CN110004206B - 一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法，属于微生物技术领域。本发明提供了一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法，此方法先结合诱变育种技术和流式细胞仪建立庞大的可供选择目标孢子库，然后通过同时利用罗丹明123(Rh123)以及7‑氨基放线菌素D(7‑AAD)对目标孢子库中的蓝色犁头霉孢子进行染色高效筛选出目标孢子库中的活孢子，再通过基于酶标仪检测的高通量筛选模型从活孢子中初筛出具有高RSA转化率的蓝色犁头霉菌株，最后通过摇瓶复筛出高产氢化可的松的蓝色犁头霉菌株，显著提高了菌株筛选效率和精准度。

Description

一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法

技术领域

本发明涉及一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法，属于微生物技术领域。

背景技术

氢化可的松(Hydrocortisone，Hd)是一种重要的甾体药物，具有抗毒、抗炎、抗过敏等作用。目前，工业上生产氢化可的松主要是以17-α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸(RSA)为底物，以蓝色犁头霉(Absidia coeralea)为生产菌株，通过生物转化法生产。

但是，由于现有的蓝色犁头霉(Absidia coeralea)在转化RSA生产氢化可的松的过程中会产生约30％的副产物表氢化可的松(Epihydrocortisone，EHC)，这大大限制了氢化可的松在生产过程中的转化率，因此，急需选育出氢化可的松产率更高的蓝色犁头霉(Absidia coeralea)。

现在，工业上选育高产氢化可的松的优良蓝色犁头霉(Absidia coeralea)菌株一般采用诱变育种方式，其过程一般包含三步，第一步，蓝色犁头霉(Absidia coeralea)孢子的突变；第二步，突变后活孢子的筛选；第三步，高产氢化可的松蓝色犁头霉(Absidiacoeralea)的筛选。但是，由于现在并没有专门针对蓝色犁头霉(Absidia coeralea)孢子的染色方法，现有的其他染色方法在应用于蓝色犁头霉(Absidia coeralea)孢子时，不能较好的将活孢子和死孢子进行区分，染色效率较低，这大大增加了诱变育种中第三步的工作量，最终导致了筛选出高产菌株的频率低。

因此，急需找到一种针对蓝色犁头霉(Absidia coeralea)孢子的染色方法以提高蓝色犁头霉(Absidia coeralea)活孢子的筛选效率，进而提高可高产氢化可的松的蓝色犁头霉(Absidia coeralea)的筛选效率。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提高蓝色犁头霉(Absidia coeralea)活孢子的筛选效率，进而提高可高产氢化可的松的蓝色犁头霉(Absidia coeralea)的筛选效率。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种染色剂，所述染色剂的成分包含罗丹明123(Rh123)以及7-氨基放线菌素D(7-AAD)。

在本发明的一种实施方式中，所述染色剂中，罗丹明123的浓度为3～10μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述染色剂中，7-氨基放线菌素D的浓度为2～7.5μg/mL。

本发明还提供了一种蓝色犁头霉孢子的染色方法，所述方法为将蓝色犁头霉孢子悬液与上述染色剂混合进行染色。

在本发明的一种实施方式中，所述蓝色犁头霉孢子悬液与上述染色剂的体积比为1:1。

在本发明的一种实施方式中，所述蓝色犁头霉孢子悬液中蓝色犁头霉孢子的浓度为10⁶～10⁷个/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述染色的条件为避光，冰上孵育10～30min。

