CN101044156A - 衍生自吩嗪酮的新型酶底物及其在检测具有肽酶活性的微生物中作为揭示剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及下式(I)的新型酶底物：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、A和X如权利要求1中所定义，包含所述新型酶底物的反应介质，及其用于检测和/或鉴定和/或定量表现出至少一种肽酶活性的微生物的用途。

Description

衍生自吩嗪酮的新型酶底物及其在检测具有肽酶活性的微生物中作为揭示剂的用途
本发明涉及用于检测肽酶活性的新型生色酶底物。这些底物可在包括产生物理化学信号的酶促水解步骤的应用中使用，特别是在微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中。与现有的底物(其大多数只是产生荧光的)相比，本发明的生色底物可以用于检测微生物，特别是在凝胶化的介质中，因为其产生在反应介质中不扩散从而集中在菌落范围内的着色。
本发明还涉及包含此类底物的反应介质，涉及所述底物或介质用于检测表现出肽酶活性的革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和酵母的用途，和涉及使用方法。
通常将能够通过水解而切割在氨基酸的酰基和伯胺之间形成的酰胺基团的酶称为氨肽酶，和将能够通过水解而切割在肽的酰基残基和伯胺之间形成的酰胺基团的酶称为肽酶。在本申请中，术语“肽酶”根据情况可以指上面定义的肽酶和氨肽酶两者。
用于检测肽酶活性的、不扩散的酶生色底物已被描述，并且在现有技术中是已知的。由此，由本申请人提交的专利申请WO98/04735和WO99/38995涵盖了这样的底物。然而，这些底物具有各种缺点：其难以合成，纯度很低，和产率很低。此外，为了在培养介质中使用，必须确定非常精确的介质组成以便观察颜色。
可以在用于检测混合培养的微生物的固体介质中使用的唯一的现有底物是从吖啶衍生的底物，且描述于由本申请人提交的专利申请PCT WO2004/069804中。
衍生自吩嗪酮的分子就其产生荧光的能力来说是已知的。其可以：
-用作酸碱指示剂，如例如在Stuzka，V.等人，1963，CollectionCzech.Chem.Commun.，28，1399-1407中所描述的，或
-用作荧光标记物，例如用于追踪蛋白构象的改变，如NakanishiJ.等人，2001，Analytical Chemistry，73(13)，2920-2928中所描述的，或例如用于检测微生物，如专利US5,336,600中描述的。在后一种情况下，所描述的化合物具有缺点，即其只能在液体介质中使用，和经过证明细菌生长来进行的微生物的检测通过氧化还原电位的改变来施行。因此，不存在关于酶活性的特异性，也不存在关于细菌的属或种的特异性。
目前描述的氨基吩嗪酮的任何衍生物，特别是résorufamine的任何衍生物，从未被用作可在凝胶化的介质中使用的生色酶底物。
根据本发明，提出了用于检测表现出肽酶活性的微生物的新型生色酶底物。本发明还涉及包含此类底物的反应介质，以及涉及所述底物或所述介质用于检测肽酶活性的用途，和涉及使用方法。
由此，本申请人已令人吃惊地发现，可能通过使用新型生色吩嗪酮衍生物来检测表现出肽酶活性的微生物，所述吩嗪酮衍生物产生在反应介质中不扩散的、从而集中在菌落范围内的着色，通过培养介质中菌落着色的改变而证实了肽酶活性。
在用待测试的微生物接种包含本发明底物的反应介质之后，当其不能水解所述底物时观察到无色至白色的菌落。相反地，当其能够水解本发明的底物时，观察到有色的菌落。
本发明的吩嗪酮衍生物既是生色的又是生成荧光的，且拥有具有良好的检测灵敏度的优点。此外，荧光的激发和发射发生在可见光谱内，这样可通过肉眼和在正常光照下检测荧光。
因此，本发明的目的是式(I)的生色酶底物：
Figure A20058003560300071
其中
-R1表示氢原子、C1-C12烷基、C6-C14芳烷基、芳基、-COOH、-COOR′或-NR″R，
-R2表示氢原子、卤素原子、C1-C12烷基、-COOH或-COOR′，
-R3表示氢原子、卤素原子、C1-C12烷基、-CN、-CONH2、-COOR′或-COR′，
-R4、R5和R6各自独立地表示氢原子、卤素原子、-COOR′或C1-C3烷基，要理解R4、R5和R6中至少一个是氢原子，
-R′表示氢原子或C1-C6烷基，
-R″和R各自独立地表示C1-C6烷基，或者R″和R与它们所连接的氮原子一起形成包含一个或多个杂原子的杂环核，
-A表示至少一个氨基酸，和
-X表示封端剂或不存在。
根据本发明，术语“芳基”特别地意指C6-C12芳族核，特别是苯基、苄基、1-萘基或2-萘基。芳烷基的芳基部分也是如此。因此，C6-C14芳烷基的烷基是C2-C8。
术语“Cx-Cy烷基”意指具有x至y个碳原子(在本情况下，1至12个碳原子、1至6个碳原子、或1至3个碳原子或2至8个碳原子的)直链或支化的烷基。作为实例，可提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。
术语“卤素原子”意指氯、溴、碘和氟。
术语“杂原子”意指除了碳原子以外的原子，例如O、N或S。
R″和R可形成的杂环核可以具有任意大小，但其优选地包含5至7个环成员。
杂环核的实例包括吗啉、哌嗪、哌啶、吡咯烷和咪唑烷核。
本发明的封端剂包括本领域技术人员已知的能够保护胺的任何封端剂。作为实例，可提及叔丁氧基羰基(N-tBOC)，9-芴基氧基羰基，增溶剂例如琥珀酰基，或不可代谢的(即非天然的)氨基酸例如哌可酸。
封端剂并非系统性地存在于本发明的化合物中。在该情况下，即当本发明的化合物不具有封端剂(X不存在)时，本发明的化合物以盐例如氯化物、溴化物或三氟乙酸盐的形式存在。
由式(I)中的A表示的氨基酸是本领域技术人员已知的任何氨基酸。
根据一个具体的实施方案，本发明的目的还是式(I)的生色酶底物：
其中
-R1表示氢原子、C1-C12烷基、C6-C14芳烷基、芳基、-COOH、-COOR′或-NR″R，
-R2表示氢原子、卤素原子、C1-C12烷基、-COOH或-COOR′，要理解R1和R2中至少一个是氢原子或卤素原子，
-R3表示氢原子、卤素原子、-CN、-CONH2、-COOR′或-COR′，
-R4、R5和R6各自独立地表示氢原子或C1-C3烷基，要理解R4、R5和R6中的至少一个是氢原子，
-R′表示氢原子或C1-C6烷基，
-R″和R各自独立地表示C1-C6烷基，或者R″和R与它们所连接的氮原子一起形成包含一个或多个杂原子的杂环核，
-A表示至少一个氨基酸，和
-X表示封端剂或不存在。
