CN103403178A - 包含对氨基苯甲酸作为选择剂的微生物培养基 - Google Patents

Abstract

本发明的领域是分析复合样品中的靶微生物。本发明更具体地涉及用于检测至少一种靶微生物的培养基，其包含：至少一种天然或合成的发酵底物或酶活性底物，和抑制非靶微生物的至少一种选择剂，其由对氨基苯甲酸、其衍生物的一种或它们的盐的一种构成，其浓度在0.05和1g/L之间。

Description

包含对氨基苯甲酸作为选择剂的微生物培养基

本发明的领域是分析复合样品中的靶微生物。

更具体而言，本发明涉及利用含有对氨基苯甲酸作为选择剂的培养基来检测微生物，例如沙门氏(Salmonella)细菌。

在全球农业-食品工业中，市售产品的质量和安全性是主要的关注点。在原材料和成品中，必须能够检测、鉴定、和定量微生物群，从而从其制造到消费都保证产品的价值。重要的是，一方面要分辨产品质量指示物，其反映的是腐败菌群的总体污染率，其中有肠道菌，例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、凝固酶阳性的葡萄球菌、假单胞菌(Pseudomonas)、杆菌(Bacilli)、酵母菌、霉菌等，另一方面要检测病原菌，例如沙门氏菌或李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)。因此，从公共健康和产业的经济角度来看，微生物学分析是重要的。

样品中靶微生物检测的开发受到严格的约束，其必须在灵敏性和选择性之间寻求平衡，其中灵敏性定义为当待测样品中存在少量目标菌种时，能够检测出该目标菌种的能力，选择性定义为当待测样品中还含有其它菌种时，能够检测出目标菌种的能力。确保灵敏性和确保选择性的要素的组合使得可能实现特异性测试。

灵敏性标准通常需要利用培养靶微生物的组合物以使其可检出。因而通过将参与靶微生物代谢的标记分子掺入培养基能够提供特异性；这种相互作用产生可测量的信号。

另一方面，根据需要对特定种类还是全部的活微生物进行检测和计数，可以使用或不使用选择性培养基。

如果要寻找靶微生物，特别是细菌，显色培养基的使用越来越重要。该培养基的优势在于其含有可被靶细菌特异性切割或消化的酶底物，从而产生有色反应产物，其通常位于所述细菌的菌落中。这使得可能将所述靶细菌与样品中潜在存在的其他细菌种类区分开，特别是在农业-食品样品的情况下。这种培养基还使得可能对临床样品中含有的细菌菌种进行鉴定，所述菌种通常为感染源。

在农业-食品样品中寻找致病靶微生物的情况下，通常表现为靶微生物以远远低于非靶微生物的数量存在于微生物混合群中。除了简单地区分靶微生物与非靶微生物以外，还需要选择性地抑制所述非靶微生物的生长，以便能够检测靶微生物，否则即使所述靶微生物的菌落已着色，所述非靶微生物的生长仍将易于掩蔽所述靶微生物，从而导致假阴性结果。

具体地，需要能够将沙门氏菌属的细菌与其他细菌类型区分开来，特别是革兰氏阴性细菌，例如大肠埃希氏菌(E.coli)的细菌，其是样品中出现的共生菌。

为此目的，文献WO-A-96/30543记载了用于检测沙门氏菌的培养基，其包括β-半乳糖苷酶阳性肠道菌例如大肠埃希氏菌的显色底物和由沙门氏菌代谢、可产生酸性化合物的糖类混合物以及可显示培养基酸性的pH指示剂。此外，胆酸盐存在于培养基中，以选择性地抑制革兰氏阳性菌。

特异性检测沙门氏菌和区分革兰氏阴性菌的另一种方法描述于文献EP-B-1334175和EP-A-1325024中。该方法在于在培养基中使用所谓“自杀”底物形式的选择剂。这种底物实际上由所谓的“运送”部分和所谓的“毒性”部分组成，这些部分通过可被大肠埃希氏菌而不被沙门氏菌破坏的化学键互相连接，这导致所述毒性部分在大肠埃希氏菌内部被释放和浓缩，从而抑制其生长而有利于沙门氏菌的生长。选择的自杀底物为阿拉磷(alafosfalin)。

这种底物的主要缺点是其与培养基中存在的氨基酸竞争。而且，由于其对大量细菌菌种具有活性，因此需要有氨基酸含量相对低的培养基，这不会促进沙门氏属细菌的生长。此外，阿拉磷是相对昂贵的化合物，这极大地增加了培养基的价格。

本发明克服了这些缺点，提出了在培养基的溶液中包含对氨基苯甲酸作为选择剂。培养基在本申请中被定义为包含微生物存活和/或生长所必需的所有要素的介质，即氨基酸或蛋白水解物、矿物质、维生素以及通常本领域技术人员已知的能使微生物生长的所有的营养和代谢源。

