DE60210607T2 - Nährboden zum nachweis und/oder zur unterscheidung von enterokokken - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein chromogenes Kulturmedium, das dazu bestimmt ist, Enterokokken nachzuweisen.
• Im klinischen Bereich erweist sich der Nachweis von Enterokokken aufgrund des Auftretens von Stämmen, die gegen Antibiotika, insbesondere Vancomycin, dem meistgebrauchten Antibiotikum zur Behandlung von Infektionen, resistent sind, als äußerst wichtig. Diese nosokomialen Infektionen können somit das Leben der erkrankten Patienten gefährden.
• Die aus dem Darm isolierten Streptokokken oder Streptokokken der Gruppe D wurden üblicherweise gemäß ihren physiologischen Merkmalen in zwei Gruppen unterteilt:
  – die "Enterokokken" (Streptococcus faecium und Streptococcus faecalis), die in der Lage sind, unter ungünstigen Bedingungen zu wachsen;
  – die "nicht-Enterokokken-Streptokokken der Gruppe D" (Streptococcus bovis und Streptococcus equinus), die nicht in der Lage sind, sich unter ungünstigen Bedingungen zu vermehren.
• 1982 und 1983 haben Genomstudien (DNA-rRNA-Hybridisierungen, Erstellung von Wörterbüchern für die 16S rRNA-Oligonukleotide) gezeigt, dass die " Enterokokken" und die " nicht-Enterokokken-Streptokokken der Gruppe D" zwei verschiedenen Gattungen angehörten.
• 1984 bestätigen Schleifer und Kilpper-Bälz durch die Untersuchung der Ergebnisse der DNA – 23S rRNA-Hybridisierungen und der DNA – DNA-Hybridisierungen die alten Ergebnisse, und diese beiden Autoren schlagen das Übertragen der "Streptokokken aus der Gruppe der Enterokokken" in die Gattung "Enterococcus" vor, die sich von der Gattung "Streptococcus" unterscheidet (Int. J. Syst. Bacteriol., 1984, 34, 31-34).
• Eine sehr gute Studie über die Enterokokken kann auf der Web-Seite www.bacterio.cict.fr/bacdico/ee/enterococcus.html oder auf der Web-Seite www.life.umd.edu/classroom/bsci424/PathogenDescriptions/Enterococcus.htm oder auf der Web-Seite www.enterococcus.ouhsc.edu/lab_methods.asp gefunden werden.
• Es ist somit wichtig, über einen zuverlässigen und schnellen Test zu verfügen, der es ermöglicht, Kontaminationen durch diese Bakterien nachzuweisen, wobei dieser Test sowohl empfindlich als auch spezifisch sein muss.
• Die Enterokokken wachsen im Allgemeinen in Temperaturbereichen von 10°C bis 45°C, mit einem optimalen Wachstum bei ungefähr 35°C, auf nichtselektivem Medium (Blutagar oder Schokoladenagar). Jedoch ermöglicht ein solches Medium auch das Wachstum anderer Bakterien und erlaubt es nicht, die Enterokokken wirksam zu unterscheiden.
• Es gibt heute bestimmte Kulturmedien zum Nachweis von Enterokokken, insbesondere das von Difco verkaufte Medium MacConkey Agar ohne Kristallviolett. Kristallviolett ist eine das Wachstum der gram-positiven Bakterien hemmende Verbindung, von der angenommen wird, dass sie das Wachstum der Enterokokken und der Staphylokokken hemmt (es sei daran erinnert, dass Enterokokken gram-positive Kokken sind, die vereinzelt oder paarweise oder in kurzen Ketten vorliegen). Das "Difco Manual", 11. Ausg., Seite 288, verweist auf "MacConkey Agar w/o CV (Crystal Violet) is a differential medium that is less selective than MacConkey Agar. The lack of crystal violet permits the growth of Staphylococcus and Enterococcus.".
• Dieses Medium enthält auch andere Wachstumsinhibitoren, wie Gallensalze. Diese anderen Inhibitoren sind wirksam, um das Wachstum von grampositiven Bakterien, nicht aber der Enterokokken zu hemmen.
• Tatsächlich können Enterokokken-Bakterien auch in Medien wachsen, welche Gallensalze enthalten, da sich die Kolonien nach der Einwirkung von Galle nicht auflösen. Man kann die Enterokokken-Bakterien auch in einem Medium zum Wachsen bringen, das eine Konzentration von 6,5 % NaCl enthält, wogegen die Streptokokken diese Eigenschaft nicht besitzen.
• Aus diesen Feststellungen, dass die Medien für Enterokokken kein Kristallviolett, sondern eher andere Inhibitoren enthalten, kann gefolgert werden, dass das Kristallviolett unter zahlreichen Bedingungen ein Wachstumsinhibitor für Enterokokken ist. Diese Hypothese wird durch die Tatsache gestützt, dass von den verschiedenen MacConkey Medien dasjenige, das zum Nachweis von Enterokokken verwendet wird, kein Kristallviolett, sondern Gallensalze enthält. Dieses Medium erlaubt jedoch auch das Wachstum von Staphylokokkken.
