JP2006521803A - 微生物の検出用及び/又は識別用の培地 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、培養培地、及び、試料中に非遊離で微生物に特異的な少なくとも一種の第一の酵素によって加水分解されて標識を生じることの可能な少なくとも一種の基質を含む、試料中に存在する微生物の検出用及び/又は識別用の培地であって、更に、上記第一の酵素と異なる又は同一の、上記試料中に遊離していて微生物に由来しない少なくとも一種の第二の酵素に対する少なくとも一種の阻害剤を含むことを特徴とする培地に関する。また、本発明は、生物医学的診断又は食品微生物学、より具体的には細菌学及び菌類学の分野における好ましい用途を発見した。
Description
培養培地、及び、試料中に非遊離で微生物に特異的な少なくとも一種の第一の酵素によって加水分解されて標識を生じることの可能な少なくとも一種の基質を含む、特に生体試料又は食品試料等の試料中に存在する微生物の検出用の培地であって、
更に、上記試料中に遊離していて目的微生物に由来しない少なくとも一種の第二の酵素に対する少なくとも一種の阻害剤を含む
ことを特徴とする培地
に関する。上記第二の酵素は、上記第一の酵素と異なっていても同一であってもよい。
*明らかにする酵素活性に特異的な第一の部分;この第一の部分は、目的微生物に特異的な上記第一の酵素と相互作用可能であるが、上記第二の酵素とも相互作用可能である:
*蛍光性であっても発色性であってもよい、標識の役割をする第二の部分(以下、標識部分と呼ぶ)。
*R1は、水素原子、又は、アルキル基、アリール基若しくはハロゲン基であり、
*R2は、水素原子、又は、アルキル基、アリール基若しくはハロゲン基であり、
*R3は、存在しない、又は、アルキル基、アリール基若しくはNO2基である。
・ R1及びR2がエチル基であり、
・ R3がNO2基である、
式(I)の化合物である。
*R1及びR2がメチル基であり、
*R3がNO2基である、
式(I)の化合物である。
*R1及びR2がクロロエチル基であり、
*R3が式の環である、
式(I)の化合物である:
nは1〜12の間であり、かつ、
W、X、Y及びZはH、Br、Cl、F及びIから選択される。
微生物を検出及び識別する方法であって、
以下:
*識別目的である微生物を上記に定義する検出用の培地上に播種すること、
*識別目的である微生物を播種した検出用の培地をインキュベートすること、及び、
*基質が加水分解されて生じた標識物質を検出することにより微生物の存在を決定すること:を含む
ことを特徴とする方法
にも関する。
*R1は、水素原子、又は、アルキル基、アリール基若しくはハロゲン基であり、
*R2は、水素原子、又は、アルキル基、アリール基若しくはハロゲン基であり、
*R3は、存在しない、又は、アルキル基、アリール基若しくはNO2基である。
下記実施例により、本発明のより明瞭な理解が可能になるであろう。
<サルモネラ菌の識別における、O,O−ジエチルp−ニトロフェニルホスフェートの使用による、試料中の遊離エステラーゼの阻害>
本実施例中に示す実験の目的は、(サルモネラ菌で汚染された糞便試料中の)遊離エステラーゼに対するO,O−ジエチルp−ニトロフェニルホスフェート(パラオキソン(R)エチル;Riedel−de Haen社,St Quentin Fallavier(フランス))の阻害効果を調べることである。
検出用の培地250mlを、次の組成の粉末培地から調製する:
ペプトン 6.25g/l
Tris 0.16g/l
ラクトース 6g/l
胆汁酸塩 1.5g/l
NaCl 5g/l
寒天 14g/l
糞便10μlをペトリ皿上に付着させ、この糞便懸濁液をサルモネラ菌(0.5McF)の懸濁液10μlと混合して又は混合せずに、ペトリ皿上に三か所に分ける。様々な塩及び本出願人が保存している株に由来する様々なサルモネラ菌株を、このプロトコルに従って使用する。ペトリ皿を37℃で24時間インキュベートする。糞便付着箇所(「付着」欄)及びサルモネラ菌コロニー(「コロニー」欄)における着色の出現を、半定量スケールに従って読み取る。
0=非着色
0.5=微量の着色
1=弱い着色
2=強い着色
<サルモネラ菌の識別における、O,O−ジメチルp−ニトロフェニルホスフェートの使用による、試料中の遊離エステラーゼの阻害>
