬液并移入已经灭菌的摇瓶培养液中,在27~29℃温度条件下,在摇床上以200~220转/分培养18~20h,PH到4.5以下获得一级种子液;
5制备二级种子液:培养基以及装量与上一步相同,将一级种子液按照20%移种量移入二级摇瓶培养,在27~29℃温度条件下,在摇床上以200~220转/分培养11~13h后,PH到3.5以下即得二级种子液;
6投料发酵:按照0.2%的投料量投入RSA酒精溶液到二级种子液中摇瓶发酵培养,在以上相同条件下,培养24~48h后得到发酵液;
7结果检测:将每个摇瓶的发酵液经抽滤后,取滤液加入等量醋酸丁酯进行萃取并浓缩结晶。将结晶物抽滤得到氢化可的松粗品和母液,将氢化可的松粗品烘干称取粗品重量,根据投料量计算粗品收率和转化率;
8选取生产菌株:在收率80%以上、转化率70%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株,一方面制成砂土管原种或者牛奶冻干管在4℃条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用,另一方面传代用于甾体发酵生产;
9传代培养:在27~29℃温度条件下,将选取的生产菌株接入PDA培养基茄子瓶斜面上培养5~6天,直到气生菌丝长满斜面;
10培养生产母种:将传代培养后的菌种从茄子瓶斜面上接入PDA培养基克氏瓶斜面上培养6~7天,在27~29℃条件下培养,使得气生菌丝长满克氏瓶并呈蓝黑色;
11培养一级生产种子液:将生产母种接入种子罐中,培养基与摇瓶培养液相同,在27~29℃温度条件下培养20~22h,取样镜检确定没有被污染并且PH到4.5以下,即可移入二级发酵罐中培养;
12底物溶液制备:溶解罐中投入RSA,加入2倍水和18倍酒精,密闭后升温回流至RSA溶清,溶液清亮透明,然后保温备用;
13培养二级生产种子液:在发酵罐中置入培养液,然后将种子罐中的一级生产种子液移入该发酵罐,在27~29℃温度条件下培养培养11~13h后,取样镜检确定没有被污染并且PH到3.5以下,适当降温并将PH加片碱水溶液调节至5.2~5.4后压入底物溶液;
14投底物发酵:压入RSA底物溶液,在27~29℃温度下发酵培养18~32h,根据取样检测当时的发酵罐中的转化情况决定发酵终止时间;
15压滤:在发酵达到终止条件后加硫酸水溶液调节PH至5.4后对发酵罐内发酵液进行压滤,取滤液备用;
16滤液提取:将滤液压入提取罐,加入发酵液量1/4~1/5的醋酸丁酯,搅拌20~30min,静置分层30min后取上清液至浓缩罐进行减压浓缩,再打入同样的醋酸丁酯循环搅拌、提取,直至滤液提取干净;
17粗品浓缩:将上步的提取液减压浓缩至粥状物,放入结晶锅内用冰盐水降温结晶;
18粗品离心:将上步溶液置入离心机离心甩干;
19粗品烘干:将上述甩干物分装入烘盘内放入烘箱,烘烤获得粗品;
20精制品:根据中国专利专利号200710066229的方法进行粗制品的分离,然后采用甲醇进行重结晶得精制品。
菌株培养性状:通常在15~35℃条件下都能生长,其中以27~30℃为最适生长温度。在马铃薯琼脂培养基(PDA)上菌落初期为白色绒毛状匍匐菌丝并形成菌胎,后期为蓝黑色团状气生菌丝。27~29℃温度下在室内培养5~7d,基本上都能长满培养器皿。
菌株形态特征:菌丝分枝,或在发育初期时不分枝;具有匍匐枝,无色具隔膜,8.5~13.5mm;假根发达,通常从匍匐枝种长出,单枝或分枝,无色;孢囊柱从匍匐枝上长出,直立或斜生;孢子囊球形到梨形;孢囊孢子性状和大小不规则,3。0~12.5mm ´ 3.5-8.5mm;无厚垣孢子,接合孢子不知。
本发明的有益效果是:生产的氢化可的松具有转化率高(68~72%)、收率高(48~50%),而且生物学性状比较稳定等特点。本发明可以为以薯蓣皂甙为原料的植物甾体激素生产提高产量、降低生产成本提供技术支持。
附图说明
图1为本发明蓝色犁头霉甾体化合物微生物发酵生产流程图。
图2为本发明蓝色犁头霉发酵工艺流程图。
具体实施方式
实施例
①原种复活:在27~29℃温度条件下,将保存的原种在PDA培养基茄子瓶或者克氏瓶斜面上培养,直到气生菌丝长满斜面;
②制备菌悬液:取200ml无菌水倒入培养好的茄子瓶或者克氏瓶中,用接种针搅拌菌丝制成菌悬液,取菌悬液稀释到10-5~10-7倍数后,涂布在直径为150mmPDA平板上。在27~290C温度条件下培养3~4天;
