DE3873066T2 - Verfahren zur unmittelbaren identifikation von salmonella. - Google Patents
Verfahren zur unmittelbaren identifikation von salmonella.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur unmittelbaren Identifizierung von Salmonella-Kulturen und zu deren Unterscheidung von anderen Enterobakterien.
- Salmonellen sind die häufigste Ursache für bakterielle Darminfektionen.
- Die Infektion ist durch eine Oral-Fekal-Übertragung charakterisiert und sie kann entweder durch Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln oder durch Kontakt mit Überträgern, Mensch oder Tier, ausgelöst werden.
- Die Identifizierung von Salmonellen ist eine der wichtigsten diagnostischen Tests, die sowohl zur Vorbeugung als auch zu diagnostischen Zwecken durchgeführt werden und die schnelle Antwort und das einfache Verfahren sind die wesentlichen notwendigen Voraussetzungen für diese Verfahren.
- In der Tat ist das gravierendste diagnostische Problem bei Salmonellen-Infektionen der gegenwärtig sehr lange Zeitraum, den man für die endgültige Identifizierung mit den bisher bekannten Verfahren benötigt.
- Das Wachstum in flüssigem Kulturmedium beansprucht 12-18 Stunden, die Isolierung in festem Kulturmedium 18 Stunden und die Identifizierung 4-18 Stunden, abhängig von dem gewählten Verfahren.
- Die gesamte Analysenzeit liegt im Bereich von 34 bis 54 Stunden; einschließlich der Zeiten zwischen den verschiedenen analytischen Stufen beträgt die "tatsächliche" Zeit 2-3 Tage.
- Eine Situation dieser Art führt zu therapeutischen Nachteilen, weil die Antibiotikum-Therapie, während man auf die Ergebnisse der Untersuchung wartet, nicht spezifisch sein kann, sozialen Nachteilen wegen des Ausschlußes des verdächtigten Individuums aus der Gemeinschaft und ökonomischen Nachteilen, weil Lebensmittelbestände für mehrere Tage blockiert sind.
- Aufgabe der Erfindung ist ein neues, sehr einfaches diagnostisches Verfahren, durch das die Zeiten für die betreffende Identifizierung von gegenwärtig 4-18 Stunden auf 1-15 Minuten verkurzt werden können.
- Das Verfahren besteht in der Identifizierung des Esterase-Enzyms durch das charakteristische Wachstum auf einem natürlichen Medium, welches für Salmonellen und Enterobakterien selektiv ist, oder auf irgendeinem anderen Kultivierungssubstrat, welches mikrobielles Wachstum erlaubt, durch Verwendung eines Reagens, welches das Substrat enthält und das durch das Enzym unter definierten experimentellen Bedingungen spezifisch umgesetzt wird.
- Das Reagens, welches bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, besteht aus einem Carbonsäureester des 4-Methylumbelliferon- Fluorophors, welcher in einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Dimethylformamid, Methylcellosolve, Butylenglykol oder anderen gelöst ist.
- Insbesondere wurde gefunden, daß der 4-Methylumbelliferon-Ester einer Carbonsäure mit 7-10 Kohlenstoffatomen ein geeignetes Reagens ist.
- Das Bakterienenzym, welches in den Kulturen vorliegt, hydrolysiert das Substrat und setzt 4-Methylumbelliferon, welches unter der Wood'schen Lampe stark fluoresziert, frei.
