JP7479433B2 - クラスa型カルバペネマーゼ産生菌の検出方法および検出用多ウェルプレート - Google Patents
クラスa型カルバペネマーゼ産生菌の検出方法および検出用多ウェルプレート Download PDFInfo
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Description
(1)液体培地を用いて微量液体希釈法によりカルバペネマーゼ産生菌を検出する方法であって、前記液体培地が以下の(a)および(b)であること、並びに、前記カルバペネマーゼ産生菌がクラスA型カルバペネマーゼ産生菌であることを特徴とするカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(a)メロペネム0.015~256μg/mLを含有する液体培地、
(b)メロペネム0.015~256μg/mLおよび、阻害剤としてクラブラン酸1~64μg/mLまたはタゾバクタム1~64μg/mLを含有する液体培地。
(2)前記液体培地に加え、さらに以下の(c)を用いること、並びに、前記カルバペネマーゼ産生菌が、クラスA型カルバペネマーゼ産生菌およびクラスBに属するカルバペネマーゼ(以下、クラスB型カルバペネマーゼという。)産生菌であることを特徴とする(1)に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(c)メロペネム0.015~256μg/mLおよび、阻害剤としてジピコリン酸(2,6-ピリジンジカルボン酸)(DPA)100~1600μg/mLを含有する液体培地。
(3)前記液体培地に加え、さらに以下の(d)および(e)を用いること、並びに、前記カルバペネマーゼ産生菌がクラスA型カルバペネマーゼ産生菌およびクラスB型カルバペネマーゼ産生菌であることを特徴とする(2)に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(d)イミペネム(IPM)0.015~256μg/mLを含有する液体培地、
(e)イミペネム0.015~256μg/mLおよび、阻害剤としてジピコリン酸100~1600μg/mLを含有する液体培地。
(4)前記液体培地に加え、さらに以下の(f)を用いること、並びに、前記カルバペネマーゼ産生菌が、クラスA型カルバペネマーゼ産生菌およびクラスDに属するカルバペネマーゼ(以下、クラスD型カルバペネマーゼという。)産生菌であることを特徴とする(1)に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(f)メロペネム0.015~256μg/mLおよび、阻害剤としてアビバクタム(AVI)1~64μg/mLを含有する液体培地。
(5)前記液体培地に加え、さらに以下の(f)を用いること、並びに、前記カルバペネマーゼ産生菌がクラスA型カルバペネマーゼ産生菌、クラスB型カルバペネマーゼ産生菌およびクラスD型カルバペネマーゼ産生菌であることを特徴とする(2)または(3)に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(f)メロペネム0.015~256μg/mLおよび、阻害剤としてアビバクタム1~64μg/mLを含有する液体培地。
(6)前記液体培地に加え、さらに以下の(g)を用いることを特徴とする(1)~(5)のいずれか1項に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(g)ラタモキセフ(LMOX)0.06~128μg/mLを含有する液体培地。
(7)前記液体培地がミュラーヒントンブイヨン培地、陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地、溶血添加ミュラーヒントンブイヨン培地、ハートインフュージョンブイヨン培地、普通ブイヨン培地およびトリプトソイブイヨン培地から選択されることを特徴とする(1)~(6)のいずれか1項に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(8)液体培地を収容するための複数のウェルからなる複数の収容部を備え、(1)~(7)のいずれか1項に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法に用いられる多ウェルプレートであって、前記複数の収容部が、各ウェルに以下の(a)を含む第1収容部および各ウェルに以下の(b)を含む第2収容部を含むことを特徴とする前記多ウェルプレート。
(a)メロペネム0.015~256μg/mLを含有する液体培地、
(b)メロペネム0.015~256μg/mLおよび、阻害剤としてクラブラン酸1~64μg/mLまたはタゾバクタム1~64μg/mLを含有する液体培地。
(9)各ウェルに含まれる前記液体培地が凍結されていることを特徴とする(8)に記載の多ウェルプレート。
(10)各ウェルに含まれる前記液体培地が乾燥固定化されていることを特徴とする(8)に記載の多ウェルプレート。
