CN101874118A - 检测和/或鉴定金黄色葡萄球菌的反应培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于鉴别金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的反应培养基，其包含是β-核糖苷酶底物的代谢指示物与至少一种其它代谢指示物和/或至少一种代谢调节物的组合。本发明还涉及检测和/或鉴定金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于其包括下述步骤：a)提供一种反应培养基，其包含是β-核糖苷酶底物的代谢指示物与至少一种其它代谢指示物和/或至少一种代谢调节物的组合，b)用待测生物学样品接种该培养基，c)允许温育，以及d)鉴别金黄色葡萄球菌的存在。

Description

检测和/或鉴定金黄色葡萄球菌的反应培养基
本发明涉及特异于金黄色葡萄球菌的反应培养基。其还涉及使用这种培养基检测和/或鉴定金黄色葡萄球菌的方法。
葡萄球菌属的大多数物种是人类机会致病菌，其在由于外伤或由于直接植入医学产品所导致的皮肤损伤类事件中呈现很高风险。
在葡萄球菌中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)毫无疑问是致病性最强的物种，因为其产生大量胞外酶和毒素。其可以是导致许多各种各样的病理状况的原因，从简单的甲沟炎到最严重的感染诸如败血病、心内膜炎、肺病或者骨关节感染，对此的预后不是非常乐观的。其可常见于必须接受涉及诸如注射器或导管等设备的住院治疗的患者。因此对于这个日益增加的牵涉到院内疾病的病原菌之存在的检测具有很大价值。
在细菌学中，常规是将特征在于产生凝固酶的金黄色葡萄球菌物种与称为“凝固酶阴性”的其它物种对比。区分金黄色葡萄球菌和非葡萄球金黄色菌的常规方法是基于对游离凝固酶和脱氧核糖核酸酶的搜寻，以及基于乳胶上凝集反应的获取，其目的在于证实纤维蛋白原亲和因子、A蛋白和荚膜抗原的存在。然而，其它的潜在病原性葡萄球菌物种能表达凝固酶。
也有技术可在选择性培养基上培养从而可以评估金黄色葡萄球菌的存在，如高盐Chapman培养基(含有7.5％NaCl)，其通常对金黄色葡萄球菌和水解甘露醇的葡萄球菌是选择性的，以及Baird Parker培养基(含有亚碲酸钾和氯化锂作为选择剂)，其用于分离及计数食品中的凝固酶阳性葡萄球菌并使得证实卵磷脂酶活性成为可能。然而，这些技术缺乏灵敏性(检测到少量存在于待测生物学样品中的所搜寻物种的能力)以及特别是缺乏特异性(在含有其它物种的待测生物学样品中检测所搜寻物种的能力)并且仅可给出推定性诊断，需要其它确认测试。但是，鉴定金黄色葡萄球菌所必需的额外操作增加了分析时间及成本。它们需要众多的试剂及有资格的人员的参与。
也可以使用含有酶底物特别是磷酸酶及/或β-葡糖苷酶或者α-葡糖苷酶的底物的培养基。例如可以提及的是显色培养基CHROMagar(商标)Staph.Aureus，其使得分离葡萄球菌及通过显色底物鉴定金黄色葡萄球菌成为可能，所述底物使金黄色葡萄球菌显示淡紫色着色(Gaillot O.et al.，2000.J.Clin.Microbiol.38，4，1587-1591)。同一属的其它物种继而在理论上可由蓝色或无色着色所检测。该鉴定本质上是基于磷酸酶、β-葡糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶及β-半乳糖苷酶活性，也基于抑制剂去铁胺的存在，去铁胺使得区分金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)成为可能。然而，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的区分并不完全，因为这两个物种在CHROMagar(商标)培养基上产生相同颜色的菌落。这是由于磷酸酶底物缺乏特异性所致，该底物对于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌均是阳性的，以及由于去铁胺对于表皮葡萄球菌仅仅是部分抑制这一事实。
也可以如专利申请WO 02/079486所述使用α-葡糖苷酶底物。如此，则仅利用对α-葡糖苷酶活性的检测即可将金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)分开，它们是三种临床分离的主要葡萄球菌物种。然而，虽然具有含吲哚酚核的生色团的α-葡糖苷酶底物非常适合用于固体培养基中，它们在液体培养基中的应用却是会产生问题的，因为该着色在液体培养基中并不扩散。