- Der Test kann leicht ausgeführt werden, indem man einen Tropfen des Reagens auf die wachsende Mikrobenkultur gibt und das Auftreten von Fluoreszenz innerhalb von 1-5 Minuten beobachtet.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Salmonellen stellt einen bemerkenswerten Fortschritt, verglichen zu den gegenwärtig verfügbaren Verfahren, dar, insbesondere ist das genannte Verfahren schneller und einfacher als die bisher bekannten, wie z.B. das in der französischen Patentschrift 2 457 323 beschriebene. Gemäß dem bekannten Verfahren erhält man die Ergebnisse nach vorzugsweise 2-8 Stunden, indem man Kulturbehandlungen durchführt, welche bei dieser Erfindung nicht in Betracht gezogen werden, oder nach einer kürzeren Zeit, wobei es in diesem Falle notwendig ist, das Substrat in das Kulturmedium zu geben, damit es vom Enzym umgesetzt wird. Dies sind komplexe und kaum durchführbare Verfahren in Routinetests in einem mikrobiologischen Laboratorium. Außerdem unterscheidet sich das Verfahren des oben erwähnten französischen Patents von dieser Erfindung, weil die Identifizierung von Salmonellen auf einer colorimetrischen Reaktion mit Diazoniumsalz, welches in jedem Falle zu dem Reagens gegeben werden muß, basiert.
- Das Dokument EP-A-0 091 837 beschreibt ein Verfahren zur Anpassung der mikrobiellen Empfindlichkeit auf Antibiotika durch Bestimmung der MIC (minimale inhibitorische Konzentration), bei dem als Indikatoren für das mikrobielle Wachstum Umbelliferon-Derivate verwendet werden.
- Im Gegensatz dazu besteht dieses Verfahren in der Identifizierung von Salmonella unter Verwendung von Umbelliferon-Derivaten als Substrat.
- Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahrens besteht darin, daß das verwendete Reagens die Identifizierung der Mikrobe Salmonella innerhalb von 1-5 Minuten erlaubt, ohne die definitive Identifizierung jeder Kultur, die auf einem festen Selektionsmedium ähnliche Charakteristika wie Salmonella (z.B. Proteus) aufweist, auszuführen und deshalb Zeit und Materialien spart.
- Durch ausgeführte Experimente mit 572 Salmonella-Stämmen wurde erfindungsgemäß gefunden, daß die Empfindlichkeit des Reagens bei der Ermittlung des Vorliegens von Bakterien 95,4 % beträgt, seine Spezifität 90,8 % beträgt.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Salmonellen funktioniert sogar, wenn man die wachsenden Mikroben auf Papierscheiben oder Baumwollkissen, welche mit dem Reagens der Aufgabe dieser Erfindung imprägniert worden sind, gibt, anstatt letztere auf das Kulturmedium mit den wachsenden Mikroben zu geben.
- Die Acylester von 4-Methylumbelliferon sind bekannte Verbindungen, beschrieben in der US-Patentschrift 3 553 235, und ihre Verwendung als fluorogene Substrate für die Bestimmung von Carboxylesterase- und, insbesondere der Lipaseaktivität ist auch bekannt.
- Ein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung von 4-Methylumbelliferon-Derivaten besteht in der Herstellung einer Lösung von 4-Methylumbelliferon, vorzugsweise in Form eines Natriumsalzes in einem Lösungsmittel wie Aceton oder Methylenchlorid und der Behandlung der genannten Lösung mit einer stöchiometrischen Menge oder einem kleinen Überschuß des Chlorids der gewünschten Carbonsäure mit 7-10 Kohlenstoffatomen. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur und unter Wasserausschluß durchgeführt, und das Produkt kann nach bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden.
- Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele erläutert, welche sich mit der Herstellung von 4-Methylumbelliferon-Derivaten (zur Erläuterung) und dem Verfahren zur Identifizierung von Salmonellen beschäftigen.
- 2 g 4-Methylumbelliferon, Natriumsalz, werden in 20 ml Aceton gelöst; 4 g Heptanoylchlorid werden tropfenweise bei Raumtemperatur und unter wasserfreien Bedingungen zugegeben. Wenn die Reaktion nach einer kurzen Zeit abgelaufen ist, wird das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand in Methylenchlorid, während wiederholt mit verdünntem Natriumbicarbonat gewaschen wird, aufgenommen; die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen; die durch Kristallisation aus Methanol/Hexan - Heptan - Octan gereinigte Titelverbindung wird in 95 % Ausbeute erhalten, Schmelzpunkt: 39-41ºC.
