JP4437849B2 - 基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別方法 - Google Patents
基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は基質拡張型β−ラクタマーゼ（Extended Spectrum Beta-Lactamase、ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別方法およびそれに用いる鑑別用ディスクおよび鑑別用液体希釈培地に関する。
【０００２】
なお、本発明では次の略語を使用することがある。
【略語表】
ＥＳＢＬ：基質拡張型β−ラクタマーゼ
ＣＰＤＸ：セフポドキシム
ＣＡＺ：セフタジジム
ＣＴＸ：セフォタキシム
ＡＺＴ：アズトレオナム
ＣＴＲＸ：セフトリアキソン
ＣＶＡ：クラブラン酸
ＡＭＰＣ：アモキシシリン
ＳＢＴ：スルバクタム
ＴＡＺ：タゾバクタム
ＣＡＭＨＢ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Broth)
ＮＣＣＬＳ：米国臨床検査標準委員会 (National Commitee for Clinical Laboratory Standards)
ＭＩＣ：最小発育阻止濃度
【０００３】
【従来の技術】
β−ラクタマーゼは、β−ラクタム系抗菌薬を加水分解して不活化する酵素で、従来のβ−ラクタマーゼは第一、第二世代のβ−ラクタム剤を分解し、不活化していた。そこでこの酵素に対抗するために第三世代の薬剤が開発され使用されてきたが、最近これらの薬剤を分解する酵素を持った耐性菌が出現している。このように第一、第二世代のβ−ラクタム剤に対するβ−ラクタマーゼを持った菌が突然変異を起こし、その菌が産生する分解可能な基質の種類を広げた酵素を基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）と呼び、その菌がＥＳＢＬ産生菌と呼ばれている。
１９８０年代中頃から欧米を中心にＣＴＸやＣＡＺ等に耐性を示すＥＳＢＬ産生菌として肺炎桿菌や大腸菌が分離されるようになり臨床上の問題となっている。最近は日本においてもＥＳＢＬ産生菌が分離され、特に院内感染の原因菌として問題視されている。
ＥＳＢＬは、尿、喀痰、便などの臨床材料から分離されているが、その産生するＥＳＢＬは、欧米ではＴＥＭ型やＳＨＶ型の酵素が主であるが、日本ではＴｏｈｏ型が多く、またＫＩＴ型やＭＥＮ型も見られる。[1][2][3][4][5]。
【０００４】
このＥＳＢＬ産生菌の検出法としては種々の報告があるが、標準化された方法は無く、ＥＳＢＬ産生菌の確認に関しては未だ混乱した状態にあり、わずかにＮＣＣＬＳが示した暫定的検出案が実用可能な方法として示されているにすぎない。
ＮＣＣＬＳは、１９９９年１月に１年間の試用期間を定めて、ディスク法および微量液体希釈法による、暫定的な検出法、確認法のガイドライン（M100-S9）を公表した。[6][7]。
【０００５】
このＮＣＣＬＳのディスク法暫定案[6]は、スクリーニング試験法と確認試験法に分かれている。
スクリーニング試験はディスク拡散標準法に準拠して行われる。
それぞれ、ＣＰＤＸ １０μg、ＣＡＺ ３０μg、ＡＺＴ ３０μg、ＣＴＸ ３０μg、ＣＴＲＸ ３０μgを含有するディスクを用いて、試験菌を３５℃１６−１８時間ミューラーヒントン寒天培地上で好気培養し、形成される阻止円の直径を測定し、これらのディスクの阻止円径がどれか一つでも下記の基準以下の場合に「ＥＳＢＬ産生を疑う」とされている。
基準：ＣＰＤＸ ≦２２mm
ＣＡＺ ≦２２mm
ＡＺＴ ≦２７mm
ＣＴＸ ≦２７mm
ＣＴＲＸ ≦２５mm
【０００６】
確認試験もディスク拡散標準法に準拠して行われる。
ＣＡＺディスク（３０μg）とＣＡＺ／ＣＶＡディスク（３０μg／１０μg）との組合わせ、および、ＣＴＸディスク（３０μg）とＣＴＸ／ＣＶＡディスク（３０μg／１０μg）との組合わせを用い、スクリーニングでＥＳＢＬが疑われた試験菌を３５℃１６−１８時間ミューラーヒントン寒天培地上で好気培養し、形成される阻止円の直径を測定し、どちらかの組合せにおいてＣＶＡ添加ディスクの阻止円径が無添加ディスクより５mm以上大きいものをＥＳＢＬとしている。つまり、例えばＣＡＺディスクの阻止円が１６mmで、ＣＡＺ／ＣＶＡディスク阻止円が２１mmのとき、その菌はＥＳＢＬと判定される。
【０００７】
同様にＮＣＣＬＳの微量液体希釈法（ＭＩＣ法）暫定案[7]は、スクリーニング試験法と確認試験法に分かれている。
スクリーニング試験は微量液体希釈法標準法に準拠して行われる。
それぞれ、ＣＰＤＸ １μg/ml、ＣＡＺ １μg/ml、ＡＺＴ １μg/ml、ＣＴＸ １μg/ml、ＣＴＲＸ １μg/mlを含有するＣＡＭＨＢに、試験菌を接種し、３５℃１６−２０時間好気培養し、これらの薬剤のどれか一つでも試験菌が発育した場合に「ＥＳＢＬ産生を疑う」とされている。つまり、いずれかの薬剤で２μg/ml以上のＭＩＣを示した場合にＥＳＢＬ産生が疑われる。
【０００８】
確認試験も微量液体希釈法標準法に準拠して行われる。
ＣＡＭＨＢを基礎培地に用い、ＣＡＺを０．２５−１２８μg/ml含有する希釈系列とＣＡＺ／ＣＶＡを０．２５／４−１２８／４μg/ml含有する希釈系列との組合せ、および、ＣＴＸを０．２５−６４μg/ml含有する希釈系列とＣＴＸ／ＣＶＡを０．２５／４−６４／４μg/ml含有する希釈系列との組合せを用い、スクリーニングでＥＳＢＬが疑われた試験菌を接種し、３５℃１６−２０時間好気培養し、試験菌の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求め、どちらかの組合せにおいて薬剤単独のＭＩＣと合剤のＭＩＣが３管（８倍）以上差が出たものをＥＳＢＬとしている。つまり、例えばＣＡＺのＭＩＣが８μg/mlで、ＣＡＺ／ＣＶＡ合剤のＭＩＣが１μg/mlのとき、その菌はＥＳＢＬと判定される。
【０００９】
しかしこのＮＣＣＬＳ法は未だ暫定案であって、確定された標準法ではなく、また一般の病院や検査室ではＣＶＡの入手に問題があり、容易に実施できる試験方法ではない。
さらに、欧米と日本のＥＳＢＬの発現型の違い／頻度によるものと思われるが、日本型のＥＳＢＬではＣＡＺ／ＣＶＡ、ＣＴＸ／ＣＶＡを用いる確認試験では鑑別できないものが多数見られることが確認されている。[8]。
また[4]や[5]には、市販のＡＭＰＣ／ＣＶＡディスクを利用したダブルディスク法やその他の鑑別方法が記載されているが、それらはＮＣＣＬＳ法に準拠しておらず、また実験手技や判定に熟練を要する方法である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、手技や判定に熟練を要せず、ＮＣＣＬＳ法と同様の操作で容易にかつ正確にＥＳＢＬ産生菌を確認できる鑑別方法、およびそれに用いる鑑別用ディスクおよび鑑別用液体培地を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
かかる実状において本発明者らは鋭意努力の結果、β−ラクタマーゼの基質としてＣＰＤＸを用い、ＣＰＤＸとβ−ラクタマーゼ阻害剤を組み合わせると容易にＥＳＢＬが確認できることを見いだし、本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、
（１）ＣＰＤＸ含有ディスクとＣＰＤＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、を用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（２）ＣＰＤＸ含有ディスクとＣＰＤＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、および、以下の(1)(2)の群より選択される１以上の組合せを用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法