令人惊奇地是，本发明人已证实使用一或多种核糖苷酶(ribosidase)底物可使快速、简易地鉴定金黄色葡萄球菌成为可能。特别是，一或多种核糖苷酶底物与代谢调节物和/或另一种代谢指示物的组合使用可使区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌物种成为可能。
在介绍本发明前，先给出下述定义以使本发明能够被更清楚的理解。它们决不具限制性的。
术语反应培养基意指包含微生物的代谢表达和/或生长所必需的所有元素的培养基。该反应培养基可以是固体、半固体或液体。术语“固体培养基”意指，例如一种凝胶培养基。琼脂是微生物学中培养微生物的常规胶凝剂，但也可以使用明胶或琼脂糖。有些配制品是可商购的，如例如Columbia琼脂、Trypticase-soy琼脂、MacConkey琼脂、Sabouraud琼脂，或者更普遍地，在Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中所描述的那些。
所述反应培养基可以包含一种或多种元素组合，如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素等。该培养基也可包含着色剂。作为指示，可以提及的用作着色剂的有Evans蓝、中性红、绵羊血、马血、遮光剂(opacifiant)如氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿、一种或多种代谢指示物、一种或多种代谢调节物等。
所述反应培养基可以是揭示性培养基(milieu de révélation)，或者培养性及揭示性培养基。在第一种情况中，微生物在接种前已被培养，在第二种情况中，检测和/或鉴定培养基也构成培养性培养基。
本领域技术人员也可以使用双平板(bi-boite)，使得可以便利地比较两种包含各种底物或各种选择性混合物的培养基，其上沉积了相同的生物学样品。
术语“代谢调节物”意指调节微生物生长的任何化合物。这种代谢调节物可以特别是糖苷酶(osidase)调节物，选择性化合物，特别如氯化锂、亚碲酸钾或者氯化钠，或者选择性化合物的混合物，抗生素，一或多种抗生素和/或一或多种抗真菌剂的混合物，任选包含一种或多种β-内酰胺，一种或多种氨基葡糖苷，一种或多种糖肽，一种或多种喹诺酮，一种或多种多肽，两性霉素，一种或多种吡咯化合物，其使得可以促进金黄色葡萄球菌的检测，促进金黄色葡萄球菌细菌生长的抑制剂，特别如氯化锂(LiCl)，叠氮化钠(NaN3)，粘菌素，两性霉素，氨曲南(Aztréonam)，粘杆菌素(Colimicine)，氯化钠(NaCl)，去铁胺，以及弧菌抑制化合物O/129。
优选地，依据本发明的培养基包含用于促进金黄色葡萄球菌生长和/或抑制其它微生物物种生长的选择性混合物。这种混合物优选包含氯化锂、弧菌抑制化合物O/129、氨曲南和两性霉素。
术语“代谢糖苷酶调节物”特别是意指在反应培养基中可以诱导或抑制一种或多种糖苷酶活性表达的化合物。
优选地，代谢调节物的浓度在0.5mg/l和75g/l之间。
术语“代谢指示物”意指能证实微生物的存在的任意化合物。这种代谢指示物可以特别是底物，如核糖苷酶底物，或者除了β-核糖苷酶底物之外的底物，如特别是糖苷酶底物，酯酶底物或者肽酶底物，更特别地是β-葡糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶和/或β-葡糖醛酸糖苷酶和/或磷酸酶底物，由此促进金黄色葡萄球菌的检测。该培养基也可以包含一种或多种不同于β-核糖苷酶底物的代谢指示物，如底物的组合。本领域技术人员会根据所希望鉴定的微生物而调整底物浓度。优选地，底物浓度在5-1000mg/l之间，优选在50-400mg/l之间。
术语底物意指可以被如β-核糖苷酶的酶水解以便产生能使直接或间接检测微生物成为可能的产物的分子。这种底物特别包括特异于待揭示酶活性的第一部分和作为标记的第二部分，其此后称作标记部分。这种标记部分可以是生色的、产生荧光的、发光的，等等。
术语“β-核糖苷酶底物”特别是意指2-羟苯基-β-D-核糖苷(儿茶酚-β-D-核糖苷)；品红-β-D-核糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；二羟基黄酮-β-D-核糖苷；X-β-D-核糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；粉红-β-D-核糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；6-溴-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；5-溴-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；6-氟-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；茜素-β-D-核糖苷；(P)-硝基苯基-β-D-核糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-核糖苷(4-methyl-umbelliferyl-β-D-riboside)；萘酚-β-D-核糖苷；二氯氨基苯基-β-D-核糖苷。