• Es ist angebracht, anzumerken, dass die zum Nachweis von Enterokokken am häufigsten verwendete Methode in einer Filtrationstechnik auf einem Selektivmedium (wie dem Medium m-Enterococcus Agar = Slanetz-Bartley-Medium oder dem Oxolinsäure-Äsculin-Azid-Medium = OAA-Medium) besteht, gefolgt von einer Bestätigung durch Kultur auf Galle-Äsculin-Agar, die 48 h bei 44°C inkubiert wird. Die selektive Wirkung kann verstärkt werden, indem das Slanetz-Bartley-Medium bei 41°C inkubiert wird. Meistens wird die vollständige Identifikation nicht vorgenommen und es wird nur der Katalasenachweis durchgeführt, um bestimmte Staphylokokkenstämme abzutrennen, die sich auf den verwendeten Medien entwickeln können.
• Es ist somit angebracht, über ein Medium zu verfügen, das den Nachweis von Enterokokken ermöglicht und es außerdem ermöglicht, sie von den Staphylokokken zu unterscheiden, die im Allgemeinen auf den Kulturmedien der Enterokokken wachsen.
• Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass es möglich ist, die Konzentration von Kristallviolett derart einzustellen, dass dieses seine Funktion der Wachstumshemmung für die Mehrheit der gram-positiven Bakterien und insbesondere die Staphylokokken beibehält und zugleich das Wachstum der Enterokokken erlaubt.
• So verwenden die Medien aus dem Stand der Technik (insbesondere das von Difco Laboratories verkaufte Medium MacConkey Agar) im Allgemeinen eine Kristallviolett-Konzentration, die gleich 1 mg/l ist. Es wurde gezeigt, dass es die Zugabe von Kristallviolett in einer Konzentration von 0,1 bis ungefähr 1,5 mg/l erlaubt, das Wachstum der Enterokokken aufrechtzuerhalten, insbesondere wenn das Medium keine anderen Wachstumsinhibitoren für gram-positive Bakterien enthält.
• Es wurde ebenfalls gezeigt, dass es die Zugabe von Kristallviolett erlaubt, die Verwendung von Natriumazid zu vermeiden, das sehr häufig in den Nachweismedien für Enterokokken vorliegt (wegen seiner wachstumshemmenden Eigenschaften gegenüber bestimmten Bakterien, das aber für den Menschen giftig ist). Bevorzugt enthält somit ein Medium gemäß der Erfindung kein Natriumazid.
• Dieses Ergebnis und insbesondere die Tatsache, dass die Konzentration von Kristallviolett unter bestimmten Bedingungen über 1 mg/l liegen kann und dennoch das Wachstum der Enterokokken erlaubt, konnte in Anbetracht der im Stand der Technik beschriebenen Kenntnisse nicht vorausgesehen werden, insbesondere die Tatsache, dass das Natriumazid auch weggelassen werden kann.
• Demgemäß hat die vorliegende Erfindung ein Kulturmedium für den Nachweis und/oder die Unterscheidung von Enterokokken zum Gegenstand, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es in einem Kulturmedium für Enterokokken Kristallviolett in einer Konzentration umfasst, welche das Wachstum der Enterokokken und die Inhibierung des Wachstums des überwiegenden Teils der gram-positiven Bakterien ermöglicht.
• Die Konzentration liegt über 0,1 mg/l, bevorzugter über 0,25 mg/l oder über 0,5 mg/l. So beobachtet man eine Wachstumshemmung einer bedeutenden Menge gram-positiver Bakterien nach Zugabe von Kristallviolett in einer so niedrigen Konzentration wie 0,1 mg/l.
• Die Konzentration liegt unter 1 mg/l. Beträgt die Konzentration von Kristallviolett ungefähr 1 mg/l, so ist es angebracht, die anderen Inhibitoren grampositiver Bakterien, insbesondere Gallensalze, zu reduzieren oder wegzulassen. Es ist dem Fachmann zugänglich, die Inhibitorkonzentrationen in Abhängigkeit der Konzentration des dem erfindungsgemäßen Medium zugesetzten Kristallvioletts einzustellen.
• In einer anderen Ausführungsform der Erfindung liegt die Konzentration von Kristallviolett unter 0,8 mg/l, bevorzugter unter 0,7 mg/l. Bei solchen Konzentrationen können gegebenenfalls andere Inhibitoren gram-positiver Bakterien zugegeben werden.
• Dem Fachmann ist bekannt, was der Ausdruck "Kulturmedium für Enterokokken" bedeutet, das heißt ein Kulturmedium, welches die Nährstoffe enthält, die notwendig sind, um das Wachstum dieser Bakterien zu erlauben. Insbesondere sind Pepton aus Casein, aus Soja, aus Fleisch, Hefe- oder Rinderextrakt, Dextrose usw. zu nennen.