(11)液体培地を収容するための複数のウェルからなる複数の収容部を備え、(1)~(7)のいずれか1項に記載の方法に用いられる多ウェルプレートであって、前記複数の収容部が、各ウェルに以下の(a)を含み、各ウェルの薬剤が乾燥固定化されている第1収容部および各ウェルに以下の(b)を含み、各ウェルの薬剤が乾燥固定化されている第2収容部を含むことを特徴とする前記多ウェルプレート。
(a)使用時にメロペネム0.015~256μg/mLとなるように、調製された試薬組成物、
(b)使用時にメロペネム0.015~256μg/mLおよび、阻害剤としてクラブラン酸1~64μg/mLまたはタゾバクタム1~64μg/mLとなるように、調製された試薬組成物。
本発明の多ウェルプレートは、例えば、使用時にメロペネム0.015~256μg/mLとなるように、調製された試薬組成物が、多ウェルプレートの第1収容部の各ウェルに乾燥固定化され、使用時にメロペネム0.015~256μg/mLおよび、阻害剤としてクラブラン酸4μg/mLとなるように、調製された試薬組成物が、第2収容部の各ウェルに乾燥固定化された多ウェルプレートなどとして供給されうる。試薬組成物が基礎培地成分を含む場合は、多ウェルプレートの各ウェルに精製水などを添加して試薬組成物を溶解させて薬剤を含有する液体培地とし、本発明のカルバペネマーゼ検出法に用いられる。一方、試薬組成物が基礎培地成分を含まない場合は、多ウェルプレートの各ウェルに液体基礎培地を添加して試薬組成物を溶解させて薬剤を含有する液体培地とし、本発明のカルバペネマーゼ検出方法に用いられる。乾燥固定化方法としては、薬剤や培地成分が変質しない限り、特に制限されず、自然乾燥、送風乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥といった一般的な乾燥方法が挙げられる。乾燥固定化した多ウェルプレートの作製のための操作に関しても原則として全て無菌環境下で行う。
メロペネム(MEPM)を基質とし、阻害剤としてクラブラン酸(CVA)を組み合わせた微量液体希釈法において、クラスA型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されているクレブシエラ・ニューモニエ3株、大腸菌1株、およびクラスA型カルバペネマーゼ非産生菌として確認されている大腸菌2株、緑膿菌1株を供試菌として用い、クラスA型カルバペネマーゼ産生菌の検出性能を調べた。なお、以下には、陽性コントロールについて記載しないが、抗菌薬および阻害剤を含有しない陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地を陽性コントロールとして使用し、被検菌が問題なく発育することを確認している。
Clinical and Laboratory Standards Institute(以下、CLSIという。)で設定された標準法の微量液体希釈法に準じて、メロペネム0.015~32μg/mLを含有する陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地の2倍希釈系列を作成し、96穴マイクロプレートに100μLずつ分注した。同様に、その希釈系列にクラブラン酸1~64μg/mLを添加した陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地の2倍希釈系列を96穴マイクロプレートに100μLずつ分注した。作製したマイクロプレートの薬剤配列は、図8(薬剤配列1)に示したとおりである。なお、作製したマイクロプレートは-70℃で保存し、使用時に融解して用いた。
前培養した各菌株のコロニーを釣菌し、滅菌生理食塩水に懸濁させMcFarland No. 1の菌液を作製した後、滅菌生理食塩水で10倍希釈して接種用菌液とした。その後、前記接種用菌液を2.5μLずつ、(1)で準備したマイクロプレートの各ウェルに接種し(これにより、各ウェルの培地100μLあたりの最終接種菌量は約5×104CFU(colony forming unit)/ウェルになる)、35±2℃で18時間好気培養した。
培養後、それぞれのMICを測定し、判定を行った。MIC値の結果を以下の表1に示す。
メロペネム(MEPM)を基質とし、阻害剤としてタゾバクタム(TAZ)を組み合わせた微量液体希釈法において、クラスA型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されているクレブシエラ・ニューモニエ3株、大腸菌1株、およびクラスA型カルバペネマーゼ非産生菌として確認されている大腸菌2株、緑膿菌1株を供試菌として用い、クラスA型カルバペネマーゼ産生菌の検出性能を調べた。なお、以下には、陽性コントロールについて記載しないが、抗菌薬および阻害剤を含有しない陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地を陽性コントロールとして使用し、被検菌が問題なく発育することを確認している。
