ES2215224T3 - Medio de cultivo para la puesta en evidencia de las bacterias e. coli enterohemorragicas, y procedimiento para su puesta en evidencia. - Google Patents
Medio de cultivo para la puesta en evidencia de las bacterias e. coli enterohemorragicas, y procedimiento para su puesta en evidencia.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN MEDIO DE CULTIVO PARA LA IDENTIFICACION DE LAS BACTERIAS E. COLI ENTEROHEMORRAGICAS, EN PARTICULAR SEROTIPOS O157 Y/O O11, QUE COMPRENDEN UN COMPUESTO CROMOGENICO SUSTRATO DE LA ENZIMA AL -GALACTOSIDASA. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACION DE E.COLI ENTEROHEMORRAGICAS EN UNA MUESTRA.
Description
Medio de cultivo para la puesta en evidencia de
las bacterias E. coli enterohemorrágicas, y procedimiento
para su puesta en evidencia.
La presente invención se refiere a un nuevo medio
de aislamiento y de identificación de las bacterias E. coli
O157 y a un procedimiento para su puesta en evidencia.
La Escherichia coli enterohemorrágica
(EHEC), en particular el serotipo O157, ha sido el origen de la
mayoría de los casos de intoxicaciones alimenticias en Estados
Unidos, en Canadá y en Europa. En América el Norte, la carne de
vacuno (en particular la carne cruda), los productos a base de carne
de vacuno, la leche cruda, han estado relacionados con estas
epidemias.
Las características de la virulencia de este
germen, idénticas a las de las E. coli enteropatógenas y de
las E. coli verotoxinógenas convierten este germen en un
problema mayor para la salud pública. En efecto, provoca cólicos
hemorrágicos que se caracterizan por unas diarreas sanguinolentas,
pudiendo dichos síntomas evolucionar hacia unas complicaciones
renales muy graves (síndrome urémico hemolítico).
Las investigaciones se orientan por tanto, estos
últimos años, hacia la detección rápida de las cepas EHEC en los
productos alimenticios (FDA, 8ª edición, 1955- Bolton et al.,
1955), y más particularmente hacia una detección específica del
serotipo O157.
Los medios de aislamiento de la técnica anterior
son:
- -
- en particular unos medios poco selectivos, tales como el medio MacConkey al sorbitol y el examen de todas las bacterias gram negativas, sorbitol negativo,
- -
- se han añadido a veces unos antibióticos con un éxito limitado puesto que se puede obtener una inhibición en el crecimiento de las E. coli O157 buscadas,
- -
- se ha añadido a veces un compuesto fluorógeno o cromógeno que permiten eliminar las colonias de bacterias que poseen una \beta-glucuronidasa (esencialmente de las E. coli típicas).
La mayoría de las cepas de Eschericia coli
O157 aisladas de epidemias no fermenta el sorbitol en 24 horas, no
presenta actividad \beta-glucuronidasa y no se
desarrolla a 45,5ºC. Muchos métodos de screening de las cepas EHEC
de muestras clínicas o alimenticias utilizan también el sorbitol
MacConkey agar (SMAC) como medio de aislamiento primario.
Las colonias sospechosas sorbitol negativo son a
continuación confirmadas como Escherichia coli O157 mediante
unas pruebas bioquímicas y serológicas.
Entre los demás medios más corrientemente
utilizados se citarán:
- \rightarrow
- CT-SMAC: medio derivado del SMAC, que contiene dos inhibidores (cefíximo y telurita de potasio) que lo hacen más selectivo. En efecto, estos compuestos inhiben las numerosas bacterias que no fermentan el sorbitol, tales como Proteus spp, Morganella morganii, Providencia spp, Hafnia alvei .... Un estudio realizado en 1993 ha mostrado que cerca de 400 cepas de E. coli O157 EHEC, se cultivaban en medio CT-SMAC, permitiendo la puesta en evidencia de las colonias sorbitol negativo.
- \rightarrow
- CR-SMAC: medio derivado del SMAC, que contiene cefíximo y ramnosa, para la puesta en evidencia de las colonias sorbitol negativo, ramnosa negativo.
- \rightarrow
- SMAC + MUG (4-metilhumbeliferil-\beta-D-glucuronida), para la puesta en evidencia de las colonias sorbitol negativo, \beta-glucorunidasa negativo.
- \rightarrow
- SMAC + BCIG (5-bromo-4-cloro-3-indoxil-D-\beta-glucuronida), para la puesta en evidencia de las colonias sorbitol negativo, \beta-glucuronidasa negativo.
- \rightarrow
- Gelosa Fluorocult E-coli O157: H7: medio que contiene sorbitol, MUG y tiosulfato de sodio, para la puesta en evidencia las de colonias sorbitol negativo, MUG negativo y H_{2}S negativo.
Las variantes del medio SMAC, medio poco
selectivo inicialmente, han sido realizadas mediante la adición de
inhibidores, que contribuyen a aumentar la sensibilidad de
aislamiento de E. coli O157 por eliminación de las floras
asociadas.