非常令人惊讶的是，本发明人确实表明，将相对高浓度的对氨基苯甲酸添加至合适的培养基中，可以抑制或减慢特别是革兰氏阴性菌的生长，例如肠道细菌，而有利于沙门氏属细菌的生长。

更具体地，本发明涉及一种微生物培养基，其包含：

·至少一种天然或合成的发酵底物或酶活性底物，和

·至少一种选择剂，其由对氨基苯甲酸、其衍生物的一种或它们的盐的一种构成，其浓度在0.05和1g/L之间，优选在0.05和0.8g/L之间。

优选地，靶微生物是沙门氏菌属的细菌。

非靶微生物来自革兰氏阴性菌的组，特别地包括肠道细菌。

对氨基苯甲酸衍生物可以来自特别地包括4-氨基苯甲酸、4-(甲基氨基)苯甲酸、4-氨基-2-氯苯甲酸、4-氨基-3-硝基苯甲酸、4-氨基水杨酸的组。

可接受的盐可以是例如钾盐或钠盐。因此，4-氨基苯甲酸钾或4-氨基苯甲酸钠可以用作化合物。

有利地，根据本发明的培养基包含至少一种显色酶底物或荧光酶底物。

优选地，根据本发明的培养基进一步包含胆酸盐。例如，其可以包括脱氧胆酸钠。

有利地，所述培养基可以包含至少一种其他的选择剂，其来自包括新生霉素、万古霉素、两性霉素、头孢磺啶的组。

在本发明的术语范围之内，底物选自能够水解成某种产物的任何底物，这使得能够直接或间接检测对目标微生物特异的酶活性。在直接检测的情况下，底物包括对所述酶活性具有特异性的第一部分和可显色或发荧光的用作标记的第二部分。

底物同样可以为代谢性底物，例如碳源或氮源，其降解产物可以改变pH，这种改变可以用pH指示剂检测。pH指示剂是一种化学物质，其颜色随着与微生物生长相关的pH变化而改变。pH指示剂的实例可以涉及中性红、苯胺蓝、溴甲酚紫蓝。在第二个具体实施方式中，所述pH指示剂为荧光团(例如4-甲基伞形酮、香豆素、或试卤灵衍生物)。

在本发明的术语范围之内，选择剂被理解为是指可能促进靶微生物生长和/或抑制一或多种非靶微生物生长的任何化合物。

本发明所述的培养基，可以是即用型的粉末形式、凝胶形式或液体形式，即可直接接种到管、瓶中或培养皿上。在凝胶型培养基的情况下，琼脂是微生物学用于培养微生物的常规凝胶剂，但也可以使用另一种凝胶剂，例如明胶或琼脂糖。最后，培养基可以包装在瓶中、筒中或特别用于自动化细菌学装置的卡片中。例如，由本申请人市售的

卡、

卡和瓶。

本发明还涉及对靶细胞和非靶细胞的混合群中的靶微生物进行检测的方法，其包括下列步骤：

·使期望揭示其中的所述靶微生物的样品与本发明所述的培养基接触，

·在促进所述靶微生物繁殖的温度下整体温育，

·在所述的培养基上观察所述微生物。

促进微生物生长的温度在20和44℃之间，将所述样品在该温度下保持足以允许检测微生物的时期，即在2-96小时之间的时期。至于温育的气体，优选是有氧的，但也可以是无氧的或者在CO₂中。通过观察未扩散至培养基即集中在菌落中的颜色变化，用肉眼来进行鉴定。如果显示为荧光，则使用本领域技术人员已知的荧光检测设备。

本发明所述的培养基和检测方法可以用于食品、环境或临床来源的样品。样品定义为用于分析的实体中分离的小部分或小量的实体。

食品来源的样品中，非穷举性的涉及乳制品(酸奶、奶酪等)、肉、鱼、蛋、水果、蔬菜、水、饮料(牛奶、果汁、汽水等)的样品。最后，食品样品可以来自于动物饲料，例如特别是动物食品。

还可以是环境样品，例如表面、水和空气样本。

临床来源的样品可以对应于全血、血清、血浆、尿液、粪便、脑脊液的样本，鼻、喉、皮肤、伤口、器官、组织、或分离的细胞的样本等。

最后，本发明涉及对氨基苯甲酸、其衍生物的一种或它们的盐的一种用作选择剂的体外用途。有利地，其以0.05和1g/L之间，优选0.05和0.8g/L之间的浓度使用。

给出下列实施例是为了说明而绝非限制。其使得可以更好地理解本发明。

实施例

实施例1-用于检测沙门氏属细菌的培养基，其包含3种显色底物、抗生素的组合(新生霉素、头孢磺啶、万古霉素、两性霉素)以及不同浓度的对氨基苯甲酸(PABA)

