DE69728532T2

DE69728532T2 - Wachstumsmedium zum nachweis von enterohaemorragische e. coli-bakterien, und nachweisverfahren

Info

Publication number: DE69728532T2
Application number: DE69728532T
Authority: DE
Inventors: Alain Rambach
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-04-15
Filing date: 1997-04-14
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2017-04-15
Also published as: EP0901520B1; ES2215224T3; CA2252004C; JP3711563B2; JP2000508176A; EP0901520A1; US6165743A; FR2747394B1; ATE263831T1; DE69728532D1; FR2747394A1; WO1997039103A1; CA2252004A1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Medium für die Isolierung und Identifizierung von E. coli 0157-Bakterien und ein Verfahren zu deren Nachweis.
Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC), insbesondere der Serotyp 0157, sind die Ursache der meisten Fälle von Lebensmittelvergiftungen in den Vereinigten Staaten, in Kanada und in Europa gewesen. In Nordamerika sind Rindfleisch (insbesondere rohes), die Erzeugnisse auf der Grundlage von Rind, Rohmilch an diesen Epidemien beteiligt gewesen.
Die Virulenzeigenschaften dieses Keims, welche identisch sind mit jenen der enteropathogenen E. coli und der verotoxinogenen E. coli, machen diesen Keim zu einem Hauptproblem für die öffentliche Gesundheit. Tatsächlich ruft er hämorrhagische Kolitiden hervor, die durch blutige Durchfälle, Symptome, die sich in Richtung von sehr schweren renalen Komplikationen weiterentwickeln können (urämisches hämolytisches Syndrom), gekennzeichnet sind.
Die Forschung orientiert sich dementsprechend in den letzten Jahren in Richtung des schnellen Nachweises von EHEC-Stämmen in Lebensmittelerzeugnissen (FDA, 8. Auflage, 1995 – Bolton et al., 1995) und insbesondere in Richtung eines spezifischen Nachweises des Serotyps 0157.
Die Isolierungsmedien des Standes der Technik sind:

– insbesondere wenig selektive Medien, wie das MacConkey-Medium mit Sorbitol, und Untersuchung aller gram-negativen, Sorbitolnegativen Bakterien,
– man hat manchmal Antibiotika mit begrenztem Erfolg zugesetzt, denn man kann eine Hemmung der Vermehrung der gesuchten E. coli 0157 erhalten,
– man hat manchmal eine fluorogene oder chromogene Verbindung zugesetzt, welche es erlaubt, die Kolonien von Bakterien zu eliminieren, welche eine β-Glucuronidase aufweisen (im wesentlichen typische E. coli).

Die Hauptzahl der aus Epidemien isolierten Stämme von Escherichia coli 0157 fermentiert Sorbitol in 24 h nicht, weist keine β-Glucuronidase-Aktivität auf und vermehrt sich bei 45,5°C nicht. Auch setzen viele Verfahren zum Screening von klinischen oder Nahrungsmittelproben auf EHEC-Stämme den Sorbitol-MacConkey-Agar (SMAC) als primäres Isolierungsmedium ein.
Die als Sorbitol-negativ vermuteten Stämme werden dann durch biochemische und serologische Tests als Escherichia coli 0157 bestätigt.
Von den anderen Medien, die am häufigsten eingesetzt werden, erwähnen wir:

– CT-SMAC: von SMAC abgeleitetes Medium, welches zwei Inhibitoren (Cefixim und Kaliumtellurit) enthält, welche dieses selektiver machen. Tatsächlich hemmen diese Verbindungen zahlreiche Bakterien, die Sorbitol nicht fermentieren, wie Proteus spp., Morganella morganii, Providencia spp., Hafnia alvei ... Eine 1993 ausgeführte Untersuchung hat gezeigt, dass nahezu 400 Stämme von E. coli 0157 EHEC allesamt auf dem CT-SMAC-Medium, welches den Nachweis von Sorbitol-negativen Kolonien erlaubt, wachsen.
– CR-SMAC: von SMAC abgeleitetes Medium, welches Cefixim und Rhamnose enthält, für den Nachweis von Sorbitol-negativen, Rhamnose-negativen Kolonien.
– SMAC + MUG (4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid) für den Nachweis von Sorbitol-negativen, β-Glucuronidase-negativen KoLonien.
– SMAC + BCIG (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-D-β-glucuronid) für den Nachweis von Sorbitol-negativen, β-Glucuronidase-negativen Kolonien.
– Gelose Fluorocult E. coli 0157: H7: Medium, welches Sorbitol, MUG und Natriumthiosulfat enthält, für den Nachweis von Sorbitol-negativen, MUG-negativen und H₂S-negativen Kolonien.