根据本发明的一个实施方案，A表示氨基酸，或具有至多10个氨基酸的肽，其中所述氨基酸是相同或不同的。优选地，考虑到底物的成本，A表示氨基酸，或具有至多4个氨基酸的肽，其中所述氨基酸是相同或不同的。
在适合于本发明目的的氨基酸中，可提及例如α-丙氨酸和β-丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸和焦谷氨酸。
根据本发明的一个实施方案，其中R1表示烷基并且R2表示氢原子的本发明化合物是优选的。更优选地，R1表示C1-C6烷基，或甚至C3-C6烷基，甲基和戊基是特别优选的。
其中R1表示氢原子并且R2表示C1-C6烷基的化合物构成了本发明的另一个实施方案。其中R2表示乙基或己基的化合物是优选的。
根据另一个实施方案，本发明的化合物是其中R3、R4、R5和R6各自表示氢原子的化合物。
根据另一个实施方案，还优选这样的化合物，其中R1和R2表示烷基或氢原子，并且R4表示氢原子、烷基或-COOR′，其中R′是烷基。作为烷基，优选C1-C3烷基，优选地是C1烷基。
根据另一个实施方案，还优选其中R1、R2、R3和R4是烷基或氢原子的化合物。作为烷基，优选C1-C3烷基，优选地是C1烷基。
可按照下面的流程1中所示的操作方案来制备本发明的化合物：
流程1
Figure A20058003560300091
Figure A20058003560300101
根据流程1，按照Wi1staetter和Mayer的方案(1904)，在化合物(2)存在的情况下通过经适当地取代的对苯二胺(1)的氧化氯化来制备合适的二氯亚胺(3)。然后，在乙醇溶液中将如此得到的二氯亚胺(3)与经适当地取代的间苯二酚(4)缩合，以产生résorufamine(5)。然后，在冷却至大约-12℃的水浴中将résorufamine(5)与一个或多个任选地受保护的氨基酸(6)反应，产生式(I)的化合物。当然，此处应当指出，当A是单个氨基酸时，化合物(6)中的A′相应于化合物(I)的A，但包含额外的羟基。换句话说，当A是单个氨基酸时，A′以-C(O)OH收尾，而A通过-C(O)-连接至-NH-，丢失了-OH。当A是至少两个氨基酸的链时，A′的最后一个氨基酸是如前面描述的，即，与A的最后一个氨基酸相比较，其包含额外的羟基。
可使用该方法制备本发明的所有化合物。然而，优选地，可按照下面的流程2中描述的方案来制备其中R1或R2是烷基的式(I)化合物。
流程2
Figure A20058003560300111
在上面的流程2中，在0至-3℃的温度下，在磷酸或硫酸存在的情况下，通过经适当地取代的3-氨基苯酚(7)与碱金属的亚硝酸盐例如亚硝酸钠的反应来制备亚硝基化合物(8)。然后，在作为酸催化剂的硫酸以及环化剂存在的情况下，在溶剂例如丙醇或丁醇中将如此获得的亚硝基乙酰氨基苯酚化合物(8)与经适当地取代的间苯二酚(4)反应。使如此获得的乙酰氨基吩嗪酮脱去乙酰基，方法是于90℃在硫酸存在的情况下进行短暂加热，在该过程之后进行冷却和水沉淀。然后，如流程1的操作方案中所示的，将如此获得的résorufamine(5)与一个或多个任选地经保护的氨基酸(6)反应。
也可按照下面的操作方案(如流程3中所示的)来制备所述化合物：
流程3
取代的2，5-二甲氧基苯酚类的合成
Figure A20058003560300121
取代的2，5-二硝基氟苯类的合成
Figure A20058003560300122
résorufamine或7-氨基吩嗪-3-酮的合成
肽的基联
Figure A20058003560300132
在上面的流程3中，以4个步骤制备本发明的化合物。
根据第1步骤，从也经适当地取代的氢醌化合物(9)制备经适当地取代的2，5-二甲氧基苯酚化合物(12)。将该化合物(9)在二甲基甲酰胺(DMF)中与NaH反应，随后加入碘甲烷，该反应之后在40℃下搅拌，从而产生经适当地取代的2，5-二甲氧基苯基化合物(10)。然后，按照Duff反应(Smith WE，1972，J Org.Chem.，37：3972)，在回流下将该化合物在三氟乙酸(trifluoroacétate)(TFA)中与乌洛托品反应，从而产生经适当地取代的2，5-二甲氧基苯甲醛(11)。最后，按照Bayer-Villiger反应(Capecchi T.等人，2000，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，2681)，在0℃下将化合物(11)在甲醇中与单过氧邻苯二甲酸镁反应，然后在DMF中与NaOH反应，从而产生经适当地取代的2，5-二甲氧基苯酚(12)。
根据第2步骤，从经适当地取代的氟苯胺(13)制备2，5-二硝基氟苯(17)。在0℃下，将该化合物(13)在三乙胺和二氯甲烷(DCM)中与乙酰氯反应，从而产生经适当地取代的N-乙酰-氟苯胺(14)。然后，将该化合物在乙酸中与浓硫酸和硝酸的混合物反应，从而产生经适当地取代的硝基苯胺化合物(15)。将该化合物(15)和盐酸一起回流，产生硝基苯胺化合物(16)，所述化合物(16)自身于65℃在乙酸中与过硼酸钠反应，从而产生化合物(17)。
根据第3步骤，通过将在第1步骤中获得的2，5-二甲氧基苯(12)和在第2步骤中获得的2，5-二硝基氟苯(17)如下所述进行反应而获得résorufamine(5)：将化合物(12)和(17)在环境温度下在DMF中与NaH反应，产生经适当地取代的二芳基醚(18)。然后，将该化合物(18)在DCM中与BBr3反应，产生二羟基二芳基醚(19)，其在催化剂Pd/C和甲醇存在的情况下自身发生反应，产生résorufamine(5)。
最后，根据最后一个步骤，然后如流程1的操作方案中所示，将如此获得的résorufamine(5)与一个或多个任选地经保护的氨基酸(6)反应。
在上面的操作方案中，起始反应物(化合物(1)、(2)、(4)、(6)、(7)、(9)和(13))可商购获得，特别是从Sigma获得。
本发明的目的还在于反应介质，所述介质单独地或与至少一种其他酶底物相组合地包含至少一种如上定义的式(I)的生色酶底物，所述其他酶底物是与通过本发明的底物而检测的酶活性不同的酶活性的特异性酶底物。
由此，当将表现出肽酶活性的微生物接种在包含本发明的化合物的反应介质之中或之上时，在反应介质之中或之上产生不扩散的、从而集中在菌落范围内的着色。
根据本发明，术语“反应介质”意指允许至少一种微生物的至少一种酶活性的显现的介质。
可将该反应介质只用作揭示的介质，或用作培养并揭示的介质。在第一种情况下，在接种前进行微生物的培养，而在第二种情况下，反应介质也构成了培养介质，这构成了本发明的一个特定实施方案。
所述反应介质可以是固体、半固体或液体。术语“固体介质”意指例如凝胶化的介质。