③制备茄子瓶斜面:在培养的PDA平板上,选择单个菌落接种在60mlPDA茄子瓶斜面上,在27~290C温度条件下培养5~6天;
④制备一级种子液:制备培养液100ml置入500ml摇瓶中,在27~290C温度条件下,在摇床上(200~220转/分)培养20~22h后,检测PH在4.5以下即获得一级种子液;
⑤制备二级种子液:培养基以及装量与上一步相同,将一级种子液按照20%移种量移入二级摇瓶培养在27~290C温度条件下,在摇床上(200~220转/分)培养11~13h后,检测PH在3.5以下即为二级种子液。;
⑥投料发酵:按照0.2%的投料量投入底物酒精溶液到二级种子液中,在相同条件下,培养24~48h后检测符合要求后下料;
⑦结果检测:将每个摇瓶的发酵液经抽滤后,取滤液加入等量醋酸丁酯进行萃取并浓缩结晶。将结晶物抽滤得到氢化可的松粗品和母液,将氢化可的松粗品烘干称取粗品重量,根据投料量计算粗品收率和转化率;
⑧选取生产菌株:在收率80%以上、转化率70%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株,一方面制成砂土管原种或者牛奶冻干管在4℃条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用,另一方面传代用于甾体发酵生产;
⑨传代培养:在27~29℃温度条件下,将选取的生产菌株接入PDA培养基茄子瓶斜面上培养5~6d,到气生菌丝长满斜面;
⑩培养生产母种:将传代培养后的菌种从茄子瓶斜面上接入PDA培养基克氏瓶斜面上培养6~7天,在27~29℃条件下培养,使得气生菌丝长满克氏瓶并呈蓝黑色;
⑪培养一级生产种子液:将50瓶生产菌种接入已经置入了3.6t培养液(配方与摇瓶培养液相同)的种子罐(6t容积)中。在27~290C温度条件下培养20~22h后,取样镜检确定没有被污染并且PH到4.5以下,菌丝体体积达到85%以上标准后即可移入二级发酵罐中培养;
⑫底物溶液制备:溶解罐中投入RSA,加入2倍水和18倍酒精,密闭后升温回流至RSA溶清,溶液清亮透明,然后保温备用;
⑬培养二级生产种子液:将50t容积的发酵罐中置入30t培养液(配方与摇瓶培养液相同),然后将种子罐中的培养液全部移入该发酵罐,在27~290C温度条件下培养11~13h后,取样镜检确定没有被污染并且PH到3.5以下,菌丝体体积在40%~60%之间,适当降温并将PH加片碱水溶液调节至5.2~5.4后压入底物溶液;
⑭投底物发酵:在二级种子液的发酵罐中压入备用的底物溶液,在相同条件下培养18h后,根据取样检测当时的发酵罐中的转化情况决定发酵终止时间,一般控制发酵时间18~32h,最长不超过32h;
⑮压滤:在发酵达到终止条件后加硫酸水溶液调节PH至5.4后对发酵罐内发酵液进行压滤,取滤液备用;
⑯滤液提取:将滤液压入提取罐,发酵液量1/4~1/5的醋酸丁酯,搅拌20~30min,静置分层30min后取上清液至浓缩罐进行减压浓缩,再打入同样的醋酸丁酯循环搅拌、提取,直至滤液提取干净;
⑰粗品浓缩:将上步的提取液减压浓缩至粥状物,放入结晶锅内用冰盐水降温结晶;
⑱粗品离心:将上步溶液置入离心机离心甩干;
⑲粗品烘干:将上述甩干物分装入烘盘内放入烘箱,烘烤获得粗品;
⑳精制品:根据中国专利专利号200710066229的方法进行粗制品的分离,然后采用甲醇进行重结晶得精制品。
对本发明提出的新型蓝色犁头霉菌株,就其菌株培养基、培养条件和摇床验证的整个过程,进行了4个实例验证:
实例1
在摇床转速190r/min,培养温度27℃,发酵时间24h的条件下,收率为78.50%,转化率为68.86%。
实例2
在摇床转速200r/min,培养温度28℃,发酵时间30h的条件下,收率为81.75%,转化率为72.46%。
实例3
在摇床转速210r/min,培养温度29℃,发酵时间36h的条件下,收率为81.68%,转化率为72.24%。
实例4
在摇床转速220r/min,培养温度30℃,发酵时间48h的条件下,收率为80.33%,转化率为71.79%。
其结果表明:在培养基和培养条件(摇床转速、培养温度和培养时间)做相应变动的条件下,蓝色犁头霉菌株LJYH20130405-3和LJYH20130405-4对RSA的粗品收率和氢化可的松的转化率分别稳定在78~82%和68~73%之间,说明本发明提出的蓝色犁头霉新型菌株具有优良的性状;而且其在大型生产规模上该菌株也具有较高的转化率和收率,其转化率为68~72%,氢化可的松(精品)收率为48~50%。