本发明还提供了上述染色剂或上述染色方法在蓝色犁头霉孢子染色以及筛选蓝色犁头霉活孢子方面的应用。

本发明还提供了一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法，所述方法为使用上述染色方法。

在本发明的一种实施方式中，将待筛选的蓝色犁头霉孢子配置成孢子悬液；使用上述染色方法对孢子悬液进行染色后，使用流式细胞仪筛选活孢子；将单个活孢子分装至添加有种子培养基的细胞培养板中进行第一次培养，获得种子液；将种子液接种至添加有发酵培养基的细胞培养板中进行第二次培养，获得发酵液A；待发酵液A的pH下降至3.8～4.0后，调节发酵液A的pH为5.4～5.6，并于发酵液A中添加17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)溶液进行第三次培养，获得发酵液B；将发酵液B离心，取上清；将上清稀释至酶标仪所能测定的范围内，取稀释后的上清加入酶标板中，用酶标仪测定OD_245nm，OD_245nm越高，发酵液B中被转化的17-α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸(RSA)越多，比较每一份稀释后的上清测得的OD_245nm，即得17-α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸(RSA)转化率相对高的菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述待筛选的蓝色犁头霉孢子是通过将蓝色犁头霉成熟孢子诱变处理后得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述诱变处理包含物理诱变、化学诱变和代谢工程改造。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基在细胞培养板中的添加量为100～200μL。

在本发明的一种实施方式中，所述第一次培养的温度为28℃、时间为48h。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液在发酵培养基中的添加量占发酵培养基总体积的10％。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基在细胞培养板中的添加量为100～200μL。

在本发明的一种实施方式中，所述第二次培养的温度为28℃、转速为900r/min。

在本发明的一种实施方式中，所述17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)溶液在第二次培养获得的发酵液中添加量占第二次培养获得的发酵液总体积的2.5‰。

在本发明的一种实施方式中，所述17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)溶液的制备方法为将17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)研磨均匀后用体积百分浓度为85％的乙醇回流溶解。

在本发明的一种实施方式中，所述17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)与乙醇的质量比为1:18。

在本发明的一种实施方式中，所述第三次培养的温度为28℃、转速为900r/min、时间为60h。

在本发明的一种实施方式中，所述稀释后的上清在酶标板中的添加量为50～200μL。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞培养板包含96深孔板、96浅孔板、48深孔板、24深孔板和/或12深孔板。

在本发明的一种实施方式中，所述酶标板为96孔酶标板。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包含将得到的17-α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸(RSA)转化率相对高的菌株接种至发酵培养基进行摇瓶发酵，用高效液相色谱测定发酵获得的发酵液中氢化可的松的产量，以确定菌株是否能高产氢化可的松。

本发明还提供了上述高通量筛选方法在筛选氢化可的松高产菌株方面的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种蓝色犁头霉孢子的染色方法，此方法为同时利用罗丹明123(Rh123)以及7-氨基放线菌素D(7-AAD)对蓝色犁头霉孢子进行染色；利用此方法，可以将蓝色犁头霉活孢子染成绿色、死孢子染成红色以很好的将蓝色犁头霉活孢子和死孢子进行很好的区分；并且，利用此方法对蓝色犁头霉孢子进行染色的染色效率很高，将利用此方法筛选出的蓝色犁头霉活孢子进行培养，平均生长率可高达93.2％；

(2)本发明提供了一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法，此方法先结合诱变育种技术和流式细胞仪建立庞大的可供选择目标孢子库，然后通过同时利用罗丹明123(Rh123)以及7-氨基放线菌素D(7-AAD)对目标孢子库中的蓝色犁头霉孢子进行染色高效筛选出目标孢子库中的活孢子，再通过基于酶标仪检测的高通量筛选模型从活孢子中初筛出具有高RSA转化率的蓝色犁头霉菌株，最后通过摇瓶复筛出高产氢化可的松的蓝色犁头霉菌株，显著提高了菌株筛选效率和精准度。

附图说明

图1：罗丹明123(Rh123)的结构式。

图2：7-氨基放线菌素D(7-AAD)的结构式。

图3：氢化可的松与表氢化可的松的全波长扫描图。

图4：氢化可的松浓度与OD_245nm的关系。

图5：表氢化可的松浓度与OD_245nm的关系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的罗丹明123(Rh123)以及7-氨基放线菌素D(7-AAD)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；下述实施例中涉及的17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)购自山东新华制药有限公司；下述实施例中涉及的蓝色犁头霉(斜面)购自北纳生物，产品编号为：BNCC185750。