Die Varianten des SMAC-Mediums, eines wenig selektiven Ausgangsmediums, wurden durch Zugabe von Inhibitoren, welche dazu beitragen, die Empfindlichkeit hinsichtlich der Isolierung von E. coli 0157 durch Eliminierung von damit assoziierten Floren zu erhöhen, hergestellt.
Gleichwohl weisen die aktuellen Nachweistechniken hauptsächliche Nachteile vom Gesichtspunkt der Empfindlichkeit wie auch der Spezifität auf, da E. coli 0157 in den Nahrungsmittelproben in geringer Menge bezogen auf die anderen vorhandenen Keime und die anderen Spezies, wie E. hermanii, die die gleichen Phänotypen auf den aktuellen Medien aufweisen, vorhanden ist.
Die Erfindung ermöglicht eine Lösung für dieses Problem, denn sie ermöglicht eine verbesserte Selektivität und Spezifität bezogen auf die Medien des Standes der Technik, denn die Zugabe von Chromogen, welches das Enzym α-Galactosidase detektiert, zu einem farblosen Medium erlaubt es, die Stämme des Serotyps 0157 schnell und leicht ausfindig zu machen. Wir erhalten gut konzentrierte Anfärbungen, deren Farbe von dem chromophoren Abschnitt des gewählten Chromogens abhängt, die an der Stelle der Kolonien lokalisiert sind und die eine leichte Detektion erlauben.
Die Erfindung betrifft folglich ein neues Kulturmedium für den Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli-Bakterien, insbesondere vom Serotyp 0157, welches außer aus einem Kulturmedium für E. coli aus einer chromogenen Verbindung, welche ein Substrat des Enzyms α-Galactosidase ist, besteht.
Um die Selektivität zu erhöhen, können wir eine chromogene Verbindung zusetzen, welche ein Substrat der β-Glucosidase ist, welche ermöglicht, insbesondere eine große Anzahl von koliformen Bakterien zu eliminieren.
Um die Selektivität zu erhöhen, können wir eine chromogene Verbindung zusetzen, welche ein Substrat der β-Glucuronidase ist, welche erlaubt, insbesondere den Hauptteil der E. coli aus anderen Serogruppen als 0157 und 011 zu eliminieren.
Die chromogene Verbindung, welche ein Substrat des Enzyms α-Galactosidase ist, wird vorteilhafterweise unter den Derivaten von Indoxyl-α-galactosid, bei denen das Chromophor unter den substituierten oder nicht-substituierten Indoxylresten ausgewählt ist, ausgewählt.
Die chromogene Verbindung, welche ein Substrat der β-Glucosidase ist, wird vorzugsweise unter den Derivaten von Indoxyl-β-glucosid, bei denen das Chromophor unter den substituierten oder nicht-substituierten Indoxylresten ausgewählt ist, ausgewählt.
Die chromogene Verbindung, welche ein Substrat der β-Glucuronidase ist, wird vorzugsweise unter den Derivaten von Indoxyl-β-glucuronid, bei denen das Chromophor unter den substituierten oder nicht-substituierten Indoxylresten ausgewählt ist, ausgewählt.
Unter substituiertem oder nicht-substituiertem Indoxyl versteht man die Indoxylreste und Indoxyl, welches durch ein oder mehrere Alkylreste oder Halogene substituiert ist. Es handelt sich insbesondere um alkylierte, halogenierte, dihalogenierte oder trihalogenierte Indoxylreste, welche vorzugsweise unter den Bromindoxyl-, Chlorindoxyl-, Dichlorindoxyl-, Chlorbromindoxyl-, Trichlorindoxyl- und Methylindoxylresten ausgewählt werden.
Vorteilhafterweise werden die indoxylierten chromophoren Verbindungen unter den 3-Indoxyl-, 6-Chlorindoxyl-, 5-Bromindoxyl-, 3-Bromindoxyl-, 4,6-Dichlorindoxyl-, 6,7-Dichlorindoxyl-, 5-Brom-4-chlorindoxyl-, 5-Brom-6-chlorindoxyl- oder 4,6,7-Trichlorindoxylresten ausgewählt.
Vorzugsweise wird die chromogene Verbindung, welche ein Substrat des Enzyms α-Galactosidase ist, ausgewählt unter den folgenden Verbindungen:
5-Brom-6-chlor-3-Indoxyl-α-galactosid und
6-Chlor-3-indoxyl-α-galactosid.
Für die chromogenen Verbindungen, welche Substrate der Enzyme β-Glucosidase und/oder β-Glucuronidase sind, wird das Chromophor vorzugsweise ausgewählt unter den folgenden Resten:
5-Brom-4-chlor-3-indoxyl,
5-Brom-3-indoxyl und
3-Indoxyl.
Vorteilhafterweise umfasst das erfindungsgemäße Medium zwischen 0,01 und 0,2 g/l Chromogen, welches ein Substrat der α-Galactosidase ist, vorzugsweise ungefähr 0,05 g/l.
Gegebenenfalls liegt die Konzentration der chromogenen Verbindungen, welche Substrate der β-Glucosidase und/oder β-Glucuronidase sind, gleichfalls zwischen 0,01 und 0,2 g/l, vorzugsweise bei ungefähr 0,05 g/l.

Andere Eigenschaften der erfindungsgemäßen Medien werden im Lichte der nachfolgenden Beispiele ersichtlich. Beispiel 1

Formulierung CHROMagar 0157	in g/l
Agar	15
Pepton	5
Hefeextrakt	2
Fleischextrakt	1
NaCl	5
5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-α-galactosid	0,05
5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-glucosid	0,05
5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-glucuronid	0,05
Desoxycholat	0,5.