(1)ＣＡＺ含有ディスクとＣＡＺ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、
(2)ＣＴＸ含有ディスクとＣＴＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ
（３）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（１）（２）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（４）１ディスク当たりの薬剤量がそれぞれＣＰＤＸ ５−１５μg、ＣＡＺ ２０−４０μg、ＣＴＸ ２０−４０μg、のディスクと、
それぞれにβ−ラクタマーゼ阻害剤としてＣＶＡ ５−２０μgを添加したディスクとの組合せを用いる（１）−（３）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（５）直径６．３５mmの円形濾紙製のディスクを用いるＥＳＢＬ産生菌の鑑別法において、試験菌を接種したミューラーヒントン寒天培地平板上に、ＣＰＤＸ １０μgを含有する単剤ディスクと、ＣＰＤＸ １０μgおよびＣＶＡ １０μgを含有する合剤ディスクとを載せ、３５℃で１６−１８時間好気培養し、形成される阻止円の直径を測定し、合剤ディスクの阻止円が単剤ディスクの阻止円より５mm以上大きいとき、その菌をＥＳＢＬ産生菌と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法
（６）ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク
（７）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（６）記載のディスク
（８）１ディスク当たり、ＣＰＤＸ ５−１５μgおよびクラブラン酸ＣＶＡ ５−２０μgを含有する（７）記載のディスク、である。
【００１３】
つまり、本発明はＣＰＤＸ単剤を含有するディスクと、ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤の２薬剤を合わせて含有するディスクを組み合わせて用いることを特徴とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法であり、それに用いるディスクである。本法に使用可能なβ−ラクタマーゼ阻害剤としてはＣＶＡ、ＳＢＴ、ＴＡＺがあるが、その中でも本発明にはＣＶＡが好ましい。またＣＶＡはリチウム塩等の金属塩の形態で差し支えない。
また本法にＮＣＣＬＳ法に記載のＣＡＺとＣＡＺ／ＣＶＡディスクおよびＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組み合わせを加えて行うとさらに感度が向上する。
本発明に使用するディスクの材質は特に規定されない。各薬剤が含浸可能でかつ乾燥可能なもので、さらに使用時に各薬剤が培地中に放出される材質であれば種々の物質が使用可能である。またその形状および大きさも特に規定されない。それぞれの材質、形状、大きさに応じて、それぞれの判定基準を設定すれば良いのである。
もし、判定基準をＮＣＣＬＳと同様に設定するのであれば、材質は通常のＫＢディスクに用いるペーパー濾紙が適しており、その形状・大きさは直径６．３５mmの円形が好ましい。
本発明のＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクは製造方法に工夫を加えることにより安定化され、通常のＫＢディスクと同様に市場に流通可能である。
【００１４】
また本発明は、
（９）ＣＰＤＸ含有液体培地とＣＰＤＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、を用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（１０）ＣＰＤＸ含有液体培地とＣＰＤＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、および、以下の(1)(2)の群より選択される１以上の組合せを用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法
(1)ＣＡＺ含有液体培地とＣＡＺ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、
(2)ＣＴＸ含有液体培地とＣＴＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ
（１１）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（９）（１０）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（１２）ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/ml、ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/ml、ＣＴＸ ０．２５−１２８μg/ml、をそれぞれ含有する液体培地と、
それぞれにβ−ラクタマーゼ阻害剤としてＣＶＡ ２−１０μg/mlを添加した液体培地との組合せを用いる（９）−（１１）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（１３）薬剤を含有させたＣＡＭＨＢの希釈系列を用いる微量液体希釈法によるＥＳＢＬ産生菌の鑑別法において、ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/mlを含有する単剤液体培地と、ＣＰＤＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／４μg/mlを含有する合剤液体培地とに、試験菌を接種し、３５℃で１６−２０時間好気培養し、試験菌のＭＩＣを測定し、合剤液体培地のＭＩＣが単剤液体培地のＭＩＣより８倍以上小さいとき、その菌をＥＳＢＬ産生菌と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法
（１４）ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有する液体培地
（１５）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（１４）記載の液体培地
（１６）ＣＰＤＸ０．２５−１２８μg/mlおよびＣＶＡ２−１０μg/mlを含有する（１５）記載の液体培地、でもある。
【００１５】
つまり、本発明はＣＰＤＸ単剤を含有する液体培地と、ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤の２薬剤を合わせて含有する液体培地とを組み合わせて用いることを特徴とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法であり、それに用いる液体培地でもある。本法に使用可能なβ−ラクタマーゼ阻害剤としてはＣＶＡ、ＳＢＴ、ＴＡＺがあるが、その中でも本発明にはＣＶＡが好ましい。またＣＶＡはリチウム塩等の金属塩の形態で差し支えない。
また本法にＮＣＣＬＳ法に記載のＣＡＺとＣＡＺ／ＣＶＡ液体培地およびＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡ液体培地との組み合わせを加えて行うとさらに感度が向上する。
本発明に使用する液体培地は、試験菌の生育が阻害や促進されない液体培地で希釈系列の作成が容易なものであれば特に限定されない。それぞれの条件に応じて、それぞれの判定基準を設定すれば良いのである。
もし、ＭＩＣを測定し、判定基準をＮＣＣＬＳと同様に設定するのであれば、ＮＣＣＬＳと同様に、ＣＡＭＨＢが本発明には好ましい。
【００１６】
またさらに本発明の液体培地は、その希釈系列を９６穴プレート等の適当な容器に分注し、生培地として供給されても良いし、凍結保存や乾燥保存が可能であるので、凍結状態・乾燥状態で供給されても良い。
