JP3964178B2 - メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法 - Google Patents
メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−ラクタム薬を含有する液体培地とβ−ラクタム薬およびメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤としてジカルボン酸誘導体を含有する液体培地との組合せを用いたメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法に関する。
【０００２】
本発明では次の略語を使用することがある。
【略語表】
ＭＢＬ：メタロ−β−ラクタマーゼ (Metallo-Beta-Lactamase)
ＥＳＢＬ：基質拡張型β−ラクタマーゼ (Extended Spectrum Beta-Lactamase)
ＳＭＡ：メルカプト酢酸ナトリウム (Mercaptoacetic Acid Sodium salt)
ＭＰＡ：２−メルカプトプロピオン酸 (2-Mercaptopropionic Acid)
ＳＭＰ：２−メルカプトプロピオン酸ナトリウム (2-Mercaptopropionic Acid Sodium salt)
ＤＰＡ：ジピコリン酸（2,6-pyridinedicarboxylic acid）
ＣＡＺ：セフタジジム
ＩＰＭ：イミペネム
ＮＣＣＬＳ：米国臨床検査標準委員会 (National Commitee for Clinical Laboratory Standards)
ＭＩＣ：最小発育阻止濃度 (Minimum Inhibitory Concentration)
ＭＨＡ：ミューラー・ヒントン寒天培地 (Mueller Hinton Agar)
ＭＨＢ：ミューラー・ヒントン液体培地 (Mueller Hinton Broth)
ＣＡＭＨＡ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン寒天培地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Agar)
ＣＡＭＨＢ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Broth)
【０００３】
【従来の技術】
β−ラクタム薬（β−ラクタム系抗菌薬）は、その分子構造母核中にβ−ラクタム環を持つ抗菌薬の総称でペニシリンの発見以来、多くのβ−ラクタム薬が開発されている。このβ−ラクタム薬の開発に伴い、その分子構造中のβ−ラクタム環を加水分解して、その抗菌作用を無効化する酵素β−ラクタマーゼを産生する耐性菌（β−ラクタマーゼ産生菌）が出現した。β−ラクタマーゼはクラスＡ〜Ｄ型に分類される。このうちクラスＢ型酵素はその活性中心に亜鉛などの金属イオンを有しているので、メタロ−β−ラクタマーゼ（ＭＢＬ）と呼ばれている。ＭＢＬの阻害剤としてはチオール化合物やＥＤＴＡなどが知られている（特開２０００−２２４９９８号公報）。
【０００４】
ＭＢＬ産生菌は、ＭＢＬを産生することにより、ペニシリン系からセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系抗菌薬に至るまでの幅広い範囲のβ−ラクタム薬に耐性を獲得した。近年になって、これらのβ−ラクタム薬に耐性を示す緑膿菌やセラチア菌などのグラム陰性桿菌（ＭＢＬ産生菌）が各地の医療施設から分離され問題となっている。ＭＢＬをプラスミド性に産生する菌は、これまでわが国でのみ分離されてきたが、最近、外国においても分離され、海外の専門家の間でも関心が高まりつつある（Lancet.,352,546;1998)。
【０００５】
ＭＢＬ産生菌は、セファロスポリナーゼ過剰産生株などと類似の薬剤耐性パターンを示すが、後者がカルバペネム薬に感受性を示すのに対し、ＭＢＬ産生菌は、当初カルバペネム薬に感受性を示している株も、カルバペネム薬の存在下で酵素の産生が誘導され、やがてカルバペネム薬に耐性を示すようになる。従って、有効かつ適正な化学療法を実施する上で、両者を早期に識別できる検査方法の確立が必要となっていた。
【０００６】
ＭＢＬ産生菌は、第３世代セフェム系やセファマイシン系に高度耐性を示し、カルバペネム系にも低度〜高度耐性を示す。しかし、同様に第３世代セフェム系に高度耐性を示すセファロスポリナーゼ過剰産生株などとＭＢＬ産生菌とを病院の検査室において日常的に実施されている薬剤感受性試験や酵素学的な検査方法により識別することはこれまでは不可能であった。このため、ＰＣＲ法によるＭＢＬ遺伝子を検出する方法以外に確実にＭＢＬを判別する方法はなかった（臨床と微生物.,26(2),153,1999)。
【０００７】
この現状に鑑み、国立感染症研究所の荒川らはＭＢＬ産生菌を容易に判別することが可能なディスク拡散法を開発し、既にＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．に文献発表を