优选地，本发明培养基中β-核糖苷酶底物的浓度在25-1000mg/l之间，更优选为在50-400mg/l之间。
术语“β-葡糖苷酶底物”特别是意指2-羟苯基-β-D-葡糖苷(儿茶酚-β-D-葡糖苷)；品红-β-D-葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷)；二羟基黄酮-β-D-葡糖苷；X-β-D-葡糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷)；粉红-β-D-葡糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷)；6-溴-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷；5-溴-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷；6-氟-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷；茜素-β-D-葡糖苷；(P)-硝基苯基-β-D-葡糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷；萘酚苯甲基-β-D-葡糖苷(Naphtholbenzein-β-D-glucoside)；吲哚氧基-N-甲基-β-D-葡糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-β-D-葡糖苷；8-羟基喹啉-β-D-葡糖苷；萘酚-β-D-葡糖苷。
优选地，本发明培养基中β-葡糖苷酶底物的浓度在25-1000mg/l之间，更优选在50-400mg/l之间。
术语“β-半乳糖苷酶底物”特别是意指2-羟苯基-β-D-半乳糖苷(儿茶酚-β-D-半乳糖苷)；品红-β-D-半乳糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷)；二羟基黄酮-β-D-半乳糖苷；X-β-D-半乳糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷)；粉红-β-D-半乳糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷)；6-溴-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷；5-溴-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷；6-氟-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷；茜素-β-D-半乳糖苷；(P)-硝基苯基-β-D-半乳糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷；萘酚苯甲基-β-D-半乳糖苷；吲哚氧基-N-甲基-β-D-半乳糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-β-D-半乳糖苷；8-羟基喹啉-β-D-半乳糖苷；萘酚-β-D-半乳糖苷。
优选地，本发明培养基中β-半乳糖苷酶底物的浓度在25-1000mg/l之间，更优选在50-400mg/l之间。
术语金黄色葡萄球菌意指金黄色葡萄球菌的任何菌株，包括抗性菌株如MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)、MSSA、GISA、VISA或VRSA(分别为糖肽中间体、万古霉素中间体或者万古霉素抗性金黄色葡萄球菌)。
术语生物学样品意指来源于生物学流体样本的临床样品，或者来源于任何类型食物的食物样品。此样品因此可以是液体或者固体，可以提及而无限制意义的有临床血液、血浆、尿或者粪便样品，鼻、喉、皮肤、伤口或者脑脊液样本，食品样品，其来自水、来自饮料如奶或者果汁、来自酸奶、来自肉、来自蛋、来自蔬菜、来自蛋黄酱、来自干酪；来自鱼等，来源于动物饲料的食品样品，特别如来自动物食物的样品。在这个方面，本发明涉及用于鉴别金黄色葡萄球菌特征的反应培养基，其包含是β-核糖苷酶底物的代谢指示物组合至少一种其它代谢指示物和/或至少一种代谢调节物。