• Das Medium gemäß der Erfindung umfasst darüber hinaus bevorzugt mindestens eine chromogene Substanz, die Substrat eines Zuckerfermentationsenzyms ist, wobei dieses Enzym bevorzugt eine Glucosidase, insbesondere β-Glucosidase, oder eine Galactosidase, insbesondere β-Galactosidase, ist.
• Die Tatsache, dass man eine chromogene Substanz zugeben kann, ist insofern vollkommen unerwartet, als Kristallviolett bereits die erfindungsgemäßen Medien färbt, wodurch man davon abgebracht wird, ein Element zuzugeben, das eine Farbe hinzufügt, wie eine chromogene Substanz.
• Bevorzugt setzt die chromogene Substanz durch Hydrolyse einen fällbaren Chromophor frei, der ausgewählt ist aus Indoxyl-, Halogenindoxyl- (Bromindoxyl-, Chlorindoxyl-, Fluorindoxyl-, lodindoxyl, Dichlorindoxyl-, Chlorbromindoxyl-, Trichlorindoxyl-), Methylindoxyl- oder Hydroxychinolin-Derivaten, insbesondere den folgenden Derivaten: 6-Chlorindoxyl, 5-Bromindoxyl, 3-Bromindoxyl, 6-Fluorindoxyl, 5-Iodindoxyl, 4,6-Dichlorindoxyl, 6,7-Dichlorindoxyl, 5-Brom-4-chlorindoxyl, 5-Brom-6-chlorindoxyl, 4,6,7-Trichlorindoxyl, N-Methyl-indoxyl oder 8-Hydroxychinolin.
• Bevorzugt ist die chromogene Substanz, die Substrat der β-Glucosidase ist, ein Indoxylglucosid, insbesondere 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-glucosid, und/oder ist die chromogene Substanz, die Substrat der β-Galactosidase ist, ein Indoxylgalactosid, insbesondere 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-β-galactosid.
• Um einen besseren Nachweis der Enterokokken zu ermöglichen, können dem erfindungsgemäßen Kulturmedium auch Wachstumsinhibitoren für gramnegative Bakterien, wie Nalidixinsäure oder Colistin, zugegeben werden.
• Um atypische Enterokokken nachzuweisen, die gegenüber bestimmten Antibiotika resistent sind und weitgehend für die nosokomialen Infektionen verantwortlich sind, kann man den erfindungsgemäßen Medien auch diese Antibiotika zusetzen. So wird man Vancomycin in einer Konzentration von ungefähr 6 mg/l zugeben. Es sei darauf hingewiesen, dass man den Anteil resistenter Bakterien in einer Probe nachweisen kann, indem auf einer Platte ohne Antibiotika und auf einer diese enthaltenden Platte ausplattiert wird und die Anzahl der als Enterokokken identifizierten Kolonien auf jeder Platte verglichen wird.
• Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines Kulturmediums gemäß der Erfindung zum Nachweis und/oder zur Unterscheidung von Enterokokken sowie ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Unterscheidung von Enterokokken in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, welche bestehen aus:
• a. Beimpfen eines Kulturmediums gemäß der Erfindung mit der Probe oder einem Inokulum, das von der Probe abgeleitet ist,
• b. Nachweis der Anwesenheit von Enterokokken auf dem Kulturmedium.
• Die Anwesenheit von Enterokokken wird durch das Wachstum von Kolonien auf dem Medium nachgewiesen, und dies wird durch deren Färbung nach Freisetzung des Chromophors ausgehend von dem Chromogen, das ein Substrat des Enzyms ist, erleichtert.
• Bevorzugt wird ein Chromophor gewählt, der eine von der Wellenlänge des Kristallvioletts unterschiedliche Wellenlänge besitzt, um ihn leichter identifizieren zu können. Jedoch erlaubt das erfindungsgemäße Medium auch die Verwendung und den Nachweis von Chromophoren, die eine Wellenlänge nahe der Wellenlänge des Kristallvioletts besitzen.
• Allgemein betrifft die Erfindung auch ein Kulturmedium für den Nachweis gram-positiver oder gram-negativer Bakterien, welches außer Wachstumsfaktoren für diese gram-positiven oder gram-negativen Bakterien eine chromogene Substanz und Kristallviolett umfasst, wobei das Kristallviolett in einer Konzentration vorliegt, welche das Wachstum der Bakterien, die man nachweisen will, und die differentielle Hemmung des Wachstums gram-positiver Bakterien ermöglicht, wobei die Konzentration bevorzugt zwischen 0,1 mg/l und 1 mg/l einschließlich liegt.
• Die Erfindung hat somit gezeigt, dass in ein chromogenes Medium ein Farbstoff zugegeben werden kann und zugleich die Eigenschaften des Chromogens beibehalten werden.
• Das Chromogen wird derart gewählt, dass der freigesetzte Chromophor eine Wellenlänge besitzt, die von der des Kristallvioletts oder des in dem chromogenen Medium verwendeten Farbstoffs unterschiedlich ist.
• BEISPIELE
• Beispiel 1
• Ein bevorzugtes Medium für die Durchführung der Erfindung umfasst (pro Liter):