行い(J.Clin.Microbiol.,38(1),40,2000)、また特許出願も行っている(特願平１１−２６８９７号)。
この方法は合計３枚の濾紙ディスクを用いる方法である。まず、直径６．３５mmの濾紙ディスクに、ＭＢＬ阻害剤としてメルカプト酢酸（ＭＡＡ）、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、メルカプトエタノール等のチオール化合物を含浸させたＭＢＬ阻害剤ディスクを作成する。
次いで、ＣＡＺなどのβ−ラクタム薬を含有する乾燥ディスク２枚を、被検菌を塗布した寒天平板上に距離を置いて静置し、一方のＣＡＺディスクに近接してＭＢＬ阻害剤ディスクを静置し、阻害剤の影響下で形成される阻止円の形状と、阻害剤の影響のない通常の阻止円の形状の違いを観察し、ＭＢＬ産生菌であるかどうかを判定するものである。この方法では、得られる阻止円の形状・大きさがＭＢＬ阻害剤ディスクの有無で全く異なるため、ＭＢＬ産生菌であるかどうか容易に判定することができる。
【０００８】
しかしながら、上記判定方法では、ＭＢＬ産生菌であるかどうかは定性的に判定できるが、定量的な最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めることはできない。また、使用したチオール化合物（ＭＢＬ阻害剤）は揮発性であるため、阻害剤ディスクは乾燥ができず、用時調製で用いるしかなく、操作性にやや問題が残った。
【０００９】
また、本発明者らはＭＡＡ、ＭＰＡ、ＳＭＡ等のチオール化合物（ＭＢＬ阻害剤）とＣＡＺ等のβ−ラクタム薬を用いた微量液体希釈法によるＭＩＣ測定も試みた。この方法は、９６穴マイクロプレートを用い、２倍の希釈系列でＣＡＺ０．２５−１２８μg/mlを含有する液体培地の希釈系列と、一定量のＭＢＬ阻害剤及びＣＡＺ０．２５−１２８μg/mlを含有する液体培地希釈系列との組合せを用い、被検菌を培養し、ＭＩＣを測定する方法である。この方法でＣＡＺ単独のＭＩＣ及びＣＡＺ／ＭＰＡ合剤のＭＩＣが容易に測定でき、またその差もＭＢＬ産生菌では明確であった。
【００１０】
しかしながら、使用したチオール化合物（ＭＢＬ阻害剤）は、揮発性であり、悪臭を発する。そのため、特に試薬の調製時にその悪臭が検査室全体に広がり、このままルーチン検査として用いるには問題が多いものであった。
このため、本発明者らは、ＭＢＬ阻害剤としてチオール化有機酸を用い、この有機酸を適当なアルカリ塩とすることにより、その不揮発化を図り、不揮発化したＭＢＬ阻害剤が揮発性のチオール化有機酸と同様なＭＢＬ阻害作用があることを見出し、この阻害剤を用いたメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法を既に提案している（特願２０００−１２１９８２号）。
【００１１】
【発明が解決すべき課題】
しかしながら、本発明者のその後の研究によれば、使用したＭＢＬ阻害剤とβ−ラクタム薬とを混合して乾燥を行うと、β−ラクタム薬の保存安定性が悪く、短期間で力価の低下が認められた。特にカルバペネム系抗菌薬では、乾燥直後に力価の低下が顕著であった。そのため、９６穴マイクロプレートを乾燥してルーチン検査として用いるには未だ問題があった。
【００１２】
従って本発明は、β−ラクタム薬の保存安定性が良く、長期間に亘ってβ−ラクタム薬の力価を安定時に維持できるので、ルーチン検査に有用でＭＩＣ測定が可能なＭＢＬ産生菌の感受性試験方法及びそれに使用する多穴容器を提供でき、さらにβラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤の２薬を合剤として含有する乾燥した濾紙ディスクを提供すること、さらに進めて、βラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤の２薬を合剤として含有する乾燥したＭＩＣ測定用の多穴容器を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、メルカプト基を有さない、キレート作用の強いジカルボン酸誘導体をＭＢＬ阻害剤として用いることにより、β−ラクタム系抗菌薬の力価の低下をきたすことなく、チオール化有機酸と同様のＭＢＬ阻害作用があることを見いだし、本発明を完成した。
【００１４】
本発明は、β−ラクタム薬を含有する液体培地と、β−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸誘導体を含有する液体培地との組合せを用いるＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験方法を提供する。
【００１５】
本発明に使用するＭＢＬ阻害剤であるジカルボン酸誘導体は、β−ラクタム系抗菌薬の力価に影響を及ぼすことなく、かつ細菌毒性の少ないジカルボン酸誘導体である限り、公知のものの中から適宜選択することができる。