1.测试培养基的制备

所述测试培养基如下：

·对照培养基：由申请人市售的

沙门氏菌培养基(编号43621)，其含有新生霉素、万古霉素、两性霉素和头孢磺啶以及3种显色底物

·培养基1：对照培养基，添加0.1g/L PABA，

·培养基2：对照培养基，添加0.3g/L PABA，

·培养基3：对照培养基，不添加抗生素但添加0.5g/L PABA，

这些培养基是90毫米培养皿中的培养基。

2.培养基的接种和观测

将不同沙门氏菌种或血清型的菌株(例如肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、伤寒沙门氏菌(S.thyphimurium)、古巴沙门氏菌(S.cubana)、鸡伤寒沙门氏菌(S.gallinarum)、副伤寒沙门氏菌(S.parathyphi))和其他属的细菌例如革兰氏阴性菌(大肠杆菌(E.coli)、肠道杆菌(Enterobacter)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、变形杆菌(Proteus)、哈夫尼亚菌(Hafnia))(均来自申请人的保藏)悬浮于生理学水中，然后依照四分体技术将其接种于培养基上。将菌株在37℃下温育24小时。在24小时温育之后，观测所形成的菌落。

3.结果：

所获结果示于下面表1中。

表1

这些结果显示了通过所有的培养基检测沙门氏菌的良好的灵敏性。然而，仅培养基1至3减少了其他革兰氏阴性菌的生长。

实施例2-用于检测沙门氏属细菌的培养基，其包含3种显色底物、选择性成分的组合(新生霉素、头孢磺啶、万古霉素、两性霉素、胆酸盐、脱氧胆酸钠)以及对氨基苯甲酸(PABA)

1.根据本发明的培养基的制备

实验中的测试培养基如下：

·对照培养基：

沙门氏菌培养基(编号43621)，其含有新生霉素、万古霉素、两性霉素、头孢磺啶、1.5g/L胆酸盐以及3种显色底物

·培养基1：对照培养基，添加0.1g/L PABA，胆酸盐增加至3g/L

·培养基2：对照培养基，添加0.1g/L PABA，胆酸盐增加至3g/L以及5g/L的脱氧胆酸钠

2.培养基的接种和观测

将属于沙门氏菌的不同菌种或血清型的菌株(例如肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、古巴沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌(S.arizonae))和其他属的细菌例如革兰氏阴性菌(沙雷氏菌、肠道杆菌、柠檬酸杆菌、变形杆菌、哈夫尼亚菌)(均来自申请人的保藏)悬浮于生理学水中，然后依照四分体技术将其接种于培养基上。将培养皿在37℃下温育24小时。在24小时温育之后，观测所形成的菌落。

3.结果：

所获结果示于下面表2中。

表2

这些结果显示了所有培养基用于寻找沙门氏菌的极好的灵敏性，其中通过配方2检测到了所有10种沙门氏菌株。

然而，仅培养基1和2使得可能减少除沙门氏菌以外的细菌属的生长。通过将PABA与胆酸盐例如脱氧胆酸钠结合，可以获得最佳的选择性。

Claims (11)

1.用于检测至少一种靶微生物的培养基，其包含：

·至少一种天然或合成的发酵底物或酶活性底物，和

·至少一种选择剂，其由对氨基苯甲酸、其衍生物的一种或它们的盐的一种构成，其浓度在0.05和1g/L之间，优选在0.05和0.8g/L之间。

2.根据权利要求1的培养基，其中所述靶微生物是沙门氏菌属的细菌。

3.根据权利要求1或2的培养基，其中非靶微生物来自特别地包括肠道细菌的组。

4.根据任一前述权利要求的培养基，其中所述对氨基苯甲酸的衍生物来自特别地包括4-氨基苯甲酸、4-(甲基氨基)苯甲酸、4-氨基-2-氯苯甲酸、4-氨基-3-硝基苯甲酸、4-氨基水杨酸的组。

5.根据任一前述权利要求的培养基，其进一步包含至少一种显色酶底物或荧光酶底物。

6.根据任一前述权利要求的培养基，其进一步包含胆酸盐。

7.根据任一前述权利要求的培养基，其包含脱氧胆酸钠作为胆酸盐。

8.根据任一前述权利要求的培养基，至少一种其他的选择剂来自包括新生霉素、万古霉素、两性霉素、头孢磺啶的组。

9.对靶细胞和非靶细胞的混合群中的靶微生物进行检测的方法，其包括下列步骤：

·将期望揭示其中的所述靶微生物的样品与根据权利要求1-8任一项的培养基接触，

·在促进所述微生物繁殖的温度下整体温育，

·在所述培养基上观测所述微生物。

10.对氨基苯甲酸、其衍生物的一种或它们的盐的一种在培养基中用作选择剂的体外用途。

11.根据前述权利要求的用途，其中所述对氨基苯甲酸、其衍生物的一种或它们的盐的一种以0.05和1g/L之间，优选0.05和0.8g/L之间的浓度存在于培养基中。