CLSIで設定された標準法の微量液体希釈法に準じて、メロペネム0.015~32μg/mLを含有する陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地の2倍希釈系列を作成し、96穴マイクロプレートに100μLずつ分注した。同様に、その希釈系列にタゾバクタム1~64μg/mLを添加した陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地の2倍希釈系列を96穴マイクロプレートに100μLずつ分注した。作製したマイクロプレートの薬剤配列は、図9(薬剤配列2)に示したとおりである。なお、作製したマイクロプレートは-70℃で保存し、使用時に融解して用いた。
前培養した各菌株のコロニーを釣菌し、滅菌生理食塩水に懸濁させMcFarland No. 1の菌液を作製した後、滅菌生理食塩水で10倍希釈して接種用菌液とした。その後、前記接種用菌液を2.5μLずつ、(1)で準備したマイクロプレートの各ウェルに接種し(これにより、各ウェルの培地100μLあたりの最終接種菌量は約5×104CFU/ウェルになる)、35±2℃で18時間好気培養した。
培養後、それぞれのMICを測定し、判定を行った。MIC値の結果を以下の表2に示す。
メロペネム(MEPM)を基質とし、阻害剤としてクラブラン酸(CVA)との組み合わせ、阻害剤としてジピコリン酸(DPA)との組み合わせ、および阻害剤としてアビバクタム(AVI)との組み合わせを用いた微量液体希釈法において、クラスA型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されているクレブシエラ・ニューモニエ3株および大腸菌1株、クラスB型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されているクレブシエラ・ニューモニエ1株、並びにクラスD型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されている大腸菌1株およびクレブシエラ・ニューモニエ1株を供試菌として用い、カルバペネマーゼ産生菌の検出性能を調べた。
CLSIで設定された標準法の微量液体希釈法に準じて、メロペネム0.001~256μg/mLを含有する陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地の2倍希釈系列を作成し、96穴マイクロプレートに100μLずつ分注した。同様に、その希釈系列にクラブラン酸4μg/mL、ジピコリン酸175μg/mL、またはアビバクタム4μg/mLを添加した陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地の2倍希釈系列を96穴マイクロプレートに100μLずつ分注した。作製したマイクロプレートの薬剤配列は、図10(薬剤配列3)に示したとおりである。なお、作製したマイクロプレートは-70℃で保存し、使用時に融解して用いた。
前培養した各菌株のコロニーを釣菌し、滅菌生理食塩水に懸濁させMcFarland No. 1の菌液を作製した後、滅菌生理食塩水で10倍希釈して接種用菌液とした。その後、前記接種用菌液を2.5μLずつ、(1)で準備したマイクロプレートの各ウェルに接種し(これにより、各ウェルの培地100μLあたりの最終接種菌量は約5×104CFU/ウェルになる)、35±2℃で18時間好気培養した。
培養後、それぞれのMICを測定し、メロペネム/クラブラン酸のMIC値とメロペネム単独のMIC値の差の閾値を2管以上とし、メロペネム/ジピコリン酸のMIC値とメロペネム単独のMIC値の差の閾値を2管以上とし、さらにメロペネム/アビバクタムのMIC値とメロペネム単独のMIC値の差の閾値を2管以上として判定を行った。
メロペネム(MEPM)を基質とし、阻害剤としてクラブラン酸(CVA)との組み合わせ、阻害剤としてジピコリン酸(DPA)との組み合わせ、および阻害剤としてアビバクタム(AVI)との組み合わせを用いた微量液体希釈法において、クラスA型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されている大腸菌1株、クラスB型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されているクレブシエラ・ニューモニエ1株、並びにクラスD型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されている大腸菌1株およびクレブシエラ・ニューモニエ1株を供試菌として用い、カルバペネマーゼ産生菌の検出性能を調べた。
CLSIで設定された標準法の微量液体希釈法に準じて、メロペネム0.015~32μg/mLを含有する陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地の2倍希釈系列を作成し、96穴マイクロプレートに100μLずつ分注した。同様に、その希釈系列にクラブラン酸4μg/mL、ジピコリン酸175μg/mL、またはアビバクタム4μg/mLを添加した陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地の2倍希釈系列を96穴マイクロプレートに100μLずつ分注した。作製したマイクロプレートの薬剤配列は、図11(薬剤配列4)に示したとおりである。なお、作製したマイクロプレートは-70℃で保存し、使用時に融解して用いた。