Beispiel 2: Durch verschiedene Stämme erhaltene Anfärbungen Man inokuliert das Kulturmedium mit verschiedenen Bakterienstämmen, dann lässt man 24 h inkubieren.
Man findet gleichfalls E. coli 0157-Stämme, die dennoch SLT + ("Shigella Like Toxine" (Shigella-artiges Toxin)-positiv) mit einem Sorbitol-positiven Charakter sind und die durch das Medium der Erfindung nachgewiesen werden, wohingegen sie auf MacConkey-Sorbitol-Medium falsch-negativ, rot, sind und folglich nicht detektiert werden. Das Medium der Erfindung bedingt folglich nicht nur einen Spezifitätsvorteil (Eliminierung von Falsch-Positiven), sondern bedingt einen Empfindlichkeitsvorteil (Nachweis von auf MacConkey-Sorbitol-Medium falsch-negativen Stämmen), was von sehr großer Bedeutung ist.
Außerdem liefert das Medium der Erfindung eine gute Vermehrungsausbeute, denn abgesehen von der Selektivität bezüglich der Hemmung der gram-positiven Bakterien basiert das Medium nicht hauptsächlich auf einem Prinzip selektiver Vermehrung.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zum Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli 0157 in einer Probe, bei welchem man das erfindungsgemäße Kulturmedium mit der Probe oder einem Inokulum von der Probe animpft und man dann gegebenenfalls das Vorhandensein von enterohämorrhagischen E. coli nachweist.
Auf dem Gebiet der Mikrobiologie der Nahrungsmittel versucht man beispielsweise zu zeigen, dass weniger als zehn E. coli O157 : H7-Bakterien in einem Nahrungsmittel vorhanden sind. Man setzt ein Verfahren zur mikrobiellen Vermehrung, dann gegebenenfalls ein Verfahren zur Anreicherung durch IMS-Immuneinfang ("IMS-Immunocapture") vor der Verdünnung bzw. der Inokulation mit Hilfe von an Kügelchen gebundenen Antikörpern ein. Indessen eliminiert diese Anreicherung nicht mehrere Bakterien, die auf den Medien des Standes der Technik falsche Positive ergeben. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Mediums bedingt folglich einen entscheidenden Vorteil ebenso, wenn man diese IMS-Methode zur Anreicherung durch Immuneinfang ("immunocapture") einsetzt.

Claims

Kulturmedium für den Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli-Bakterien vom Serotyp 0157, dadurch gekennzeichnet, dass es außer aus einem Kulturmedium für E. coli aus einer einzigen chromogenen Verbindung, welche ein Substrat des Enzyms α-Galactosidase ist, besteht.
Kulturmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chromogene Verbindung, welche ein Substrat des Enzyms α-Galactosidase ist, ausgewählt wird unter den Derivaten von Indoxyl-α-galactosid, bei denen das Chromophor unter den substituierten oder nicht-substituierten Indoxylresten ausgewählt ist.
Kulturmedium nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Chromophor der chromogenen Verbindung, welche ein Substrat des Enzyms α-Galactosidase ist, ausgewählt wird unter den folgenden Resten: 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-α-galactosid und 6-Chlor-3-indoxyl-α-galactosid.
Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der chromogenen Verbindung, welche ein Substrat von α-Galactosidase ist, zwischen 0,01 und 0,2 g/l einschließlich, vorzugsweise ungefähr 0,05 g/l beträgt.
Verfahren zum Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli 0157 in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man das Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit der Probe oder einem Inokulum, das von der Probe stammt, animpft und dass man gegebenenfalls das Vorhandensein von enterohämorrhagischen E. coli nachweist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium eine chromogene Verbindung, welche ein Substrat der β-Glucosidase ist, und/oder eine chromogene Verbindung, welche ein Substrat der β-Glucuronidase ist, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die chromogene Verbindung, welche ein Substrat der β-Glucosidase ist, ausgewählt wird unter den Derivaten von Indoxyl-β-glucosid und/oder die chromogene Verbindung, welche ein Substrat der β-Glucuronidase ist, ausgewählt wird unter den Derivaten von Indoxyl-β-glucuronid, bei denen das Chromophor unter den substituierten oder nicht-substituierten Indoxylresten ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Chromophor der chromogenen Verbindung, welche ein Substrat des Enzyms β-Glucosidase ist, und/oder der chromogenen Verbindung, welche ein Substrat des Enzyms β-Glucuronidase ist, ausgewählt wird unter den folgenden Resten: 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl 5-Brom-3-indoxyl und 3-Indoxyl.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der chromogenen Verbindungen, welche Substrate der β-Glucosidase und/oder der β-Glucuronidase sind, zwischen 0,01 und 0,2 g/l einschließlich, vorzugsweise 0,05 g/l beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man vorab ein Verfahren zur mikrobiellen Vermehrung der Probe, dann gegebenenfalls ein Verfahren zur Anreicherung durch IMS-Immuneinfang ("IMS-Immunocapture") einsetzt, bevor das Kulturmedium angeimpft wird.