Claims (4)
1.一种蓝色犁头霉菌株,属于真菌界、接合菌门、毛霉目、小克银汉霉科,保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,保藏时间为2013年6月8日,保藏号为:CGMCCNo.7688。
2.一种权利要求1所述的蓝色犁头霉菌株在以甾体中间体RSA为底物制备氢化可的松产物中的应用。
3.一种权利要求1所述的蓝色犁头霉菌株在以甾体中间体RSA为底物生产氢化可的松的方法,其特征在于包括以下步骤:
⑴原种复活:在菌种生长温度条件下,将保存的原种在PDA培养基茄子瓶或者克氏瓶斜面上培养,直到气生菌丝长满斜面;
⑵制备菌悬液:取无菌水倒入培养好菌种的茄子瓶中,用接种针搅拌完全,再取菌悬液稀释后,涂布在PDA平板上,在菌种生长温度条件下培养;
⑶制备茄子瓶或者克氏瓶斜面:在培养的PDA平板上选择单个菌落接种在PDA茄子瓶或者克氏瓶斜面上,在菌种生长温度条件下培养;
⑷制备一级种子液:在培养好的茄子瓶或克氏瓶斜面菌种中加入无菌水制备菌悬液并移入已经灭菌的摇瓶培养液中,在菌种生长温度条件下,在摇床上培养,pH到4.5以下获得一级种子液;
⑸制备二级种子液:培养基以及装量与上一步相同,将一级种子液按照20%移种量移入二级摇瓶培养,在菌种生长温度条件下,在摇床上培养,pH到3.5以下即得二级种子液;
⑹投料发酵:按照0.2wt%的投料量投入RSA酒精溶液到二级种子液中摇瓶发酵培养得到发酵液;
⑺结果检测:将每个摇瓶的发酵液经抽滤后,取滤液加入等量醋酸丁酯进行萃取并浓缩结晶,将结晶物抽滤得到氢化可的松粗品和母液,将氢化可的松粗品烘干称取粗品重量,根据投料量计算粗品收率和转化率;
⑻选取生产菌株:在收率80%以上、转化率70%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株,一方面制成砂土管原种或者牛奶冻干管在4℃条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用,另一方面传代用于甾体发酵生产;
⑼传代培养:在菌种生长温度条件下,将选取的生产菌株接入PDA培养基茄子瓶斜面上培养,直到气生菌丝长满斜面;
⑽培养生产母种:将传代培养后的菌种从茄子瓶斜面上接入PDA培养基克氏瓶斜面上培养,在菌种生长温度条件下培养,使得气生菌丝长满克氏瓶并呈蓝黑色;
⑾培养一级生产种子液:将生产母种接入种子罐中,培养基与摇瓶培养液相同,在菌种生长温度条件下培养,取样镜检确定没有被污染并且PH到4.5以下,菌丝体体积达到85%以上标准后即可移入二级发酵罐中培养;
⑿底物溶液制备:溶解罐中投入RSA,加入水和酒精,密闭后升温回流至RSA溶清,溶液清亮透明,然后保温备用;
⒀培养二级生产种子液:在发酵罐中置入培养液,然后将种子罐中的一级生产种子液移入该发酵罐,在菌种生长温度条件下培养培养后,取样镜检确定没有被污染并且pH到3.5以下,菌丝体体积在40%~60%之间,降温并加片碱水溶液压入底物溶液;
⒁投底物发酵:压入RSA底物溶液,在菌种生长温度下发酵培养,根据取样检测当时的发酵罐中的转化情况决定发酵终止时间;
⒂压滤:在发酵达到终止条件后加硫酸水溶液调节pH至5.4后对发酵罐内发酵液进行压滤,取滤液备用;
⒃滤液提取:将滤液压入提取罐,加入发酵液量1/4~1/5的醋酸丁酯,搅拌,静置分层后取上清液至浓缩罐进行减压浓缩,再打入同样的醋酸丁酯循环搅拌、提取,直至滤液提取干净;
⒄粗品浓缩:将上步的提取液减压浓缩至粥状物,放入结晶锅内用冰盐水降温结晶;
⒅粗品离心:将上步溶液置入离心机离心甩干;
⒆粗品烘干:将上述甩干物分装入烘盘内放入烘箱,烘烤获得粗品;
⒇精制品:进行粗制品的分离,然后采用甲醇进行重结晶得精制品。
4.按权利要求3所述的蓝色犁头霉菌株在以甾体中间体RSA为底物生产氢化可的松的方法,其特征是:
a.步骤⑴中,原种复活温度条件为27~29℃;
b.步骤⑵中,菌悬液涂布在直径150mm的PDA平板上;
c.步骤⑷中,一级种子液摇床上转速为200~220转/分,培养18~20h;
d.步骤⑸中,二级种子液摇床上转速为200~220转/分,培养11~13h:
e.步骤⑹中,投料发酵的培养时间为24~48h;