17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸(RSA)溶解方法如下：

将17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)研磨均匀后用体积百分浓度为85％的乙醇回流溶解；其中，17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)与乙醇的质量比为1:18。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

氢化可的松的测定：高效液相色谱(HPLC)。

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)；色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18；流动相：乙腈280mL，超纯水720mL；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；紫外检测器波长：245nm；

标准样品制备：准确称取表氢化可的松0.0120g，氢化可的松0.040g，甲醇定容至30mL，准确移取上述充分混匀后有溶液1mL，用甲醇：水＝9：1的溶液定容至25mL；

样品制备：准确量取发酵液样品2mL，稀释至20mL，经0.22μL滤膜过滤，滤液供高效液相色谱分析。

平均生长率的测定：

筛选出蓝色犁头霉活孢子以单孢子的形式涂布于平板培养基上，28℃下培养48h后计算平均生长率，平均生长率＝(S/A)×100％；其中，A表示接种的单孢子总个数，S表示平板上形成菌落的总个数。

下述实施例中涉及的培养基如下：

平板、斜面培养基(g/L)：葡萄糖20、土豆浸粉12、琼脂30，pH调至6.8～7.2，121℃灭菌15min。

种子、发酵培养基(g/L)：葡萄糖10.5、玉米浆干粉5、酵母粉1.6、(NH₄)₂SO₄5，pH调至6.4～6.7，121℃灭菌15min。

实施例1：Rh123染料、7-AAD染料双染

具体步骤如下：

1、ARTP诱变

将蓝色犁头霉斜面菌株在28℃下培养2d至孢子成熟，刮取成熟孢子于1.5mL无菌生理盐水管子中，菌悬液震荡均匀后用无菌滤纸过滤；吸取10μL浓度为1×10⁷个/mL的菌悬液均匀涂布在无菌的载片表面，将载片置于载台上，用ARTP诱变育种系统处理，在入射功率为100W、氦气流量为10SLM条件下，分别处理1min、2min、3min、4min和5min获取不同活性的蓝色犁头霉孢子。

2、Rh123染料、7-AAD染料对孢子双重染色

ARTP诱变育种系统处理完毕后，用无菌镊子将载片放至装有1mL生理盐水的EP管中，振荡1min，把附着在菌物载片上的微生物洗脱到液体中，4500rpm离心10min，生理盐水洗涤2次后，再用生理盐水适量稀释制成孢子浓度在10⁶-10⁷个/mL之间的纯净菌悬液，取等体积的蓝色犁头霉孢子悬液和双重染色剂(V_{12μg/mL的Rh123}：V_{10μg/mL的7-AAD}＝1：1)混合，避光放置冰上孵育15min进行染色。

3、流式细胞仪检测与分选

以没有经过染色的蓝色犁头霉孢子悬液为阴性对照，通过调整流式细胞仪的FSC、SSC、Gain值以及电压的设定值将背景噪音信号确定在合适范围内，以避免非特异性结合的影响；调整完毕后，将经染色的蓝色犁头霉孢子悬液上流式细胞仪检测分析筛选出蓝色犁头霉活孢子；其中，流式细胞仪的FSC-Log Height、SSC-Log Height分别用来检测孢子的前向散射光和侧向散射光，两种散射光能够反映孢子的大小和密度，首先通过FSC-LogHeight、SSC-Log Height坐标确定孢子区域，FITC-Log Height通道检测Rh123染色有活性孢子发出的荧光，RPE-TR-Log Height通道检测7-AAD染色无活性孢子发出的荧光，所得数据用Summit 5.4软件分析，综合分析，蓝色犁头霉死孢子被7-AAD染色后，发出红色荧光信号，蓝色犁头霉活孢子被Rh123染色后，发出绿色荧光信号。