- Berechnet: C 70,8 % H 6,99 %
- Gefunden: C 71,0 % H 6,89 %
- 2 g 4-Methylumbelliferon, Natriumsalz, werden in 20 ml Aceton gelöst und 4,0 g Octanoylchlorid werden tropfenweise bei 20ºC und unter wasserfreien Bedingungen zugegeben; wenn die Reaktion nach einer kurzen Zeit abgelaufen ist, wird das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand in Methylenchlorid, während wiederholt mit verdünntem Natriumbicarbonat gewaschen wird, aufgenommen; die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Die durch Kristallisation aus Methanol/Hexan-Heptan-Octan gereinigte Titelverbindung wird in 97,5 % Ausbeute erhalten, Schmelzpunkt: 41-43ºC.
- Berechnet: C 71,5 % H 7,33 %
- Gefunden: C 71,6 % H 7,35 %
- 2 g 4-Methylumbelliferon, Natriumsalz, werden in 20 ml Aceton gelöst und 4 g Nonanoylchlorid werden tropfenweise bei 18ºC und unter wasserfreien Bedingungen zugesetzt; wenn die Reaktion nach einer kurzen Zeit abgelaufen ist, wird das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand in Methylenchlorid, während wiederholt mit verdünntem Natriumbicarbonat gewaschen wird, aufgenommen; die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Die durch Kristallisation aus Methanol/Hexan-Heptan-Octan gereinigte Titelverbindung wird in 95 % Ausbeute erhalten, Schmelzpunkt: 47-49ºC.
- Berechnet: C 72,12 % H 7,64 %
- Gefunden: C 72,2 % H 7,68 %
- Auf einem Bett aus SS-Agar-Selektionskulturmedium werden Kolonien von Salmonella typhimurium und Proteus mirabilis in gemischter Flora kultiviert. Beide Kulturen können Lactose nicht verwerten und sind H&sub2;S- positiv. Ein Tropfen 4-Methylumbelliferon-octanoat, gelöst in Aceton, wird auf die wachsenden Mikroben gegeben. Nach 2-3 Minuten wird eine Fluoreszenz unter der Wood'schen Lampe bei 366 nm beobachtet. Die Kolonien von Salmonella typhimurium zeigen eine stark blaue Fluoreszenz, während die Kolonien von Proteus mirabilis keine Fluoreszenz zeigen.
- Es ist deshalb möglich, Salmonella spp. in Wachstumsgemischen von Mikroben nachzuweisen, was bei jedem anderen Verfahren aufgrund des daraus folgenden offensichtlichen diagnostischen Fehlers unmöglich war.
- Der Begriff "SS-Agar", wie er hier verwendet wird, bezieht sich in einer abgekürzten an sich bekannten Form, auf das Kulturmedium Salmonella Shigella Agar.
Claims (3)
1. Verfahren zur unmittelbaren Identifizierung von
Salmonellen und ihrer Unterscheidung von anderen, nicht
fermentierenden H&sub2;S-positiven oder -negativen Bakterien, dadurch
gekennzeichnet, daß das Verfahren direkt auf
dem mikrobiellen Kulturmediurn durch Verwenden eines Reagenses
aus einem 4-Methylumbelliferonester einer Carbonsäure mit 7
bis 10 Kohlenstoffatomen, auf den das in den Kulturen
vorhandene bakterielle Enzym spezifisch einwirkt, und Beobachten
der entstandenen Fluoreszenz innerhalb von 1-5 Minuten,
durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das verwendete Reagens
4-Methylumbelliferonoctanoat ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß Papierscheibchen oder Baumwollkissen
mit dem Reagens imprägniert werden und das mikrobielle
Wachstum darauf niedergeschlagen wird.
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1992
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| Publication number | Publication date |
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