f.步骤⑼中,传代培养的生产菌株培养时间为5~6天;
g.步骤⑽中,生产母种在克氏瓶斜面上培养6~7天;
h.步骤⑾中,一级生产种子液培养时间为20~22h;
i.步骤⑿中,溶解罐中投入RSA后,再加入2倍水和18倍酒精;
j.步骤⒀中,一级生产种子液在发酵罐中应培养11~13h后,取样镜检后,降温并加片碱水溶液调节至pH5.2~5.4后压入底物溶液;
k.步骤⒁步骤中,投底物发酵发酵培养时间为18~32h;
l.步骤⒃中,滤液与醋酸丁酯混合时间为搅拌20~30min,静置分层30min;
m.步骤⒇中,粗制品分离的方法采用中国专利专利ZL200710066229的方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610706221.XA CN106148203A (zh) | 2016-08-23 | 2016-08-23 | 一种蓝色犁头霉及其应用技术 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610706221.XA CN106148203A (zh) | 2016-08-23 | 2016-08-23 | 一种蓝色犁头霉及其应用技术 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106148203A true CN106148203A (zh) | 2016-11-23 |
Family
ID=57342548
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610706221.XA Pending CN106148203A (zh) | 2016-08-23 | 2016-08-23 | 一种蓝色犁头霉及其应用技术 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106148203A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107475131A (zh) * | 2017-09-20 | 2017-12-15 | 天津科技大学 | 一株蓝色犁头霉及其应用 |
CN110004206A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-07-12 | 江南大学 | 一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法 |
CN110804640A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-02-18 | 华中药业股份有限公司 | 一种氢化可的松的生产发酵工艺 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101125876A (zh) * | 2007-09-24 | 2008-02-20 | 丽江映华生物药业有限公司 | 高纯度氢化可的松生产制备工艺 |
CN101168765A (zh) * | 2007-10-11 | 2008-04-30 | 天津科技大学 | 一种利用环糊精的疏水化合物生物转化方法 |
CN104893982A (zh) * | 2014-04-08 | 2015-09-09 | 丽江映华生物药业有限公司 | 一种黑根霉及其应用技术 |
-
2016
- 2016-08-23 CN CN201610706221.XA patent/CN106148203A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101125876A (zh) * | 2007-09-24 | 2008-02-20 | 丽江映华生物药业有限公司 | 高纯度氢化可的松生产制备工艺 |
CN101168765A (zh) * | 2007-10-11 | 2008-04-30 | 天津科技大学 | 一种利用环糊精的疏水化合物生物转化方法 |