前培養した各菌株のコロニーを釣菌し、滅菌生理食塩水に懸濁させMcFarland No. 1の菌液を作製した後、滅菌生理食塩水で10倍希釈して接種用菌液とした。その後、前記接種用菌液を2.5μLずつ、(1)で準備したマイクロプレートの各ウェルに接種し(これにより、各ウェルの培地100μLあたりの最終接種菌量は約5×104CFU/ウェルになる)、35±2℃で18時間好気培養した。
培養後、それぞれのMICを測定し、メロペネム/クラブラン酸のMIC値とメロペネム単独のMIC値の差の閾値を2管以上とし、メロペネム/ジピコリン酸のMIC値とメロペネム単独のMIC値の差の閾値を2管以上とし、さらにメロペネム/アビバクタムのMIC値とメロペネム単独のMIC値の差の閾値を2管以上として判定を行った。
メロペネム(MEPM)を基質とし、阻害剤としてタゾバクタム(TAZ)との組み合わせ、阻害剤としてジピコリン酸(DPA)との組み合わせ、および阻害剤としてアビバクタム(AVI)との組み合わせを用いた微量液体希釈法において、クラスA型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されている大腸菌1株、クラスB型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されているクレブシエラ・ニューモニエ1株、並びにクラスD型カルバペネマーゼ産生菌であることが確認されている大腸菌1株およびクレブシエラ・ニューモニエ1株を供試菌として用い、カルバペネマーゼ産生菌の検出性能を調べた。
CLSIで設定された標準法の微量液体希釈法に準じて、メロペネム0.015~32μg/mLを含有する陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地の2倍希釈系列を作成し、96穴マイクロプレートに100μLずつ分注した。同様に、その希釈系列にタゾバクタム4μg/mL、ジピコリン酸175μg/mL、またはアビバクタム4μg/mLを添加した陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地の2倍希釈系列を96穴マイクロプレートに100μLずつ分注した。作製したマイクロプレートの薬剤配列は、図12(薬剤配列5)に示したとおりである。なお、作製したマイクロプレートは-70℃で保存し、使用時に融解して用いた。
前培養した各菌株のコロニーを釣菌し、滅菌生理食塩水に懸濁させMcFarland No. 1の菌液を作製した後、滅菌生理食塩水で10倍希釈して接種用菌液とした。その後、前記接種用菌液を2.5μLずつ、(1)で準備したマイクロプレートの各ウェルに接種し(これにより、各ウェルの培地100μLあたりの最終接種菌量は約5×104CFU/ウェルになる)、35±2℃で18時間好気培養した。
培養後、それぞれのMICを測定し、メロペネム/タゾバクタムのMIC値とメロペネム単独のMIC値の差の閾値を2管以上とし、メロペネム/ジピコリン酸のMIC値とメロペネム単独のMIC値の差の閾値を2管以上とし、さらにメロペネム/アビバクタムのMIC値とメロペネム単独のMIC値の差の閾値を2管以上として判定を行った。
Claims (9)
- 液体培地を用いて微量液体希釈法によりカルバペネマーゼ産生菌を検出する方法であって、前記液体培地が以下の(a)および(b)であること、並びに、前記カルバペネマーゼ産生菌が腸内細菌科細菌のクラスA型カルバペネマーゼ産生菌であることを特徴とするカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(a)メロペネムを希釈系列濃度で含有する液体培地であって、メロペネムの濃度が0.12μg/mL以上1μg/mL以下のすべての範囲に亘る希釈系列濃度を必ず含むものである液体培地、
(b)メロペネムを希釈系列濃度で含有する液体培地それぞれに、阻害剤として1μg/mL以上32μg/mL以下の範囲内の一定濃度のクラブラン酸または2μg/mL以上16μg/mL以下の範囲内の一定濃度のタゾバクタムを含有する液体培地であって、
メロペネムの濃度が0.03μg/mL以上0.25μg/mL以下のすべての範囲に亘る希釈系列濃度を必ず含むものである液体培地。 - 前記液体培地に加え、さらに以下の(f)を用いること、並びに、前記カルバペネマーゼ産生菌が、腸内細菌科細菌のクラスA型カルバペネマーゼ産生菌およびクラスD型カルバペネマーゼ産生菌であることを特徴とする請求項1に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(f)メロペネムを希釈系列濃度で含有する液体培地それぞれに、阻害剤として2μg/mL以上8μg/mL以下の範囲内の一定濃度のアビバクタムを含有する液体培地であって、
メロペネムの濃度が0.03μg/mL以上0.25μg/mL以下のすべての範囲に亘る希釈系列濃度を必ず含むものである液体培地。 - 阻害剤を含有せずメロペネムを含有する液体培地を用いた場合の最小発育阻止濃度(MIC)が0.125μg/mLより大きい腸内細菌科細菌をカルバペネマーゼ産生菌であるとする基準を用いることを特徴とする請求項1または2に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
