CN115466685A - 藤仓镰刀菌及其发酵生产赤霉素a4+7的方法及运用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种藤仓镰刀菌及其赤霉素A4+7的方法及运用，其中本申请的藤仓镰刀菌于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.40179，菌种名为QJ47‑9。本申请中的藤仓镰刀菌经市售藤仓镰刀菌诱导得到，其具有更高的发酵水平，发酵温度高于市售藤仓镰刀菌，且发酵周期缩短，相较于现有的生产菌中具有明显的优势。
Description
技术领域
本申请涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种藤仓镰刀菌及其发酵生产赤霉素A4+7的方法及运用。
背景技术
赤霉素是一类内源性植物调节物质，在各种作物种均有存在。赤霉素具有双萜结构，具有较多的种类。不同的赤霉素之间的差别主要在于双键和羟基为位置和数目，其作为植物激素，可以起到促进植物生长、防止器官脱落、促进麦芽糖转化、促进细胞生长等诸多作用，常被用做植物生长调节剂，起到促进种子萌发、调节植物株高和器官大小、刺激植物开花、调节果实大小等作用。
目前，市售的赤霉素主要为赤霉素A3和赤霉素A4+7，其制备方法主要为微生物发酵法。该方法一般通过菌种在一定温度下发酵得到，由于目前，市面上的赤霉素发酵工艺一般的使用温度均为30℃。由于发酵制备赤霉素的过程中，赤霉素生产菌会释放出大量的热量，因此需要采用大量冷却水，以控制反应体系的温度，进而保证赤霉素生产菌活性，这种方法带来了大量冷却水的使用，造成了资源的浪费和生产成本的升高。
发明内容
本申请涉及藤仓镰刀菌，该藤仓镰刀菌可以在32℃以上的环境中发酵并以较高的产量制备赤霉素4+7，具有良好的经济效应。
本申请涉及的藤仓镰刀菌经原赤霉素A4+7生产菌诱变得到，其菌种名为QJ47-9，于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.40179，拉丁名为Fusarium fujikuroi。
本申请还涉及上述藤仓镰刀菌在生产赤霉素4+7中的运用。
本申请涉及通过以上藤仓镰刀菌发酵制备赤霉素A4+7中方法，其中，发酵温度不低于30℃，优选不低于32℃。发酵时间不少于6天，优选为6天。
本申请中，制备赤霉素A4+7的方法具体包括如下步骤：
S1、配置种子培养基，加入如权利要求1中所述的藤仓镰刀菌菌种，培养得到种子液；
S2、将种子液转移到发酵培养基中，对种子液进行发酵，得到发酵液。
在步骤S2中，发酵温度不低于30℃，优选不低于32℃。发酵时间不少于6天，优选为6天。
其中，种子培养基和发酵培养基中，所含碳源独立地选取淀粉、葡萄糖、蔗糖、糖蜜中的任意数量种，所含氮源独立地选取黄豆饼粉、玉米浆干粉、花生粉、酵母粉、棉籽粉、低温豆粕中的任意数量种。优选的，种子培养基采用如下配比：蔗糖40-60、黄豆粉8-12、NH4NO3 1.0-1.5、MgSO4·7H2O1.0-1.5、KH2PO4 1.0-1.5’，单位为g/L；发酵培养基采用如下配比：淀粉80-120，黄豆饼粉10-15、玉米浆干粉20-30、K2SO4 1.2-2.0、MgSO4·7H2O 1.0-1.5、ZnSO4·7H2O 4-5×10-3，单位为g/L。
通过采用上述技术方案，利用本申请中诱导得到的新菌种，在相同条件下的赤霉素A4+7产量优于市售传统赤霉素生产菌种，且其适应温度提高到32℃，且只需6天就可以完成发酵过程，大幅减少了生产过程的冷凝水使用并缩短了生产流程，具有出色的经济效应。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本申请进行进一步阐述。
实施例1，藤仓镰刀菌，由市售赤霉素A4+7生产菌诱变得到，其菌种名为QJ47-9，于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.40179，拉丁名为Fusariumfujikuroi。
上述藤仓镰刀菌的诱变流程具体包括如下步骤：
1、菌丝体富集培养
解冻出发菌株冷冻甘油管，用无菌吸管吸取0.5mL至装有30mL富集培养基的250mL锥形瓶中，在30℃，摇床转速200r/min条件下，培养2d。
2、原生质体制备
将培养好的菌丝体用无菌滤纸过滤转至无菌离心管，用缓冲液洗涤3次后吸干多余水分，按破壁酶终浓度1.5％(w/w)的比例往菌丝体中加入预先配制好的破壁酶酶液，30℃、50r/min保温震荡4h，离心去酶液得到原生质体。
3、常压室温等离子体诱变
将原生质体悬浮液均匀涂布于载片表面，干燥后待用。诱变仪工作条件：注入气体为氦气，电源功率200W，气流量10L/min，照射距离2mm，样品量10μL。处理时间为100s。将处理后的载片置于装有1mL生理盐水的ep管以洗下菌体，再取0.1mL涂布至至原生质体再生平板，30℃培养48h后观察并纪录菌落数。挑取单菌落至斜面，30℃培养4d后进行发酵实验，筛选得到QJ47-9。在该诱变条件下，致死率82％，正突变率4.6％。
