KR101518214B1 - 엑스 갈과 세 가지 탄소원을 이용한 고감도 쉬겔라 소네이 선별 배지 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

엑스 갈과 세 가지 탄소원을 이용한 고감도 쉬겔라 소네이 선별 배지 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)를 선별하기 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 다른 식중독 균은 분해할 수 있으나, 쉬겔라속은 분해할 수 없는 D-솔비톨, D-자일로스 및 락토오즈로 이루어진 탄소원 혼합물과 쉬겔라속 중에서 쉬겔라 소네이는 분해할 수 있으나, 다른 쉬겔라속 균주는 분해할 수 없는 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드를 혼합하여 배지를 조성하여 균주를 배양하고, 콜로니 성상 확인을 통해 Vitek 이나 API 테스트를 수행하지 않아도 쉬겔라 소네이의 동정이 가능하다.

Description

엑스 갈과 세 가지 탄소원을 이용한 고감도 쉬겔라 소네이 선별 배지 조성물 및 이의 제조방법{Development of high sensitivity selective medium for detection of Shigella sonnei using a chromogenic substrate and three carbohydrates}
본 발명은 식중독 균의 하나로 잘 알려진 쉬겔라속 균 4종 중 쉬겔라 소네이만을 선별하여 검출할 수 있는 배지 조성물 및 이의 제조방법, 이를 이용한 쉬겔라 소네이 검출방법에 관한 것이다.
쉬겔라(Shigell, 이질균)는 유행성 또는 급성으로 발병하는 소화기 계통의 전염성 질환으로, 1898년 일본의 시가(Shiga)에 의해 분리되었으며, 수인성 병원균으로 분류되어 왔으나 최근에는 식품에서 유래하여 식중독을 일으키는 병원균으로 잘 알려져 있다. 쉬겔라속 균은 40 여종의 혈청형이 분리되어 있지만, 혈청학적 성상에 의해 균체 O항원에 의해 4 가지 혈청군으로 나눌 수 있으며, 각각의 혈청군은 쉬겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae), 쉬겔라 플렉시너리(Shigella flexneri), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii) 및 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)이다.
쉬겔라속 균은 운동성이 없는 통성혐기성의 그람 음성 간균으로 장내 세균과에 속하고 이질을 일으키는 병원균으로, 상기 병원균에 의해 발병되는 쉬겔라증(Shigellosis)은 우리나라에서 제1군 전염병으로 지정되어 관리되고 있다. 쉬겔라증의 증상으로는 고열과 복통을 동반하며, 잦은 점혈성 또는 장액성 설사, 메스꺼움, 구토 및 장염 등이 나타난다.
쉬겔라속 균주(Shigella spp.)에 의해 발병되는 식중독 중 약 70% 이상은 쉬겔라 소네이(S. sonnei)로부터 기인하며, 약 20% 가량이 쉬겔라 플렉시너리(S. flexneri)로부터 기인한다고 알려져 있는데, 선진국에서는 주로 쉬겔라 소네이에 의한 감염이 대부분을 차지하나, 위생상태가 불량한 개발도상국에서는 쉬겔라 플렉서너리가 감염의 주원인을 차지하고 있다[H. van der Zee, Handbook of Culture Media for Food Microbiology, vol 37, part 1 (2003) 209-214]. 국내에서도 1980년 대까지는 쉬겔라 플렉서너리가 감염의 주원인이었으나, 1991년 이후 쉬겔라 소네이에 의한 감염이 증가하여 현재 국내 쉬겔라증의 상당 부분은 쉬겔라 소네이에 인한 것이다. 쉬겔라속 균(Shigella spp .)은 적은 양의 균수로도 질병 유발이 가능하며, 식품에서 쉬겔라속 균을 분리하는 것은 다른 병원성 장내 세균보다 어렵다고 알려져 있으며, 특히 쉬겔라속 간의 구별은 더 용이하지 않다.
미국 FDA Bacteriological analytical manual에는 쉬겔라 부용(Shigella broth)에서 쉬겔라속 균을 증균 배양시킨 후 MacConkey agar(MAC)에서 분리 배양하는 방법이 권고되어 있으며, 우리나라 질병관리본부 법정 전염병 실험실 진단지침(13)에서는 쉬겔라속 균을 식품에서 분리 시 MAC 또는 Salmonella Shigella agar(SSA) 사용을 권고하고 있고, 그 외에 Tergitol-7 agar(T7), Xylose lysine desoxycholate agar(XLD), Desoxycholate citrate agar(DCA) 및 Hektone Enteric agar(HEA)등을 사용하여 의심 집락을 선별하고 있으나, 상기 배지들은 쉬겔라속 균에 대한 낮은 선택성을 가지며, 특히 쉬겔라속(Shigella spp.) 간의 구별이 되지 않아, 반드시 Viteck system 이나 API kit를 이용한 생화학테스트를 거쳐 동정해야한다는 문제점이 있다. 한국 공개특허 제2013-0135998호에서는 쉬겔라속 중 쉬겔라 소네이만을 선택적으로 검출하기 위하여 쉬겔라 소네이의 355 bp 크기의 단편을 증폭하는 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 증폭을 통해 쉬겔라 소네이 만을 선택적으로 검출하고 있으나, 상기 방법은 유전자 증폭 장치 등의 설비를 필요로 하는 문제점이 있어, 검출을 위한 접근성이 떨어진다는 단점이 있다.
따라서, 유전자 분석장비 없이도 손쉽게 쉬겔라와 다른 장내 세균 간의 검출이 용이하며, 특히 쉬겔라속 4종 중 쉬겔라 소네이만을 선택적으로 검출할 수 있는 새로운 배지 조성물의 개발이 필요한 시점이다.
본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 쉬겔라속(Shigella spp.) 4종 중에서 쉬겔라 소네이만을 선별할 수 있는 쉬겔라 소네이 선별용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 쉬겔라 소네이 선별 배지의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 쉬겔라 소네이 선별 배지를 이용한 쉬겔라 소네이 검출방법을 제공하는 것이다.
상기한 과제를 달성하기 위해서 본 발명은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)를 선별하기 위한 배지 조성물로서, 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠; D-솔비톨; D-자일로스; 및 락토오즈;를 포함하는 쉬겔라 소네이 선별용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 배지 조성물은 뉴트랄 레드(neutral red), 육추출물(beef extract), 카시톤(casitone), 염화나트륨, 아가(agar) 및 담즙산염(bile salt) 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 배지 조성물은 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠 0.0005 내지 0.01 중량%, D-솔비톨 0.05 내지 3 중량%, D-자일로스 0.05 내지 3 중량%, 락토오즈 0.05 내지 3 중량%, 뉴트랄 레드 0.0005 내지 0.01 중량%, 육추출물 0.05 내지 3 중량%, 카시톤 0.05 내지 5 중량%, 염화나트륨 0.05 내지 3 중량%, 아가 0.5 내지 7 중량%, 담즙산염 0.005 내지 0.5 중량% 및 증류수 잔부를 포함하여 구성될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 배지 조성물은 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠; D-솔비톨; D-자일로스 및 락토오즈를 증류수에 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물을 70 내지 100 ℃로 5 내지 60 분간 교반하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있으며,
상기 혼합물은 뉴트랄 레드(neutral red), 육추출물(beef extract), 카시톤(casitone), 염화나트륨, 아가(agar) 및 담즙산염(bile salt) 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
쉬겔라 소네이의 선별적 검출은 상기 방법으로 제조된 쉬겔라 소네이 선별배지에 병원성 미생물을 분주하고, 35 내지 38 ℃에서 12 내지 36시간 동안 배양하는 단계; 및 배지에 형성된 콜로니의 성상을 관찰하는 단계;를 포함하여 수행함으로써 검출될 수 있는데, 쉬겔라 소네이는 중앙은 청록색 집락을 나타내고 집락 가장자리는 반투명 또는 투명한 콜로니를 형성함으로 육안으로 쉽게 구별이 가능하다.
본 발명은 식품 및 환경에 상재하고 있는 쉬겔라 소네이를 선별적으로 검출할 수 있는 선택배지를 제공함으로써 쉬겔라 소네이와 다른 쉬겔라 종의 구별이 가능하며, 종래의 배지에서 쉬겔라속과 구별하기가 용이하지 않았던 슈도모나스, 프로테우수, 에드워드시엘라, 세라티아, 하프니아 및 모르가넬라 종 등과도 구분할 수 있어 균 동정의 판단 오류를 줄일 수 있다. 또한 균 동정시간을 단축시킬 수 있으며, 추가적인 Vitek 이나 API 테스트를 수행하지 않아도 쉬겔라 소네이의 동정이 가능하며, 오토클레이브나 유전자 증폭장치 같은 기기를 필요로 하지 않아 비용을 절감할 수 있어 경제적이고, 간이 실험실에서도 빠르고 정확성 높게 쉬겔라 소네이의 검출이 가능하여 산업현장에서 적용이 용이하다.
도 1은 본 발명에 따른 선별 배지에서 배양된 쉬겔라 소네이의 콜로니 형상이다.
도 2는 본 발명에 따른 선별 배지에서 배양된 쉬겔라 플랙시너리, 쉬겔라 보이디 및 쉬겔라 디젠테리 혼합 균주의 콜로니 형상이다.
도 3은 본 발명에 따른 선별 배지에서 배양된 Edwardsiella , Morganella , Proteus 및 Pseudomonas 혼합 균주의 콜로니 형상이다.
도 4는 본 발명에 따른 선별 배지에서 배양된 nterobacter aerogenes , Hafnia alvei , Klebsiella pneumoniae , Salmonella Typhimurium, Salmonella enteritidis , Serratia marcescens , Yersinia enterocolitica, Citrobacter freundii , Cronobacter muytjensii , Cronobacter sakazakii, Enterobacter cloacae, Escherichia coli 및 Escherichia coli O157:H7 혼합 균주의 콜로니 형상이다.
도 5는 본 발명에 따른 선별 배지를 이용하여 병원성 미생물 53종을 혼합하여 배양한 콜로니의 형상이다.
도 6은 본 발명에 따른 선별 배지를 이용하여 병원성 미생물 53종의 콜로니를 비교한 이미지이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 쉬겔라속(Shigella spp.) 4종 중에서 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)를 선별할 수 있는 쉬겔라 소네이 선별용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 배지 조성물은 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside,X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠, D-솔비톨, D-자일로스 및 락토오즈를 포함한다.
본 발명에 따르면, 쉬겔라속 균주(Shigella spp.)는 탄소원인 D-솔비톨, D-자일로스 및 락토오즈 중 어느 것도 분해하지 못하는 특성을 나타낸다. 이에 D-솔비톨, D-자일로스 및 락토오즈를 포함시킨 배지에 식중독 유발 병원성 미생물을 분주하여 배양함으로써, 상기 D-솔비톨, D-자일로스 및 락토오즈 중에서 어느 하나라도 분해하는 균주와 상기 D-솔비톨, D-자일로스 및 락토오즈 중 어느 것도 분해하지 못하는 균주, 즉, 쉬겔라속을 구분할 수 있으며,
쉬겔라속 4종 중에서, 쉬겔라 소네이는 베타-갈락토시데이즈를 생산하는 특성을 나타내나, 다른 쉬겔라속 3종인 쉬겔라 플렉시너리, 쉬겔라 보이디 및 쉬겔라 디젠테리는 상기 베타-갈락토시데이즈를 생산하지 못하는 특성을 나타냄으로, 상기 베타-갈락토시데이즈의 생산 유무를 이용하여 쉬겔라속 4종 중에서 쉬겔라 소네이를 선별할 수 있다.
본 발명에 따르면, 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 또는 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(X-gal)는 락토오즈(lactose)의 유사체(analogue)로, 베타-갈락토시데이즈에 의해 락토오즈처럼 인식되어 분해되는데, 분해 시 청록색을 나타내게 된다. 즉, 상기 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 또는 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(X-gal)가 있는 배지에 베타-갈락토시데이즈를 생산하는 쉬겔라속 균주들이 배양되면, 쉬겔라 소네이는 청록색 콜로니를 형성하며, 쉬겔라 소네이를 제외한 다른 쉬겔라속 균주는 투명하거나 색이 없는 콜로니를 형성하므로 쉬겔라속 중에서 쉬겔라 소네이를 선별할 수 있다.
본 발명에 따르면 상기 쉬겔라 소네이 선별용 배지 조성물은 뉴트랄 레드(neutral red), 육추출물(beef extract), 카시톤(casitone), 염화나트륨, 아가(agar) 및 담즙산염(bile salt) 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 뉴트랄 레드는 pH에 따라 색이 변하는 지시약으로, 증식하면서 산을 생산하는 균주를 식별할 수 있어 바람직하며, 상기 육추출물은 아미노산, 펩티드, 유기산류, 인산 등의 풍부하여 균주배양의 영양원으로 바람직하고, 카시톤은 비타민과 트립토판이 파괴되지 않은 채 잔존하므로 배지의 질소원으로 제공할 수 있어 바람직하다. 상기 담즙산염은 그람양성균을 억제할 수 있으며, Escherichia coil과 같은 유당을 발효하는 균주를 적색 집락을 형성하도록 하여 유당발효 균주를 감별할 수 있으므로 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 쉬겔라 소네이 선별용 배지 조성물의 바람직한 조성비는 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠 0.0005 내지 0.01 중량%, D-솔비톨 0.05 내지 3 중량%, D-자일로스 0.05 내지 3 중량%, 락토오즈 0.05 내지 3 중량%, 뉴트랄 레드 0.0005 내지 0.01 중량%, 육추출물 0.05 내지 3 중량%, 카시톤 0.05 내지 5 중량%, 염화나트륨 0.05 내지 3 중량%, 아가 0.5 내지 7 중량%, 담즙산염 0.005 내지 0.5 중량% 및 증류수 잔부를 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 쉬겔라 소네이 선별 배지는 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠; D-솔비톨; D-자일로스 및 락토오즈를 증류수에 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물을 70 내지 100 ℃로 5 내지 60 분간 교반하는 단계;를 포함하여 수행함으로써 제조될 수 있다.
상기 혼합물은 뉴트랄 레드(neutral red), 육추출물(beef extract), 카시톤(casitone), 염화나트륨, 아가(agar) 및 담즙산염(bile salt) 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있으며,
상기 혼합물의 혼합비율은 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠 0.0005 내지 0.01 중량%, D-솔비톨 0.05 내지 3 중량%, D-자일로스 0.05 내지 3 중량%, 락토오즈 0.05 내지 3 중량%, 뉴트랄 레드 0.0005 내지 0.01 중량%, 육추출물 0.05 내지 3 중량%, 카시톤 0.05 내지 5 중량%, 염화나트륨 0.05 내지 3 중량%, 아가 0.5 내지 7 중량%, 담즙산염 0.005 내지 0.5 중량% 및 증류수 잔부로 구성될 수 있다.
일반적인 배지 제조방법은 배지 조성물을 오토클레이브를 사용하여 고온 및 고압 조건에서 처리하는 단계를 포함하나, 본 발명은 대기압 분위기 하에서 70 내지 100 ℃로 5 내지 60 분간 교반하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 배지의 제조 시, 상기 온도범위를 초과하면 온도가 너무 높아 자일로스 또는 락토오즈가 열에 의해 파괴되므로 바람직하지 않으며, 온도가 상기 범위 미만이면 미생물이 멸균되지 않아 오염된 배지를 사용할 수 있어 바람직하지 않다. 상기 교반 시간이 상기 범위 미만이면 배지 조성물이 충분히 혼합되기 어려우며, 상기 교반 시간이 상기 범위를 초과하면 배지의 성분이 변성될 수 있어 바람직하지 않다.
본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 쉬겔라 소네이 선별 배지에 병원성 미생물을 분주하는 단계; 35 내지 38 ℃에서 12 내지 36시간 동안 배양하는 단계; 및 배지에 형성된 콜로니의 성상을 관찰하는 단계;를 포함하는 쉬겔라 소네이 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 선별 배지를 이용하면, 쉬겔라 소네이는 중앙은 청록색 집락을 나타내고 집락 가장자리는 반투명 또는 투명한 콜로니를 형성하여 다른 균주와 다른 성상을 나타냄으로 쉽게 구별이 가능하여 균 동정의 판단오류를 줄일 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 따르면, 쉬겔라 소네이를 제외한 쉬겔라속 3종은 투명하거나 색이 없는 콜로니를 형성하며, 종래의 배지에서 쉬겔라속과 구별하기가 용이하지 않았던 슈도모나스, 프로테우수, 에드워드시엘라, 세라티아, 하프니아 및 모르가넬라 종과도 구별이 가능하고, 그외 장내 세균 및 식중독 세균 등은 보라색, 핑크색, 연보라색 등의 콜로니를 형성하며, 그람 양성균은 억제하는 특성을 가진다. 따라서 다양한 균주가 혼합되어 배양된 배지에서도 쉬겔라 소네이를 확인할 수 있어 Viteck system 이나 API kit를 이용한 생화학테스트를 거치지 않아도 쉬겔라 소네이를 검출할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 증균배지의 제조
탈이온수 1 리터에 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(X-gal) 0.05 g, D-솔비톨 5 g, D-자일로스 5 g, 락토오즈 5 g, 뉴트랄 레드(neutral red) 0.03 g, 육추출물(beef extract) 5 g, 카시톤(casitone) 10 g, 염화나트륨 5 g, 아가(agar) 15 g 및 담즙산염(bile salt) 0.5 g을 혼합하여 배지 조성물을 제조하였다. 상기 배지 조성물을 95 ℃에서 20 분간 교반 시켜 멸균 후 실험에 사용하였다.
제조예 1.
D-솔비톨, D-자일로스 및 락토오즈를 첨가하지 않은 것을 제외하고, 실시예 1의 방법으로 증균 배지를 제조하였다. (X-gal 첨가)
제조예 2.
X-gal, D-자일로스 및 락토오즈 첨가하지 않은 것을 제외하고, 실시예 1의 방법으로 증균 배지를 제조하였다. (D-솔비톨 첨가)
제조예 3.
X-gal, D-솔비톨 및 락토오즈를 첨가하지 않은 것을 제외하고, 실시예 1의 방법으로 증균 배지를 제조하였다. (D-자일로스 첨가)
제조예 4.
X-gal, D-솔비톨 및 D-자일로스를 첨가하지 않은 것을 제외하고, 실시예 1의 방법으로 증균 배지를 제조하였다. (락토오즈 첨가)
시험예
증균 배지의 성장 특성을 조사하기 위해 사용된 균주는 쉬겔라 소네이 10종(ATCC 9290, KCTC 2518, NCCP 10875, NCCP 11204, NCCP 11220, NCCP 11221, NCCP 14743, 10304-98, 10305-98, 6129), 쉬겔라 플렉시너리 6종(ATCC 9199, F1852, F340-MS1, F3414, F141, F5207) 쉬겔라 보이디 2종(KCCM 41649, KCCM 41650), 쉬겔라 디젠테리 2종(NCCP 10344, NCCP 10705)과 Pseudomonas putida ATCC 21025, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692, Pseudomonas oleovorans ATCC 8062, Edwardsiella tarda NCCP 10364, Morganella morganii NCCP 10921, Proteus mirabilis NCCP 10399, Citrobacter freundii ATCC 8090, Yersinia enterocolitica ATCC 23715, Salmonella Typhimurium ATCC 19585, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Klebsiella pneumoniae 2종(ATCC 13882, ATCC 13883) Cronobacter sakazakii 3종(ATCC 12868, ATCC 29004, ATCC 29544), Cronobacter muytjensii ATCC 51329, Enterobacter aerogenes 3종(ATCC 13048, ATCC 15038, ATCC 35028) Enterobacter cloacae 2종(ATCC 7256, ATCC 13047), Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli O157:H7 3종(ATCC 43889, ATCC 43890, ATCC 43894), Hafnia alvei 3종 (ATCC 29926, ATCC 29927, ATCC 13337), Serratia marcescens NCCP 10219, Staphylococcus aureus ATCC 27664, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Bacillus cereus ATCC 11778, Bacillus subtilis ATCC 9372으로 총 53종의 균주를 이용하여 실시하였다.
시험예 1. 균주의 탄소원 3종 및 X- gal 분해 특성 조사
상기 53종의 균주를 이용하여 탄소원 3종(D-솔비톨, D-자일로스 및 락토오즈)과 X-gal에 대한 분해 특성을 조사하였으며, 동일속 균주에 대한 결과는 같이 나타내었다. 하기 표에서 +는 분해, -는 비분해, ±는 분해 또는 비분해를 의미한다. 표 1은 쉬겔라속 균주의 결과이며, 표 2는 종래 쉬겔라 선별배지를 이용할 때 쉬겔라와 구분이 어려웠던 균주들의 결과이며, 표 3은 장내 세균 및 그람 음성 식중독 균주의 결과이다.
구분 제조예1 제조예2 제조예3 제조예4
X-gal D-솔비톨 D-자일로스 락토오즈
Shigella sonnei + - - -
Shigella flexneri - - - -
Shigella boydii - - - -
Shigella dysenteria - - - -
구분 제조예1 제조예2 제조예3 제조예4
X-gal D-솔비톨 D-자일로스 락토오즈
Edwardsiella tarda - - - -
Morganella morganii - - - -
Proteus mirabilis - - - +
Pseudomonas aeruginosa - - - -
Pseudomonas oleovorans - - - -
Pseudomonas putida - - - +
구분 제조예1 제조예2 제조예3 제조예4
X-gal D-솔비톨 D-자일로스 락토오즈
Enterobacter aerogenes ± + + +
Hafnia alvei + - - +
Klebsiella pneumoniae + + + +
Salmonella Typhimurium - + - +
Salmonella enteritidis - + - +
Serratia marcescens - + - -
Yersinia enterocolitica - + - -
Citrobacter freundii + + + +
Cronobacter muytjensii + - + +
Cronobacter sakazakii + - + +
Enterobacter cloacae + + + ±
Escherichia coli + + + +
Escherichia coli O157:H7 + - + +
상기 표 1 내지 표 3을 통해 X-gal을 분해하면서 동시에 탄소원 3종(D-솔비톨, D-자일로스 및 락토오즈)는 분해하지 않는 균주는 쉬겔라 소네이가 유일한 것을 확인하였다.
시험예 2. 균주의 콜로니 성상확인
본 발명에 따른 선택배지에 상기 균주 53종을 분주한 뒤 37 ℃에서 20 시간 동안 각각 배양하여 각 균주의 콜로니 성상을 확인하였으며, 이를 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.
균주종류 콜로니성상
Shigella sonnei ATCC 9290


중앙: 청록색집락
외곽: 반투명/투명
Shigella sonnei KCTC 2518
Shigella sonnei NCCP 10875
Shigella sonnei NCCP 11204
Shigella sonnei NCCP 11220
Shigella sonnei NCCP 11221
Shigella sonnei NCCP 14743
Shigella sonnei 10304-98
Shigella sonnei 10305-98
Shigella sonnei 6129
균주종류 콜로니성상
Shigella flexneri ATCC 9199


투명 또는 반투명
(무색)
Shigella flexneri F1852
Shigella flexneri F340-MS1
Shigella flexneri F3414
Shigella flexneri F141
Shigella flexneri F5207
Shigella boydii KCCM 41649
Shigella boydii KCCM 41650
Shigella dysenteria NCCP 10344
Shigella dysenteria NCCP 10705
Pseudomonas putida ATCC 21025

투명 또는 반투명
(무색)
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692
Pseudomonas oleovorans ATCC 8062
Edwardsiella tarda NCCP 10364
Morganella morganii NCCP 10921
Proteus mirabilis NCCP 10399
Citrobacter freundii ATCC 8090








핑크, 보라
또는 연보라색
Yersinia enterocolitica ATCC 23715
Salmonella Typhimurium ATCC 19585
Salmonella enteritidis ATCC 13076
Klebsiella pneumoniae ATCC 13882
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Cronobacter sakazakii ATCC 12868
Cronobacter sakazakii ATCC 29004
Cronobacter sakazakii ATCC 29544
Cronobacter muytjensii ATCC 51329
Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Enterobacter aerogenes ATCC 15038
Enterobacter aerogenes ATCC 35028
Enterobacter cloacae ATCC 7256
Enterobacter cloacae ATCC 13047
Escherichia coli ATCC 25922
Escherichia coli O157:H7 ATCC 43889
Escherichia coli O157:H7 ATCC 43890
Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894
Hafnia alvei ATCC 29926
Hafnia alvei ATCC 29927
Hafnia alvei ATCC 13337
Serratia marcescens NCCP 10219
Staphylococcus aureus ATCC 27664
억제
Listeria monocytogenes ATCC 19115
Bacillus cereus ATCC 11778
Bacillus subtilis ATCC 9372
표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 쉬겔라 소네이는 모두 청록색을 나타내는 콜로니가 형성되었으며, 상기 쉬겔라 소네이가 성장된 배지를 촬영하여 도 1에 나타내었다.
한편, 쉬겔라 플렉시너리, 쉬겔라 보이디 및 쉬겔라 디젠테리를 모두 혼합하여 본 발명의 실시예 1에 따른 배지에서 37 ℃에서 20 시간 동안 배양한 결과를 도 2에 나타내었다. 쉬겔라 소네이를 제외한 쉬겔라속 3종은 모두 반투명 또는 투명의 형상을 나타내었으며, 쉬겔라 소네이와 확연히 구별이 되었다.
종래의 MacConkey agar(MAC) 등의 배지에서 쉬겔라속과 구분이 불가능하였던 Edwardsiella, Morganella , Proteus 및 Pseudomonas 균주를 모두 혼합하여 본 발명의 실시예 1에 따른 배지에서 37 ℃에서 20 시간 동안 배양한 결과를 도 3에 나타내었다. 본 발명에 따른 선별 배지를 통해, 쉬겔라 소네이 뿐만 아니라 쉬겔라속과도 다른 성상을 나타내는 콜로니가 생성되는 것을 확인하였다.
Enterobacter aerogenes , Hafnia alvei , Klebsiella pneumoniae , Salmonella Typhimurium, Salmonella enteritidis , Serratia marcescens , Yersinia enterocolitica, Citrobacter freundii , Cronobacter muytjensii , Cronobacter sakazakii, Enterobacter cloacae , Escherichia coli 및 Escherichia coli O157:H7를 혼합하여 본 발명의 실시예 1에 따른 배지에서 37 ℃에서 20 시간 동안 배양한 결과를 도 4에 나타내었다. 본 발명에 따른 선별 배지를 통해 상기 균주들은 보라색, 옅은 보라, 핑크색 등의 콜로니가 생성되는 것을 확인하였다.
균주 53종을 모두 혼합하여 본 발명의 실시예 1에 따른 배지에서 37 ℃에서 20 시간 동안 배양한 결과를 도 5에 나타내었다. 여러 균주들 속에서 쉬겔라 소네이가 다른 균주와 확실히 구분되는 특이적 콜로니 성상을 나타내는 것을 확인하였으며, 그람 양성균은 저해되었다.
시험예 3. 실시예 1의 배지에 대한 쉬겔라 소네이의 스트레스 회복력 측정
쉬겔라 소네이는 500 여개의 적은 셀 만으로도 감염을 유발하는 특성이 있으므로, 쉬겔라 소네이를 검출하기 위한 선별 배지는 적은 수의 균에도 검출할 수 있도록 증균 성능이 우수하여야 한다. 본 발명에 따른 실시예 1의 배지에 대한 성능을 측정하기 위하여 쉬겔라 소네이의 열 및 산 스트레스 회복력 실험을 각각 수행하였다.
시험예 3.1 열처리
실시예 1의 배지에 쉬겔라 소네이를 배양한 뒤, 60 ℃에서 2분간 열처리하였으며, 대조군으로 영양배지인 TSA를 사용하여 회복 세포 수를 비교하였으며, 하기 표 6에 나타내었다.
시험예 3.1 산처리
실시예 1의 배지에 쉬겔라 소네이를 배양한 뒤, pH 3.5인 시트릭산 버퍼용액에서 10분간 산처리하였으며, 대조군으로 영양배지인 TSA를 사용하여 회복 세포 수를 비교하였으며, 하기 표 6에 나타내었다.
구분

 log CFU/ml 회복된 세포 수
대조군 시험예 3.1 시험예 3.2
무처리 열처리 산처리
영양배지 (TSA) 6.33±0.04 6.10±0.21 6.26±0.02
실시예 1 6.15±0.17 5.50±0.40 5.52±0.13
상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 쉬겔라 소네이 선별 배지에서 열 및 산 스트레스를 받은 쉬겔라 소네이 균주의 회복력이 대조군인 영양배지와 비교하여 우수한 성능을 나타내는 것을 확인하였다.
시험예 4. 실시예 1의 선별력 측정
본 발명에 따른 실시예 1의 배지의 선별력을 측정하였으며 이를 하기 표 7에 나타내었다.
구분 균주 수 Specificity(%) 균주 수 Sensitivity
(%)
True-negative False-positive False-negative True-positive
실시예 1 39 0 100 0 10 100
상기 표 7에서 Specificity는 타겟외 균주가 타겟균주인 쉬겔라 소네이의 성상을 얼마나 나타내는지 확인하는 수치로, 상기 타겟외 균주로는 본 발명에서 사용된 총 53중 중 쉬겔라 소네이 10종 및 그람양성균 4종을 제외한 39종이 이용되었으며, 실시예 1의 배지를 사용하여 확인하였다. 수치계산법은 하기 식(1)과 같다.
True-negative/(True-negative+False-positive)×100 - 식(1)
한편, Sensitivity는 타겟균주인 쉬겔라 소네이가 예상되는 콜로니 성상(청록색)을 얼마나 나타내는지 확인하는 수치로 본 발명에서 사용된 쉬겔라 소네이 10종을 이용하여 확인하였으며, 계산법은 하기 식(2)와 같다.
True-positive/(False-negative+True-positive)×100 - 식(2)
상기 식(1), (2) 및 표 7에서, positive는 쉬겔라 소네이의 성상인 청록색의 콜로니를 의미하며, negative는 청록색의 콜로니를 제외한 색상 또는 성상의 콜로니, 즉 연보라, 핑크, 보라, 무색 등 쉬겔라 소네이의 예상되는 성상 이외의 성상을 의미한다.
True-negative는 negative인 콜로니 중에서 쉬겔라 소네이를 제외한 나머지 균주들인 경우를 의미하며,
False-positive는 positive인 콜로니 중에서 쉬겔라 소네이가 아닌 균주들인 경우를 의미하고,
False-negative는 negative인 콜로니 중에서 쉬겔라 소네이인 경우를 의미하며,
True-positive는 positive인 콜로니 중에서 쉬겔라 소네이인 경우를 의미한다.
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 쉬겔라 소네이 선별용 배지는 쉬겔라 소네이의 선별력이 우수한 것을 알 수 있다.

Claims (8)

  1. 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)를 선별하기 위한 배지 조성물로서, 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠; D-솔비톨; D-자일로스; 및 락토오즈;를 포함하는 쉬겔라 소네이 선별용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 뉴트랄 레드(neutral red), 육추출물(beef extract), 카시톤(casitone), 염화나트륨, 아가(agar) 및 담즙산염(bile salt) 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 쉬겔라 소네이 선별용 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠 0.0005 내지 0.01 중량%, D-솔비톨 0.05 내지 3 중량%, D-자일로스 0.05 내지 3 중량%, 락토오즈 0.05 내지 3 중량%, 뉴트랄 레드 0.0005 내지 0.01 중량%, 육추출물 0.05 내지 3 중량%, 카시톤 0.05 내지 5 중량%, 염화나트륨 0.05 내지 3 중량%, 아가 0.5 내지 7 중량%, 담즙산염 0.005 내지 0.5 중량% 및 증류수 잔부를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 쉬겔라 소네이 선별용 배지 조성물.
  4. 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠; D-솔비톨; D-자일로스 및 락토오즈를 증류수에 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
    상기 혼합물을 70 내지 100 ℃로 5 내지 60 분간 교반하는 단계;를 포함하는 쉬겔라 소네이 선별 배지의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 혼합물은 뉴트랄 레드(neutral red), 육추출물(beef extract), 카시톤(casitone), 염화나트륨, 아가(agar) 및 담즙산염(bile salt) 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 쉬겔라 소네이 선별 배지의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 혼합물은 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토시드 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-베타-D-갈락토피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, X-gal) 중에서 선택되는 1종 이상의 크로모젠 0.0005 내지 0.01 중량%, D-솔비톨 0.05 내지 3 중량%, D-자일로스 0.05 내지 3 중량%, 락토오즈 0.05 내지 3 중량%, 뉴트랄 레드 0.0005 내지 0.01 중량%, 육추출물 0.05 내지 3 중량%, 카시톤 0.05 내지 5 중량%, 염화나트륨 0.05 내지 3 중량%, 아가 0.5 내지 7 중량% 및 담즙산염 0.005 내지 0.5 중량%을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 쉬겔라 소네이 선별 배지의 제조방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 쉬겔라 소네이 선별 배지에 병원성 미생물을 분주하고, 35 내지 38 ℃에서 12 내지 36시간 동안 배양하는 단계; 및 배지에 형성된 콜로니의 성상을 관찰하는 단계;를 포함하는 쉬겔라 소네이 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서, 쉬겔라 소네이는 중앙은 청록색 집락을 나타내고 집락 가장자리는 반투명 또는 투명한 콜로니를 형성하는 것을 특징으로 하는 쉬겔라 소네이 검출방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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