本发明还涉及是β-核糖苷酶底物的代谢指示物组合另一种代谢指示物和/或代谢调节物在鉴定金黄色葡萄球菌中的应用。
根据本发明一个优选实施方案，所述代谢调节物选自糖苷酶活性的调节物，选择性化合物，特别如氯化锂、亚碲酸钾或氯化钠，或者选择性化合物的混合物，抗生素或者一或多种抗生素和/或一或多种抗真菌剂的混合物，特别如一种或多种β-内酰胺，一种或多种氨基葡糖苷，一种或多种糖肽，一种或多种喹诺酮，一种或多种多肽，两性霉素，吡咯化合物，单独或者与一种或多种选择性化合物组合。
根据本发明一个优选实施方案，所述其它代谢指示物是酶底物，优选是糖苷酶、酯酶、肽酶、β-葡糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶底物。根据一个更优选的实施方案，所述其它代谢指示物选自β-葡糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶底物。
根据本发明一个优选实施方案，所述β-核糖苷酶底物选自2-羟苯基-β-D-核糖苷(儿茶酚-β-D-核糖苷)；品红-β-D-核糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；二羟基黄酮-β-D-核糖苷；X-β-D-核糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；粉红-β-D-核糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；6-溴-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；5-溴-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；6-氟-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；茜素-β-D-核糖苷；(P)-硝基苯基-β-D-核糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-核糖苷。
根据本发明一个优选实施方案，所述β-核糖苷酶底物是儿茶酚-β-D-核糖苷。
根据本发明另一个优选实施方案，所述β-核糖苷酶底物是X-β-D-核糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)。
根据本发明一个优选实施方案，所述反应培养基是固体培养基。
根据本发明另一个优选实施方案，所述反应培养基是液体培养基。在这种情况中，所述β-核糖苷酶底物优选为儿茶酚-β-D-核糖苷，因为其允许在大约18小时内检测/鉴定金黄色葡萄球菌。
本发明还涉及一种检测和/或鉴定金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于其包括下述步骤或者由下述步骤组成：
a)提供如上述所定义的反应培养基，
b)用待测生物学样品接种该培养基，
c)使之温育，并
d)鉴定金黄色葡萄球菌的存在。
本方法还可以包含确认步骤。此确认步骤可以特别是生物化学、免疫学或者分子学鉴定。
微生物接种可以用本领域技术人员已知的任何接种技术进行。温育步骤可以在所希望检测的酶活性的表达是最佳的温度下进行，所述温度可由本领域技术人员根据待测酶活性而容易地选择。
根据本发明一个优选实施方案，在步骤c)中，允许温育时间在16-48小时之间，优选在18-24小时之间。
步骤d)可以通过视觉检查、通过比色法或通过荧光测定法进行。
对一种或多种抗生素具有获得性抗性的金黄色葡萄球菌菌株，特别是MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株)、GISA(糖肽中间体金黄色葡萄球菌菌株)、VISA(万古霉素中间体金黄色葡萄球菌菌株)、VRSA(万古霉素抗性金黄色葡萄球菌菌株)和其它抗性表型可以通过加入适当的抗生素而检测，所述抗生素特别选自β-内酰胺、头孢菌素、糖肽、氨基葡糖苷、喹诺酮、多肽等。
下述实施例是作为解释而给出，其实质上不以任何方式进行限制。它们使得能够更清楚地理解本发明。
实验1：用于鉴别金黄色葡萄球菌特点的β-D-核糖苷酶的底物之评估：
以下培养基在200ml Columbia琼脂基础(Oxoid)中制备，其组合了生色β-D-核糖苷酶底物。用于该培养基中的各种底物及浓度和附加物如下表1中所述：
  生色底物   所用缩写   浓度mg/l   添加剂和浓度
  2-羟苯基-β-D-核糖苷   儿茶酚-β-D-核糖苷   400   柠檬酸铁铵100mg/l
  5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷   品红-β-D-核糖苷   100   -