琼脂是在微生物学中用于培养微生物的常规固体介质，但可以使用明胶、琼脂糖或另一种胶凝剂。可商购获得某些制剂，例如Co1umbia琼脂、Trypcase-soja琼脂、Mac Conkey琼脂、Sabouraud琼脂，或更一般地，在Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中描述的制剂。
优选地，当反应介质还是培养介质时，其是凝胶化形式的。
反应介质中的琼脂的量是2至40g/l。对于固体介质，琼脂的量优选地是9至25g/l，更优选地12至14g/l，和对于半固体介质，琼脂的量优选地是2至6g/l。
本发明的酶底物可用于广泛的pH范围，特别是在pH5.5至10的范围内。
在反应介质中本发明的酶底物的浓度在0.01和1g/l之间，优选地在0.025和0.40g/l之间，且有利地其为0.05g/l。这是因为，在该底物浓度上，获得更好的着色反差。
所述反应介质可包含至少一种其他底物，所述其他底物是与通过本发明的底物而检测的酶活性不同的酶活性的特异性底物。所述其他底物的酶促水解产生与通过本发明的底物所检测的信号不同的可检测信号，例如不同颜色或荧光的产物，使得能够证明例如检测和/或鉴定和/或定量一种或多种微生物。
作为其他的特异性底物，可提及吲哚氧基类型的底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷(BIOSYNTH)或5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷(BIOSYNTH)，或用于检测微生物的任何其他底物。
其他的特异性酶底物的浓度一般在0.01和2g/l之间。本领域技术人员将能够根据所用的底物而容易地确定该浓度。
所述反应介质还可以组合地包含一种或多种成分，例如氨基酸、蛋白胨、糖类、核苷酸、矿物质、维生素、抗生素、表面活性剂、缓冲剂、磷酸盐、铵盐、钠盐、金属盐。介质的实例描述于本申请人的专利申请EP 656 421和WO99/09 207中。
因此，本发明的酶底物和反应介质可用于具有肽酶活性的微生物的诊断。
因此，本发明的目的还在于上面定义的式(I)的生色酶底物或反应介质用于在体外检测和/或鉴定和/或定量表现出至少一种肽酶活性的微生物的用途。
本发明还涉及用于检测和/或鉴定和/或定量表现出至少一种肽酶活性的微生物的方法，其特征在于，所述方法包括：
·提供如上定义的反应介质，
·用待测试的生物样品接种所述介质，
·温育，和
·揭示至少一种肽酶活性单独地或与至少一种不同于该肽酶活性的其他酶活性相组合地存在。
接种和温育步骤是本领域技术人员众所周知的。
例如，温育温度通常在20和55℃之间，最常见地在25和45℃之间，30、35和37℃的温度是最常使用的温育温度。至于温育的气氛，其可以无区别地是厌氧的或需氧的。
用肉眼通过显现着色的变化来进行揭示过程，所述着色在反应介质中不扩散从而集中在菌落范围内。
作为由于本发明的酶底物而可以诊断的微生物，可以提及革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和酵母。
作为革兰氏阴性细菌，可以提及下列属的细菌：假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血菌属(haemophilus)、摩根氏菌属(Morganella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)和军团菌属(Legionella)。
作为革兰氏阳性细菌，可以提及下列属的细菌：肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、利斯特氏菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)、分枝杆菌属(Mycobacteria)和棒杆菌属(Corynebacteria)。
酵母的实例包括下列属的酵母：假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、糖酵母属(Saccharomyces)和丝孢酵母属(Trichosporon)。
本发明的底物特别适合用于革兰氏阴性细菌的检测，因为可同时获得微生物的生长和菌落的清晰着色。
特别地，其中A是L-丙氨酸的本发明生色底物具有优点，即其使得能够将革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌清晰地区分开。
因此，本发明的另一个目的在于用于区分细菌属于革兰氏阳性微生物还是属于革兰氏阴性微生物的方法，其特征在于，所述方法包括：
·提供如上定义的反应介质，其中生色底物的取代基A是L-丙氨酸，
·用待测试的生物样品接种所述介质，
·温育，和
·揭示至少一种意味着存在革兰氏阴性微生物的着色变化的存在。
其中A是β-丙氨酸或焦谷氨酸的本发明的生色底物具有优点，即其使得能够将绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)与其他属区分开，也可将绿脓假单胞菌与假单胞菌属的其他物种区分开。
因此，本发明的另一个目的在于检测绿脓假单胞菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
·提供如上定义的反应介质，其中生色底物的取代基A是β-丙氨酸或焦谷氨酸，
·用待测试的生物样品接种所述介质，
·温育，和
·揭示至少一种意味着存在绿脓假单胞菌微生物的着色变化的存在。
待分析的生物样品是任何临床样品，例如唾液、血液、尿液或粪便样本，或其分析可帮助临床医师作出诊断的任何其他样品。所述样品也可以是来自食品和/或制药工业的产物的样品，或者食品和/或制药工业的基础产物(produit de base)的样品，在所述产物中必须保证不存在致病微生物，或者计数污染性菌群，或者检测特定微生物。
借助于下列以非限性的、举例说明的方式给出的实施例，将更全面地理解本发明。
实施例1：7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨酰基)-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮的合成
通过1.76g(10mmol)对苯二胺的氯化来制备1，4-二氯苯醌二亚胺，随后在无水甲醇(50ml)存在的情况下通过加热将其溶解，并将9g尿素加入至搅拌的所述溶液中。然后，在40-50℃下向所述溶液中加入1.8g(10mmol)5-戊基间苯二酚，并在完全溶解后，小心地使反应混合物回流以避免过度放热。加热持续1.5小时，在该时间后，缓慢地向充分搅拌的含氨的冰/水混合物中加入该冷却的反应混合物。通过吸滤收集沉淀并用水洗涤，然后风干，从而获得2.2g由标题化合物的混合物组成的粗产物，未氯化的产物占大部分。