そのようなジカルボン酸誘導体の中でも、特にピリジン置換誘導体が好ましい。このピリジン置換誘導体としては、例えば、２，３−ピリジンジカルボン酸、２，４−ピリジンジカルボン酸、２，５−ピリジンジカルボン酸、２，６−ピリジンジカルボン酸、３，４−ピリジンジカルボン酸、および３，５−ピリジンジカルボン酸から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられるが、特に２，６−ピリジンジカルボン酸（ＤＰＡ：ジピコリン酸）が好ましい。
【００１６】
また、本発明で用いるβ−ラクタム薬は、その分子構造母核中にβ−ラクタム環を持つ抗菌薬の中から適宜選択すれば良い。その具体例としては、セフタジジム、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフポドキシム、セフピロム、セフェピムなどの第三・第四世代セフェム系抗菌薬、セフメタゾール、セフミノクスなどの第二・第三世代セファマイシン系抗菌薬、イミペネム、パニペネム、メロペネムなどのカルバペネム系抗菌薬から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
これらのβ−ラクタム薬の中でも、セフタジジム（ＣＡＺ）やイミペネム（ＩＰＭ）が好ましく用いられる。
【００１７】
本発明のＭＢＬ生産菌の薬剤感受性試験方法をより具体的に説明すると、β−ラクタム薬０．２５−１２８μg/mlを含有する液体培地と、β−ラクタム薬０．２５−１２８μg/mlおよびＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸誘導体１００−１６００μg/mlを含有する液体培地との組合せを用いる。
β−ラクタム薬の含有量が０．２５μg/ml未満になると、その抗菌作用が低下し、逆に１２８μg/mlを超えると、抗菌薬が溶解し難くなる。
また、ＭＢＬ阻害剤であるジカルボン酸の含有量が１００μg/ml未満になると、ＭＢＬ阻害効果が得られず、逆に１６００μg/mlを超えると、菌の発育を阻害する。
【００１８】
本発明に用いる液体培地としては、微量液体希釈法に用いられる一般的な液体培地であれば、特に制限されない。その具体例としては、ミューラー・ヒントン液体培地、陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地、ブレインハートインフュージョン液体培地、トリプトソイ液体培地、ＡＢＣＭ液体培地、溶血液加ミューラー・ヒントン液体培地、シェドラー液体培地、ブルセラ液体培地、溶血液添加ブルセラ液体培地が挙げられる。
これらの液体培地の中でも、特にミューラー・ヒントン液体培地（ＭＨＢ）や陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地（ＣＡＭＨＢ）が好ましく用いられる。
【００１９】
また、本発明は、上記で説明したＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験に用いる多穴容器であって、多穴容器の各穴にβ−ラクタム薬を含有する液体培地と、β−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸誘導体を含有する液体培地とを分注したＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験に用いる多穴容器も提供する。
多穴容器としては、この業界で通常使用されているものであれば、特に限定されないが、一般的には９６穴マイクロプレートが好ましく用いられる。
この多穴容器は、生培地などの液体培地を分注した容器として供給されても良いが、保存安定性を考慮すると、使用時まで凍結保存した形態で供給されることが好ましい。
本発明においては、各穴の薬剤のみを乾燥固定化した多穴容器として供給されても良いし、薬剤を含有する液体培地を乾燥固定化した多穴容器として供給されても良い。
乾燥固定化方法としては、薬剤や培地成分が変質しない限り、特に制限されず、自然乾燥、送風乾燥、凍結乾燥といった一般的な乾燥方法が挙げられる。
【００２０】
更に、本発明は、ＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸誘導体を含有するディスクをも提供する。
本発明のディスクは、円形である限りその直径は特に問わないが、一般的に使用されているＫＢディスクと同様の直径６．３５mmの濾紙ディスクに一定量のジカルボン酸誘導体を添加・乾燥したものが好ましい。ジカルボン酸誘導体の含浸量は、濾紙ディスク一枚当たり０．１−３mgが適当である。
【００２１】
本発明に用いるジカルボン酸誘導体としては、上述したように、公知のものの中から適宜選択することができ、その中でも、特にピリジン置換誘導体が好ましい。このピリジン置換誘導体としては、例えば、２，３−ピリジンジカルボン酸、２，４−ピリジンジカルボン酸、２，５−ピリジンジカルボン酸、２，６−ピリジンジカルボン酸、３，４−ピリジンジカルボン酸、および３，５−ピリジンジカルボン酸から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられるが、特に２，６−ピリジンジカルボン酸（ＤＰＡ：ジピコリン酸）が好ましい。
【００２２】
本発明は、β−ラクタム薬を含有するディスクとβ−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤を含有するディスクとの組合せを用いるＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験方法でもあり得る。
本発明においては、β−ラクタム薬を含有するディスクと、β−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤を含有するディスクとを被検菌を接種した寒天平板上に静置し、培養後の阻止円の直径の違いにより、ＭＢＬ産生菌かどうか容易に判定することができる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明は、チオール基を有していないキレート作用を有するジカルボン酸誘導体をＭＢＬ阻害剤として用いているので、β−ラクタム薬系抗菌剤の保存安定性を向上させることができる。従って本発明によれば、β−ラクタム薬系抗菌剤の力価に影響を及ぼすことなく、一般検査室でのＭＢＬ産生菌のＭＩＣ測定が可能となると共に、一般病院や検査センターの細菌検査の自動化・システム化にも対応が可能である。
【００２４】
また、本発明は、β−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸を含有するディスクの製造および供給が可能となる。従って本発明によれば、β−ラクタム薬を含有するディスクとβ−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸を含有するディスクとの組合せを用いるＭＢＬ産生菌鑑別方法の開発が容易となる。
【００２５】
ＭＢＬ産生菌は、ＥＳＢＬ産生菌よりも臨床上の薬剤耐性の問題は大きいが、未だ標準的な国際試験法が確立されていないのが現状である。本発明により、一般的な検査室で簡易にＭＢＬ産生菌の鑑別やＭＩＣ測定が可能となるので、このような国際標準法の作製が可能となる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２７】
実施例１ 薬剤感受性試験用マイクロプレートの作成
ＮＣＣＬＳ標準法の微量液体希釈法に準じてβ−ラクタム薬としてＣＡＺおよびＩＰＭ０．２５−１２８μg/mlを含有するＣＡＭＨＢの２倍希釈系列を作成し、９６穴マイクロプレートに１００μlずつ分注した。同様にその希釈系列にＭＢＬ阻害剤２５−３２００μg/mlを添加したＣＡＭＨＢ２倍希釈系列を９６穴マイクロプレートに１００μlずつ分注した。
【００２８】
(1)ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/ml
(2)ＣＡＺ／ＭＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(3)ＣＡＺ／ＳＭＰ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(4)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml
(5)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml
(6)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml
(7)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(8)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml
(9)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml
(10)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml
(11)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml
(12)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml
(13)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml
(14)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml
(15)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(16)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml
(17)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml
(18)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml
(19)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml
(20)ＩＰＭ ０．２５−１２８μg/ml
(21)ＩＰＭ／ＭＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(22)ＩＰＭ／ＳＭＰ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(23)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml
(24)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml
(25)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml
(26)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(27)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml
(28)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml
(29)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml
(30)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml
(31)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml
(32)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml
(33)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml
(34)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(35)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml
(36)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml
(37)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml
(38)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml
【００２９】
上記(1)−(38)の希釈系列マイクロプレートにＭＢＬ産生菌（K.pneumoniae 4134）および非産生菌（K.pneumoniae 4153）それぞれ１株を接種し、３５℃で１晩培養したところ、遊離のＭＢＬ阻害剤としてＭＰＡを含む(2),(21)は、強い悪臭がしたが、ＭＢＬ産生菌と非産生菌とでは、ＭＩＣ値の顕著な（３管＝８倍以上）相違が認められた。
同様に、ＭＢＬ阻害剤１００−１６００μg/mlを含むその他の系列ではＭＢＬ産生菌と非産生菌とで明らかな発育の違いが見られた。
これに対し、ＭＢＬ阻害剤２５〜５０μg/mlを含む(4),(5),(12),(13),(23),(24),(31),(32)ではＭＢＬ産生菌と非産生菌ともに発育し、阻害剤を含まない(1),(20)と同様であり、産生菌と非産生菌との区別がつかなかった。
また、ＭＢＬ阻害剤３２００μg/mlを含む(11),(19),(30),(38)ではＭＢＬ産生菌と非産生菌とも発育せず、それぞれの区別がつかなかった。
なお、本プレートを−７０℃で凍結保存したが、６ヶ月後でも使用可能であった。
【００３０】
実施例２ 微量液体希釈法（ＭＩＣ法）によるＭＢＬ産生菌および非産生菌の確認
ＰＣＲ法によりＭＢＬ産生菌であることが確認されているKlebsiella pneumoniae ２株、Pseudomonas aeruginosa １３株、Serratia marcescens ３４株、および同様にＰＣＲ法によりＭＢＬ非産生菌として確認されているＥＳＢＬ産生Klebsiella pneumoniae ２株、ペニシリナーゼ（ＰＣＮ）産生Klebsiella pneumoniae ２株、セファロスポリナーゼ（ＣＰＮ）産生Klebsiella pneumoniae ２株を試験菌として用い、実施例１で作製したマイクロプレートのＣＡＺ０．２５−１２８μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）とＣＡＺ／ＤＰＡ０．２５／４００−１２８／４００μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）との組合せ、及びＩＰＭ０．２５−１２８μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）とＩＰＭ／ＤＰＡ０．２５／４００−１２８／４００μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）との組合せを用い、ＮＣＣＬＳガイドラインに従い、微量液体希釈法で試験菌を培養し、ＭＩＣを測定した。
純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを希釈し、培地１mlあたりの菌数が約１０４個になるようにマイクロタイタープレートの各穴に接種し、３５℃で１８時間好気培養したのち、それぞれの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。β−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤合剤のＭＩＣがβ−ラクタム薬単独のＭＩＣより３管（８倍）以上離れているものをＭＢＬ産生菌と判定した。その結果を表１に示す。
なお、本実施例の判定基準はＮＣＣＬＳのＥＳＢＬ産生菌判定基準に準拠し、それと同一にした。
【００３１】
【表１】
【００３２】
上記表１において、感度とは（ＭＢＬ産生菌と正しく判定された菌数）／（全ＭＢＬ産生菌数）を表し、特異性とは（非ＭＢＬ産生菌と正しく判定された菌数）／（全非ＭＢＬ産生菌数）を表し、一致率とは（ＭＢＬ・非ＭＢＬ産生菌と正しく判定された菌数）／（全検体数）を表している。言い換えれば、感度はＭＢＬ産生菌がＭＢＬ産生菌として正しく判定される確率をいい、特異性はＭＢＬ産生菌でないものがＭＢＬ産生菌でないと判定される確率をいい、一致率はそれぞれが正しく判定される確率を表す。
つまりＣＡＺで言えば、感度は４７／４９＝９６％となり、特異性は６／６＝１００％となり、一致率は５３／５５＝９６％となる。
【００３３】
表１の結果より、ＣＡＺでＭＢＬ産生菌と判定された菌数は４７株であるので、その感度は４７／４９＝９６％であり、また特異性は１００％であった。ＭＢＬの一致率は９６％と高く、本発明は一般の微生物検査室でのＭＢＬ産生菌の簡易スクリーニング法として有用性が高いと考えられる。さらにＩＰＭと組み合わせれば、ＭＢＬ産生菌は２株増えて４９株と判定される。つまり感度は４９／４９＝１００％、特異性は６／６＝１００％、一致率は５５／５５＝１００％とさらに高率となる。被検菌数をさらに増やして確認すれば、本方法はＭＢＬ産生菌の確認試験として使用できる可能性がある。
【００３４】
実施例３ 薬剤を固定化乾燥したプレートの作成及びＭＩＣの測定
液体培地１００μlを加えて溶解した時に下記の濃度となるようにＣＡＺ及びＣＡＺ／ＤＰＡの薬剤２倍希釈系列溶液を調製し、９６穴マイクロプレートに適量分注し、４５℃で６０分間送風乾燥し、薬剤を固定化乾燥したプレートを作成した。
(1)ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/ml
(2)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml
薬剤を固定化乾燥したプレートの各穴にＣＡＭＨＢ１００μlを分注し薬剤を溶解し、実施例２で使用したＭＢＬ産生菌４９株、ＭＢＬ非産生菌６株を接種し、実施例２と同様に操作し、ＭＩＣを測定した。
その結果、本薬剤を固定化乾燥したプレートも、実施例２と同様の菌の発育を示し、感度・特異性・一致率も同一成績であった。
ＭＢＬ阻害剤は不揮発性の有機酸であるので、乾燥プレートとして作製・保存してもそのＭＢＬ阻害作用は保持されていた。
【００３５】
実施例４ ＭＢＬ阻害剤を含有した乾燥ディスクの作製及び保存安定性
遊離のチオール化有機酸、及びチオール化有機酸の塩を含む乾燥ディスクと、チオール基を有していない有機酸を含む乾燥ディスクとを作製し、ディスク拡散法を行い阻止円直径を測定した。
(1)ＳＭＡ（２．９mg/ディスク含有）
(2)ＭＰＡ（２．７mg/ディスク含有）
(3)ＤＰＡ（０．５mg/ディスク含有）
市販のＳＭＡ、ＭＰＡを精製水に溶解し、１．０モルの水溶液を作製した。ＤＰＡは、０．０５モルのＥＨＥＰＥ緩衝液ｐＨ７．０に溶解し、最終濃度０．１２モルのＤＰＡ水溶液を作製した。ＫＢディスク用の直径６．３５mmの濾紙ディスクに上記の各調製溶液２５μlを滴下し、５０℃で６０分間乾燥し、ＳＭＡディスク、ＭＰＡディスク、ＤＰＡディスクを作製した。
ＰＣＲ法であらかじめＭＢＬ産生菌であることが確認されている肺炎桿菌（K.pneumoniae)１株、および霊菌（S.marcescens）１株、緑膿菌（P.aeruginosa）２株を用いて、J.Clin.Microbiol.,38(1),40,2000に従った方法で操作し、その阻止円の直径を測定した。