  – Agar	15 g
  – Hefeextrakt und Peptone	9 g
  – NaCl	5 g
  – Nalidixinsäure	50 mg
  – Colistin	5 mg
  – Kristallviolett	0,5 mg
  – 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-glucosid	50 mg

• Beispiel 2
• Das Ausplattieren von Bakterien auf dem Medium gemäß der Erfindung ergab folgende Ergebnisse (24 Stunden Inkubation bei 37°C):

  
• Die Verwendung des Mediums gemäß der Erfindung ermöglicht es somit, Enterokokken nachzuweisen und sie von den Staphylokokken zu unterscheiden.
• Beispiel 3
• Beispiele für Medien für Enterokokken, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, indem ihnen Kristallviolett zugesetzt wird und gegebenenfalls das Natriumazid weggelassen wird oder indem chromogene Substanzen und gegebenenfalls Vancomycin zugesetzt werden, um die resistenten Stämme nachzuweisen. Galle-Äsculin-Medium (Zusammensetzung in Gramm pro Liter):

  Fleischextrakt:

  3,0

  Fleischpepton:	5,0
  Rindergalle:	40,0
  Äsculin:	1,0
  Eisencitrat:	0,5
  Agar:	14, 5

  Dieses Medium kann mit 5 % Pferdeserum angereichert werden. Galle-Äsculin-Azid-Medium (Zusammensetzung in Gramm pro Liter):

  Trypton:	17,0
  Pepton:	3,0
  Hefeextrakte:	5,0
  Äsculin:	1,0
  NaCl:	5,0
  Ammoniumeisencitrat:	0,5
  Natriumcitrat:	1,0
  Natriumazid:	0,25
  Rindergalle:	10,0
  Agar:	13,5

  Slanetz-Bartley-Medium oder m-Enterococcus-Agar (Zusammensetzung in Gramm pro Liter):

  Trypton:	15,0
  Pepton:	5,0
  Hefeextrakte:	0,5
  Glucose:	2,0 oder 5,0
  K2HPO4:	4,0
  Natriumazid:	0,4
  2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (1%-ige Lösung):	10,0
  Agar:	10

  Oxolinsäure-Äsculin-Azid-Medium oder OAA-Medium (Zusammensetzung in Gramm pro Liter):