在搅拌下，将乙酸(30％，200cm3)从2-颈烧瓶中逐滴加入溶液中，所述溶液由溶解在200cm3水中的大约5g硼氢化钠和200mg氢氧化钠组成。将氢气通过3-颈烧瓶，在所述3-颈烧瓶中，将7-氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮和7-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮(0.564g)的混合物溶解在无水二甲基甲酰胺(15cm3，加热随后冷却)中，并用无水四氢呋喃(THF)(15cm3)稀释该溶液。向所述溶液中加入催化剂Pd/C(5％，200mg)。在所述溶液中温和地通入氢气，并在明显的还原后长时间持续该过程(大约1小时)。通过溶液从紫红色转变成灰绿色来证明还原。如此，获得résorufamine的溶液。
在分开的烧瓶中，将0.756g(4.0mmol)N-t-Boc-L-丙氨酸和0.408g(4.0mmol)N-甲基吗啉溶解在无水THF(10cm3)中，将溶液冷却至-20℃并在搅拌的同时加入0.56cm3(4.0mmol)氯甲酸异丁酯。在-20℃下进一步搅拌混合物30分钟，在该时间后，于-10℃在搅拌下将所述混合物导入résorufamine溶液中，同时通入氢气。15分钟后，停止输入氢气，密封所述系统并在环境温度下搅拌反应混合物过夜。过滤反应混合物并在减压下蒸发溶剂，将残留的固体溶解在二氯甲烷(DCM)中，过滤，并用NaHCO3(5％，2次，50cm3)和水(50cm3)洗涤所述DCM溶液。用MgSO4干燥有机相，过滤，并浓缩，从而获得由两种标题产物组成的残留物。通过使用汽油(essence)和乙酸乙酯(7∶3)混合物进行洗脱的在二氧化硅柱上的色谱法来进行纯化。第一个点相应于橙色固体形式的7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基-吩嗪-3-酮，第二个点相应于棕色固体形式的7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨酰基)-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮。
实施例2：7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮的合成
重复上面实施例1中描述的操作方案，除了用N-t-Boc-β-丙氨酸代替N-t-Boc-L-丙氨酸外。
为了回收标题化合物，进行在二氧化硅柱上的色谱法，用汽油/乙酸乙酯(6∶4)混合物进行洗脱。第一个点相应于橙色固体形式的7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮，第二个点相应于橙色固体形式的7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮。
实施例3：胺化衍生物的脱保护
为进行该过程，根据下列比例将在实施例1和2中获得的化合物溶解在2cm3的TFA(三氟乙酸)中：7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮为0.10g(0.21mmol)，和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨酰基)氨基-1-戊基吩嗪-3-酮、7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基-吩嗪-3-酮和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1-戊基吩嗪-3-酮各为80mg(0.18mmol)。
将混合物在环境温度下保持15分钟。通过薄层色谱法记录反应的进程直至显示没有额外的起始材料。在真空中蒸发TFA，并用醚充分洗涤残留物，进行干燥，从而获得三氟乙酸盐(棕色固体)形式的不同化合物，产率如下：7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮为0.095g(92％)，和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨酰基)氨基-1-戊基吩嗪-3-酮、7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1-戊基吩嗪-3-酮各为80mg(97％)。
实施例4：7-N-(L-焦谷氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基-吩嗪-3-酮和7-N-(L-焦谷氨酰基)-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮的合成
重复上面实施例1中描述的操作方案，除了使用0.516g L-焦谷氨酸代替N-t-Boc-L-丙氨酸外。
为了回收标题化合物，进行在二氧化硅柱上的色谱法，用DCM/MeOH(95∶5)混合物进行洗脱。第一个点相应于棕色固体形式的7-N-(L-焦谷氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基-吩嗪-3-酮，第二个点相应于棕色固体形式的7-N-(L-焦谷氨酰基)-氨基-1-戊基-吩嗪-3-酮。
实施例5：7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2-二甲基-吩嗪-3-酮和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2，4-三甲基-吩嗪-3-酮的合成
5.1.制备二甲氧基苯的一般过程
在配备有冷凝器、磁力搅拌棒和氯化钙保护管的干燥的圆底2-颈烧瓶中，将氢醌(1摩尔当量)溶解在50ml无水三甲基甲酰胺(DMF)中，并以少量的方式加入2.2摩尔当量的NaH。在加入碱后，当H2停止放出时，在15至20分钟内逐滴加入4摩尔当量的碘甲烷。在添加结束时，在40℃下搅拌反应混合物2小时。向烧瓶中加入200ml盐水，并用乙醚(3次，50ml)萃取所得的混合物。用水(2次，50ml)洗涤合并的有机层，并通过MgSO4干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残留物进行柱色谱法。
5.1.1.  1，4-二甲氧基-2，3-二甲基苯
如上面的5.1部分中所述，使用1.957g(0.01416mol)2，3-二甲基氢醌进行操作。使用轻质松香水(essence minérale lég ère)：乙醚的95∶5混合物，分离出白色固体形式的产物(2.27g，80％)。
5.1.2.1，4-二甲氧基-2，3，5-三甲基苯