【００１７】
【作用】
本発明ではＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとを組み合わせて用いるだけで、ＥＳＢＬの検出が高率で可能であるがさらに、ＮＣＣＬＳ法に記載のＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスクとの組合せ、およびＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せとともに試験を行うとさらに検出率が増加する。
またディスク法のみならず、微量液体希釈法によるＭＩＣ測定にも応用可能であり、ＣＰＤＸ液体培地とＣＰＤＸ／ＣＶＡ液体培地の組合せにより、さらにＣＡＺとＣＡＺ／ＣＶＡ、ＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡとの組み合わせを併せて行うことにより、ＥＳＢＬを高率で検出できる。
ＥＳＢＬのような耐性菌の出現はそれぞれの地域で使用される薬剤の種類に左右されるものであるので、ヨーロッパ、米国、日本とでは汎用される抗菌薬の種類が異なり、ＥＳＢＬについてもβ−ラクタマーゼが作用する基質となる薬剤の種類はそれぞれの国により異なっているものと推定される。従っていわゆる日本型のＥＳＢＬの検出にはＣＰＤＸ／ＣＶＡが適しているものと推定される。
【００１８】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。なお、下記実施例は単に説明のためのものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００１９】
実施例１ ＣＶＡ含有ディスクの作成
ＮＣＣＬＳガイドライン[6]に従い、ビーチャム社より購入したＣＶＡを精製水に溶解し、１０００μg/mlの溶液を作成した。
栄研化学（株）製直径６．３５mmのＫＢディスクＣＰＤＸ（１０μg含有）、ＣＡＺ（３０μg含有）、ＣＴＸ（３０μg含有）にそれぞれ上記ＣＶＡ溶液１０μl（１０μg含有）を滴下し、５０℃で２０分間乾燥し、ＣＰＤＸ／ＣＶＡディスク（１０／１０μg含有）、ＣＡＺ／ＣＶＡディスク（３０／１０μg含有）、ＣＴＸ／ＣＶＡ（３０／１０μg含有）ディスクを作成した。
本ディスクは冷所保存(２−１０℃)で１年間使用可能であった。
【００２０】
実施例２ ＥＳＢＬ産生菌の阻止円直径の測定
ＥＳＢＬ産生菌であることが確認されている大腸菌２株、肺炎桿菌２株、およびＥＳＢＬではない大腸菌２株、肺炎桿菌２株を用いて、実施例１で作成したディスクを用いて、阻止円の直径を測定した。
純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを綿棒を用いてミューラーヒントン寒天培地表面に均一に接種した。その上にＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスク、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスク、ＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクを載せ、３５℃で１８時間好気培養し、それぞれの阻止円直径をシャーレの裏からmm単位で正確に測定した。結果を表１（ＥＳＢＬ産生菌）、表２（非ＥＳＢＬ産生菌）に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
各菌の阻止円直径は表１および表２に示すとおりであった。
表１（ＥＳＢＬ産生菌）において、各菌はＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいて、その阻止円径の差が５mm以上であるので、全てＥＳＢＬと判定された。ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいては、E.coli 4119株および K.pneumoniae 4135株は、その阻止円径の差が５mm以上であるので、ＥＳＢＬと判定されたが、E.coli 4138株および K.pneumoniae 4120株はその差が５mm未満であるのでＥＳＢＬとは判定されなかった。
ＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいては、各菌ともその阻止円径の差は５mm以上であった。
表２（非ＥＳＢＬ産生菌）において、各菌はＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスクとの組合せおよびＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいて、その阻止円径の差が５mm未満であるので、すべてＥＳＢＬとは判定されなかった。
ＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいても、各菌ともその阻止円径の差は５mm未満であった。
従って、ＮＣＣＬＳ法と同様に、本発明におけるＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとの阻止円直径の差が５mm以上の時、試験菌をＥＳＢＬ産生菌と判定することにした。
【００２４】
実施例３ ＥＳＢＬ産生菌および非産生菌の確認
ＰＣＲ法による耐性遺伝子の検出でＥＳＢＬ産生菌もしくは非産生菌であることが確認されているEscherichia coli １９株（内ＥＳＢＬ産生菌１３株）、Klebsiella pneumoniae ２３株（内ＥＳＢＬ産生菌１８株）を試験菌として用い、実施例２と同様に培養し、各阻止円の直径を測定し、ＣＶＡ含有ディスク阻止円径が無添加ディスクより５mm以上大きい菌をＥＳＢＬと判定した。結果を表３に示す。
表３においてtypeの欄にESBLsの記載のある菌はＰＣＲ法にてＥＳＢＬ産生菌であることが確認されている菌である。また各薬剤の欄でESBLの記載のある菌は、阻止円直径の差よりＥＳＢＬと判定された菌である。
【００２５】
【表３】
【００２６】
上表において、感度とは（ＥＳＢＬと正しく判定された菌数）／（全ＥＳＢＬ産生菌数）を表し、特異性とは（非ＥＳＢＬと正しく判定された菌数）／（全非ＥＳＢＬ産生菌数）を表し、一致率とは（ＥＳＢＬ・非ＥＳＢＬを正しく判定された菌数）／（全検体数）を表している。言い換えれば、感度はＥＳＢＬがＥＳＢＬとして判定される確率をいい、特異性はＥＳＢＬでないものがＥＳＢＬでないと判定される確率をいい、一致率はそれぞれが正しく判定される確率を表す。つまりＣＰＤＸで言えば、感度は２９／３１＝９４％となり、特異性は１１／１１＝１００％となり、一致率は４０／４２＝９５％となる。
【００２７】
上表に示すようにＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとの組合せで９４％の感度が得られた。さらにＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスク、ＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せの結果を加えるとE.coli 4173株もＥＳＢＬと判定されるので感度は９７％に増加する。
ＮＣＣＬＳ法に従って、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスク、ＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せのみで判定すると感度は６５％に留まり、ＮＣＣＬＳ法では問題があることが解る。
【００２８】
実施例４ 患者検体の判定
ＥＳＢＬ産生菌感染が疑われる患者５名の糞便検体より、大腸菌を分離し、実施例２と同様に操作し、それぞれの阻止円直径を測定し、判定を行った。結果を表４に示す。
【００２９】
【表４】
検体１−４はＥＳＢＬ産生菌と判定された。検体４はＮＣＣＬＳ法ではＥＳＢＬとは判定されず、本法によりＥＳＢＬが判明した。