  二羟基黄酮-β-D-核糖苷   DHF-β-D-核糖苷   400   柠檬酸铁铵100mg/l
  5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷   X-β-D-核糖苷   80和200   -
  6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷   粉红-β-D-核糖苷   100和200   -
  4-甲基伞形酮基-β-D-核糖苷   4-MU-β-D-核糖苷   50   -
表1：所用生色β-D-核糖苷酶底物的缩写和浓度
β-D-核糖苷酶底物溶解在DMSO中并加入培养基中以获得表1所示浓度。
191个细菌菌株以0.5MacFarland的悬液稀释至1/1000接种到每个培养基上。培养皿置于37℃温育，继而读数。
培养基分配到Petri培养皿中，然后用大约100000CFU接种，继而在37℃温育48小时。在温育18、24和48小时后目测所形成的菌落。
191个菌株原种包括：79个MRSA，48个葡萄球菌种，61个肠球菌种和3个α-溶血性链球菌。
获得的结果在下表中示出。
Figure GPA00001141097000081
表2：各种β-D-核糖苷酶底物的评估
所有培养基均能清楚地检测金黄色葡萄球菌。
包含底物儿茶酚-β-D-核糖苷或者X-β-核糖苷的反应培养基最具特异性且最灵敏，因为对儿茶酚-β-D-核糖苷仅温育18小时后以及对于X-β-D-核糖苷温育24小时后，它们就可以很好地检测金黄色葡萄球菌(MRSA和MSSA)，且在凝固酶阴性葡萄球菌中仅有3％的假阳性。
含有DHF-β-D-核糖苷的培养基也是非常灵敏的，但是具有较少的特异性，因为是β-核糖苷酶阳性的凝固酶阴性葡萄球菌的百分比在24小时时是68％，在48小时时是91％。
实验2：儿茶酚-β-D-核糖苷在一种液体培养基中的评估
以下培养基具有与chromID S.aureus base(bioMérieux)相同的组成，不含选择剂和琼脂以获得液体培养基。底物和诱导物在高压灭菌前用溶解在DMSO中的300ml/g儿茶酚-β-D-核糖苷和500mg/l的柠檬酸铁铵取代。培养基继而被分配在试管中，比例为每个试管1.5ml。
对于这种培养基，用在37℃准备了24小时的预培养物接种。制备0.5McF的生理盐水悬液，继而用10μl细菌悬液接种每个试管。
在37℃温育24和48小时后读数。
总共11个葡萄球菌菌株被测试：5个金黄色葡萄球菌和6个葡萄球菌属其它物种(凝固酶阴性)。所得结果记录在下表3中。
Figure GPA00001141097000091
表3：儿茶酚-β-D-核糖苷在液体培养基中的评估
在固体培养中获得的并显示儿茶酚-β-D-核糖苷对金黄色葡萄球菌的高特异性的结果也在液体培养基中获得确认：在18小时起观察到金黄色葡萄球菌100％着色，而葡萄球菌属其它物种无一被检测到。
实验3：对于用底物儿茶酚-β-D-核糖苷和X-β-D-核糖苷对广泛的葡萄球菌属菌种获得的结果的确认
为了确认包含底物儿茶酚-β-D-核糖苷或者底物X-β-D-核糖苷的反应培养基的相关性，还进行了下述实验：
儿茶酚-β-D-核糖苷：使用补加了300mg/l儿茶酚-β-D-核糖苷、然后高压灭菌且含有500mg/l柠檬酸铁铵的GTS培养基(bioMérieux)，此培养基被分配于直径55mm的Petri培养皿中。
X-β-D-核糖苷：使用修改的Chapman培养基，其不含NaCl、高压灭菌并补加60mg/l的X-β-D-核糖苷，此培养基被分配于直径55mm的Petri培养皿中。
对于这两种培养基，用37℃准备了24h的预培养物接种。制备0.5McF的在生理盐水中的悬液，然后用10μl的已校准接种环将每个菌株接种到培养皿上。
在37℃温育24和48小时后读数。
总共90个葡萄球菌被测试：34个金黄色葡萄球菌，包括25个MRSA，及46个葡萄球菌其它物种(包括施氏葡萄球菌(S.schleiferi)；头状葡萄球菌(S.capitis)；猪葡萄球菌(S.hyicus)；中间葡萄球菌(S.intermedius)；溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)；耳葡萄球菌(S.auricularis)；人葡萄球菌(S.hominis)；沃氏葡萄球菌(S.warneri)；产色葡萄球菌(S.chromogenes)；科氏葡萄球菌(S.cohnii)；表皮葡萄球菌；松鼠葡萄球菌(S.sciuri)；木糖葡萄球菌(S.xylosus)；腐生葡萄球菌)。
获得的结果记录在表4中。
Figure GPA00001141097000101