如上面的5.1部分中所描述的，使用2.175g(0.01429mol)2，3，5-三甲基氢醌进行操作。分离出无色油形式的产物(2.367g，92％)。
5.2.通过Duff反应进行的二甲氧基苯的甲酰化
将1当量的二甲氧基苯溶解在20ml TFA中，并向所得的溶液中加入1.05当量的乌洛托品。在无水条件下将反应混合物回流2小时。在减压下蒸发TFA，将残留物溶解在100ml醚中，并用水(3次，50ml)洗涤有机溶液，然后通过MgSO4干燥。蒸发溶剂，并将残留物进行柱色谱法，使用轻质松香水(60-80℃)∶乙醚的80∶20混合物进行洗脱。
5.2.1. 2，5-二甲氧基-3，4-二甲基苯甲醛
如上面的5.2部分中所描述的，使用2.270g(0.01366mol)1，4-二甲氧基-2，3-二甲基苯进行该操作。分离出白色固体形式的标题产物(1.18g，44％)。
5.2.2. 2，5-二甲氧基-3，4，6-三甲基苯甲醛
如上面的5.2部分中所描述的，使用2.274g(0.01262mol)1，4-二甲氧基-2，3，5-三甲基苯进行该操作。分离出黄色固体形式的标题产物(1.21g，46％)。
5.3.采用Bayer-Villiger氧化反应来制备酚类的一般过程
将0.033mol二甲氧基苯甲醛溶解在50ml甲醇中，并逐滴加入单过氧邻苯二甲酸镁(MMPP)(0.018mol)在50ml甲醇中的悬浮液，同时将反应混合物保持在0℃。在添加结束时，在环境温度下将反应混合物搅拌4小时。使用50ml 1M NaOH在碱性条件下水解所得的酯。1小时后，在减压下除去四分之三的甲醇，用1M HCl中和剩余的碱并将pH调节至3。用乙酸乙酯(3次，50ml)萃取酚，通过MgSO4干燥合并的有机层，蒸发溶剂，并将残留物进行柱色谱法。
5.3.1. 2，5-二甲氧基-3，4-二甲基苯酚
如上面的5.3部分中所描述的，使用1.126g(5.797mmol)2，5-二甲氧基-3，4-二甲基苯甲醛进行该操作。使用轻质松香水(60-80℃)∶乙醚的60∶40混合物作为洗脱剂，以黄色油的形式分离出标题产物(0.239g，23％)。
5.3.2. 2，5-二甲氧基-3，4，6-三甲基苯酚
如上面的5.3部分中所描述的，使用1.205g(5.786mmol)2，5-二甲氧基-3，4，6-二甲基苯甲醛进行该操作。使用轻质松香水(60-80℃)∶乙醚的75∶25混合物作为洗脱剂，以白色固体的形式分离出标题产物(0.856g，75％)。
5.4.制备二芳基醚的一般过程
将1摩尔当量的合适的酚溶解在10ml无水DMF中，并以少量的方式加入1.1摩尔当量的NaH。在气体完全释放后，在环境温度下搅拌所得的酚钠溶液15分钟。向烧瓶中逐滴加入1摩尔当量的在5ml无水THF中的2，5-二硝基氟苯溶液，并将反应混合物搅拌2小时。最后，将烧瓶中的内容物倒入50ml水中，用醚(3次，50ml)进行萃取，并通过MgSO4干燥合并的有机层。在减压下除去溶剂，并将残留物进行柱色谱法。
5.4.1. 1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4-二甲基苯
如上面的5.4部分中所描述的，使用0.293g(1.575mmol)2，5-二硝基氟苯和0.287g(1.575mmol)2，5-二甲氧基-3，4-二甲基苯酚进行该操作。在使用轻质松香水(60-80℃)∶乙酸乙酯的85∶15混合物作为洗脱剂的柱色谱法后，获得橙色固体形式的标题产物(0.415g，76％)。
5.4.2. 1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4，6-三甲基苯
如上面的5.4部分中所描述的，使用0.812g(4.362mmol)2，5-二硝基氟苯和0.856g(4.362mmol)2，5-二甲氧基-3，4，6-三甲基苯酚进行该操作。在使用轻质松香水(60-80℃)∶乙醚的75∶25混合物作为洗脱剂的柱色谱法后，获得黄色固体形式的标题产物(1.412g，89％)。
5.5.用于氢醌-甲基-醚的脱保护的一般过程
将1摩尔当量的二甲基芳基醚溶解在30ml的无水DCM中，并冷却至-78℃。向冷却的醚溶液中逐滴加入2.5摩尔当量的BBr3在己烷中的溶液(1M)，并在-78℃下搅拌反应产物30分钟。然后，加热至环境温度并进行搅拌直至反应结束(随后进行薄层色谱法)。于0℃用10ml甲醇稀释反应混合物，并倒入50ml水中。分离有机层，并用乙酸乙酯(3次，25ml)洗涤水层。通过MgSO4干燥合并的有机层。除去溶剂，并将残留物进行柱色谱法。
5.5.1. 1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4-二甲基-2，5-二羟基苯
不分离标题化合物，但形成标题化合物，随后根据同一容器中的反应直接进行还原和环化(参见下面的5.6.1部分)。
5.5.2. 1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4，6-三甲基-2，5-二羟基苯
如上面的5.5部分中所描述的，使用0.626g(1.728mmol)1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-2，5-二甲氧基-3，4，6-二甲基苯甲醛进行该操作。使用轻质松香水(60-80℃)∶乙醚的70∶30混合物作为洗脱剂，分离出橙色固体形式的标题产物(0.435g，75％)。
5.6.制备7-氨基吩嗪-3-酮的一般过程
将1.3mmol的二羟基二芳基醚溶解在5ml甲醇中，并向溶液中加入Pd/C5％催化剂(10％重量/重量)。在环境温度下，在氢化装置中于氢气气氛中搅拌反应混合物4小时。向烧瓶中加入二氧化硅(以对于待引入柱色谱法的残留物的载量来说足够的量)，并再次剧烈地搅拌混合物4小时，使其自由接触空气。在氧化结束时，除去溶剂，并使用洗脱剂梯度对残留物进行柱色谱法，所述梯度始于轻质松香水(60-80℃)∶乙酸乙酯的50∶50混合物，然后改变成相同溶剂的25∶75混合物，之后变成0∶100混合物。最后，使用乙酸乙酯∶甲醇的90∶10混合物作为洗脱剂。
5.6.1. 7-氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮
如上面的5.6部分中所描述的，根据同一容器中的反应，从0.266g(0.7636mmol)1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4-二甲基-2，5-二羟基苯开始进行该操作。获得棕红色固体形式的标题产物(0.125g，68％)。
5.6.2. 7-氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮
如上面的5.6部分中所描述的，从0.435g(1.3013mmol)1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4，6-三甲基-2，5-二羟基苯开始进行该操作。获得棕红色固体形式的标题产物(0.237g，72％)。
5.7.用于将肽偶联至7-氨基吩嗪-3-酮的一般过程
将0.4mmol 7-氨基吩嗪-3-酮溶解在位于装有磁力搅拌棒的小圆底烧瓶中的5ml无水DMF之中，并向溶液中加入0.010g Pd/C5％催化剂。在环境温度下将烧瓶置于氢化装置中并维持氢气气氛，同时搅拌反应混合物1小时。可以通过溶液的颜色从强紫红色变为灰绿色来确认完全还原。在分开的烧瓶中，将0.089g(0.4719mmol)的N-t-Boc-丙氨酸、0.072g(0.4719mmol)的羟基苯并三唑(HOBt)和0.07ml(0.4719mmol)的二异丙基碳二亚胺(DIC)溶解在5ml无水DCM中，并在环境温度下搅拌反应混合物1小时。在该时期后，在惰性气氛下，借助于注射器将第二个烧瓶的内容物导入第一个烧瓶(其装有还原形式的7-氨基吩嗪-3-酮)中。由于反应物的非常快速的氧化的原因，避免了来自空气中的氧的存在。在环境温度下将混合物再搅拌20分钟。通过C盐来过滤反应混合物，并蒸发掉溶剂。将残留物重新溶解在20ml乙酸乙酯中，用20ml 1M HCl、20ml 10％Na2CO3和20ml水洗涤有机层。通过MgSO4干燥，过滤，并在减压下进行蒸发，从而获得残留物，所述残留物通过使用轻质松香水(60-80℃)∶乙酸乙酯的30∶70混合物作为洗脱剂的柱色谱法进行纯化。
5.7.1. 7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮
如上面的5.7部分中所描述的，使用0.110g(0.4578mmol)7-氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮进行该操作。获得棕红色固体形式的标题产物(0.104g，55％)。
5.7.2. 7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮
如上面的5.7部分中所描述的，使用0.100g(0.3933mmol)7-氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮进行该操作。获得橙色固体形式的标题产物(0.113g，68％)。
5.8.N-叔丁氧基羰基的脱保护
将0.2mmol相应的用N-叔丁氧基羰基进行保护的化合物溶解在3ml无水DCM中，并向溶液中加入1ml TFA。在环境温度下搅拌反应混合物直至反应结束(然后进行薄层色谱法)。在减压下蒸发掉溶剂和剩余的TFA，并通过使用洗脱剂梯度的在短柱上的色谱法来纯化残留物，所述梯度始于轻质松香水(60-80℃)∶乙酸乙酯的50∶50混合物，然后改变成相同溶剂的0∶100混合物。最后，使用乙酸乙酯∶甲醇的90∶10混合物作为洗脱剂。
5.8.1. 7-N-(β-丙氨酰基)氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮的三氟乙酸盐
如上面的5.8部分中所示，使用0.047g(0.1138mmol)7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮进行该操作。获得红色固体形式的标题产物(0.046g，95％)。
5.8.2. 7-N-(β-丙氨酰基)氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮的三氟乙酸盐
如上面的5.8部分中所示，使用0.081g(0.1897mmol)7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮进行该操作。获得红色固体形式的标题产物(0.080g，96％)。
实施例6：7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1-甲基-2-氯吩嗪-3-酮-4-羧酸甲酯的制备
将1.76g(10mmol)1，4-二氯苯醌亚胺溶解在50ml无水乙醇中，并轻轻搅拌。向该搅拌的溶液中加入1.82g(10mmol)4-甲基-2，6-二羟基苯甲酸甲酯。温和地加热回流该搅拌的溶液直至出现大量放热，从而需要将烧瓶从热源移开。在放热减少后，再使反应混合物回流30分钟，然后使之冷却至环境温度。在环境温度下进一步放置3小时后，通过吸滤收集固体产物，用少量热水洗涤，然后进行抽吸，从而在真空条件下的干燥器中进行干燥前，以尽可能干燥的状态获得产物。使用乙酸乙酯作为流动相对残留物进行硅胶薄层色谱法。观察到大量的深色基础产物，以及观察到粉红色荧光组分。将固体产物溶解在乙酸乙酯中，过滤，并将其通过硅胶锥体。滤液基本上没有基础产物。在减压下除去溶剂，并分离出固体产物。
如上所述，使用t-BOCβ-丙氨酸对固体产物进行氨基酰化，从而获得标题化合物。
实施例7：7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-6-甲基-吩嗪-3-酮的合成
7.1.N-乙酰基-2-甲基-3-氟苯胺的合成
在搅拌下，向处于0℃的由3.161g(25.26mmol)2-甲基-3-氟苯胺和3.87ml(27.78mmol)的三乙胺在50ml DCM中形成的溶液之中加入1.98ml(27.78mmol)乙酰氯。使溶液重新升温至环境温度并搅拌1小时。用水(3次，50ml)洗涤溶液，用MgSO4干燥，并在减压下除去溶剂。在矿物油/乙酸乙酯(EtOac)混合物中重结晶后，获得3.844g(91％)白色晶体形式的标题化合物。
7.2.N-乙酰基-2-甲基-3-氟-4-硝基苯胺的合成
在18℃下，在10ml乙酸中，将在上面7.1部分中获得的化合物与5ml浓硫酸和5ml硝酸的混合物反应1小时。然后在100ml水中稀释反应溶液，并在乙酸乙酯(EtOAc)(3次，50ml)中进行萃取，通过MgSO4进行干燥，在真空条件下除去溶剂。分离出白色固体形式的标题化合物(1.96g，71％)。
7.3.2-甲基-3-氟-4-硝基苯胺的合成
将1.311g(6.18mmol)在上面7.2部分中获得的化合物在5M盐酸中回流2小时。用碳酸钠中和溶液，然后用乙醚(3次，50ml)进行萃取，通过MgSO4进行干燥，并在真空条件下除去溶剂。通过使用松香水(essence minérale)∶EtOAc的70∶30混合物作为洗脱剂的柱色谱法来纯化残留物。分离出黄色固体形式的标题产物(0.589g，94％)。
7.4.2-氟-3，6-二硝基甲苯的合成