【００３０】
実施例５ 微量液体希釈法（ＭＩＣ測定）によるＥＳＢＬ産生菌および非産生菌の確認
実施例３で使用したＥＳＢＬ産生菌もしくは非産生菌であることが確認されているEscherichia coli １９株（内ＥＳＢＬ産生菌１３株）、Klebsiella pneumoniae ２３株（内ＥＳＢＬ産生菌１８株）を試験菌として用い、ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）とＣＰＤＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／４μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）の組合せと、ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/mlとＣＡＺＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／４μg/mlの組合せ、ＣＴＸ ０．２５−１２８μg/mlとＣＴＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／４μg/mlの組合せを用い、ＮＣＣＬＳガイドラインに従い、微量液体希釈法で試験菌を培養し、ＭＩＣを測定した。
２倍希釈で作成した各薬剤濃度のＣＡＭＨＢ液体培地を９６穴のマイクロタイタープレートに１００μlずつ分注した。純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを希釈し、培地１mlあたりの菌数が約１０4個になるように各穴に接種し、３５℃で１８時間好気培養したのち、それぞれの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。合剤のＭＩＣが単剤のＭＩＣより３管（８倍）以上離れているものをＥＳＢＬと判定した。結果を表５に示す。
【００３１】
【表５】
【００３２】
実施例３と同様の結果が得られ、本発明は微量液体希釈法でも高い感度、一致率を示した。またＣＰＤＸの結果にＣＡＺおよびＣＴＸの結果を加えると、実施例３と同様に、E.coli 4173株もＥＳＢＬと判定されるので感度は９７％に増加する。
ＮＣＣＬＳ法の組合せのみで判定すると感度は６５％に留まる。
【００３３】
【発明の効果】
ＮＣＣＬＳのディスクを用いる方法では、試験を行う度にＣＶＡ溶液を作製し、ＣＡＺとＣＴＸのディスクに所定の濃度を添加する必要があり、操作が煩雑である。また、溶解したＣＶＡは安定性が悪く、十分な管理を行わなければ判定結果に影響を及ぼす。
本発明の合剤ディスクは薬剤の安定性が改良され、乾燥状態であれば冷所で１年間使用可能であるので、要時調製の煩雑さが無く、安定した成績が得られる。また本発明の液体培地は、９６穴プレート等の適当な容器に分注し、生培地として供給されても良いし、凍結保存や乾燥保存が可能であるので、凍結状態・乾燥状態で供給されても良い。その結果、面倒な要時調製が不要となる。
【００３４】
耐性菌、特にＥＳＢＬのような耐性菌の出現はそれぞれの地域で使用される薬剤の種類に左右される。医療保険制度などの関連でヨーロッパ、米国、日本とでは汎用される抗菌薬の種類が異なり、ＥＳＢＬについてもβ−ラクタマーゼが作用する基質となる薬剤の種類はそれぞれの国により異なっている。ＮＣＣＬＳのＥＳＢＬの確認法では基質としてＣＡＺとＣＴＸを用いているが、これは米国での薬剤の使用状況を基本に作成されているためと考えられ、いわゆる日本型のＥＳＢＬの実状に適合していない。日本国内では投与量等の関係上これら２薬剤よりもＣＰＤＸの使用頻度が高いため、ＥＳＢＬの検査を目的とした基質としてはＣＰＤＸを用いる方が、より確実にＥＳＢＬの鑑別が可能になる。
ＥＳＢＬ産生菌感染症は治療しうる抗菌薬が存在する。従って、的確な診断と適切な抗菌薬の選択を行えば、ＭＲＳＡやＶＲＥと異なり、治療が比較的容易である。本発明により、ＥＳＢＬ産生菌の存在が容易に確認でき、より効果的な治療や耐性菌の蔓延を防ぐことができる。
【００３５】
【参考文献】
[1]医学の歩み、１８５（５）、３１３、１９９８
[2]臨床と微生物、２６（２）、１０３、１９９９
[3]臨床と微生物、２６（２）、１２１、１９９９
[4]臨床と微生物、２６（２）、１４７、１９９９
[5]Medical Technology、２７（４）、３５３、１９９９
[6]NCCLS Document、１９（１）、３６、１９９９
[7]NCCLS Document、１９（１）、７５、１９９９
[8]内部データ、第４７回日本化学療法学会総会（１９９９年６月１１−１２日、東京）において発表予定
【発明の属する技術分野】
本発明は基質拡張型β−ラクタマーゼ（Extended Spectrum Beta-Lactamase、ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別方法およびそれに用いる鑑別用ディスクおよび鑑別用液体希釈培地に関する。
【０００２】
なお、本発明では次の略語を使用することがある。
【略語表】
ＥＳＢＬ：基質拡張型β−ラクタマーゼ
ＣＰＤＸ：セフポドキシム
ＣＡＺ：セフタジジム
ＣＴＸ：セフォタキシム
ＡＺＴ：アズトレオナム
ＣＴＲＸ：セフトリアキソン
ＣＶＡ：クラブラン酸
ＡＭＰＣ：アモキシシリン
ＳＢＴ：スルバクタム
ＴＡＺ：タゾバクタム
ＣＡＭＨＢ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Broth)
ＮＣＣＬＳ：米国臨床検査標準委員会 (National Commitee for Clinical Laboratory Standards)
ＭＩＣ：最小発育阻止濃度
【０００３】
【従来の技術】
β−ラクタマーゼは、β−ラクタム系抗菌薬を加水分解して不活化する酵素で、従来のβ−ラクタマーゼは第一、第二世代のβ−ラクタム剤を分解し、不活化していた。そこでこの酵素に対抗するために第三世代の薬剤が開発され使用されてきたが、最近これらの薬剤を分解する酵素を持った耐性菌が出現している。このように第一、第二世代のβ−ラクタム剤に対するβ−ラクタマーゼを持った菌が突然変異を起こし、その菌が産生する分解可能な基質の種類を広げた酵素を基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）と呼び、その菌がＥＳＢＬ産生菌と呼ばれている。
１９８０年代中頃から欧米を中心にＣＴＸやＣＡＺ等に耐性を示すＥＳＢＬ産生菌として肺炎桿菌や大腸菌が分離されるようになり臨床上の問題となっている。最近は日本においてもＥＳＢＬ産生菌が分離され、特に院内感染の原因菌として問題視されている。
ＥＳＢＬは、尿、喀痰、便などの臨床材料から分離されているが、その産生するＥＳＢＬは、欧米ではＴＥＭ型やＳＨＶ型の酵素が主であるが、日本ではＴｏｈｏ型が多く、またＫＩＴ型やＭＥＮ型も見られる。[1][2][3][4][5]。
【０００４】
このＥＳＢＬ産生菌の検出法としては種々の報告があるが、標準化された方法は無く、ＥＳＢＬ産生菌の確認に関しては未だ混乱した状態にあり、わずかにＮＣＣＬＳが示した暫定的検出案が実用可能な方法として示されているにすぎない。
ＮＣＣＬＳは、１９９９年１月に１年間の試用期間を定めて、ディスク法および微量液体希釈法による、暫定的な検出法、確認法のガイドライン（M100-S9）を公表した。[6][7]。
【０００５】
このＮＣＣＬＳのディスク法暫定案[6]は、スクリーニング試験法と確認試験法に分かれている。
スクリーニング試験はディスク拡散標準法に準拠して行われる。
それぞれ、ＣＰＤＸ １０μg、ＣＡＺ ３０μg、ＡＺＴ ３０μg、ＣＴＸ ３０μg、ＣＴＲＸ ３０μgを含有するディスクを用いて、試験菌を３５℃１６−１８時間ミューラーヒントン寒天培地上で好気培養し、形成される阻止円の直径を測定し、これらのディスクの阻止円径がどれか一つでも下記の基準以下の場合に「ＥＳＢＬ産生を疑う」とされている。
基準：ＣＰＤＸ ≦２２mm
ＣＡＺ ≦２２mm
ＡＺＴ ≦２７mm
ＣＴＸ ≦２７mm
ＣＴＲＸ ≦２５mm