本実施例中に示す実験の目的は、サルモネラ菌で汚染された糞便について、遊離エステラーゼに対するO,O−ジメチルp−ニトロフェニルホスフェート(パラオキソン(R)メチル;Riedel−de Haen社,St Quentin Fallavier(フランス))の阻害効果を実証することである。
検出用の培地250mlを、次の組成の粉末培地から調製する:
ペプトン 6.25g/l
Tris 0.16g/l
ラクトース 6g/l
胆汁酸塩 1.5g/l
NaCl 5g/l
寒天 14g/l
実施例1と同様に、このペトリ皿について、接種し、インキュベートし、値を読み取る。
<サルモネラ菌の識別における、O,O−ジ−(2−クロロエチル)−O−(3−クロロ−4−メチルクマリン−7−イル)ホスフェートの使用による、試料中の遊離エステラーゼの阻害>
本実施例中に示す実験の目的は、サルモネラ菌で汚染された試料(糞便)中の遊離エステラーゼに対するO,O−ジ−(2−クロロエチル)−O−(3−クロロ−4−メチルクマリン−7−イル)ホスフェート(ハロキソン(R);シグマ社,St Quentin Fallavier(フランス))の阻害効果を実証することである。
O,O−ジエチルp−ニトロフェニルホスフェートを様々な濃度のO,O−ジ−(2−クロロエチル)−O−(3−クロロ−4−メチルクマリン−7−イル)ホスフェート(ハロキソン(R);CAS No.321−55−1;R276995,シグマ社,St Quentin Fallavier(フランス);0、1、10、100又は1000mg/l)で置き換えて、実施例1の培地250mlを実施例1の方法に従って調製する。
実施例1と同様に、このペトリ皿について、接種し、インキュベートし、値を読み取る。
<酵母の識別における、O,O−ジエチルp−ニトロフェニルホスフェート、O,O−ジメチルp−ニトロフェニルホスフェート及びO,O−ジ−(2−クロロエチル)−O−(3−クロロ−4−メチルクマリン−7−イル)ホスフェートの使用による、試料中の遊離エステラーゼの阻害>
本実施例中に示す実験の目的は、カンジダ属酵母で汚染された糞便について、遊離エステラーゼに対するO,O−ジエチルp−ニトロフェニルホスフェート、O,O−ジメチルp−ニトロフェニルホスフェート及びO,O−ジ−(2−クロロエチル)−O−(3−クロロ−4−メチルクマリン−7−イル)ホスフェートの阻害効果を実証することである。
検出用の培地250mlを、次の組成の粉末培地から調製する:
ペプトン 10g/l
グルコース 1g/l
Tris 0.16g/l
寒天 14g/l
*O,O−ジエチルp−ニトロフェニルホスフェート:5mg/l
*O,O−ジメチルp−ニトロフェニルホスフェート:25mg/l、又は、
*O,O−ジ−(2−クロロエチル)−O−(3−クロロ−4−メチルクマリン−7−イル)ホスフェート:75mg/l。
糞便10μlをペトリ皿上に付着させ、この糞便懸濁液をカンジダ属の懸濁液10μlと混合して又は混合せずに、ペトリ皿上に三か所に分ける。様々な糞便及び本出願人が保存している株に由来する様々なカンジダ属株を、このプロトコルに従って使用する。ペトリ皿を37℃で24時間インキュベートする。
0=非着色
0.5=微量の着色
1=弱い着色
2=強い着色
<細菌の識別における、カスタノスペルミンの使用による、試料中の遊離α−グルコシダーゼの阻害>
本実施例中に示す実験の目的は、黄色ブドウ球菌株で汚染された試料(糞便)中の遊離α−グルコシダーゼに対する、カスタノスペルミンの阻害効果を実証することである。
O,O−ジエチルp−ニトロフェニルホスフェートを様々な濃度(0、1、2、4及び8g/l)のカスタノスペルミンで置き換えて、実施例1の培地250mlを実施例1の方法に従って調製する。
実施例1と同様に、このペトリ皿について、接種し、インキュベートし、値を読み取る。
<本発明による少なくとも一種の第二の酵素に対する阻害剤を識別する方法>
この方法は、実施例1又は2の実験に、次の置き換えを加えた実施である:
i)(酵素基質を含む)上述の培養培地を、目的微生物に適切な培地で置き換える;
ii)糞便を、上記微生物について調べる目的であり、かつ、培地中に含まれる一種以上の酵素基質と寄生的に反応する試料で置き換える;