在65℃下，向由1.61g(10.46mmol)过硼酸钠四水合物在11mlEtOAc中形成的溶液之中，逐滴加入由0.357g(2.10mmol)在上面7.3部分中获得的化合物在4ml乙酸中形成的溶液，并搅拌所述混合物6小时。在50ml的水中稀释反应溶液，在乙醚(3次，20ml)中进行萃取，通过MgSO4进行干燥，并在真空下除去溶剂。通过使用松香水∶三氯甲烷的70∶30混合物作为洗脱剂的柱色谱法来纯化残留物，从而获得黄色液体形式的标题产物(0.274g，65％)。
7.5. 2，5-二甲氧基苯酚的合成
如上面的5.3部分中所示，使用5.53g(0.0333mol)2，5-二甲氧基苯甲醛进行该操作。使用轻质松香水(60-80℃)∶乙醚的80∶20混合物作为洗脱剂而分离出黄色油形式的标题产物(4.27g，83％)。
7.6. 1-(3′，6′-二硝基-2′-甲基苯氧基)-2，5-二甲氧基苯的合成
如上面的5.4部分中所示，使用0.366g(1.83mmol)在上面7.4部分中制备的2-氟-3，6-二硝基甲苯和0.282g(1.83mmol)在上面7.5部分中制备的2，5-二甲氧基苯酚来进行该操作。使用轻质松香水(60-80℃)∶乙醚的70∶30混合物作为洗脱剂而分离出黄色固体形式的标题产物(0.400g，65.5％)。
7.7.标题化合物的合成
可如上面的5.5至5.7部分中所示，获得标题化合物。
实施例8：革兰氏阴性细菌的L-丙氨酸肽酶活性的检测
使用实施例1中制备的氯化或未氯化的化合物，即7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮(氯化的L-丙氨酰基化合物)和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨酰基)氨基-1-戊基吩嗪-3-酮(未氯化的L-丙氨酰基化合物)，所述化合物根据实施例3中描述的操作方案进行脱保护。
将10mg每种L-丙氨酰基化合物溶解在1ml二甲亚砜中，并向200ml 50℃的熔化的Columbia琼脂中加入所述混合物。将如此形成的介质分配入培养皿中(每种底物的终浓度：50mg/l)。
然后，使用标定为10μl的接种环(oese)，用标定为0.5McFarland的悬浮液，将来自国际保藏或来源于申请人保藏的菌株接种在各介质上。还将所有菌株接种在没有生色底物的Columbia琼脂介质上，作为生长对照。将所有培养物在37℃下温育24至48小时。
表1中给出了在温育24和48小时之间获得的生长和着色的结果，其中G表示生长，C表示颜色，I表示无色，符号++表示非常好的生长，符号+表示菌株的良好生长，符号+/-表示菌株的中等生长，符号-表示不存在菌株的生长。
表1
 未氯化的L-丙氨酰基化合物   氯化的L-丙氨酰基化合物   对照
  No.  菌株名称  国际登录号  G   C   G   C   C
  123456789  大肠杆菌(Escherichia coli)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)哈达尔沙门氏菌(Salmonella hadar)奇异变形菌(Proteusmirabilis)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)雷氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)  NCTC 10418NCTC 10896NCTC 10975NCTC 6571NCTC 7475NCTC 10662NCTC 11994NCTC 8306  紫红色紫红色紫红色紫红色I紫红色紫红色II   ++++-++--   粉红色/紫红色粉红色/紫红色粉红色/紫红色粉红色/紫红色I粉红色/紫红色粉红色/紫红色II   +++++++++/-   ++++++++++/-
上面表1中的结果显示，本发明的酶底物使得能够检测所有细菌菌株，因为它们都生长，但只能观察到革兰氏阴性菌株(菌株1至4和6至7)的着色的改变，这还使得能够区别革兰氏阴性菌株和革兰氏阳性菌株。
实施例9：绿脓假单胞菌类别的细菌的β-丙氨酸肽酶活性的检测
为进行该检测，使用在实施例2中制备的氯化或未氯化的β-丙氨酸化合物，即7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮(氯化的β-丙氨酰基化合物)和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1-戊基吩嗪-3-酮(未氯化的β-丙氨酰基化合物)，所述化合物根据实施例5中描述的操作方案进行脱保护。
还根据实施例5中描述的方案来准备培养皿和接种菌株。
温育24和48小时之间的着色结果显示于下面的表2中。
表2
菌株名称 国际登录号  未氯化的β-丙氨酰基化合物  氯化的β-丙氨酰基化合物
 绿脓假单胞菌绿脓假单胞菌绿脓假单胞菌绿脓假单胞菌洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)GI洋葱伯克霍尔德氏菌GIII鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)脆弱假单胞菌(Pseudomonas fragilis)嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonasmaltophilia)Ralstonia basilensisRalstonia taiwanensis LMG 1222LMG 18832ATCC 19606NCIMB 8987  紫红色紫红色紫红色紫红色黄色黄色无色无色无色无色无色无色  紫红色淡紫红色淡紫红色紫红色黄色黄色无色无色无色无色无色无色
上面表2中的结果证明，本发明的化合物使得能够优先地检测绿脓假单胞菌细菌(显现出淡紫红色至紫红色的着色)。
实施例10：焦谷氨酰基肽酶活性的检测
为进行该检测，使用在实施例4中制备的氯化或未氯化的焦谷氨酰基化合物，即7-N-(L-焦谷氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮(氯化的L-焦谷氨酰基化合物)和7-N-(L-焦谷氨酰基)氨基-1-戊基吩嗪-3-酮(未氯化的L-焦谷氨酰基化合物)，所述化合物根据实施例5中描述的操作方案进行脱保护。
还根据实施例5中描述的方案来准备培养皿和接种菌株。
温育24和48小时之间的着色结果显示于下面的表3中。
表3
菌株名称 国际登录号   未氯化的焦谷氨酰基化合物   氯化的焦谷氨酰基化合物