CN104893982A (zh) * | 2014-04-08 | 2015-09-09 | 丽江映华生物药业有限公司 | 一种黑根霉及其应用技术 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107475131A (zh) * | 2017-09-20 | 2017-12-15 | 天津科技大学 | 一株蓝色犁头霉及其应用 |
CN110004206A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-07-12 | 江南大学 | 一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法 |
CN110004206B (zh) * | 2019-04-12 | 2021-03-02 | 江南大学 | 一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法 |
CN110804640A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-02-18 | 华中药业股份有限公司 | 一种氢化可的松的生产发酵工艺 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104893983B (zh) | 液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法及制品 | |
CN102061320B (zh) | 11α,17α-二羟基-雄甾-4-烯-3,20-二酮的制备方法 | |
CN106434401B (zh) | 一种富含麦角甾醇的酵母菌株及麦角酵母粉的制备方法 | |
CN101736033A (zh) | 深层发酵生产调脂降压功能红曲的方法 | |
CN104099385B (zh) | 一种深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的方法 | |
CN102703339A (zh) | 高产精氨酸脱亚胺酶菌株及用它生产l-瓜氨酸的方法 | |
CN106148203A (zh) | 一种蓝色犁头霉及其应用技术 | |
CN107475030A (zh) | 一种纯种小曲的生产工艺 | |
CN103045487B (zh) | 一株生产柠檬酸的菌株及其发酵生产柠檬酸的方法 | |
CN104087632B (zh) | 一种深层液态发酵生产桑黄胞外多糖的方法 | |
CN110205250A (zh) | 一株纤维素酶高产菌株及其筛选方法与应用 | |
CN101928671A (zh) | 一种链格孢属菌及其发酵人参茎叶总皂苷制备人参皂苷Rg3的方法 | |
CN110317734A (zh) | 一种高产糖化酶、酯化酶和蛋白酶的红曲霉及其分离培养方法和应用 | |
CN104357335B (zh) | 一株新型黑曲霉和其生产糖化酶的方法 | |
CN102168024B (zh) | 一种金龟子绿僵菌 | |
CN107475131A (zh) | 一株蓝色犁头霉及其应用 | |
CN102533570A (zh) | 一种黑曲霉及其应用及发酵制备柠檬酸的方法 | |
CN101736034A (zh) | 深层发酵低桔霉素红曲红色素的制备方法 | |
CN105779309B (zh) | 一株土曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用 | |
CN109022501A (zh) | 一种利用废弃物获取阿魏酸的方法 | |
CN1944625A (zh) | 虫草饮品用大米固态发酵的蛹虫草菌丝培育方法 | |
CN109536558A (zh) | 制备β-胡萝卜素的方法 | |
CN113881572A (zh) | 一种高产洛伐他汀红曲及其培育方法和应用 | |
CN105602856B (zh) | 黑曲霉(Aspergillus niger)An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 | |
CN105779554A (zh) | 微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20161123 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |