CN102586390A - 用于特异地检测抗性生物的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及两种培养基的组合用于区分生物样品中的至少3组微生物的用途，所述生物样品包含：第一组微生物，属于第一个微生物分类群并包含针对第一种治疗的至少第一种抗性机制；第二组微生物，属于第二个微生物分类群并包含针对第二种治疗的至少第二种抗性机制；第三组微生物，其对所述第一种和第二种治疗没有抗性，所述两种培养基的组合包括：a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；b.至少两种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物；c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性。

Description

用于特异地检测抗性生物的培养基
本申请是申请日为2006年2月9日、申请号为200680004645.6、发明名称为“用于特异地检测抗性生物的培养基”的发明专利申请的分案申请。
本发明领域是通过生物化学方法的微生物学分析的领域，并且特别是检测和鉴定微生物例如尤其是细菌或酵母的领域。
细菌对抗生素的抗性是主要的公共卫生问题。感染性微生物对治疗的抗性与抗感染分子同时形成，并且目前代表了治疗中的主要障碍。这种抗性负责多种问题的根源，包括实验室检测的困难，有限的治疗选择和对临床结果的有害影响。
特别地，在过去20年中致病性细菌抗性的快速且抑制不住的增加代表了医学中的主要流行问题之一。由这些生物引起的感染是住院时间延长的原因，并且与治疗失败后的高发病率和死亡率相关。
在一个菌株中可以同时涉及几种抗性机制。它们一般分为3类：抗生素不能渗透到细菌中，通过细菌的酶系统来使抗生素失活或排出，以及细菌靶和抗生素之间缺乏亲和力。
就所涉及的物种和抗生素的数目而言，酶促失活是获得性抗性的最常见的机制。因此，染色体C类头孢菌素酶目前构成革兰氏阴性菌中占优势的抗性机制之一，革兰氏阴性菌表达对头孢菌素类具有抗性的此类酶。类似地，β-内酰胺酶是由某些细菌表达的酶，其能够水解β-内酰胺环(其是β-丙氨酸类家族的抗生素的基本结构)的C-N键，从而产生在微生物学上失活的产物。已开发了几种β-内酰胺酶抑制剂(BLI)，例如克拉维酸(CA)、三唑巴坦和舒巴坦，以增加抗微生物活性并扩展与之相关的β-丙氨酸类的谱系。由于这些抑制剂充当β-内酰胺酶的自杀底物，因而防止了抗生素的酶促降解并允许它们有效对抗最初有抗性的细菌。然而，由于菌株持续暴露于抗生素压力，所以细菌通过β-内酰胺酶的连续且动态的产生而表现出它们的适应能力，所述β-内酰胺酶在形成新分子的同时进行进化。
因此，产生高水平染色体C类头孢菌素酶(céphalosporinaseschromosomiques de classe C haut niveau)的革兰氏阴性细菌(称为Case HN细菌)，以及产生广谱β-内酰胺酶(β-lactamases àspectre étendu)的革兰氏阴性细菌(因而称为BLSE细菌)，已成为日益增加的威胁，特别是因为所涉及的细菌种类数目日益增加。CaseHN和BLSE细菌不仅对基于第1代和第2代青霉素类和头孢菌素类的治疗有抗性，还对第3代头孢菌素类(C3G)(头孢噻肟CTX、头孢他啶CAZ、头孢泊肟CPD、头孢曲松CRO)和单环内酰胺类(氨曲南ATM)有抗性。相反地，7α-甲氧基头孢菌素类(头霉素：头孢西丁、头孢替坦)和碳青霉烯类(亚胺培南、美罗培南、厄他培南(ertapenem))一般保持了其活性。BLSE被β-内酰胺酶抑制剂(BLI)抑制，这使得能够将它们与其他头孢菌素酶区别开。
因此，这些细菌最常同时表现出针对几种治疗的抗性，这对于建立相关治疗和避免治疗失败造成了困难。因此，大肠杆菌(Escherichiacoli)可以是Case HN和BLSE。此外，因为BLSE阳性肠细菌有通过菌株的克隆传递或质粒结合转移而散布抗性的趋势，所以它们代表了传染控制方面的问题。在大多数研究中，大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)仍是最常见的产生BLSE的物种。然而，几年以来，BLSE已大大扩展了它们的宿主物种的名单。因为，许多肠细菌和非发酵型革兰氏阴性杆菌(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))物种也已报道为BLSE的生产者。
除了这些BLSE细菌外，还可以提及的是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，它也是形成了许多抗性机制的致病性细菌，例如对于甲氧西林、青霉素、四环素、红霉素、万古霉素的抗性。屎肠球菌(Enterococcus faecium)是在医院环境中发现的另一种多重抗性的细菌，它可以抵抗青霉素、万古霉素和利奈唑胺。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)通常对异烟肼和利福平具有抗性。其他病原体提供了某些抗性，例如沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和链球菌属(Streptococcus)。
因此，从公共卫生观点看来，能够尽快地鉴定此类微生物和此类抗性机制是非常必要的。
一般地，对治疗有抗性的微生物的寻找按照下列步骤进行：
1.获取可能包含所述微生物的生物样品；
2.接种并孵育培养基(18-48小时)以诱导微生物的指数生长；
3.在培养基上定位潜在重要的微生物的菌落；
4.表征微生物物种；
5.鉴定所分析的微生物的抗性机制、它们的生物学意义、和任选地还有合适的疗法。
这一系列步骤涉及在获取可能包含所述微生物的样品和指出适合于患者的治疗之间的大量时间。此外，使用者通常必须人工地执行将微生物从第一种培养基转移至第二种培养基的步骤，这可以引起特别是污染问题，以及对操作者的健康造成危险。
例如，为了检测在大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌菌株中广谱β-内酰胺酶(BLSE)的存在，可以使用如Jacoby和Han的出版物(J ClinMicrobiol.34(4)：908-11，1996)中所描述的扩散技术，然而这并不给出用于鉴定所测试的菌株的任何信息；可以确定该细菌是否是BLSE生产菌，但不能区分此类细菌是大肠杆菌还是肺炎克雷伯氏菌。
代谢底物也可用于检测BLSE或Case HN的存在。在这方面，AES实验室提出了在组合了含有头孢噻肟的Drigalski培养基和含有头孢他啶的MacConkey培养基的双板(bi
Figure BDA0000144887900000031
)中的培养基。Drigalski和MacConkey培养基使得能够揭示乳糖的酸化作用，这是在非常大量的肠细菌种类中存在的代谢作用。然而，此类培养基仅仅使得能够区分抗性细菌和非抗性细菌，而并不使得能够区分表达BLSE的细菌和表达Case HN的细菌。这种培养基也不能鉴定特定的细菌种类，和不能例如将大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌区别开来。
在检测除BLSE外的抗性机制的情况下，可以提及专利申请EP0954560，它涉及通过将万古霉素与生色培养基相组合来寻找万古霉素抗性肠球菌，所述生色培养基揭示两种酶活性(β-葡糖苷酶和吡咯烷酮基-芳基酰胺酶)。然而，这种生色培养基只使得能够确定所述万古霉素抗性菌株是否属于肠球菌属(Enterococcus)，但并不使得能够鉴定所涉及的物种或抗性机制，特别是如果涉及获得性或野生型抗性。
因此，表征微生物物种以及随后鉴定其对治疗的抗性是长时间和费力的。如果实验室给予临床医师阳性检出结果，而分离物事实上不含抗性微生物，那么这可以导致无用的和不适当的治疗。相反地，如果不传达后来被确认的阳性检出结果，则会使患者的隔离(和可能地，合适的治疗)这样的布置延迟一天。这显示需要快速和可靠的确认测试。
因此，本发明提出通过提供新型诊断工具来改善现有技术，所述诊断工具允许在所实施的疗法中获得时间、可靠性和针对性。我们的发明使得能够在单一步骤中鉴定样品中存在的微生物种类，并且确定它们的抗性机制以便提出适合于每个患者的治疗。本发明特别适合于辨别不同的微生物种类，它们具有针对不同治疗的不同抗性机制，但它们都可能存在于同一样品中。
在更加深入本发明的公开内容之前，给出下列定义以便有助于理解本发明：
术语“培养基”意指包含微生物存活和/或生长所需的所有成分的介质。根据本发明的培养基可以包含可能的其他添加剂，例如：蛋白胨、一种或多种生长因子、碳水化合物、一种或多种选择剂、缓冲液、一种或多种胶凝剂等。这种培养基可以是液体、凝胶的形式，其是现成可用的，即准备好用于接种在试管、烧瓶中或接种在培养皿上。
在本发明的范围内，术语“微生物”包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，酵母，和更一般地，通常是单细胞的、肉眼看不见的、可以在实验室中繁殖并操作的生物。
作为革兰氏阴性细菌，可以提及下列属的细菌：假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、摩根氏菌属(Morganella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、莫拉氏菌属(Moraxella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、普罗威登斯菌属(Providencia)和军团菌属(Legionella)。
作为革兰氏阳性细菌，可以提及下列属的细菌：肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、利斯特氏菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、库克菌属(Kocuria)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacteria)和棒状杆菌属(Corynebacteria)。
作为酵母，可以提及下列属的酵母：假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、糖酵母属(Saccharomyces)和丝孢酵母属(Trichosporon)。
术语“生物样品”意指来源于生物学液体样本的临床样品，或来源于任何类型食物的食物样品。这种样品因此可以是液体或固体，并且可以以非限制性的方式提及临床样品，其来自血液、血浆、尿、粪便，来自鼻、咽喉、皮肤、伤口、脑脊液的样本；食物样品，其来自水、饮料例如牛奶、果汁，来自酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱、乳酪，来自鱼等；来源于预期用于动物的食物的食物样品，例如特别地，来源于动物用粗粉的样品。
术语“抗性机制”意指任何类型的设置，其允许微生物致使治疗对所述微生物部分或完全无效，从而保证其存活。抗性机制一般分为3类：抗生素不能渗透到细菌中，通过细菌的酶系统来使抗生素失活或排出，以及细菌靶和抗生素之间缺乏亲和力。
指示性地，可以特别提及与属于广谱β-内酰胺酶组的酶的表达相关联的抗性机制；与属于高水平染色体C类头孢菌素酶组的酶的表达相关联的抗性机制；针对糖肽的抗性机制，优选由属于肠球菌属的细菌所形成的抗性机制。
当微生物是金黄色葡萄球菌时，还可以提及针对甲氧西林、青霉素、四环素、红霉素、万古霉素的抗性机制。
当微生物是屎肠球菌时，还可以提及针对青霉素、万古霉素和利奈唑胺的抗性机制。
当微生物是酵母时，还可以提及针对两性霉素B或针对吡咯家族的抗真菌剂的抗性机制。
最后，当微生物是结核分枝杆菌时，可以提及针对异烟肼和利福平的抗性机制。
术语“治疗”意指能够防止或减少来源于患者的微生物生长的处理。这种治疗可以特别包括抗微生物剂化合物，例如抗生素，如青霉素类、常规的头孢菌素类、广谱头孢菌素类、单环内酰胺类、糖肽、氨基糖苷，或例如抗真菌剂，或抗性抑制剂化合物。应注意的是，这种治疗还可包括患者的隔离，从而防止微生物在其他患者中的传播。
使得能够检测酶或代谢活性的“底物”这一术语意指由于微生物的酶或代谢活性而能够直接或间接产生可检测信号的任何分子。
当这种活性是酶活性时，则称为酶底物。术语“酶底物”意指任何底物，其可以被酶水解为允许直接或间接检测微生物的产物。这种底物特别包括对待揭示的酶活性特异的第一部分，和充当标记的第二部分，其在下文中称为标记部分。这种标记部分可以是生色的、发荧光的、发光的等。作为非常适合于固体支持物(过滤器、琼脂、电泳凝胶)的生色底物，可以特别提及基于吲哚酚及其衍生物的底物，和基于羟基喹啉或七叶亭及其衍生物的底物，其使得能够检测糖苷酶和酯酶活性。还可以提及基于硝基苯酚和硝基苯胺及衍生物的底物，在基于硝基苯酚的底物的情况下使得能够检测糖苷酶和酯酶活性，并且在基于硝基苯胺的底物的情况下使得能够检测肽酶活性。最后，可以提及基于萘酚和萘胺及其衍生物的底物，其使得能够经由萘酚检测糖苷酶和酯酶活性，和经由萘胺检测肽酶活性。特别地，但非限制性地，这种底物可以使得能够检测酶活性例如糖苷酶、肽酶、酯酶等的活性。酶底物还可以是其水解产物可被直接或间接检测的天然底物。作为天然底物，可以特别提及用于检测色氨酸酶或脱氨酶活性的色氨酸、用于检测脱氨酶活性的环状氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸)、用于检测磷脂酶活性的磷脂酰肌醇，等等。
当这种活性是代谢活性时，那么底物是代谢底物，例如碳源或氮源，其与在代谢产物之一存在时产生着色的指示剂相偶联。
根据本发明的优选实施方案，所述第一种和/或第二种酶或代谢活性是酶活性，其优选选自下列酶活性：β-葡糖苷酶、脱氨酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、氨基己糖苷酶、N-乙酰基-氨基己糖苷酶、磷酸酶、酯酶和氨肽酶。
例如，为了检测大肠杆菌，优选使用β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶或色氨酸酶或脱氨酶活性；为了检测变形菌，优选使用脱氨酶活性；为了检测肠球菌，优选使用β-葡糖苷酶活性。对于白色假丝酵母(Candida albicans)，优选氨基己糖苷酶；对于单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，优选磷脂酶；对于沙门氏菌，优选酯酶；对于铜绿假单胞菌，优选酯酶或β-丙氨酸氨肽酶；对于金黄色葡萄球菌，优选磷酸酶或α-葡糖苷酶。
“用于区别两组微生物的标记”这一术语意指对于第一组和第二组不具有相同特性的化合物。因此，这种化合物可以是：
●特异的底物；
●抗性机制的抑制剂，其因而允许抑制展现出特定抗性的生物的生长，而无需辨别微生物的种类。
在使用特异的底物的情况下，对于检测大肠杆菌，优选使用β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶或色氨酸酶或脱氨酶活性；对于检测变形菌，优选使用脱氨酶活性；对于检测肠球菌，优选使用β-葡糖苷酶活性。对于白色假丝酵母，优选氨基己糖苷酶；对于单核细胞增生利斯特氏菌，优选磷脂酶；对于沙门氏菌，优选酯酶；对于铜绿假单胞菌，优选酯酶或β-丙氨酸氨肽酶；对于金黄色葡萄球菌，优选磷酸酶或α-葡糖苷酶。
在使用抗性机制的抑制剂的情况下，优选使用：
●克拉维酸、三唑巴坦或舒巴坦，当第一组和/或第二组包含由β-内酰胺酶表达而引起的抗性机制时。那么，培养基中克拉维酸的浓度优选为0.05-32mg/l，优选0.1-8mg/l，更加优选0.25-6mg/l；
●氯唑西林或双氯西林，当第一组和/或第二组包含由头孢菌素酶表达而引起的抗性机制时。
术语“分类群”意指一组具有分类单位的微生物。分类群可以是科、属、属的集合、种、种的集合或亚种。指示性地，可以提及肠细菌、克雷伯氏菌属、埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、沙雷氏菌属、KESC(克雷伯氏菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、柠檬酸杆菌属)、变形菌族(Proteeae)、变形菌属、摩根氏菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、假丝酵母属、大肠杆菌、大肠杆菌0157:H7、肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性的葡萄球菌、白色假丝酵母、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、克鲁斯氏假丝酵母(Candida krusei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)。
术语“抗微生物剂”意指能够防止或减缓微生物生长的任何化合物。这种化合物可以是抗生素或抗真菌剂。
术语“抗生素”意指能够防止或减缓细菌生长的任何化合物。指示性地，可以特别提及头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢泊肟、氨曲南、万古霉素、妥布霉素和环丙沙星这些抗生素。
术语“抗真菌剂”意指能够防止或减缓酵母或霉菌生长的任何化合物。指示性地，可以特别提及两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、放线菌酮。
根据本发明的优选实施方案，
●当抗生素是头孢噻肟时，培养基中头孢噻肟的浓度优选为0.25-8mg/l，优选1-2mg/l；
●当抗生素是头孢他啶时，培养基中头孢他啶的浓度优选为0.25-8mg/l，优选2-2.5mg/l；
●当抗生素是头孢曲松时，培养基中头孢曲松的浓度优选为0.25-8mg/l，优选1-2.5mg/l；
●当抗生素是头孢泊肟时，培养基中头孢泊肟的浓度优选为0.1-32mg/l，优选0.75-10mg/l，更加优选1-6mg/l；
●当抗生素是氨曲南时，培养基中氨曲南的浓度优选为0.1-8mg/l，优选0.75-1.5mg/l。
根据本发明的一个特别实施方案，培养基包含至少两种抗生素的组合。优选地，至少两种抗生素的组合包括头孢噻肟和头孢他啶。
不管本发明的实施方案如何，培养基还可包含着色剂。指示性地，作为着色剂可以提及Evans蓝、中性红、绵羊血、马血、遮光剂例如二氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿等。
所有培养基还可包含下列物质，以便增加它们的灵敏性：
●至少一种抗微生物剂，其具有对抗革兰氏阳性细菌的活性，例如特别是利奈唑胺或万古霉素；
●至少一种抗微生物剂，其具有对抗酵母的活性，例如特别是伏立康唑或两性霉素B；
在这方面，本发明涉及两种培养基的组合用于区分生物样品中的至少3组微生物的用途，所述生物样品包含：
●第一组微生物，属于第一个微生物分类群并包含针对第一种治疗的至少第一种抗性机制；
●第二组微生物，属于第二个微生物分类群并包含针对第二种治疗的至少第二种抗性机制；
●第三组微生物，其对所述第一种和第二种治疗没有抗性，
所述两种培养基的组合包括：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少两种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性。
优选地，培养基包含使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物的至少两种标记，其中至少一种是所述第一种或所述第二种抗性机制的抑制剂。培养基还可包含使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物的至少两种标记，它们中每一种是所述第一种或所述第二种抗性机制的抑制剂。
本发明的该第一个实施方案使得能够在同一个样品中区分第一组和第二组，其包括不同的微生物物种或不同的微生物分类群，所述两组中的每一组对不同治疗具有抗性。
因此，本发明的这个实施方案使得能够，例如在同一个样品中区分包括大肠杆菌BLSE的第一组和包括细菌KESC Case HN的第二组。在这种特定情况下，两种培养基的组合可以是下列：
●至少第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，例如葡糖醛酸糖苷酶底物，如6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，或者半乳糖苷酶底物，如5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；
●第一种鉴定标记，其是葡糖苷酶底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，它使得能够鉴定细菌KESC；
●第二种鉴定标记，其是抗性机制的抑制剂，例如氯唑西林；
●至少一种抗微生物剂，其是抗生素，例如头孢泊肟。
如下称为两种培养基的组合，即第一种培养基可以包含：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，例如葡糖醛酸糖苷酶底物，如6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，或者半乳糖苷酶底物，如5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；
●第一种标记，其是抗性机制的抑制剂，例如氯唑西林；
●抗微生物剂，其是抗生素，例如头孢泊肟，
而第二种培养基包含：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，例如葡糖醛酸糖苷酶底物，如6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，或者半乳糖苷酶底物，如5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；
●第一种标记，其是葡糖苷酶底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，它使得能够鉴定细菌KESC；
●抗微生物剂，其是抗生素，例如头孢他啶。
另一种可替代方案可以使用第一种培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，例如葡糖醛酸糖苷酶底物，如6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，或者半乳糖苷酶底物，如5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；
●第一种标记，其是葡糖苷酶底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，它使得能够鉴定细菌KESC；
●抗微生物剂，其是抗生素，例如氨曲南，
而第二种培养基包含：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，例如葡糖醛酸糖苷酶底物，如6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，或者半乳糖苷酶底物，如5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；
●第一种标记，其是抗性机制的抑制剂，例如克拉维酸；
●抗微生物剂，其是抗生素，例如头孢他啶。
本领域技术人员将选择每种培养基，以便系统性地获得根据本发明的组合。对所述第三组微生物具有活性的抗微生物剂存在于这两种培养基中。本领域技术人员将可以特别地使用双板，它使得能够容易地比较将在其上放置同一种生物样品的两种培养基。
在这方面，本发明还涉及包括两种培养基的组合的双板，所述组合包括：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少两种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性，所述抗微生物剂存在于所述双板的每一侧上。
本发明的该第一个实施方案不限于区分3组微生物，而是还能够区分4、5或更多组微生物。那么，必需向培养基中加入另外的鉴定标记，以便区别不同的组。
在这方面，本发明还涉及包括两种培养基的组合的双板，所述组合包括：
-对于第一种培养基：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，例如葡糖醛酸糖苷酶底物如6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，或半乳糖苷酶底物如5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，或者使得能够鉴定变形菌族的底物，例如色氨酸；
●第一种鉴定标记，其是葡糖苷酶底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷；
●第二种鉴定标记，其是抗性的抑制剂，例如氯唑西林；
●至少一种抗微生物剂，其是抗生素，例如头孢泊肟；-对于第二种培养基：
●第一种底物，其使得能够鉴定肠球菌，例如葡糖苷酶底物，如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷；
●第一种鉴定标记，其是另一种葡糖苷酶底物，例如甲基-α-葡糖苷；
●至少一种抗微生物剂，其是抗生素，例如万古霉素。
本发明还涉及培养基用于区分生物样品中的至少3组微生物的用途，所述生物样品包含：
●第一组微生物，属于第一个微生物分类群并包含针对治疗的至少一种抗性机制；
●第二组微生物，属于不同于所述第一个分类群的第二个微生物分类群，但包含针对治疗的至少一种抗性机制，所述抗性机制与第一组的相同；
●第三组微生物，其对所述治疗没有抗性，
所述培养基包含：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少一种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物，所述标记是使得能够检测所述第二组微生物的至少一种酶或代谢活性的底物；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性。
本发明的该第二个实施方案使得能够在同一个生物样品中区分第一组和第二组，其包括不同的微生物物种或不同的微生物分类群，但所述两组中的每一组对同一种治疗具有抗性。在本发明的这个具体实施方案中，不必使用培养基的组合，因为包括如上定义的特征的单一培养基就足够了。
因此，本发明的这个实施方案使得能够，例如在同一个样品中区分包括大肠杆菌BLSE的第一组和包括细菌KESC BLSE的第二组。
在这方面，本发明涉及培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶的酶活性，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-150mg/l；
●第二种底物，其使得能够在有色指示剂存在下检测甲基-α-葡糖苷的代谢，所述有色指示剂优选中性红，浓度为2-100mg/l，优选4-50mg/l；
●抗微生物剂，其是抗生素，优选万古霉素，浓度为0.5-128mg/l，优选2-32mg/l。
当抗生素是万古霉素时，这种培养基优选用于区分：
●第一组肠球菌，其展现出针对万古霉素的获得性抗性；
●第二组肠球菌，其展现出针对万古霉素的天然抗性；
●第三组肠球菌，其对万古霉素没有抗性。
本发明还涉及培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测氨基己糖苷酶的酶活性，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-150mg/l；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶活性，优选6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-200mg/l；
●抗微生物剂，其是抗真菌剂，优选两性霉素B(amphoB)，浓度为0.5-64mg/l，优选1-16mg/l，更加优选1-8mg/l。
当抗真菌剂是两性霉素B时，这种培养基优选用于区分：
●第一组酵母，包括白色假丝酵母，其展现出两性霉素B抗性；
●第二组酵母，包括热带假丝酵母(Candida tropicalis)和/或葡萄牙假丝酵母和/或乳酒假丝酵母(C.kefyr)，其展现出两性霉素B抗性；
●第三组酵母，其对两性霉素B没有抗性。
本发明还涉及培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测氨基己糖苷酶的酶活性，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-150mg/l；
●第二种底物，其使得能够检测磷酸酶活性，优选5-溴-6-氯-3-吲哚基-磷酸酯，浓度为25-750mg/l，优选40-200mg/l；
●抗微生物剂，其是抗真菌剂，优选两性霉素B，浓度为0.5-64mg/l，优选1-16mg/l，更加优选1-8mg/l。
当抗真菌剂是两性霉素B时，这种培养基优选用于区分：
●第一组酵母，包括白色假丝酵母，其展现出两性霉素B抗性；
●第二组酵母，包括热带假丝酵母和/或光滑假丝酵母和/或克鲁斯氏假丝酵母，其展现出两性霉素B抗性；
●第三组酵母，其对两性霉素B没有抗性。
本发明还涉及培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的氨基己糖苷酶的酶活性，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-150mg/l；
●第二种底物，其使得能够检测所述第二组微生物的β-葡糖苷酶活性，优选6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-200mg/l；
●抗微生物剂，其是抗真菌剂，优选氟康唑，浓度为1-256mg/l，优选2-128mg/l，更加优选8-64mg/l。
当抗真菌剂是氟康唑时，这种培养基优选用于区分：
●第一组酵母，包括白色假丝酵母，其展现出氟康唑抗性；
●第二组酵母，包括热带假丝酵母和/或葡萄牙假丝酵母和/或乳酒假丝酵母，其展现出氟康唑抗性；
●第三组酵母，其对氟康唑没有抗性。
本发明还涉及培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测氨基己糖苷酶的酶活性，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-150mg/l；
●第二种底物，其使得能够检测磷酸酶活性，优选5-溴-6-氯-3-吲哚基-磷酸酯，浓度为25-750mg/l，优选40-200mg/l；
●抗微生物剂，其是抗真菌剂，优选氟康唑，浓度为1-256mg/l，优选2-128mg/l，更加优选8-64mg/l。
当抗真菌剂是氟康唑时，这种培养基优选用于区分：
●第一组酵母，包括白色假丝酵母，其展现出氟康唑抗性；
●第二组酵母，包括热带假丝酵母和/或光滑假丝酵母和/或克鲁斯氏假丝酵母，其展现出氟康唑抗性；
●第三组酵母，其对氟康唑没有抗性。
本发明还涉及培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶的酶活性，优选6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，浓度为25-750mg/l，优选40-300mg/l，或者检测β-半乳糖苷酶的酶活性，优选5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-150mg/l；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶活性，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或者检测色氨酸酶或脱氨酶活性，优选色氨酸，浓度为50-5000mg/l，优选250-2000mg/l；
●抗微生物剂，其是抗生素，优选头孢他啶。那么，培养基中头孢他啶的浓度优选为0.25-8mg/l，优选2-2.5mg/l。
当抗生素是头孢他啶时，这种培养基优选用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE或Case NH；
●第二组细菌，KESC BLSE或Case NH；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类和/或头孢菌素类没有抗性。
本发明还涉及培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性，优选6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，浓度为25-750mg/l，优选40-300mg/l，或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-150mg/l；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶活性，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或者检测色氨酸酶或脱氨酶活性，优选色氨酸，浓度为50-5000mg/l，优选250-2000mg/l；
●抗微生物剂，其是抗生素，优选头孢泊肟，浓度为0.5-32mg/l，优选0.75-10mg/l，更加优选1-6mg/l，和氯唑西林，浓度为10-2000mg/l，优选50-500mg/l。
当抗生素是头孢泊肟时，这种培养基优选用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE；
●第二组细菌，KESC BLSE；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类没有抗性。
本发明还涉及培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶的酶活性，优选6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，浓度为25-750mg/l，优选40-300mg/l，或者检测β-半乳糖苷酶的酶活性，优选5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-150mg/l；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶活性，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或者检测色氨酸酶或脱氨酶活性，优选色氨酸，浓度为50-5000mg/l，优选250-2000mg/l；
●包括抗微生物剂和抗性的抑制剂的组合。优选地，这种组合包括头孢曲松，浓度为0.25-8mg/l，优选1-2.5mg/l，和克拉维酸，浓度为0.05-32mg/l，优选0.1-8mg/l，更加优选0.25-6mg/l。
这种培养基优选用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌CaseHN；
●第二组细菌，KESC CaseHN；
●第三组细菌，其对头孢菌素类没有抗性。
本发明还涉及培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶的酶活性，优选6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，浓度为25-750mg/l，优选40-300mg/l，或者检测β-半乳糖苷酶的酶活性，优选5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-150mg/l；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶活性，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或者检测色氨酸酶或脱氨酶活性，优选色氨酸，浓度为50-5000mg/l，优选250-2000mg/l；
●两种抗微生物剂，其优选是两种抗生素，优选头孢泊肟，浓度为0.1-32mg/l，优选0.25-10mg/l，更加优选0.5-4mg/l，和氨曲南，浓度为优选0.1-8mg/l，优选0.5-1.5mg/l。
这种培养基优选用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE或Case NH；
●第二组细菌，KESC BLSE或Case NH；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类和/或头孢菌素类没有抗性。
本发明还涉及培养基，其包含：
●至少第一种底物，其使得能够检测α-葡糖苷的代谢，优选甲基-α-葡糖苷，浓度为1-50g/l，优选5-20g/l，或者5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或者5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l；
●至少第二种底物，其使得能够检测与α-葡糖苷的代谢不同的第二种活性，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或者6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或者茜素-β-D-半乳糖苷，浓度为10-500mg/l，优选20-250mg/l，或者5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或者5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或者6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l。优选地，这第二种底物使得能够检测β-葡糖苷酶或β-半乳糖苷酶活性；
●至少一种抗微生物剂，优选抗生素，例如万古霉素，浓度为0.5-128mg/l，优选2-32mg/l。
当抗生素是万古霉素时，这种培养基优选用于区分：
●第一组微生物，包括粪肠球菌和屎肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第二组微生物，包括铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)和鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)，其对万古霉素具有抗性；
●第三组微生物，其对万古霉素没有抗性。
在这种情况下，第一种底物优选为甲基-α-葡糖苷，第二种底物优选为5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷或6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，并且抗微生物剂优选为万古霉素。
这种培养基还优选用于区分：
●第一组微生物，包括粪肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第二组微生物，包括屎肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第三组微生物，其对万古霉素没有抗性或表现出天然抗性(铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌)。
在这种情况下，第一种底物优选为5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-葡糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-葡糖苷，第二种底物优选为6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷或茜素-β-D-半乳糖苷或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷或6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，并且抗微生物剂优选为万古霉素。
这种培养基还优选用于区分：
●第一组微生物，包括粪肠球菌和屎肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第二组微生物，包括金黄色葡萄球菌，其处于中间状态或对万古霉素具有抗性；
●第三组微生物，其对万古霉素没有抗性。
在这种情况下，第一种底物优选为5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-葡糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-葡糖苷，第二种底物优选为6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，并且抗微生物剂优选为万古霉素。
下表使得能够根据希望检测的物种来挑选底物和抗微生物剂的适当组合：
Figure BDA0000144887900000201
可能适当的是还调整万古霉素的浓度，优选0.5-12mg/l。
本发明还涉及培养基，其包含：
●抗微生物剂，优选抗生素，例如氯唑西林；
●抗性机制的抑制剂，例如优选第3代头孢菌素，选自头孢噻肟、头孢他啶、头孢泊肟和头孢曲松。
这种培养基还优选用于检测BLSE细菌。
本发明的第二个实施方案不限于区分3组微生物，而是还能够区分4、5或更多组微生物。那么，必需向培养基中加入所述不同组之间的鉴定标记。
在这方面，本发明还涉及培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶的酶活性，优选6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，浓度为25-750mg/l，优选40-300mg/l，或者检测β-半乳糖苷酶的酶活性，优选5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-150mg/l；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l；
●抗微生物剂的组合，优选抗生素的组合，例如
○头孢泊肟，浓度为0.5-32mg/l，优选0.75-10mg/l，更加优选1-6mg/l；
○氯唑西林，浓度为10-2000mg/l，优选50-500mg/l；
○万古霉素，浓度为0.5-128mg/l，优选2-32mg/l；和
○两性霉素B，浓度为0.5-64mg/l，优选1-16mg/l，更加优选1-8mg/l；
●第三种底物，其使得能够检测脱氨酶活性，例如组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸，浓度为50-5000mg/l，优选250-2000mg/l。
这种培养基还可包括第五种抗生素，其是头孢磺啶，浓度为0.5-64mg/l，优选1-16mg/l。
这种培养基优选用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE；
●第二组细菌，KESC BLSE；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类和/或头孢菌素类没有抗性；
●第四组细菌，变形菌族BLSE。
类似地，本发明还涉及培养基，其包含：
●至少第一种底物，其使得能够检测α-葡糖苷的代谢，优选5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l；
●至少第二种底物，其使得能够检测与α-葡糖苷的代谢不同的第二种活性，优选6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或茜素-β-半乳糖苷，浓度为10-500mg/l，优选20-250mg/l，或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l，或6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，浓度为25-500mg/l，优选40-250mg/l。优选地，这第二种底物使得能够检测β-葡糖苷酶或β-半乳糖苷酶活性；
●抗微生物剂的组合，优选抗生素的组合，例如
○万古霉素，浓度为0.5-128mg/l，优选2-32mg/l；
○氨曲南，浓度为1-150mg/l，优选4-60mg/l；
○粘菌素，浓度为1-100mg/l，优选2-20mg/l；
○两性霉素B，浓度为0.5-50mg/l，优选1-15mg/l。
当所述抗生素之一是万古霉素时，这种培养基优选用于区分：
●第一组微生物，包括屎肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第二组微生物，包括粪肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第三组微生物，其对万古霉素没有抗性。
这种培养基还优选用于区分：
●第一组微生物，包括屎肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第二组微生物，包括金黄色葡萄球菌，其处于中间状态或对万古霉素具有抗性；
●第三组微生物，其对万古霉素没有抗性。
根据希望鉴定的微生物组而挑选的底物组合例如在第19页的表中呈现。通过使用适当的抗微生物剂组合，不仅可以区分3组微生物，还可以区分4、5或更多组微生物。
本发明还涉及两种培养基的组合用于区分生物样品中的至少3组微生物的用途，所述生物样品包含：
●第一组微生物，属于第一个微生物物种并包含针对第一种治疗的第一种抗性机制；
●第二组微生物，属于与所述第一组微生物相同的微生物物种，但包含针对第二种治疗的第二种抗性机制，所述抗性机制与所述第一组的相同；
●第三组微生物，其对所述第一种和第二种治疗没有抗性；
所述两种培养基的组合包括：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少一种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物，所述标记是针对第一种治疗和/或第二种治疗的抗性机制的抑制剂；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性。
本发明的该第三个实施方案使得能够在同一个样品中区分包括同一个微生物物种或同一个微生物分类群的第一组和第二组，所述两组中的每一组对不同治疗具有抗性。
因此，本发明的这个实施方案使得能够，例如在同一个样品中区分包括大肠杆菌BLSE的第一组和包括大肠杆菌Case HN的第二组。在这种特定情况下，两种培养基的组合可以是下列：
●至少第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，例如β-葡糖醛酸糖苷酶底物，如6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，或者β-半乳糖苷酶底物，如5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；
●第一种鉴定标记，其是抗性机制的抑制剂，优选氯唑西林；
●第二种鉴定标记，其是抗性机制的另一种抑制剂，优选克拉维酸；
●至少第一种抗微生物剂，其是头孢泊肟。
如下称为两种培养基的组合，即第一种培养基可以包含：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，它是6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸；
●第一种标记，其是抗性机制的抑制剂，优选氯唑西林；
●抗微生物剂，优选抗生素，优选头孢泊肟，
而第二种培养基包含：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，例如6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸；
●第二种标记，其是抗性机制的另一种抑制剂，优选克拉维酸；
●抗微生物剂，优选抗生素，优选头孢泊肟，
另一种可替代方案可以使用第一种培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，它是5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；
●第一种标记，其是脱氨酶或色氨酸酶的底物，优选色氨酸；
●抗微生物剂，优选抗生素，优选头孢泊肟，
而第二种培养基包含：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，它是6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸；
●第二种标记，其是抗性机制的抑制剂，优选克拉维酸；
●抗微生物剂，优选抗生素，优选头孢他啶。
本领域技术人员将选择每种培养基，以便系统性地获得根据本发明的组合。对所述第三组微生物具有活性的抗微生物剂存在于这两种培养基中。本领域技术人员将可以特别地使用双板，它使得能够容易地比较将在其上放置同一种生物样品的两种培养基。
在这方面，本发明还涉及包括两种培养基的组合的双板，所述组合包括：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少一种标记，其使得能够区别第一组微生物和第二组微生物，所述标记是针对第一种治疗和/或第二种治疗的抗性机制的抑制剂；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性。
本发明的该第三个实施方案不限于区分3组微生物，而是还能够区分4、5或更多组微生物。那么，必需向培养基中加入另外的鉴定标记，以便区别不同的组。
在这方面，本发明涉及包括两种培养基的组合的双板，所述组合包括：
-对于第一种培养基：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，例如葡糖醛酸糖苷酶底物，如6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，或者半乳糖苷酶底物，如5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；
●第二种底物，其使得能够鉴定变形菌族，例如脱氨酶或色氨酸酶的底物，例如色氨酸；
●第三种底物，其使得能够鉴定KESC群，例如葡糖苷酶底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷；
●标记，其使得能够区别BLSE菌株和CaseHN菌株，优选抗性的抑制剂，优选克拉维酸；
●至少一种抗微生物剂，其优选是抗生素，优选头孢他啶；-对于第二种培养基：
●第一种底物，其使得能够鉴定大肠杆菌，例如葡糖醛酸糖苷酶底物，如特别是6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，或者半乳糖苷酶底物，如特别是5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；
●第二种底物，其使得能够鉴定变形菌族，例如脱氨酶或色氨酸酶的底物，例如色氨酸；
●第三种底物，其使得能够鉴定KESC群，例如葡糖苷酶底物，例如特别是5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷；
●至少一种抗微生物剂，优选抗生素，优选头孢曲松。
给出下列实施例，用于解释目的而没有任何进行限制的意图。它们使得能够更充分地理解本发明。
实施例1
下列实施例基于BLSE的表型检测，利用这些菌株对抗生素的易感性以及它们对与β-内酰胺酶抑制剂的组合的敏感性的减少。对此，使用基于CPS ID 3的双板(用于检测尿中的微生物的生色培养基，并由bioMérieux以编号43541进行出售)，其中一半琼脂含有抗生素和一半琼脂含有抗生素/β-内酰胺酶抑制剂组合。
1.菌株的选择
在所进行的操作的范围内，为了评估对革兰氏阴性杆菌有作用的抗生素的活性，使用能够生产BLSE的不同种类的肠细菌(大肠杆菌、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、奇异变形菌(Proteus mirabilis))，和非发酵型革兰氏阴性杆菌(铜绿假单胞菌)。在这些试验中比较了BLSE-阳性菌株、产生高水平头孢菌素酶(céphalosporinase hautniveau，Case HN)的菌株和野生型菌株。
对于涉及对革兰氏阳性细菌有作用的抗生素的操作，测试了革兰氏阳性球菌(金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、粪肠球菌、屎肠球菌、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae))和革兰氏阳性杆菌(乳杆菌属物种(Lactobacillus spp))的菌株。
对于用于评估抗真菌剂活性的试验，使用酵母(白色假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、克鲁斯氏假丝酵母、都柏林假丝酵母(Candida dubliniensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、头状地霉(Geotrichum capitatum))的不同菌株。
2.培养基的制备
所使用的培养基是CPS ID3培养基(编号43541)，其还包含至少一种抗生素和至少一种抗性机制的抑制剂。
所测试的培养基的组成如下：
Figure BDA0000144887900000271
加入渗透水并整个进行均质化，并且在100℃的水浴中进行熔化。将该基础培养基分配到烧瓶中，烧瓶数目相应于在该操作中将测试的培养基的总数目。随后将烧瓶于121℃高压灭菌15分钟。取回培养基并在水浴中于55±3℃保持过熔，以便无菌地加入热不稳定的添加剂(预先通过0.22μm过滤来进行灭菌)。
然后，将培养基倾倒入直径为90mm的双板中(即大约9.5ml/半板)，并置于平坦表面上以便它们可以重新凝固。随后将琼脂表面在层流通风橱中干燥30分钟。
3.培养基的接种
由在有氧气氛中在TSA培养基上于36℃±2℃培养24小时的预培养物，在生理盐水中制备0.5McF的接种物，随后将1μl该悬浮液转移到5ml生理盐水中。为了获得足够数目的分离的菌落，制备一系列接种物，从而确定待接种的细菌的最佳量是103-104CFU/ml。使用无菌拭子直接在2个所述半琼脂上进行接种。随后将培养物于37℃在有氧气氛中温育。
4.培养基的阅读
阅读于18小时(±30分钟)、24小时(±1小时)和48小时(±4小时)进行。根据以下1-3的阅读等级，观察菌落的密度和大小，以及团块和分离的菌落的外观、颜色和着色强度：0：没有生长；0.1：痕量生长；0.25：菌落直径＜0.5mm；0.5：菌落直径为0.5mm；0.75：0.5mm＜直径＜1mm；1：菌落直径为1mm；1.25：1mm＜直径＜1.5mm；1.5：菌落直径为1.5mm；2：菌落直径为2mm；3：菌落直径＞2mm。
5.结果
a)筛选抗生素
测试了由NCCLS(全国临床实验室标准委员会(NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards))推荐的5种抗生素。对于每种受试产品，准备一系列浓度以便确定这样的浓度，即该浓度使得能够抑制受试肠细菌野生型菌株，而既不影响BLSE阳性菌株的生长也不影响Case HN阳性菌株的生长。
在下面的表III中列出了所采用的浓度。
表III.在测试条件下允许抑制受试肠细菌野生型菌株，而不影响BLSE阳性菌株生长的抗生素浓度的极限值
  低值   高值
  头孢噻肟   1mg/L   2mg/L
  头孢他啶   2mg/L   2.5mg/L
  头孢曲松   1mg/L   2.5mg/L
  头孢泊肟   2mg/L   10mg/L
  氨曲南   1mg/L   1.5mg/L
低值相应于抑制受试肠细菌野生型菌株所需的最小抗生素浓度。高值相应于可以使用而不影响受试BLSE阳性菌株生长的最大抗生素浓度。
在这些浓度下，野生型菌株和抗性菌株的分离是令人满意的，并且在CPS ID 3培养基上的酶活性表达是一致的。
另外，应当指出的是，头孢他啶是在BLSE检测中所测试和使用的、显示出对铜绿假单胞菌野生型菌株的活性的唯一抗生素。准备一系列浓度以便确定使得能够完全抑制这些菌株的最小浓度，并且极限值是1.5mg/L。
抗生素的添加对于在该生色培养基上细菌酶活性的表达没有任何影响。在对照CPS ID 3培养基上和在包含如上所述的抗生素的培养基上分离和鉴定所述微生物群。
b)筛选β-内酰胺酶的抑制剂
使用3种β-内酰胺酶抑制剂(BLI)，即克拉维酸、三唑巴坦和舒巴坦。在头孢噻肟存在下，对于每一种准备一系列的浓度，以便确定用于抑制BLSE阳性菌株而不损害Case HN菌株生长的最佳浓度。
在头孢噻肟存在下克拉维酸似乎是最有效的BLI。三唑巴坦和舒巴坦需要大于2mg/L的浓度以抑制BLSE阳性菌株，而克拉维酸在低得多的浓度下更有效，并且这在大的应用范围上(当它与头孢噻肟组合使用时为0.1-8mg/L)。
在一系列浓度的克拉维酸存在下测试了每种抗生素(头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢泊肟、氨曲南)，以便确定最有效的组合。下面的表IV中列出了所采用的组合。
表IV.所采用的抗生素和克拉维酸(CA)的组合，其抑制所测试的BLSE阳性肠细菌菌株，但允许Case HN阳性菌株生长
  头孢噻肟   2mg/L   +CA   0.1mg/L
  头孢他啶   2.5mg/L   +CA   2mg/L
  头孢曲松   2mg/L   +CA   0.25mg/L
  头孢泊肟   9mg/L   +CA   0.25mg/L
  氨曲南   1mg/L   +CA   0.5mg/L
表V中列出了使用在一侧上含有单独的抗生素和在另一侧上含有抗生素+克拉维酸的组合的双板而获得的结果。
表V
  仅有抗生素   抗生素+克拉维酸
 野生型大肠杆菌
 BLSE阳性大肠杆菌   粉红色菌落
 Case HN阳性大肠杆菌   粉红色菌落   粉红色菌落
 野生型变形菌族
 BLSE阳性变形菌族   栗色菌落
 Case HN阳性变形菌族   栗色菌落   栗色菌落
 野生型KESC
 BLSE阳性KESC   绿色菌落
 Case HN阳性KESC   绿色菌落   绿色菌落
β-内酰胺酶抑制剂的添加对在该生色培养基上细菌酶活性的表达没有任何影响。在对照CPS ID 3培养基上和在包含β-内酰胺酶抑制剂的培养基上分离和鉴定所述微生物群。
c)抗生素的组合
考虑抗生素和克拉维酸的相对活性，组合了下列物质：
●头孢噻肟(对BLSE阳性菌株有作用的抗生素，与最低浓度的克拉维酸相组合)
●头孢他啶(对铜绿假单胞菌野生型菌株有作用的抗生素)，和
●克拉维酸，
以便能够首先抑制通过添加BLI进行测试的肠细菌的野生型菌株(包括绿脓杆菌的野生型菌株)，和BLSE阳性菌株。
对于铜绿假单胞菌菌株测试了此类组合，铜绿假单胞菌这个物种对头孢噻肟天然具有抗性但对头孢他啶敏感。当将1.5mg/L CAZ(头孢他啶)、1mg/L CTX(头孢噻肟)和0.25mg/L CA(克拉维酸)相组合时，所测试的所有肠细菌的野生型菌株和BLSE阳性菌株均被抑制而只有铜绿假单胞菌的Case HN菌株和BLSE阳性菌株全部生长。涉及在一侧上含有单独的CAZ并在另一侧上含有CTX+克拉维酸的双板。
这些抗生素组合的添加对于在该生色培养基上细菌酶活性的表达没有任何影响。在对照CPS ID 3培养基和包含此类抗生素组合的培养基上分离和鉴定所述微生物群。
d)着色剂试验
根据本发明的培养基也可应用于在双板中使用，双板的一侧包含抗生素，而另一侧包含另一种抗生素或抗生素组合。如果在两侧上使用相同的CPS ID 3培养基基层，那么这两侧通过着色剂的存在而加以区别。
所测试的着色剂，Evans蓝，使培养基产生绿色。该着色使得能够容易地区别双板的2侧，而不影响培养基的生产力，也不损害菌落的酶活性的阅读。在产生一系列浓度的Evans蓝并将其在高压灭菌之前或之后加入后，所采用的值如下：
-1.5或2mg/L，如果该着色剂在高压灭菌后加入。
-2-5mg/L，如果该着色剂在高压灭菌前加入。
e)革兰氏阳性细菌的抑制
BLSE是在革兰氏阴性杆菌中唯一发现的针对β-内酰胺酶的抗性机制，因此通过该培养基抑制革兰氏阳性细菌是合适的。为了抑制敏感型革兰氏阳性细菌，在根据本发明的培养基中使用了两种抗生素，即利奈唑胺和万古霉素。
对于万古霉素，在测试条件下，2-32mg/L，特别是2-5mg/L的浓度能够抑制敏感型革兰氏阳性细菌，而不干扰BLSE细菌的检测。
对于利奈唑胺，在测试条件下，2-64mg/L，特别是4-16mg/L的浓度能够抑制敏感型革兰氏阳性细菌，而不干扰BLSE细菌的检测。
革兰氏阳性细菌的抑制使得能够改进多微生物样本中BLSE细菌的检测及其着色的特异性。
f)酵母的抑制
根据本发明的培养基还可包含抗真菌剂以便抑制可能存在的酵母，所述酵母能够在该培养基上生长并且能够损害所述微生物的生长。
因此测试了两种抗真菌剂：伏立康唑和两性霉素B。
对于两性霉素B，在测试条件下，1-32mg/L，特别是2-8mg/L的浓度能够抑制敏感型酵母，而不干扰BLSE细菌的检测。
对于伏立康唑，在测试条件下，1-64mg/L，特别是4-16mg/L的浓度能够抑制敏感型革兰氏阳性细菌，而不干扰BLSE细菌的检测。
酵母的抑制使得能够改进多微生物样本中BLSE细菌的检测及其着色的特异性。
6.结论
这些结果证实，根据本发明的培养基能够分开和推定地鉴定BLSE生产菌，将它们与高水平头孢菌素酶生产菌株区别开。使用基于CPS ID3在一侧上含有单独的头孢菌素并在另一侧上含有头孢菌素/克拉维酸的组合的双板是特别有利的。
实施例2
该第二个实施例基于BLSE的表型检测，利用对抗生素的易感性以及Case HN对与妥布霉素或氯唑西林或双氯西林的组合的敏感性的减少，并且呈现了上述头孢菌素(CTX、CAZ、CPD、CRO、ATM)与抑制头孢菌素酶的化合物(氯唑西林、双氯西林和妥布霉素)的组合的用途。此类培养基使得能够抑制具有“天然的”头孢菌素酶的细菌，其中大多数只具有高水平头孢菌素酶(Case HN)，同时允许BLSE细菌生长。
1.菌株的选择
在所进行的操作的范围内，为了评估对革兰氏阴性杆菌有作用的抗生素的活性，使用能够生产BLSE的不同种类的肠细菌(大肠杆菌、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形菌(Proteus mirabilis))，和非发酵型革兰氏阴性杆菌(铜绿假单胞菌)。在这些试验中比较了BLSE-阳性菌株、产生高水平头孢菌素酶的菌株和野生型菌株。
2.培养基的制备
所使用的培养基是CPS ID3培养基(43541)，其还包含：
●2.5mg/L的头孢他啶和2mg/L的妥布霉素(培养基A)或
●2mg/L的头孢曲松和150mg/L的氯唑西林(培养基B)或
●2mg/L的头孢泊肟和500-1000mg/L的双氯西林(培养基C)。
加入渗透水并整个进行均质化，并且在100℃的水浴中进行熔化。将该基础培养基分配到烧瓶中，烧瓶数目相应于在该操作中将测试的培养基的总数目。随后将烧瓶于121℃高压灭菌15分钟。取回培养基并在水浴中于55±3℃保持过熔，以便无菌地加入热不稳定的添加剂(预先通过0.22μm过滤来进行灭菌)。
然后，将培养基倾倒入直径为35mm的板中，并置于平坦表面上以便它们可以重新凝固。随后将琼脂表面在层流通风橱中干燥30分钟。
3.培养基的接种
这个步骤如实施例1中所述进行。
4.培养基的阅读
这个步骤如实施例1中所述进行。
5.结果
包含头孢他啶和妥布霉素的培养基A能够抑制所测试的所有野生型菌株和所有Case HN。在这个培养基上只检测到BLSE阳性菌株。
包含头孢曲松和氯唑西林的培养基B能够抑制所有Case HN和所有野生型菌株，除了Case HN和野生型的铜绿假单胞菌外，并且只有大多数BLSE阳性菌株生长。
包含头孢泊肟和双氯西林的培养基C能够抑制所有野生型菌株和大多数Case HN，而不影响BLSE阳性菌株的生长。
实施例3
该第三个实施例基于对糖肽具有抗性的肠球菌的表型检测，其中特异地区分粪肠球菌和屎肠球菌，该检测利用对抗生素的易感性的减少以及酶活性(β-葡糖苷酶)和代谢活性(甲基-α-葡糖苷的酸化)的证实。
1.菌株的选择
在所进行的操作的范围内，为了评估对肠球菌有作用的抗生素的活性，使用不同种类的肠球菌(粪肠球菌、屎肠球菌、铅黄肠球菌、鹑鸡肠球菌)。在这些试验中比较了对糖肽(VRE)具有抗性的菌株和野生型菌株。
2.培养基的制备
所使用的培养基是Columbia培养基(51026)，其还包含：
●100mg/L的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷(X-Glu)
●9g/L的甲基-α-D-葡糖苷
●25mg/L的中性红
●5g/L的胆汁盐
●4mg/L的万古霉素
●2mg/L的两性霉素B。
加入渗透水并整个进行均质化，并且在100℃的水浴中进行熔化。将该基础培养基分配到烧瓶中，烧瓶数目相应于在该操作中将测试的培养基的总数目。随后将烧瓶于121℃高压灭菌15分钟。取回培养基并在水浴中于55±3℃保持过熔，以便无菌地加入热不稳定的添加剂(预先通过0.22μm过滤来进行灭菌)。
然后，将培养基倾倒入直径为90mm的板中，并置于平坦表面上以便它们可以重新凝固。随后将琼脂表面在层流通风橱中干燥30分钟。
3.培养基的接种
这个步骤如实施例1中所述进行。
4.培养基的阅读
这个步骤如实施例1中所述进行。
5.结果
在这个培养基上，只有对糖肽具有抗性的肠球菌菌株成长并形成菌落。
具有抗性的粪肠球菌和屎肠球菌的菌株形成绿色菌落，而铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌的菌株形成蓝色至紫色的菌落。
因此，这种培养基使得能够区别这两组肠球菌，和提供适当的治疗应答。
实施例4
该第四个实施例基于对糖肽具有抗性的肠球菌的表型检测，其中特异地区分粪肠球菌和屎肠球菌，该检测利用对抗生素的易感性的减少以及两种酶活性(α-葡糖苷酶，和β-半乳糖苷酶或β-葡糖苷酶)的证实。
1.菌株的选择
在所进行的操作的范围内，为了评估对肠球菌有作用的抗生素的活性，使用不同种类的肠球菌(粪肠球菌、屎肠球菌、铅黄肠球菌、鹑鸡肠球菌)。在这些试验中比较了对糖肽(VRE)具有抗性的菌株和野生型菌株。
2.培养基的制备
所使用的培养基是Columbia培养基(51026)，其还包含：
○150mg/L的5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-吡喃葡糖苷(GreenA-α-Glu)，
○200mg/L的6-氯-3-吲哚基-β-吡喃葡糖苷(Rose-b-Glu)，或者：
○150mg/L的5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-吡喃葡糖苷(GreenA-α-Glu)，
○50mg/L的茜素-β-吡喃半乳糖苷，
和8mg/L的万古霉素，
和4mg/L的两性霉素B，
和2mg/L的粘菌素，
和32mg/L的氨曲南。
加入渗透水并整个进行均质化，并且在100℃的水浴中进行熔化。将这两种基础培养基分配到烧瓶中。随后将烧瓶于121℃高压灭菌15分钟。取回培养基并在水浴中于55±3℃保持过熔，以便无菌地加入热不稳定的添加剂(预先通过0.22μm过滤来进行灭菌)。
然后，将培养基倾倒入直径为90mm的板中，并置于平坦表面上以便它们可以重新凝固。随后将琼脂表面在层流通风橱中干燥30分钟。
3.培养基的接种
这个步骤如实施例1中所述进行。
4.培养基的阅读
这个步骤如实施例1中所述进行。
5.结果
在含有α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶底物的培养基上，具有抗性的屎肠球菌菌株形成紫色菌落，而具有抗性的粪肠球菌菌株形成粉红色菌落。铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌菌株(具有天然抗性)由于万古霉素的浓度而被抑制。
因此，这种培养基使得能够区别这2组肠球菌，并提供适当的治疗应答以及局部流行病学的跟踪观察。
在含有α-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶底物的培养基上，具有抗性的屎肠球菌菌株形成紫色菌落，而具有抗性的粪肠球菌菌株形成绿色菌落。铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌菌株(具有天然抗性)由于万古霉素的浓度而被抑制。
因此，这种培养基使得能够区别这2组肠球菌，并提供适当的治疗应答以及局部流行病学的跟踪观察。
本发明的一些优选实施方案如下：
1.两种培养基的组合用于区分生物样品中的至少3组微生物的用途，所述生物样品包含：
●第一组微生物，属于第一个微生物分类群并包含针对第一种治疗的至少第一种抗性机制；
●第二组微生物，属于第二个微生物分类群并包含针对第二种治疗的至少第二种抗性机制；
●第三组微生物，其对所述第一种和第二种治疗没有抗性，
所述两种培养基的组合包括：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少两种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性。
2.根据实施方案1的两种培养基的组合的用途，所述组合包括使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物的至少两种标记，其中至少一种是所述第一种或所述第二种抗性机制的抑制剂。
3.根据实施方案1的两种培养基的组合的用途，所述组合包括使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物的至少两种标记，它们中每一种是所述第一种或所述第二种抗性机制的抑制剂。
4.包括两种培养基的组合的双板，所述组合包括：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少两种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性，所述抗微生物剂存在于所述双板的每一侧上。
5.包括两种培养基的组合的双板，所述组合包括第一种培养基，其包含：
●使得能够鉴定大肠杆菌的第一种底物，其选自葡糖醛酸糖苷酶底物或半乳糖苷酶底物；
●第一种鉴定标记，其是葡糖苷酶底物；
●第二种鉴定标记，其是抗性的抑制剂；
●至少一种抗生素；
和第二种培养基，其包含：
●使得能够鉴定肠球菌的第一种底物，其是葡糖苷酶底物；
●第一种鉴定标记，其是另一种葡糖苷酶底物；
●至少一种抗生素。
6.培养基用于区分生物样品中的至少3组微生物的用途，所述生物样品包含：
●第一组微生物，属于第一个微生物分类群并包含针对治疗的至少一种抗性机制；
●第二组微生物，属于不同于所述第一个分类群的第二个微生物分类群，但包含针对治疗的至少一种抗性机制，所述抗性机制与第一组的相同；
●第三组微生物，其对所述治疗没有抗性，
所述培养基包含：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少一种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物，所述标记是使得能够检测所述第二组微生物的至少一种酶或代谢活性的底物；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性。
7.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶的酶活性，
●第二种底物，其使得能够在有色指示剂存在下检测甲基-α-葡糖苷的代谢，
●抗生素，其是万古霉素。
8.根据实施方案7的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组肠球菌，其展现出针对万古霉素的获得性抗性；
●第二组肠球菌，其展现出针对万古霉素的天然抗性；
●第三组肠球菌，其对万古霉素没有抗性。
9.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测氨基己糖苷酶的酶活性，
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶活性，
●抗真菌剂，其是两性霉素B。
10.根据实施方案9的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组酵母，包括白色假丝酵母，其展现出两性霉素B抗性；
●第二组酵母，包括热带假丝酵母和/或葡萄牙假丝酵母和/或乳酒假丝酵母，其展现出两性霉素B抗性；
●第三组酵母，其对两性霉素B没有抗性。
11.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测氨基己糖苷酶的酶活性，
●第二种底物，其使得能够检测磷酸酶活性，
●抗真菌剂，其是两性霉素B。
12.根据实施方案11的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组酵母，包括白色假丝酵母，其展现出两性霉素B抗性；
●第二组酵母，包括热带假丝酵母和/或光滑假丝酵母和/或克鲁斯氏假丝酵母，其展现出两性霉素B抗性；
●第三组酵母，其对两性霉素B没有抗性。
13.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测氨基己糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶活性；
●抗真菌剂，其是氟康唑。
14.根据实施方案13的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组酵母，包括白色假丝酵母，其展现出氟康唑抗性；
●第二组酵母，包括热带假丝酵母和/或葡萄牙假丝酵母和/或乳酒假丝酵母，其展现出氟康唑抗性；
●第三组酵母，其对氟康唑没有抗性。
15.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测氨基己糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测磷酸酶活性；
●抗真菌剂，其是氟康唑。
16.根据实施方案15的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组酵母，包括白色假丝酵母，其展现出氟康唑抗性；
●第二组酵母，包括热带假丝酵母和/或光滑假丝酵母和/或克鲁斯氏假丝酵母，其展现出氟康唑抗性；
●第三组酵母，其对氟康唑没有抗性。
17.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶或色氨酸酶或脱氨酶活性；
●抗生素，其是头孢他啶。
18.根据实施方案17的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE或Case NH；
●第二组细菌，KESC BLSE或Case NH；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类和/或头孢菌素类没有抗性。
19.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶或色氨酸酶或脱氨酶活性；
●抗生素，其是头孢泊肟；
●抗生素，其是氯唑西林。
20.根据实施方案19的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE；
●第二组细菌，KESC BLSE；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类没有抗性。
21.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶或脱氨酶或色氨酸酶活性；
●包括头孢曲松和克拉维酸的组合。
22.根据实施方案21的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌CaseHN；
●第二组细菌，KESC CaseHN；
●第三组细菌，其对头孢菌素类没有抗性。
23.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶或脱氨酶或色氨酸酶活性；
●两种抗生素，它们是头孢泊肟和氨曲南。
24.根据实施方案23的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE或Case NH；
●第二组细菌，KESC BLSE或Case NH；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类和/或头孢菌素类没有抗性。
25.培养基，其包含：
●至少第一种底物，其使得能够检测α-葡糖苷的代谢；
●至少第二种底物，其使得能够检测与α-葡糖苷的代谢不同的第二种活性；
●至少一种抗生素，其是万古霉素。
26.根据实施方案25的培养基，其特征在于，所述至少第二种底物使得能够检测β-葡糖苷酶或β-半乳糖苷酶活性。
27.根据实施方案25的培养基，其特征在于，所述第一种底物优选是甲基-α-葡糖苷，所述第二种底物优选是5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷或6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，并且所述抗微生物剂优选是万古霉素。
28.根据实施方案25-27的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组微生物，包括粪肠球菌和屎肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第二组微生物，包括铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第三组微生物，其对万古霉素没有抗性。
29.根据实施方案25的培养基，其特征在于，所述第一种底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-葡糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-葡糖苷，所述第二种底物是6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷或茜素-β-D-半乳糖苷或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷或6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，并且所述抗微生物剂是万古霉素。
30.根据实施方案25或29的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组微生物，包括屎肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第二组微生物，包括粪肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第三组微生物，其对万古霉素没有抗性或表现出天然抗性。
31.根据实施方案25的培养基，其特征在于，所述第一种底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-葡糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-葡糖苷，所述第二种底物是6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷，并且所述抗微生物剂是万古霉素。
32.根据实施方案25或31的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组微生物，包括粪肠球菌和屎肠球菌，其对万古霉素具有抗性；
●第二组微生物，包括金黄色葡萄球菌，其处于中间状态或对万古霉素具有抗性；
●第三组微生物，其对万古霉素没有抗性。
33.培养基，其包含：
●抗生素，其是氯唑西林；
●抗性机制的抑制剂，其是第三代的头孢菌素。
34.根据实施方案28的培养基用于检测BLSE细菌的用途。
35.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶；
●抗生素的组合，包括：
○头孢泊肟，
○氯唑西林，
○万古霉素，和
○两性霉素B；
●第三种底物，其使得能够检测脱氨酶活性。
36.根据实施方案35的培养基，其特征在于，它还包括第五种抗生素，其是头孢磺啶。
37.根据实施方案35或36的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE；
●第二组细菌，KESC BLSE；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类和/或头孢菌素类没有抗性；
●第四组细菌，变形菌族BLSE。
38.两种培养基的组合用于区分生物样品中的至少3组微生物的用途，所述生物样品包含：
●第一组微生物，属于第一个微生物物种并包含针对第一种治疗的第一种抗性机制；
●第二组微生物，属于与所述第一组微生物相同的微生物物种，但包含针对第二种治疗的第二种抗性机制，所述抗性机制与所述第一组的相同；
●第三组微生物，其对所述第一种和第二种治疗没有抗性；
所述两种培养基的组合包括：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少一种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物，所述标记是针对第一种治疗和/或第二种治疗的抗性机制的抑制剂；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性。
39.包括两种培养基的组合的双板，所述组合包括：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少一种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物，所述标记是针对第一种治疗和/或第二种治疗的抗性机制的抑制剂；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性。

Claims (17)

1.培养基用于区分生物样品中的至少3组微生物的用途，所述生物样品包含：
●第一组微生物，属于第一个微生物分类群并包含针对治疗的至少一种抗性机制；
●第二组微生物，属于不同于所述第一个分类群的第二个微生物分类群，但包含针对治疗的至少一种抗性机制，所述抗性机制与第一组的相同；
●第三组微生物，其对所述治疗没有抗性，
所述培养基包含：
a.至少第一种底物，其使得能够检测所述第一组微生物的至少第一种酶或代谢活性；
b.至少一种标记，其使得能够区别所述第一组微生物和所述第二组微生物，所述标记是使得能够检测所述第二组微生物的至少一种酶或代谢活性的底物；
c.至少一种抗微生物剂，其对所述第三组微生物具有活性。
2.根据权利要求1的培养基用于区分生物样品中的至少3组微生物的用途，其中所述第一组、第二组和第三组的微生物为革兰氏阴性细菌。
3.根据权利要求2的培养基的用途，其中所述抗微生物剂属于β-丙氨酸类家族。
4.根据权利要求2的培养基的用途，其中所述抗微生物剂属于头孢菌素类家族。
5.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶或色氨酸酶或脱氨酶活性；
●包括抗微生物剂和抗性机制的抑制剂的组合。
6.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶或色氨酸酶或脱氨酶活性；
●至少两种抗生素。
7.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶或色氨酸酶或脱氨酶活性；
●抗生素，其是头孢他啶。
8.根据权利要求7的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE或Case NH；
●第二组细菌，KESC BLSE或Case NH；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类和/或头孢菌素类没有抗性。
9.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶或色氨酸酶或脱氨酶活性；
●抗生素，其是头孢泊肟；
●抗生素，其是氯唑西林。
10.根据权利要求9的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE；
●第二组细菌，KESC BLSE；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类没有抗性。
11.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶或脱氨酶或色氨酸酶活性；
●包括头孢曲松和克拉维酸的组合。
12.根据权利要求11的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌CaseHN；
●第二组细菌，KESC CaseHN；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类和/或头孢菌素类没有抗性。
13.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶或脱氨酶或色氨酸酶活性；
●两种抗生素，它们是头孢泊肟和氨曲南。
14.根据权利要求13的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE或Case NH；
●第二组细菌，KESC BLSE或Case NH；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类和/或头孢菌素类没有抗性。
15.培养基，其包含：
●第一种底物，其使得能够检测β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性；
●第二种底物，其使得能够检测β-葡糖苷酶；
●抗生素的组合，包括：
○头孢泊肟，
○氯唑西林，
○万古霉素，和
○两性霉素B；
●第三种底物，其使得能够检测脱氨酶活性。
16.根据权利要求15的培养基，其特征在于，它还包括第五种抗生素，其是头孢磺啶。
17.根据权利要求15或16的培养基的用途，所述用途为用于区分：
●第一组细菌，大肠杆菌BLSE；
●第二组细菌，KESC BLSE；
●第三组细菌，其对β-丙氨酸类和/或头孢菌素类没有抗性；
●第四组细菌，变形菌族BLSE。
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