4、多孔板初筛高氢化可的松转化率菌株

分别将RSA、氢化可的松和表氢化可的松配置成浓度为0.03～0.1g/L的标准品溶液，在酶标仪上进行波长扫描(扫描结果见图3)，发现氢化可的松和表氢化可的松在245nm处有吸收峰，而底物RSA在245nm处无明显吸收峰；将氢化可的松标准品和表氢化可的松分别用无水甲醇配置成浓度为0.03～0.1g/L的溶液，在245nm下检测OD值，发现氢化可的松标准品和表氢化可的松标准品与OD_245nm有较好的线性关系(具体可见图4-5)，线性方程分别为Y＝2.0276X+0.1410(R²＝0.9922)和Y＝2.2581X+0.0582(R²＝0.9983)，X为标准品浓度，Y为OD_245nm；加入空白培养基发现培养基对线性趋势无明显影响，此方法可用于筛选RSA高转化率菌株。

检测筛选出的蓝色犁头霉活孢子的平均生长率，检测结果为：平均生长率可达93.2％。

将筛选出蓝色犁头霉活孢子以单孢子的形式分装至装有种子培养基的96浅孔板中(培养基装液量180μL)，28℃下培养48h，得到种子液；以10％(v/v)的接种量，将96孔板中的种子液平行转接到带挡板的装有发酵培养基的48孔板中(培养基装液量900μL)，28℃、900rpm的条件下培养30h至pH下降至3.8～4.0，加入浓度为1M的NaOH调节pH至5.4～5.6后，投入溶解好的RSA，投料量为2.5‰，28℃、900rpm的条件下继续发酵60h，得到发酵液；将48孔板中的发酵液离心，取150μL上清于96酶标板中，酶标仪测定OD_245nm，OD_245nm越大，RSA转化率越高，即能筛选获得高RSA转化率的蓝色犁头霉菌株。

5、摇瓶复筛氢化可的松高产菌株

根据初筛结果，取与OD_245nm排名前12的发酵液相对应的蓝色犁头霉活孢子，将这12个蓝色犁头霉活孢子与未经突变处理的蓝色犁头霉孢子分别以单孢子的形式分装至装有种子培养基的96浅孔板中(培养基装液量180μL)，28℃下培养48h，得到种子液；以10％(v/v)的接种量，将96孔板中的种子液平行转接到带挡板的装有发酵培养基的48孔板中(培养基装液量900μL)，28℃、900rpm的条件下培养30h至pH下降至3.8～4.0，加入浓度为1M的NaOH调节pH至5.4～5.6后，投入溶解好的RSA，投料量为2.5‰，28℃、900rpm的条件下继续发酵60h，得到发酵液。

用高效液相色谱测定发酵获得的发酵液中氢化可的松的产量，发现12个蓝色犁头霉活孢子中，有一个蓝色犁头霉活孢子的氢化可的松产量较未经突变处理的蓝色犁头霉孢子提高了18.4％，即得高产氢化可的松的蓝色犁头霉。

实施例2：Rh123染料、7-AAD染料双染

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将双重染色剂(V_{12μg/mL的Rh123}：V_{10μg/mL的7-AAD}＝1：1)替换为双重染色剂(V_{6μg/mL的Rh123}：V_{4μg/mL的7-AAD}＝1：1)。

检测筛选出的蓝色犁头霉活孢子的平均生长率，检测结果为：平均生长率可达91.8％。

实施例3：Rh123染料、7-AAD染料双染

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将双重染色剂(V_{12μg/mL的Rh123}：V_{10μg/mL的7-AAD}＝1：1)替换为双重染色剂(V_{20μg/mL的Rh123}：V_15μg/mL的7-AAD＝1：1)。

检测筛选出的蓝色犁头霉活孢子的平均生长率，检测结果为：平均生长率可达91.2％。

实施例4：Rh123染料、7-AAD染料双染

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将双重染色剂(V_{12μg/mL的Rh123}：V_{10μg/mL的7-AAD}＝1：1)替换为双重染色剂(V_{6μg/mL的Rh123}：V_{15μg/mL的7-AAD}＝1：1)。