【０００６】
確認試験もディスク拡散標準法に準拠して行われる。
ＣＡＺディスク（３０μg）とＣＡＺ／ＣＶＡディスク（３０μg／１０μg）との組合わせ、および、ＣＴＸディスク（３０μg）とＣＴＸ／ＣＶＡディスク（３０μg／１０μg）との組合わせを用い、スクリーニングでＥＳＢＬが疑われた試験菌を３５℃１６−１８時間ミューラーヒントン寒天培地上で好気培養し、形成される阻止円の直径を測定し、どちらかの組合せにおいてＣＶＡ添加ディスクの阻止円径が無添加ディスクより５mm以上大きいものをＥＳＢＬとしている。つまり、例えばＣＡＺディスクの阻止円が１６mmで、ＣＡＺ／ＣＶＡディスク阻止円が２１mmのとき、その菌はＥＳＢＬと判定される。
【０００７】
同様にＮＣＣＬＳの微量液体希釈法（ＭＩＣ法）暫定案[7]は、スクリーニング試験法と確認試験法に分かれている。
スクリーニング試験は微量液体希釈法標準法に準拠して行われる。
それぞれ、ＣＰＤＸ １μg/ml、ＣＡＺ １μg/ml、ＡＺＴ １μg/ml、ＣＴＸ １μg/ml、ＣＴＲＸ １μg/mlを含有するＣＡＭＨＢに、試験菌を接種し、３５℃１６−２０時間好気培養し、これらの薬剤のどれか一つでも試験菌が発育した場合に「ＥＳＢＬ産生を疑う」とされている。つまり、いずれかの薬剤で２μg/ml以上のＭＩＣを示した場合にＥＳＢＬ産生が疑われる。
【０００８】
確認試験も微量液体希釈法標準法に準拠して行われる。
ＣＡＭＨＢを基礎培地に用い、ＣＡＺを０．２５−１２８μg/ml含有する希釈系列とＣＡＺ／ＣＶＡを０．２５／４−１２８／４μg/ml含有する希釈系列との組合せ、および、ＣＴＸを０．２５−６４μg/ml含有する希釈系列とＣＴＸ／ＣＶＡを０．２５／４−６４／４μg/ml含有する希釈系列との組合せを用い、スクリーニングでＥＳＢＬが疑われた試験菌を接種し、３５℃１６−２０時間好気培養し、試験菌の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求め、どちらかの組合せにおいて薬剤単独のＭＩＣと合剤のＭＩＣが３管（８倍）以上差が出たものをＥＳＢＬとしている。つまり、例えばＣＡＺのＭＩＣが８μg/mlで、ＣＡＺ／ＣＶＡ合剤のＭＩＣが１μg/mlのとき、その菌はＥＳＢＬと判定される。
【０００９】
しかしこのＮＣＣＬＳ法は未だ暫定案であって、確定された標準法ではなく、また一般の病院や検査室ではＣＶＡの入手に問題があり、容易に実施できる試験方法ではない。
さらに、欧米と日本のＥＳＢＬの発現型の違い／頻度によるものと思われるが、日本型のＥＳＢＬではＣＡＺ／ＣＶＡ、ＣＴＸ／ＣＶＡを用いる確認試験では鑑別できないものが多数見られることが確認されている。[8]。
また[4]や[5]には、市販のＡＭＰＣ／ＣＶＡディスクを利用したダブルディスク法やその他の鑑別方法が記載されているが、それらはＮＣＣＬＳ法に準拠しておらず、また実験手技や判定に熟練を要する方法である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、手技や判定に熟練を要せず、ＮＣＣＬＳ法と同様の操作で容易にかつ正確にＥＳＢＬ産生菌を確認できる鑑別方法、およびそれに用いる鑑別用ディスクおよび鑑別用液体培地を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
かかる実状において本発明者らは鋭意努力の結果、β−ラクタマーゼの基質としてＣＰＤＸを用い、ＣＰＤＸとβ−ラクタマーゼ阻害剤を組み合わせると容易にＥＳＢＬが確認できることを見いだし、本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、
（１）ＣＰＤＸ含有ディスクとＣＰＤＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、を用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（２）ＣＰＤＸ含有ディスクとＣＰＤＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、および、以下の(1)(2)の群より選択される１以上の組合せを用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法
(1)ＣＡＺ含有ディスクとＣＡＺ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ、
(2)ＣＴＸ含有ディスクとＣＴＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスクとの組合せ
（３）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（１）（２）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（４）１ディスク当たりの薬剤量がそれぞれＣＰＤＸ ５−１５μg、ＣＡＺ ２０−４０μg、ＣＴＸ ２０−４０μg、のディスクと、
それぞれにβ−ラクタマーゼ阻害剤としてＣＶＡ ５−２０μgを添加したディスクとの組合せを用いる（１）−（３）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（５）直径６．３５mmの円形濾紙製のディスクを用いるＥＳＢＬ産生菌の鑑別法において、試験菌を接種したミューラーヒントン寒天培地平板上に、ＣＰＤＸ １０μgを含有する単剤ディスクと、ＣＰＤＸ １０μgおよびＣＶＡ １０μgを含有する合剤ディスクとを載せ、３５℃で１６−１８時間好気培養し、形成される阻止円の直径を測定し、合剤ディスクの阻止円が単剤ディスクの阻止円より５mm以上大きいとき、その菌をＥＳＢＬ産生菌と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法
（６）ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク
（７）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（６）記載のディスク
（８）１ディスク当たり、ＣＰＤＸ ５−１５μgおよびクラブラン酸ＣＶＡ ５−２０μgを含有する（７）記載のディスク、である。
【００１３】
つまり、本発明はＣＰＤＸ単剤を含有するディスクと、ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤の２薬剤を合わせて含有するディスクを組み合わせて用いることを特徴とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法であり、それに用いるディスクである。本法に使用可能なβ−ラクタマーゼ阻害剤としてはＣＶＡ、ＳＢＴ、ＴＡＺがあるが、その中でも本発明にはＣＶＡが好ましい。またＣＶＡはリチウム塩等の金属塩の形態で差し支えない。
また本法にＮＣＣＬＳ法に記載のＣＡＺとＣＡＺ／ＣＶＡディスクおよびＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組み合わせを加えて行うとさらに感度が向上する。
本発明に使用するディスクの材質は特に規定されない。各薬剤が含浸可能でかつ乾燥可能なもので、さらに使用時に各薬剤が培地中に放出される材質であれば種々の物質が使用可能である。またその形状および大きさも特に規定されない。それぞれの材質、形状、大きさに応じて、それぞれの判定基準を設定すれば良いのである。
もし、判定基準をＮＣＣＬＳと同様に設定するのであれば、材質は通常のＫＢディスクに用いるペーパー濾紙が適しており、その形状・大きさは直径６．３５mmの円形が好ましい。
本発明のＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクは製造方法に工夫を加えることにより安定化され、通常のＫＢディスクと同様に市場に流通可能である。
【００１４】
また本発明は、