表4：底物儿茶酚-β-D-核糖苷和X-β-D-核糖苷对广泛葡萄球菌菌株的评估
这个测试的结果显示出这两个底物从18小时开始对金黄色葡萄球菌的良好特异性。具体来说，在葡萄球菌属的13个其它物种中，仅4个非常次要的物种显出着色。这些是物种腐生葡萄球菌，木糖葡萄球菌，科氏葡萄球菌和松鼠葡萄球菌，其全部4个一起仅代表了4.4％的临床标本中所发现的葡萄球菌菌株，相比于金黄色葡萄球菌所占的23.3％(Kawamura et al.，1998，Distribution of Staphylococcus species among human clinical specimens andemended description of Staphylococcus caprae.J.Clin Microbial.36：2038-2042)。
实验4：通过直接检测凝胶培养基中β-D-核糖苷酶活性及另一糖苷酶活性来区分金黄色葡萄球菌与同一属的其它物种
以下培养基在高压灭菌的修改的Chapman培养基中制备，不含NaCl，并组合了β-核糖苷酶生色底物以及一种或两种其它代谢指示物的组合，即除了检测β-核糖苷酶活性之外的一种或两种生色底物。这些底物组合在下表中给出：
  缩写   β-D-核糖苷酶底物[浓度mg/L]   组合的底物[浓度mg/L]
  A   X-β-D-核糖苷[60mg/L]   粉红-β-葡糖苷[300mg/L]
B   X-β-D-核糖苷[60mg/L]   蓝色-β-半乳糖苷[600mg/L]
C X-β-D-核糖苷[100mg/L]   粉红-β-葡糖苷[150mg/L]蓝色-β-半乳糖苷[300mg/L]
表5：β-核糖苷酶生色底物和特异于其它酶活性的生色底物的各种组合的缩写
所述各种底物溶解在DMSO中并加入培养基中。
对于含有底物蓝色-β-半乳糖苷的培养基，加入溶解在渗透水中的IPTG以获得1mg/l的浓度。
所述培养基被分配于直径55mm的Petri培养皿中，并用在37℃准备了24h的预培养物接种。制备0.5McF的在生理盐水中的悬液，然后用10μl已校准的接种环将每个菌株接种到培养皿上。
在37℃温育18、24和48小时后读数。
总共28个葡萄球菌菌株被测试：5个MRSA和3个金黄色葡萄球菌，4个腐生葡萄球菌，4个科氏葡萄球菌，4个木糖葡萄球菌，4个松鼠葡萄球菌，2个表皮葡萄球菌以及2个溶血葡萄球菌。
在下表中，C代表温育后菌落着色，I代表这种着色的强度以及IT定义温育时间。着色强度是任意标度并可以由如下方式定义：
·符号“-”相应于活性缺失
·0.1相应于存在痕量着色
·0.5相应于存在非常浅的着色
·1相应于存在弱强度的清晰着色
·1.5相应于存在介于着色1和2之间的中间态着色
·2相应于存在中等强度的清晰着色
·2.5相应于存在介于着色2和3之间的中间态着色
·3相应于存在强着色
·3.5相应于存在介于着色3和4之间的中间态着色
·4相应于存在非常强的着色
测试结果见如下：
Figure GPA00001141097000121
Figure GPA00001141097000131
表6：底物各种组合的评估
上述结果显示温育18小时起可以用底物组合来区分金黄色葡萄球菌与表达β-D-核糖苷酶的其它葡萄球菌物种。
在48小时时仅1个腐生葡萄球菌菌株产生问题，但是在温育24小时时无混淆，因为金黄色葡萄球菌已经有很好的着色强度。
实验5：在选择性培养基上通过其β-核糖苷酶活性检测MRSA
使用修改的Chapman培养基并将其分配到直径55mm的Petri培养皿中，所述修改的Chapman培养基不含NaCl、已经高压灭菌并补加了100mg/l的X-β-D-核糖苷并且是选择性的，即包含代谢抑制调节物(LiCl，弧菌抑制化合物O/129、氨曲南和两性霉素)用于抑制MSSA和大多数其它葡萄球菌物种。
底物在加入到培养基中之前溶解于DMSO中。
用在37℃准备了24小时的预培养物进行接种。制备0.5McF的在生理盐水中的悬液，然后用10μl的已校准的接种环将每个菌株接种到培养皿上。
在37℃温育24和48小时后读数。
总共15个葡萄球菌菌株被测试：5个MRSA和2个MSSA，4个表皮葡萄球菌，1个科氏葡萄球菌，4个松鼠葡萄球菌和2个腐生葡萄球菌。
结果记录在下表7中。
Figure GPA00001141097000151
表7：在选择性培养基上通过其β-核糖苷酶活性检测MRSA
上述结果显示，在选择性培养基上，抑制MSSA和大多数其它葡萄球菌物种，可以区分MRSA，其具有青绿色着色。在这个培养基上生长的其它物种在这些培养条件下不显示任何着色。

Claims (15)

1.鉴别金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的反应培养基，其包含是β-核糖苷酶(beta ribosidase)底物的代谢指示物与至少一种其它代谢指示物和/或至少一种代谢调节物的组合。