Sin embargo, las técnicas de detección actuales
adolecen de unos inconvenientes mayores, tanto desde el punto de
vista de la sensibilidad como de la especificidad, estando la E.
coli O157 presente en pequeñas cantidades en las muestras
alimenticias, con respecto a otros gérmenes presentes, y a otras
especies tales como E. hermanii que presentan los mismos
fenotipos sobre los medios actuales.
La presente invención aporta una solución a este
problema puesto que permite una selectividad y una especificidad
mejorada con respecto a los medios del estado de la técnica, puesto
que la adición en un medio incoloro del cromógeno que detecta la
enzima \alpha-galactosidasa permite localizar de
forma fácil y rápida las cepas del serogrupo O157. Se obtienen unas
coloraciones muy concentradas, cuyo color depende de la parte
cromófora del cromógeno escogido, localizadas a nivel de las
colonias y que permiten una localización fácil.
La presente invención se refiere por lo tanto a
un nuevo medio de cultivo para la puesta en evidencia de las
bacterias E. coli enterohemorrágicas, en particular de
serotipo O157, que consiste además de en un medio de cultivo para la
E. coli, en un compuesto cromógeno sustrato de la enzima
\alpha-galactosidasa..
Para aumentar la selectividad, se puede añadir un
compuesto cromógeno sustrato de la
\beta-glucosidasa que permite eliminar en
particular un gran número de bacterias coliformes.
Para aumentar la selectividad, se puede añadir un
compuesto cromógeno sustrato de la
\beta-glucuronidasa que permite eliminar en
particular la mayoría de las E. coli de los serogrupos
diferentes al O157 y al O11.
De forma ventajosa, el compuesto cromógeno
sustrato de la enzima \alpha-galactosidasa se
selecciona de entre los derivados del
indoxil-\alpha-galactósido, cuyo
cromóforo se selecciona de entre los radicales indoxilo sustituidos
o no.
Preferentemente, el compuesto cromógeno sustrato
de la enzima \beta-galactosidasa se selecciona de
entre los derivados del
indoxil-\beta-glucosido, cuyo
cromóforo se selecciona de entre los radicales indoxilo sustituidos
o no.
El compuesto cromógeno sustrato de la
\beta-glucuronidasa preferentemente se selecciona
de entre los derivados del
indoxil-\beta-glucurónido, cuyo
cromóforo se selecciona de entre los radicales indoxilo sustituidos
o no.
Por indoxilo sustituido o no, se entiende los
radicales indoxilo e indoxilo sustituido por uno o varios radicales
alquilos o halógenos. Se trata más particularmente de los radicales
indoxilo alquilados, halogenados, di-halogenados o
tri-halogenados, preferentemente seleccionados de
entre los radicales bromo-indoxilo,
cloro-indoxilo, dicloro-indoxilo,
cloro-bromo-indoxilo,
tricloro-indoxilo y
metil-indoxilo.
De forma ventajosa, los compuestos cromóforos
indoxilados se seleccionan de entre los radicales
3-indoxilo,
6-cloro-indoxilo,
5-bromo-indoxilo,
3-bromo-indoxilo,
4,6-dicloro-indoxilo,
6,7-dicloro-indoxilo,
5-bromo-4-cloro-indoxilo,
5-bromo-6-cloro-indoxilo
o 4,6,7-tricloro-indoxilo.
Preferentemente, el compuesto cromógeno sustrato
de la enzima \alpha-galactosidasa se selecciona de
entre los siguientes compuestos:
5-bromo-6-cloro-3-indoxil-\alpha-galactósido,
y
6-cloro-3-indoxil-\alpha-galactósido.
Para los compuestos cromógenos sustratos de las
enzimas \beta-glucosidasa y/o
\beta-glucuronidasa, el cromóforo se selecciona
preferentemente de entre los siguientes radicales:
5-bromo-4-cloro-3-indoxilo,
5-bromo-3-indoxilo,
y
3-indoxilo.
De forma ventajosa, el medio según la invención
comprende entre 0,01 y 0,2 g/l de cromógeno sustrato de la
\alpha-galactosidasa, preferentemente de
aproximadamente 0,05 g/l.
En caso necesario, la concentración de los
compuestos cromógenos sustratos de la
\beta-glucosidasa y/o
\beta-glucuronidasa también está comprendida entre
0,01 y 0,2 g/l, preferentemente de aproximadamente 0,05 g/l.
Otras características de los medios según la
invención se pondrán de manifiesto a partir de los siguientes
ejemplos.
Formulación CHROMagar O157 | en g/l |
agar | 15 |
peptona | 5 |
extracto de levadura | 2 |
extracto de carne | 1 |
NaCl | 5 |
5-bromo-6-cloro-3-indoxil-\alpha-galactósido | 0,05 |
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\beta-glucósido | 0,05 |
5-bromo-6-cloro-3-indoxil-\beta-glucurónido | 0,05 |
desoxicolato | 0,5 |
Se inocula el medio de cultivo con diferentes
cepas de bacterias, y a continuación se deja incubar 24 horas.