（９）ＣＰＤＸ含有液体培地とＣＰＤＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、を用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（１０）ＣＰＤＸ含有液体培地とＣＰＤＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、および、以下の(1)(2)の群より選択される１以上の組合せを用いるＥＳＢＬ産生菌鑑別法
(1)ＣＡＺ含有液体培地とＣＡＺ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ、
(2)ＣＴＸ含有液体培地とＣＴＸ／β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地との組合せ
（１１）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（９）（１０）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（１２）ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/ml、ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/ml、ＣＴＸ ０．２５−１２８μg/ml、をそれぞれ含有する液体培地と、
それぞれにβ−ラクタマーゼ阻害剤としてＣＶＡ ２−１０μg/mlを添加した液体培地との組合せを用いる（９）−（１１）記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
（１３）薬剤を含有させたＣＡＭＨＢの希釈系列を用いる微量液体希釈法によるＥＳＢＬ産生菌の鑑別法において、ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/mlを含有する単剤液体培地と、ＣＰＤＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／４μg/mlを含有する合剤液体培地とに、試験菌を接種し、３５℃で１６−２０時間好気培養し、試験菌のＭＩＣを測定し、合剤液体培地のＭＩＣが単剤液体培地のＭＩＣより８倍以上小さいとき、その菌をＥＳＢＬ産生菌と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法
（１４）ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有する液体培地
（１５）β−ラクタマーゼ阻害剤がＣＶＡである（１４）記載の液体培地
（１６）ＣＰＤＸ０．２５−１２８μg/mlおよびＣＶＡ２−１０μg/mlを含有する（１５）記載の液体培地、でもある。
【００１５】
つまり、本発明はＣＰＤＸ単剤を含有する液体培地と、ＣＰＤＸおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤の２薬剤を合わせて含有する液体培地とを組み合わせて用いることを特徴とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法であり、それに用いる液体培地でもある。本法に使用可能なβ−ラクタマーゼ阻害剤としてはＣＶＡ、ＳＢＴ、ＴＡＺがあるが、その中でも本発明にはＣＶＡが好ましい。またＣＶＡはリチウム塩等の金属塩の形態で差し支えない。
また本法にＮＣＣＬＳ法に記載のＣＡＺとＣＡＺ／ＣＶＡ液体培地およびＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡ液体培地との組み合わせを加えて行うとさらに感度が向上する。
本発明に使用する液体培地は、試験菌の生育が阻害や促進されない液体培地で希釈系列の作成が容易なものであれば特に限定されない。それぞれの条件に応じて、それぞれの判定基準を設定すれば良いのである。
もし、ＭＩＣを測定し、判定基準をＮＣＣＬＳと同様に設定するのであれば、ＮＣＣＬＳと同様に、ＣＡＭＨＢが本発明には好ましい。
【００１６】
またさらに本発明の液体培地は、その希釈系列を９６穴プレート等の適当な容器に分注し、生培地として供給されても良いし、凍結保存や乾燥保存が可能であるので、凍結状態・乾燥状態で供給されても良い。
【００１７】
【作用】
本発明ではＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとを組み合わせて用いるだけで、ＥＳＢＬの検出が高率で可能であるがさらに、ＮＣＣＬＳ法に記載のＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスクとの組合せ、およびＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せとともに試験を行うとさらに検出率が増加する。
またディスク法のみならず、微量液体希釈法によるＭＩＣ測定にも応用可能であり、ＣＰＤＸ液体培地とＣＰＤＸ／ＣＶＡ液体培地の組合せにより、さらにＣＡＺとＣＡＺ／ＣＶＡ、ＣＴＸとＣＴＸ／ＣＶＡとの組み合わせを併せて行うことにより、ＥＳＢＬを高率で検出できる。
ＥＳＢＬのような耐性菌の出現はそれぞれの地域で使用される薬剤の種類に左右されるものであるので、ヨーロッパ、米国、日本とでは汎用される抗菌薬の種類が異なり、ＥＳＢＬについてもβ−ラクタマーゼが作用する基質となる薬剤の種類はそれぞれの国により異なっているものと推定される。従っていわゆる日本型のＥＳＢＬの検出にはＣＰＤＸ／ＣＶＡが適しているものと推定される。
【００１８】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。なお、下記実施例は単に説明のためのものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００１９】
実施例１ ＣＶＡ含有ディスクの作成
ＮＣＣＬＳガイドライン[6]に従い、ビーチャム社より購入したＣＶＡを精製水に溶解し、１０００μg/mlの溶液を作成した。
栄研化学（株）製直径６．３５mmのＫＢディスクＣＰＤＸ（１０μg含有）、ＣＡＺ（３０μg含有）、ＣＴＸ（３０μg含有）にそれぞれ上記ＣＶＡ溶液１０μl（１０μg含有）を滴下し、５０℃で２０分間乾燥し、ＣＰＤＸ／ＣＶＡディスク（１０／１０μg含有）、ＣＡＺ／ＣＶＡディスク（３０／１０μg含有）、ＣＴＸ／ＣＶＡ（３０／１０μg含有）ディスクを作成した。
本ディスクは冷所保存(２−１０℃)で１年間使用可能であった。
【００２０】
実施例２ ＥＳＢＬ産生菌の阻止円直径の測定
ＥＳＢＬ産生菌であることが確認されている大腸菌２株、肺炎桿菌２株、およびＥＳＢＬではない大腸菌２株、肺炎桿菌２株を用いて、実施例１で作成したディスクを用いて、阻止円の直径を測定した。
純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを綿棒を用いてミューラーヒントン寒天培地表面に均一に接種した。その上にＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスク、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスク、ＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクを載せ、３５℃で１８時間好気培養し、それぞれの阻止円直径をシャーレの裏からmm単位で正確に測定した。結果を表１（ＥＳＢＬ産生菌）、表２（非ＥＳＢＬ産生菌）に示す。
【００２１】
【表１】
【表２】
各菌の阻止円直径は表１および表２に示すとおりであった。
表１（ＥＳＢＬ産生菌）において、各菌はＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいて、その阻止円径の差が５mm以上であるので、全てＥＳＢＬと判定された。ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいては、E.coli 4119株および K.pneumoniae 4135株は、その阻止円径の差が５mm以上であるので、ＥＳＢＬと判定されたが、E.coli 4138株および K.pneumoniae 4120株はその差が５mm未満であるのでＥＳＢＬとは判定されなかった。
ＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいては、各菌ともその阻止円径の差は５mm以上であった。
表２（非ＥＳＢＬ産生菌）において、各菌はＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスクとの組合せおよびＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいて、その阻止円径の差が５mm未満であるので、すべてＥＳＢＬとは判定されなかった。
ＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとの組合せにおいても、各菌ともその阻止円径の差は５mm未満であった。
従って、ＮＣＣＬＳ法と同様に、本発明におけるＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとの阻止円直径の差が５mm以上の時、試験菌をＥＳＢＬ産生菌と判定することにした。
【００２４】
実施例３ ＥＳＢＬ産生菌および非産生菌の確認
ＰＣＲ法による耐性遺伝子の検出でＥＳＢＬ産生菌もしくは非産生菌であることが確認されているEscherichia coli １９株（内ＥＳＢＬ産生菌１３株）、Klebsiella pneumoniae ２３株（内ＥＳＢＬ産生菌１８株）を試験菌として用い、実施例２と同様に培養し、各阻止円の直径を測定し、ＣＶＡ含有ディスク阻止円径が無添加ディスクより５mm以上大きい菌をＥＳＢＬと判定した。結果を表３に示す。
表３においてtypeの欄にESBLsの記載のある菌はＰＣＲ法にてＥＳＢＬ産生菌であることが確認されている菌である。また各薬剤の欄でESBLの記載のある菌は、阻止円直径の差よりＥＳＢＬと判定された菌である。
【００２５】
【表３】
上表において、感度とは（ＥＳＢＬと正しく判定された菌数）／（全ＥＳＢＬ産生菌数）を表し、特異性とは（非ＥＳＢＬと正しく判定された菌数）／（全非ＥＳＢＬ産生菌数）を表し、一致率とは（ＥＳＢＬ・非ＥＳＢＬを正しく判定された菌数）／（全検体数）を表している。言い換えれば、感度はＥＳＢＬがＥＳＢＬとして判定される確率をいい、特異性はＥＳＢＬでないものがＥＳＢＬでないと判定される確率をいい、一致率はそれぞれが正しく判定される確率を表す。つまりＣＰＤＸで言えば、感度は２９／３１＝９４％となり、特異性は１１／１１＝１００％となり、一致率は４０／４２＝９５％となる。
【００２７】
上表に示すようにＣＰＤＸディスクとＣＰＤＸ／ＣＶＡディスクとの組合せで９４％の感度が得られた。さらにＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスク、ＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せの結果を加えるとE.coli 4173株もＥＳＢＬと判定されるので感度は９７％に増加する。
ＮＣＣＬＳ法に従って、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＣＶＡディスク、ＣＴＸディスクとＣＴＸ／ＣＶＡディスクとの組合せのみで判定すると感度は６５％に留まり、ＮＣＣＬＳ法では問題があることが解る。
【００２８】
実施例４ 患者検体の判定
ＥＳＢＬ産生菌感染が疑われる患者５名の糞便検体より、大腸菌を分離し、実施例２と同様に操作し、それぞれの阻止円直径を測定し、判定を行った。結果を表４に示す。
【００２９】
【表４】
【００３０】
実施例５ 微量液体希釈法（ＭＩＣ測定）によるＥＳＢＬ産生菌および非産生菌の確認
実施例３で使用したＥＳＢＬ産生菌もしくは非産生菌であることが確認されているEscherichia coli １９株（内ＥＳＢＬ産生菌１３株）、Klebsiella pneumoniae ２３株（内ＥＳＢＬ産生菌１８株）を試験菌として用い、ＣＰＤＸ ０．２５−１２８μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）とＣＰＤＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／４μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）の組合せと、ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/mlとＣＡＺＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／４μg/mlの組合せ、ＣＴＸ ０．２５−１２８μg/mlとＣＴＸ／ＣＶＡ ０．２５／４−１２８／４μg/mlの組合せを用い、ＮＣＣＬＳガイドラインに従い、微量液体希釈法で試験菌を培養し、ＭＩＣを測定した。
２倍希釈で作成した各薬剤濃度のＣＡＭＨＢ液体培地を９６穴のマイクロタイタープレートに１００μlずつ分注した。純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを希釈し、培地１mlあたりの菌数が約１０4個になるように各穴に接種し、３５℃で１８時間好気培養したのち、それぞれの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。合剤のＭＩＣが単剤のＭＩＣより３管（８倍）以上離れているものをＥＳＢＬと判定した。結果を表５に示す。
【００３１】
【表５】
実施例３と同様の結果が得られ、本発明は微量液体希釈法でも高い感度、一致率を示した。またＣＰＤＸの結果にＣＡＺおよびＣＴＸの結果を加えると、実施例３と同様に、E.coli 4173株もＥＳＢＬと判定されるので感度は９７％に増加する。
ＮＣＣＬＳ法の組合せのみで判定すると感度は６５％に留まる。
【００３３】
【発明の効果】
ＮＣＣＬＳのディスクを用いる方法では、試験を行う度にＣＶＡ溶液を作製し、ＣＡＺとＣＴＸのディスクに所定の濃度を添加する必要があり、操作が煩雑である。また、溶解したＣＶＡは安定性が悪く、十分な管理を行わなければ判定結果に影響を及ぼす。
本発明の合剤ディスクは薬剤の安定性が改良され、乾燥状態であれば冷所で１年間使用可能であるので、要時調製の煩雑さが無く、安定した成績が得られる。また本発明の液体培地は、９６穴プレート等の適当な容器に分注し、生培地として供給されても良いし、凍結保存や乾燥保存が可能であるので、凍結状態・乾燥状態で供給されても良い。その結果、面倒な要時調製が不要となる。
【００３４】
耐性菌、特にＥＳＢＬのような耐性菌の出現はそれぞれの地域で使用される薬剤の種類に左右される。医療保険制度などの関連でヨーロッパ、米国、日本とでは汎用される抗菌薬の種類が異なり、ＥＳＢＬについてもβ−ラクタマーゼが作用する基質となる薬剤の種類はそれぞれの国により異なっている。ＮＣＣＬＳのＥＳＢＬの確認法では基質としてＣＡＺとＣＴＸを用いているが、これは米国での薬剤の使用状況を基本に作成されているためと考えられ、いわゆる日本型のＥＳＢＬの実状に適合していない。日本国内では投与量等の関係上これら２薬剤よりもＣＰＤＸの使用頻度が高いため、ＥＳＢＬの検査を目的とした基質としてはＣＰＤＸを用いる方が、より確実にＥＳＢＬの鑑別が可能になる。
ＥＳＢＬ産生菌感染症は治療しうる抗菌薬が存在する。従って、的確な診断と適切な抗菌薬の選択を行えば、ＭＲＳＡやＶＲＥと異なり、治療が比較的容易である。本発明により、ＥＳＢＬ産生菌の存在が容易に確認でき、より効果的な治療や耐性菌の蔓延を防ぐことができる。
【００３５】
【参考文献】
[1]医学の歩み、１８５（５）、３１３、１９９８
[2]臨床と微生物、２６（２）、１０３、１９９９
[3]臨床と微生物、２６（２）、１２１、１９９９
[4]臨床と微生物、２６（２）、１４７、１９９９