2.权利要求1的反应培养基，其中所述代谢调节物选自糖苷酶(osidase)调节物、选择性化合物或者选择性化合物的混合物、抗生素或者一或多种抗生素和/或一或多种抗真菌剂的混合物。
3.权利要求1或2的反应培养基，其中所述其它代谢指示物是酶底物，优选糖苷酶、酯酶、肽酶、β-葡糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶底物。
4.权利要求3的反应培养基，其中所述酶底物选自β-葡糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶底物。
5.权利要求1-4任一项的反应培养基，其中所述β-核糖苷酶底物是β-呋喃核糖苷酶(beta ribofuranosidase)底物。
6.权利要求1-5任一项的反应培养基，其中所述β-核糖苷酶底物是选自如下的底物：2-羟苯基-β-D-呋喃核糖苷(儿茶酚-β-D-核糖苷)；品红-β-D-核糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；二羟基黄酮-β-D-核糖苷；X-β-D-核糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；粉红-β-D-核糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；6-溴-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；5-溴-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；6-氟-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；茜素-β-D-核糖苷；(P)-硝基苯基-β-D-核糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-核糖苷；萘酚-β-D-核糖苷；二氯氨基苯基-β-D-核糖苷。
7.权利要求6的反应培养基，其中所述β-呋喃核糖苷酶底物是2-羟苯基-β-D-呋喃核糖苷。
8.权利要求6的反应培养基，其中所述β-核糖苷酶底物是5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷。
9.是β-核糖苷酶底物的代谢指示物与至少一种其它代谢指示物和/或至少一种代谢调节物的组合用于鉴别金黄色葡萄球菌特征的应用。
10.权利要求9的应用，其中所述β-核糖苷酶底物是β-呋喃核糖苷酶底物。
11.权利要求9或10的应用，其中所述β-核糖苷酶底物是选自如下的底物：2-羟苯基-β-D-呋喃核糖苷(儿茶酚-β-D-核糖苷)；品红-β-D-核糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；二羟基黄酮-β-D-核糖苷；X-β-D-核糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；粉红-β-D-核糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；6-溴-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；5-溴-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；6-氟-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷；茜素-β-D-核糖苷；(P)-硝基苯基-β-D-核糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-核糖苷；萘酚-β-D-核糖苷；二氯氨基苯基-β-D-核糖苷。
12.权利要求11的应用，其中所述底物是5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷。
13.权利要求11的应用，其中所述底物是2-羟苯基-β-D-呋喃核糖苷。
14.一种检测和/或鉴定金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于其包括下述步骤：
a)提供权利要求1-8任一项的反应培养基，
b)用待测生物学样品接种该培养基，
c)允许温育，以及
d)鉴别金黄色葡萄球菌的存在。
15.权利要求14的方法，其特征在于其还包括确认步骤。
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