  Trypton:	20,0
  Hefeextrakte:	5,0
  Glucose:	1,0
  NaCl:	5,0
  Ammoniumeisencitrat:	0,5
  Natriumcitrat:	1,0
  Natriumazid:	0,4
  Oxolinsäure:	0,005
  Agar:	10,0

  Äsculin-Azid-Kanamycin-Agar (Zusammensetzung in Gramm pro Liter):

  Trypton:	20,0
  Hefeextrakte:	5,0
  Glucose:	1,0
  NaCl:	5,0
  Ammoniumeisencitrat:	0,5
  Natriumcitrat:	1,0
  Natriumazid:	0,15
  Kanamycinsulfat:	0,02
  Agar:	10,0

Claims (13)

1. Kulturmedium für den Nachweis und/oder die Unterscheidung von Enterokokken, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Kulturmedium für Enterokokken Kristallviolett bei einer Konzentration umfasst, welche das Wachstum der Enterokokken und die Inhibierung des Wachstums des überwiegenden Teils von gram-positiven Bakterien ermöglicht, wobei die Konzentration über 0,1 mg/l und unter 1 mg/l liegt.
2. Kulturmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es darüber hinaus ein chromogenes Agens, Substrat eines Fermentationsenzyms von Zuckern, umfasst, das derart ausgewählt ist, dass der freigesetzte Chromophor eine andere Wellenlänge als jene des Kristallvioletts besitzt.
3. Medium nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Glucosidase, insbesondere β-Glucosidase, oder eine Galactosidase, insbesondere β-Galactosidase, ist.
4. Kulturmedium nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das chromogene Agens durch Hydrolyse einen fällbaren Chromophor freisetzt, der ausgewählt ist aus Indoxyl-, Halogenindoxyl- (Bromindoxyl-, Chlorindoxyl-, Fluorindoxyl-, lodindoxyl, Dichlorindoxyl-, Chlorbromindoxyl-, Trichlorindoxyl-), Methylindoxyl- oder Hydroxychinolin-Derivaten, insbesondere den folgenden Derivaten: 6-Chlorindoxyl, 5-Bromindoxyl, 3-Bromindoxyl, 6-Fluorindoxyl, 5-Iodindoxyl, 4,6-Dichlorindoxyl, 6,7-Dichlorindoxyl, 5-Brom-4-chlorindoxyl, 5-Brom-6-chlorindoxyl, 4,6,7-Trichlorindoxyl, N-Methyl-indoxyl oder 8-Hydroxychinolin.
5. Kulturmedium nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat der β-Glucosidase ein Indoxylglucosid ist und/oder das Substrat der β-Galactosidase ein Indoxylgalactosid ist.
6. Kulturmedium nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat der β-Glucosidase 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-glucosid ist und/oder das Substrat der β-Galactosidase 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-β-galactosid ist.
7. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es auch Wachstumsinhibitoren für gram-negative Bakterien enthält.
8. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst (pro Liter): - Agar 15 g - Hefeextrakt und Peptone 9 g - NaCl 5 g - Nalidixinsäure 50 mg - Colistin 5 mg - Kristallviolett 0,5 mg - 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-glucosid 50 mg
9. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das darüber hinaus Antibiotika enthält.
10. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es kein Natriumazid enthält.
11. Verwendung eines Kulturmediums, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, für den Nachweis und/oder die Unterscheidung von Enterokokken.
12. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Unterscheidung von Enterokokken in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst, welche bestehen aus: a. Impfen eines Kulturmediums, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, mit der Probe oder einem Inokulum, das von der Probe abgeleitet ist, b. Nachweisen der Anwesenheit von Enterokokken auf dem Kulturmedium.
13. Kulturmedium für den Nachweis von gram-positiven oder gram-negativen Bakterien, umfassend außer den Wachstumsfaktoren für die grampositiven oder gram-negativen Bakterien ein chromogenes Agens und Kristallviolett bei einer Konzentration, welche das Wachstum der Bakterien, die man nachweisen will, und die differenzielle Inhibierung des Wachstums von gram-positiven Bakterien ermöglicht, wobei die Konzentration über 0,1 mg/l und unter 1 mg/l liegt, wobei das Chromogen derart ausgewählt ist, dass der freigesetzte Chromophor eine andere Wellenlänge als jene des Kristallvioletts besitzt.