  绿脓假单胞菌绿脓假单胞菌绿脓假单胞菌洋葱伯克霍尔德氏菌GI洋葱伯克霍尔德氏菌GIII鲍氏不动杆菌乙酸钙不动杆菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)脆弱假单胞菌嗜麦芽假单胞菌Raistonia basilensisRalstonia taiwanensis LMG 1222LMG 18832ATCC 19606NCIMB 8987   紫红色紫红色紫红色黄色黄色无色无色无色无色无色无色无色   紫红色紫红色紫红色黄色黄色无色无色无色无色无色无色无色
上面表3中的结果证明，本发明的化合物使得能够优先地检测绿脓假单胞菌细菌。
实施例11：绿脓假单胞菌类别的细菌的β-丙氨酸肽酶活性的检测
为进行该检测，使用在实施例5和6中制备的β-丙氨酸化合物，即7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮(b-ala-DMP)、7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮(b-ala-TMP)和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1-甲基-2-氯-4-(氧代-1-甲基)吩嗪-3-酮(b-ala-MCMP)，所述化合物如前面的实施例中所述进行脱保护。
还根据实施例7中描述的方案来准备培养皿和接种菌株。温育24和48小时之间的着色结果显示于下面的表4中。
表4
 菌株名称   国际登录号   b-ala-DMP   b-ala-TMP   b-ala-MCMP
 绿脓假单胞菌   ATCC 10145   强粉红色   橙色性粉红色   紫色
 绿脓假单胞菌   ATCC 27853   粉红色   粉红色   紫色
 绿脓假单胞菌   *   强粉红色   橙色性粉红色   紫色
 绿脓假单胞菌   ATCC 9027   强粉红色   粉红色   粉红色-紫色
 绿脓假单胞菌   *   无色   无色   无色
 荧光假单胞菌   *   无色   无色   无色
 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)   *   无色   无色   无色
 洋葱伯克霍尔德氏菌   LMG 18941   淡粉红色   淡粉红色   无色
 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagladioli)   LGM 6880   无色   无色   无色
 大肠杆菌   *   橙色   橙色   无色
*申请人的保藏
上面表4中的结果证明，本发明的化合物使得能够优先地检测绿脓假单胞菌细菌(显现出粉红色至紫色的着色)。还可指出，根据所用的取代基和其在主核上的位置，所述结果在颜色和颜色强度方面可以发生变化，以及在对于绿脓假单胞菌的灵敏度和特异性方面同样可以发生变化，因此依赖于想要的目的就可以考虑将这些不同的底物用于不同的具体应用中。

Claims (13)

1.生色酶底物，其特征在于，其相应于下面的式(I)：
Figure A2005800356030002C1
其中
-R1表示氢原子、C1-C12烷基、C6-C14芳烷基、芳基、-COOH、-COOR′或-NR″R，
-R2表示氢原子、卤素原子、C1-C12烷基、-COOH或-COOR′，
-R3表示氢原子、卤素原子、C1-C12烷基、-CN、-CONH2、-COOR′或-COR′，
-R4、R5和R6各自独立地表示氢原子、卤素原子、-COOR′或C1-C3烷基，要理解R4、R5和R6中至少一个是氢原子，
-R′表示氢原子或C1-C6烷基，
-R″和R各自独立地表示C1-C6烷基，或者R″和R与它们所连接的氮原子一起形成包含一个或多个杂原子的杂环核，
-A表示至少一个氨基酸，和
-X表示封端剂或不存在。
2.权利要求1的生色酶底物，其特征在于：
-R1表示氢原子、C1-C12烷基、C6-C14芳烷基、芳基、-COOH、-COOR′或-NR″R，
-R2表示氢原子、卤素原子、C1-C12烷基、-COOH或-COOR′，要理解R1和R2中至少一个是氢原子或卤素原子，
-R3表示氢原子、卤素原子、-CN、-CONH2、-COOR′或-COR′，
-R4、R5和R6各自独立地表示氢原子或C1-C3烷基，要理解R4、R5和R6中的至少一个是氢原子，
-R′表示氢原子或C1-C6烷基，
-R″和R各自独立地表示C1-C6烷基，或者R″和R与它们所连接的氮原子一起形成包含一个或多个杂原子的杂环核，
-A表示至少一个氨基酸，和
-X表示封端剂或不存在。
3.权利要求1或2的生色酶底物，其特征在于，R1表示烷基，优选地C1-C6烷基，和R2表示氢原子。
4.权利要求1或2的生色酶底物，其特征在于，R1表示氢原子，和R2表示烷基，优选地乙基或己基。
5.权利要求1的生色酶底物，其特征在于，R1和R2表示烷基或卤素原子，和R4表示烷基、-COOR′或氢原子。
6.权利要求1至5中任一项的生色酶底物，其特征在于，R3、R4、R5和R6表示氢原子。
7.反应介质，所述介质单独地或与至少一种其他酶底物相组合地包含至少一种权利要求1至6中任一项所定义的生色酶底物，所述其他酶底物是与通过权利要求1至6中任一项所定义的所述底物而检测的酶活性不同的酶活性的特异性酶底物。
8.权利要求7的介质，其特征在于，所述介质是培养介质。
9.权利要求7或8的介质，其特征在于，所述介质是以凝胶化形式存在的。
10.权利要求1至6中任一项所定义的生色酶底物或者权利要求7至9中任一项所定义的反应介质的用途，所述用途为用于体外检测和/或鉴定和/或定量表现出至少一种肽酶活性的微生物。
11.用于检测和/或鉴定和/或定量表现出至少一种肽酶活性的微生物的方法，其特征在于，所述方法包括：
·提供权利要求7至9中任一项所定义的反应介质，
·用待测试的生物样品接种所述介质，
·温育，和
·揭示至少一种肽酶活性单独地或与至少一种不同于该肽酶活性的其他酶活性相组合地存在。
12.用于区分细菌属于革兰氏阳性微生物还是属于革兰氏阴性微生物的方法，其特征在于，所述方法包括：
·提供权利要求7至9中任一项所定义的反应介质，其中生色底物的取代基A是L-丙氨酸，
·用待测试的生物样品接种所述介质，
·温育，和
·揭示至少一种意味着存在革兰氏阴性微生物的着色变化的存在。
13.用于检测绿脓假单胞菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
·提供权利要求7至9中任一项所定义的反应介质，其中生色底物的取代基A是β-丙氨酸或焦谷氨酸，
·用待测试的生物样品接种所述介质，
·温育，和
·揭示至少一种意味着存在绿脓假单胞菌微生物的着色变化的存在。
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