在步骤3中，原生质体培养基组分如下：蔗糖20g/L、土豆200g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、CaCO3 0.2g/L、琼脂15g/L，不额外进行pH调节。
实施例2，藤仓镰刀菌用于制备赤霉素A4+7，具体包括如下步骤：
S1、在原生质体培养的培养基中，从斜面挑取1cm2左右大小的带菌琼脂块于种子培养基中，装液量25/250mL，在温度30℃，摇床转速200r/min条件下，培养48h，得到种子液。
S2、取2mL种子液接入发酵培养基中，装液量50/500mL，在30℃，摇床转速200r/min条件下，得到发酵液。
其中，种子培养基组分如下：蔗糖50g/L，黄豆粉10g/L、NH4NO3 1.2g/L、MgSO4·7H2O 1.2g/L、KH2PO4 1.2g/L；发酵培养基采用如下配比：淀粉100g/L，黄豆饼粉13g/L、玉米浆干粉25g/L、K2SO4 1.6g/L、MgSO4·7H2O 1.2g/L、ZnSO4·7H2O 4.5×10-3g/L。
实施例3，与实施例2的区别在于，在步骤S2中，发酵温度为32℃。
另设置对比例如下：
对比例1，与实施例2的区别在于，采用市售赤霉素A4+7进行发酵。
对比例2，与实施例3的区别在于，采用市售赤霉素A4+7进行发酵。
对上述实施例和对比例制备得到的发酵液，测定其赤霉素4+7的含量，具体方法如下：
取0.5mL发酵液，加入9.5mL甲醇，强烈震荡10min，2600r/min离心10min，取上清液HPLC分析。HPLC条件：Hypersil BDS C18反相色谱柱(150mm×4.6mm)；流动相:甲醇–水(60:40，v/v)，流速0.8mL/min；紫外检测器波长203nm；进样体积20μL。测定结果的单位为mg/L。
对实施例2～3和对比例1～2中的发酵液，每组进行三次重复实验，得到如下结果。
通过上述实施例和对比例之间的对比，可以看到，本申请中诱导得到的藤仓镰刀菌相较于市售的赤霉素A4+7生产菌，在30℃和32℃下均有更优的发酵产率。其中。在30℃条件下，实施例中的藤仓镰刀菌发酵水平可以达到1200mg/L以上，而对比例1中，其在7d发酵后，赤霉素A4+7在发酵液中的含量仅为850mg/L左右。另外，在升高温度后，实施例的藤仓镰刀菌依旧具有良好的活性，其活性没有下降，且在6d左右的时间基本上可以达到峰值(约1200mg/L)，达峰后赤霉素A4+7的含量基本与30℃反应条件下得到的结果一致。而对比例2中可以明显的看到，其活性相较于对比例1有明显的下降，且在d5后峰值没有继续增加，这意味着菌种的活性在高温下已经受到了影响，难以继续进行发酵生产的行为。因此，实施例中经诱导得到的藤仓镰刀菌相较于市售的赤霉素A4+7生产菌具有更高的适应温度，因此在运用于实际生产中可以减少冷却水的使用，缩短发酵时间，进而优化生产流程，降低了企业的生产成本，缩短了企业的生产周期，进而具有良好的经济效应和市场价值。
另外，对实施例1中的藤仓镰刀菌进行五代传代，并对每代菌种进行发酵水平检验，其中，初代藤仓镰刀菌的发酵水平为1208，后续的5批次稳定性实验平均数据为：1188,1231,1207,1219,1196，单位均为mg/L。其发酵水平没有下降，证明本申请中诱导得到的藤仓镰刀菌具有出色的稳定性。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.藤仓镰刀菌，其特征在于，于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.40179，菌种名为QJ47-9，分类命名为藤仓镰刀菌。
2.权利要求1所述的菌种在发酵生产赤霉素A4+7中的运用。
3.通过权利要求1所述的藤仓镰刀菌发酵生产赤霉素A4+7的方法，其特征在于，发酵温度不低于30℃。
4.根据权利要求3所述的发酵生产赤霉素A4+7的方法，其特征在于，发酵温度不低于32℃。
5.根据权利要求4所述的发酵生产赤霉素A4+7的方法，其特征在于，发酵时间为不少于6天。
6.根据权利要求3所述的发酵生产赤霉素A4+7的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、配置种子培养基，加入如权利要求1中所述的藤仓镰刀菌菌种，培养得到种子液；
S2、将种子液转移到发酵培养基中，对种子液进行发酵，得到发酵液。
7.根据权利要求6所述的发酵生产赤霉素A4+7的方法，其特征在于，在发酵培养基和种子培养基中，所含碳源独立地选取淀粉、葡萄糖、蔗糖、糖蜜中的任意数量种。
8.根据权利要求6所述的发酵生产赤霉素A4+7的方法，其特征在于，在发酵培养基和种子培养基中，所含氮源独立地选取黄豆饼粉、玉米浆干粉、花生粉、酵母粉、棉籽粉、低温豆粕中的任意数量种。
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