ＮＣＣＬＳのディスク法（標準法）に準じて、純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させ、ＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを綿棒を用いてミューラーヒントン寒天培地（ＭＨＡ）表面に均一に接種した。菌を接種した寒天平板培地表面上に２枚のＫＢディスクＣＡＺ（栄研化学製）を３〜５cm離して接置し、どちらか片方のＫＢディスクＣＡＺからさらに１．５〜２ｃｍ離してＭＢＬ阻害剤ディスク（ＳＭＡディスク、ＭＰＡディスク、もしくはＤＰＡディスク）を載せ、３５℃で１８時間好気培養し、各ＣＡＺディスクの周囲に形成された阻止円直径をシャーレの裏からmm単位で正確に測定した。また上記作製の各ＭＢＬ阻害剤を含有したディスクを３７℃に保存して１週間毎に試験を行い、４週目まで測定を行った。その結果を表２〜表６に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
【表３】
【００３８】
【表４】
【００３９】
【表５】
【００４０】
【表６】
【００４１】
各菌の阻止円直径は表２−表６に示すとおりであった。
本実施例の判定基準はＮＣＣＬＳ法のＥＳＢＬ産生菌確認試験と同様に、本発明におけるＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＡ（ＤＰＡ）ディスクの阻止円直径の差が５mm以上の時、試験菌をＭＢＬ産生菌と判定することにした。
表２において、各菌（ＭＢＬ産生菌）はＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＡディスクの組合せで阻止円径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。またＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＤＰＡディスクに関しても同様に全ての菌においてその阻止円径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。しかし、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＭＰＡディスクに関しては全ての菌の阻止円径の差が５mm未満であるのでＭＢＬとは判定されなかった。これは、ＭＰＡディスク作製の乾燥時にＭＰＡが揮発し、ディスク中のＭＰＡ含有量が減少した影響と考えられる。
表３−表６においても同様な結果であり、ＣＡＺ／ＳＭＡディスクとＣＡＺ／ＤＰＡのディスクは３７℃保存で少なくとも４週間安定してＭＢＬを判定することが可能であった。これは冷所保存であれば１年間以上の保存安定性に相当する。
【００４２】
実施例５ 同一ディスクにＣＡＺ／ＤＰＡを含有する乾燥ディスクの作成及び使用
栄研化学（株）製の直径６．３５mmのＫＢディスクＣＡＺ（３０μg含有）に０．１２モルのＤＰＡ溶液２５μlを滴下し、５０℃で６０分間乾燥し、ＣＡＺ／ＤＰＡディスクを作製した。また、同様にＫＢディスク用の直径６．３５mmの濾紙ディスクにＤＰＡ溶液２５μlを滴下し、５０℃で６０分間乾燥し、ＤＰＡディスクを作製した。
ＰＣＲ法であらかじめＭＢＬ産生菌であることが確認されている肺炎桿菌１株、霊菌１株、および緑膿菌２株を用いて、ＮＣＣＬＳのディスク法に準じて純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを綿棒を用いてＭＨＡ表面に均一に接種した。その上にＫＢディスクＣＡＺを置き、それより３cm以上離してＣＡＺ／ＤＰＡディスクを置き、さらに３cm以上離してＤＰＡディスクを置き、３５℃で１８時間好気培養し、ＣＡＺディスク、ＣＡＺ／ＤＰＡディスク、およびＤＰＡディスクの阻止円直径を測定した。
【００４３】
【表７】
【００４４】
各菌の阻止円直径は表７に示すとおりであった。
表７に示すように、各菌（ＭＢＬ産生菌）はＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＤＰＡディスクとの組合せにおいて、全ての菌の阻止円直径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。
また、ＤＰＡディスク単独での発育阻止はＣＡＺ／ＤＰＡディスクの発育阻止に比べて顕著に小さく、故にＤＰＡ自身の抗菌力は、ほとんど無視できると考えられ、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＤＰＡディスクとの組み合わせでＭＢＬの判定が可能であった。
【００４５】
実施例６ ＭＢＬ阻害剤を含有した寒天培地平板の作製とその使用
ＤＰＡを含有するＣＡＭＨＡとＤＰＡを含有しないＣＡＭＨＡとを２分画シャーレに分注し、寒天平板を作成した。ＫＢディスクＣＡＺを静置し、その阻止円の形成を観た。