[5]Medical Technology、２７（４）、３５３、１９９９
[6]NCCLS Document、１９（１）、３６、１９９９
[7]NCCLS Document、１９（１）、７５、１９９９
[8]内部データ、第４７回日本化学療法学会総会（１９９９年６月１１−１２日、東京）において発表予定
Claims (16)
- セフポドキシム単剤含有ディスクとセフポドキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有ディスクとの組合せを用いる薬剤感受性試験において、セフポドキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有ディスクによる阻止円がセフポドキシム単剤含有ディスクによる阻止円より大きいことを判定基準とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法
- セフポドキシム単剤含有ディスクとセフポドキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有ディスクとの組合せ、及び、以下の(1)(2)の群より選択される１以上の組合せを用いる請求項１に記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
(1)セフタジジム単剤含有ディスクとセフタジジム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有ディスクとの組合せを用いる薬剤感受性試験において、セフタジジム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有ディスクによる阻止円がセフタジジム単剤含有ディスクによる阻止円より大きいことを判定基準とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法
(2)セフォタキシム単剤含有ディスクとセフォタキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有ディスクとの組合せを用いる薬剤感受性試験において、セフォタキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有ディスクによる阻止円がセフォタキシム単剤含有ディスクによる阻止円より大きいことを判定基準とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法 - β−ラクタマーゼ阻害剤がクラブラン酸である請求項１又は２記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
- １ディスク当たりの薬剤量がそれぞれ
セフポドキシム ５−１５μg、
セフタジジム ２０−４０μg、
セフォタキシム ２０−４０μg、のディスクと、
それぞれにβ−ラクタマーゼ阻害剤としてクラブラン酸 ５−２０μgを添加したディスクとの組合せを用いる請求項１−３のいずれか1項に記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 - 直径６．３５mmの円形濾紙製のディスクを用いるＥＳＢＬ産生菌の鑑別法において、試験菌を接種したミューラーヒントン寒天培地平板上に、セフポドキシム １０μgを含有する単剤ディスクと、セフポドキシム １０μg及びクラブラン酸 １０μgを含有する合剤ディスクとを載せ、３５℃で１６−１８時間好気培養し、形成される阻止円の直径を測定し、合剤ディスクの阻止円が単剤ディスクの阻止円より５mm以上大きいとき、その菌をＥＳＢＬ産生菌と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法
- 請求項１−５のいずれか1項に記載のＥＳＢＬ鑑別法に用いられるセフポドキシム及びβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク
- β−ラクタマーゼ阻害剤がクラブラン酸である請求項６記載のディスク
- １ディスク当たり、セフポドキシム ５−１５μg及びクラブラン酸 ５−２０μgを含有する請求項７記載のディスク
- セフポドキシム単剤含有液体培地とセフポドキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有液体培地との組合せを用いる薬剤感受性試験において、セフポドキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有液体培地による最小発育阻止濃度がセフポドキシム単剤含有液体培地による最小発育阻止濃度より小さいことを判定基準とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法
- セフポドキシム単剤含有液体培地とセフポドキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有液体培地との組合せ、及び、以下の(1)(2)の群より選択される１以上の組合せを用いる請求項９に記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
(1)セフタジジム単剤含有液体培地とセフタジジム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有液体培地との組合せを用いる薬剤感受性試験において、セフタジジム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有液体培地による最小発育阻止濃度がセフタジジム単剤含有液体培地による阻止最小発育阻止濃度より小さいことを判定基準とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法
(2)セフォタキシム単剤含有液体培地とセフォタキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有液体培地との組合せを用いる薬剤感受性試験において、セフォタキシム／β−ラクタマーゼ阻害剤の合剤含有液体培地による最小発育阻止濃度がセフォタキシム単剤含有液体培地による最小発育阻止濃度より小さいことを判定基準とするＥＳＢＬ産生菌鑑別法 - β−ラクタマーゼ阻害剤がクラブラン酸である請求項９又は１０記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法
- セフポドキシム ０．２５−１２８μg/ml、
セフタジジム ０．２５−１２８μg/ml、
セフォタキシム ０．２５−１２８μg/ml、をそれぞれ含有する液体培地と、
それぞれにβ−ラクタマーゼ阻害剤としてクラブラン酸 ２−１０μg/mlを添加した液体培地との組合せを用いる請求項９−１１のいずれか1項に記載のＥＳＢＬ産生菌鑑別法 - 薬剤を含有させた陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地の希釈系列を用いる微量液体希釈法によるＥＳＢＬ産生菌の鑑別法において、セフポドキシム ０．２５−１２８μg/mlを含有する単剤液体培地と、セフポドキシム／クラブラン酸 ０．２５／４−１２８／４μg/mlを含有する合剤液体培地とに、試験菌を接種し、３５℃で１６−２０時間好気培養し、試験菌の最小発育阻止濃度を測定し、合剤液体培地の最小発育阻止濃度が単剤液体培地のそれより８倍以上小さいとき、その菌をＥＳＢＬ産生菌と判定する、ＥＳＢＬ産生菌の鑑別法
- 請求項９−１３のいずれか1項に記載したＥＳＢＬ産生菌の鑑別法に用いられるセフポドキシム及びβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有する液体培地
- β−ラクタマーゼ阻害剤がクラブラン酸である請求項１４記載の液体培地
- セフポドキシム ０．２５−１２８μg/ml及びクラブラン酸 ２−１０μg/mlを含有する請求項１５記載の液体培地
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