iii)阻害剤O,O−ジエチルp−ニトロフェニルホスフェート、O,O−ジメチルp−ニトロフェニルホスフェート、O,O−ジ−(2−クロロエチル)−O−(3−クロロ−4−メチルクマリン−7−イル)ホスフェート又はカスタノスペルミンを、様々な濃度の、試験したい潜在的阻害剤で置き換える。
Claims (19)
- 培養培地、及び、試料中に非遊離で微生物に特異的な少なくとも一種の第一の酵素によって加水分解されて標識を生じることの可能な少なくとも一種の基質を含む、試料中に存在する微生物の検出用及び/又は識別用の培地であって、
更に、前記第一の酵素と異なる又は同一の、前記試料中に遊離していて微生物に由来しない少なくとも一種の第二の酵素に対する少なくとも一種の阻害剤を含む
ことを特徴とする培地。 - 前記微生物は細菌である
ことを特徴とする請求項1に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 前記細菌はサルモネラ属に属する
ことを特徴とする請求項2に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 前記微生物は酵母である
ことを特徴とする請求項1に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 前記酵母はカンジダ属に属する
ことを特徴とする請求項4に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 前記第一の酵素はエステラーゼである
ことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 前記阻害剤は、O,O−ジエチルp−ニトロフェニルホスフェート及び/若しくはO,O−ジメチルp−ニトロフェニルホスフェート及び/若しくはO,O−ジ−(2−クロロエチル)−O−(3−クロロ−4−メチルクマリン−7−イル)ホスフェート、並びに/又は、これらの物質の誘導体の少なくとも一種である
ことを特徴とする請求項7に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 検出用の培地中のO,O−ジエチルp−ニトロフェニルホスフェート又はその誘導体の濃度は、0.1〜15mg/l、好ましくは1〜10mg/lである
ことを特徴とする請求項8に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 検出用の培地中のO,O−ジメチルp−ニトロフェニルホスフェート又はその誘導体の濃度は、0.1〜100mg/l、好ましくは10〜50mg/lである
ことを特徴とする請求項8に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 検出用の培地中のO,O−ジ−(2−クロロエチル)−O−(3−クロロ−4−メチルクマリン−7−イル)ホスフェート又はその誘導体の濃度は、1〜1000mg/l、好ましくは30〜100mg/lである
ことを特徴とする請求項8に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 前記第一の酵素は、オシダーゼ、好ましくはグルコシダーゼである
ことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 検出用の培地中の式(II)の化合物又はその誘導体の濃度は、好ましくは1〜10g/l、より好ましくは2〜8g/lである
ことを特徴とする請求項13に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 前記基質は、発色性基質、好ましくはインドキシル又はその誘導体のエステルである
ことを特徴とする請求項1〜14のいずれか1項に記載の検出用及び/又は識別用の培地。 - 微生物を検出及び/又は識別する方法であって、
以下:
識別目的である微生物を請求項1〜15のいずれか1項に記載の検出用の培地上に播種すること、
識別目的である微生物を播種した検出用の培地をインキュベートすること、及び、
基質が加水分解されて生じた標識物質を検出することにより微生物の存在を決定すること:を含む
ことを特徴とする方法。 - 請求項1〜15のいずれか1項に記載の検出用及び/又は識別用の培地の、微生物を識別するための使用。
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