Mac Conkey Sorbitol | CHROMagar O157 | |||
Coliformes | rojo | azul | ||
E. coli típico | rojo | azul | ||
E. coli O157 | incoloro | violeta | ||
E. hermanii | incoloro | incoloro | ||
Hafnia alvei | incoloro | incoloro | ||
Proteus mirabilis | incoloro | incoloro | ||
Pseudomonas | incoloro | incoloro |
Se encuentran incluso unas cepas de E.
coli O157 que son sin embargo SLT+ (Shigella Like Toxine
positives) con el carácter sorbitol positivo y que son detectadas
por el medio de la invención, mientras que son falsamente negativas,
rojas sobre el medio Mac Conkey sorbitol, y por lo tanto erróneas.
El medio de la invención aporta por lo tanto no solamente una
ventaja en la especificidad (eliminación de falsos positivos) sino
que además aporta una ventaja en la sensibilidad (detección de cepas
falsamente negativas en medio Mac Conkey sorbitol) lo que es muy
importante.
Además, el medio de la invención, proporciona un
buen rendimiento en el crecimiento puesto que, salvo de manera
electiva para inhibir las bacterias gram positivas, el medio no se
basa principalmente en un principio de crecimiento selectivo.
La presente invención se refiere también un
procedimiento de puesta en evidencia de E. coli
enterohemorrágicas O157 en un muestreo, en el que se inocula el
medio de cultivo según la invención con el muestreo o un inoculado
de dicho muestreo, y se detecta a continuación en caso necesario la
presencia de E. coli enterohemorrágicas.
En el marco de la microbiología alimentaria, se
intenta demostrar por ejemplo que existen por lo menos diez
bacterias E. coli O157:H7 en un alimento. Se emplea un método
de crecimiento microbiano y a continuación eventualmente un método
de enriquecimiento por inmunocaptura IMS antes de la extensión, con
la ayuda de anticuerpos enganchados en unos glóbulos. Sin embargo,
este enriquecimiento no elimina varias bacterias que dan falsos
positivos en los medios de la técnica anterior. La utilización del
medio según la invención aporta por lo tanto una ventaja crucial
incluso si se utiliza este método IMS de enriquecimiento por
inmunocaptura.
Claims (10)
1. Medio de cultivo para el puesta en evidencia
de las bacterias E. coli enterohemorrágicas de serotipo O157,
caracterizado porque consiste, además de un medio de cultivo
para E. coli, en un único compuesto cromógeno sustrato de la
enzima \alpha-galactosidasa.
2. Medio de cultivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el compuesto cromógeno sustrato de la
enzima \alpha-galactosidasa se selecciona de entre
los derivados de
indoxil-\alpha-galactosida, cuyo
cromóforo se selecciona de entre los radicales indoxilo sustituidos
o no.
3. Medio de cultivo según la reivindicación
2,caracterizado porque el cromóforo del compuesto cromógeno
sustrato de la enzima \alpha-galactosidasa se
selecciona de entre los siguientes radicales:
5-bromo-6-cloro-3-indoxil-\alpha-galactósido,
y
6-cloro-3-indoxil-\alpha-galactósido.
4. Medio de cultivo según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la
concentración del compuesto cromógeno sustrato de la
\alpha-galactosidasa está comprendida entre 0,01 y
0,2 g/l, preferentemente de aproximadamente 0,05 g/l.
5. Procedimiento de puesta en evidencia de las
E. coli enterohemorrágicas O157 en un muestreo,
caracterizado porque se inocula el medio de cultivo según una
de las reivindicaciones 1 a 4, con el muestreo o el inoculado
proveniente de dicho muestreo y porque se detecta en caso necesario
la presencia de E. coli enterohemorrágicas.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque el medio de cultivo comprende un
compuesto cromógeno sustrato de la
\beta-glucosidasa y/o un compuesto cromógeno
sustrato de la \beta-glucuronidasa.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque el compuesto cromógeno sustrato de la
\beta-glucosidasa se selecciona de entre los
derivados del
indoxil-\beta-glucósido y/o el
compuesto cromógeno sustrato de la
\beta-glucuronidasa se selecciona de entre los
derivados de
indoxil-\beta-glucurónido, cuyo
cromóforo se selecciona de entre los radicales indoxilo sustituidos
o no.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el cromóforo del compuesto cromógeno
sustrato de la enzima \beta-glucosidasa y/o del
compuesto cromógeno sustrato de la
\beta-glucuronidasa se selecciona de entre los
radicales siguientes:
5-bromo-4-cloro-3-indoxilo,
5-bromo-3-indoxilo,
y
3-indoxilo.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque la concentración de los compuestos
cromógenos sustratos de la \beta-glucosidasa y/o
de la \beta-glucuronidasa está comprendida entre
0,01 y 0,2 g/l, preferentemente 0,05 g/l.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 5 a 9, caracterizado porque se emplea
inicialmente un método de crecimiento microbiano del muestreo y a
continuación eventualmente un método de enriquecimiento por
inmunocaptura IMS, antes de inocular el medio de cultivo.
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