- 液体培地を用いて微量液体希釈法によりカルバペネマーゼ産生菌を検出する方法であって、前記液体培地が以下の(a)および(b)であること、並びに、前記カルバペネマーゼ産生菌が腸内細菌科細菌のクラスA型カルバペネマーゼ産生菌であることを特徴とするカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(a)メロペネムを希釈系列濃度で含有する液体培地であって、メロペネムの濃度が0.03μg/mL以上1μg/mL以下のすべての範囲に亘る希釈系列濃度を必ず含むものである液体培地、
(b)メロペネムを希釈系列濃度で含有する液体培地それぞれに、阻害剤として1μg/mL以上32μg/mL以下の範囲内の一定濃度のクラブラン酸または2μg/mL以上16μg/mL以下の範囲内の一定濃度のタゾバクタムを含有する液体培地であって、
メロペネムの濃度が0.03μg/mL以上1μg/mL以下のすべての範囲に亘る希釈系列濃度を必ず含むものである液体培地。 - 前記液体培地に加え、さらに以下の(f)を用いること、並びに、前記カルバペネマーゼ産生菌が、腸内細菌科細菌のクラスA型カルバペネマーゼ産生菌およびクラスD型カルバペネマーゼ産生菌であることを特徴とする請求項4に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
(f)メロペネムを希釈系列濃度で含有する液体培地それぞれに、阻害剤として2μg/mL以上8μg/mL以下の範囲内の一定濃度のアビバクタムを含有する液体培地であって、
メロペネムの濃度が0.03μg/mL以上1μg/mL以下のすべての範囲に亘る希釈系列濃度を必ず含むものである液体培地。 - 前記液体培地がミュラーヒントンブイヨン培地、陽イオン調整ミュラーヒントンブイヨン培地、溶血添加ミュラーヒントンブイヨン培地、ハートインフュージョンブイヨン培地、普通ブイヨン培地およびトリプトソイブイヨン培地から選択されることを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
- 液体培地を収容するための複数のウェルからなる複数の収容部を備え、請求項1~6のいずれか1項に記載のカルバペネマーゼ産生菌の検出方法に用いられる多ウェルプレートであって、前記複数の収容部が、各ウェルに以下の(a)を含む第1収容部および各ウェルに以下の(b)を含む第2収容部を含むことを特徴とする前記多ウェルプレート。
(a)メロペネムを希釈系列濃度で含有する液体培地であって、メロペネムの濃度が0.12μg/mL以上1μg/mL以下のすべての範囲に亘る希釈系列濃度を必ず含むものである液体培地、
(b)メロペネムを希釈系列濃度で含有する液体培地それぞれに、阻害剤として1μg/mL以上32μg/mL以下の範囲内の一定濃度のクラブラン酸または2μg/mL以上16μg/mL以下の範囲内の一定濃度のタゾバクタムを含有する液体培地であって、
メロペネムの濃度が0.03μg/mL以上0.25μg/mL以下のすべての範囲に亘る希釈系列濃度を必ず含むものである液体培地。 - 各ウェルに含まれる前記液体培地が凍結されていることを特徴とする請求項7に記載の多ウェルプレート。
- 液体培地を収容するための複数のウェルからなる複数の収容部を備え、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法に用いられる多ウェルプレートであって、前記複数の収容部が、各ウェルに以下の(a’)を含み、各ウェルの薬剤が乾燥固定化されている第1収容部および各ウェルに以下の(b’)を含み、各ウェルの薬剤が乾燥固定化されている第2収容部を含むことを特徴とする前記多ウェルプレート。
(a’)カルバペネマーゼ産生菌検出のために微量液体希釈法による薬剤感受性試験を行う使用時、液体を添加して試薬組成物1を溶解させた際に、メロペネムを希釈系列濃度で含有する液体培地であって、メロペネムの濃度が0.12μg/mL以上1μg/mL以下のすべての範囲に亘る希釈系列濃度を必ず含むものである液体培地となるように、調製された前記試薬組成物1、
(b’)カルバペネマーゼ産生菌検出のために微量液体希釈法による薬剤感受性試験を行う使用時、液体を添加して試薬組成物2を溶解させた際に、メロペネムを希釈系列濃度で含有する液体培地それぞれに、阻害剤として1μg/mL以上32μg/mL以下の範囲内の一定濃度のクラブラン酸または2μg/mL以上16μg/mL以下の範囲内の一定濃度のタゾバクタムを含有する液体培地であって、
メロペネムの濃度が0.03μg/mL以上0.25μg/mL以下のすべての範囲に亘る希釈系列濃度を必ず含むものである液体培地となるように、調製された試薬組成物2。
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Also Published As
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