检测筛选出的蓝色犁头霉活孢子的平均生长率，检测结果为：平均生长率可达92.7％。

实施例4：Rh123染料、7-AAD染料双染

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将双重染色剂(V_{12μg/mL的Rh123}：V_{10μg/mL的7-AAD}＝1：1)替换为双重染色剂(V_{20μg/mL的Rh123}：V_{4μg/mL的7-AAD}＝1：1)。

检测筛选出的蓝色犁头霉活孢子的平均生长率，检测结果为：平均生长率可达92.2％。

实施例5：Rh123染料、7-AAD染料双染

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将避光放置冰上孵育的时间分别替换为5、10、15、20、25、30、35、40、50min进行染色。

检测筛选出的蓝色犁头霉活孢子的平均生长率，检测结果为：孵育时间为5min时，平均生长率为78.2％；孵育时间为10min时，平均生长率为90.9％；孵育时间为15min时，平均生长率为93.2％；孵育时间为20min时，平均生长率为92.9％；孵育时间为25min时，平均生长率为92.2％；孵育时间为30min时，平均生长率为91.1％；孵育时间为35min时，平均生长率为81.2％；孵育时间为40min时，平均生长率为72.1％；孵育时间为50min时，平均生长率为54.3％，可见，应将孵育时间控制在10～30min。

对比例1：Rh123染料单染

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将双重染色剂(V_{12μg/mL的Rh123}：V_{10μg/mL的7-AAD}＝1：1)替换为单染色剂：浓度为12μg/mL的Rh123。

检测筛选出的蓝色犁头霉活孢子的平均生长率，检测结果为：平均生长率可达70.1％。

比对例2：7-AAD染料单染

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将双重染色剂(V_{12μg/mL的Rh123}：V_{10μg/mL的7-AAD}＝1：1)替换为单染色剂：浓度为10μg/mL的7-AAD。

检测筛选出的蓝色犁头霉活孢子的平均生长率，检测结果为：平均生长率可达65.8％。

对比例3：碘化丙啶(PI)染料、荧光素二乙酸酯(FDA)染料双染

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将双重染色剂(V_{12μg/mL的Rh123}：V_{10μg/mL的7-AAD}＝1：1)替换为双重染色剂(V_7μg/mL的PI：V_{15μg/mL的FDA}＝1：1)。

检测筛选出的蓝色犁头霉活孢子的平均生长率，检测结果为：平均生长率可达80.4％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种氢化可的松高产菌株的高通量筛选方法，其特征在于，将待筛选的蓝色犁头霉孢子配置成孢子悬液；使用染色剂对孢子悬液进行染色后，使用流式细胞仪筛选活孢子；将单个活孢子分装至添加有种子培养基的细胞培养板中进行第一次培养，获得种子液；将种子液接种至添加有发酵培养基的细胞培养板中进行第二次培养，获得发酵液A；待发酵液A的pH下降至3.8～4.0后，调节发酵液A的pH为5.4～5.6，并于发酵液A中添加17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)溶液进行第三次培养，获得发酵液B；将发酵液B离心，取上清；将上清稀释至酶标仪所能测定的范围内，取稀释后的上清加入酶标板中，用酶标仪测定OD_245nm，OD_245nm越高，发酵液B中被转化的17-α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸(RSA)越多，比较每一份稀释后的上清测得的OD_245nm，即得17-α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸(RSA)转化率相对高的菌株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色剂的成分包含罗丹明123(Rh123)以及7-氨基放线菌素D(7-AAD)。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述染色剂中，罗丹明123的浓度为3～10μg/mL。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述染色剂中，7-氨基放线菌素D的浓度为2～7.5μg/mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蓝色犁头霉孢子悬液与染色剂的体积比为1:1。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蓝色犁头霉孢子悬液中蓝色犁头霉孢子的浓度为10⁶～10⁷个/mL。

7.权利要求1所述的高通量筛选方法在筛选氢化可的松高产菌株方面的应用。

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