市販のＤＰＡを０．０５モルのＥＨＥＰＥ緩衝液ｐＨ７．０に溶解し、８０００μg/mlのＤＰＡ溶液を作製した。あらかじめ１２１℃で１５分間の高圧滅菌したＣＡＭＨＡ培地を５０℃に冷却し、ＣＡＭＨＡ１９mlに対してＤＰＡ溶液１mlを加えて撹拌し均一な寒天培地溶液にした。分画シャーレの一画にＣＡＭＨＡ１０mlを分注し、もう一画にＤＰＡを含有したＣＡＭＨＡ１０mlを分注した。寒天培地が固化後、シャーレの蓋をずらして寒天表面の凝水を乾燥させ、ＣＡＭＨＡ平板を作製した。
ＰＣＲ法であらかじめＭＢＬ産生菌であることが確認されている肺炎桿菌１株、霊菌１株、および緑膿菌２株を用いて、ＮＣＣＬＳのディスク法に準じて純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させてＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを綿棒を用いてＣＡＭＨＡ表面とＤＰＡを含有したＣＡＭＨＡ表面とに均一に接種した。２分画シャーレの各培地上にＫＢディスクＣＡＺを１枚ずつおき、培養後各ＣＡＺディスクの阻止円直径を測定した。
【００４６】
【表８】
【００４７】
各菌の阻止円直径は表８に示すとおりであった。
表８に示すように、各菌（ＭＢＬ産生菌）はＣＡＭＨＡ上のＣＡＺディスクとＳＭＡＤＰＡを含有したＣＡＭＨＡ上のＣＡＺディスクとの組合せにおいて、全ての菌の阻止円直径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。
【００４８】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−ラクタム薬を含有する液体培地とβ−ラクタム薬およびメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤としてジカルボン酸誘導体を含有する液体培地との組合せを用いたメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法に関する。
【０００２】
本発明では次の略語を使用することがある。
【略語表】
ＭＢＬ：メタロ−β−ラクタマーゼ (Metallo-Beta-Lactamase)
ＥＳＢＬ：基質拡張型β−ラクタマーゼ (Extended Spectrum Beta-Lactamase)
ＳＭＡ：メルカプト酢酸ナトリウム (Mercaptoacetic Acid Sodium salt)
ＭＰＡ：２−メルカプトプロピオン酸 (2-Mercaptopropionic Acid)
ＳＭＰ：２−メルカプトプロピオン酸ナトリウム (2-Mercaptopropionic Acid Sodium salt)
ＤＰＡ：ジピコリン酸（2,6-pyridinedicarboxylic acid）
ＣＡＺ：セフタジジム
ＩＰＭ：イミペネム
ＮＣＣＬＳ：米国臨床検査標準委員会 (National Commitee for Clinical Laboratory Standards)
ＭＩＣ：最小発育阻止濃度 (Minimum Inhibitory Concentration)
ＭＨＡ：ミューラー・ヒントン寒天培地 (Mueller Hinton Agar)
ＭＨＢ：ミューラー・ヒントン液体培地 (Mueller Hinton Broth)
ＣＡＭＨＡ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン寒天培地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Agar)
ＣＡＭＨＢ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Broth)
【０００３】
【従来の技術】
β−ラクタム薬（β−ラクタム系抗菌薬）は、その分子構造母核中にβ−ラクタム環を持つ抗菌薬の総称でペニシリンの発見以来、多くのβ−ラクタム薬が開発されている。このβ−ラクタム薬の開発に伴い、その分子構造中のβ−ラクタム環を加水分解して、その抗菌作用を無効化する酵素β−ラクタマーゼを産生する耐性菌（β−ラクタマーゼ産生菌）が出現した。β−ラクタマーゼはクラスＡ〜Ｄ型に分類される。このうちクラスＢ型酵素はその活性中心に亜鉛などの金属イオンを有しているので、メタロ−β−ラクタマーゼ（ＭＢＬ）と呼ばれている。ＭＢＬの阻害剤としてはチオール化合物やＥＤＴＡなどが知られている（特開２０００−２２４９９８号公報）。
【０００４】
ＭＢＬ産生菌は、ＭＢＬを産生することにより、ペニシリン系からセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系抗菌薬に至るまでの幅広い範囲のβ−ラクタム薬に耐性を獲得した。近年になって、これらのβ−ラクタム薬に耐性を示す緑膿菌やセラチア菌などのグラム陰性桿菌（ＭＢＬ産生菌）が各地の医療施設から分離され問題となっている。ＭＢＬをプラスミド性に産生する菌は、これまでわが国でのみ分離されてきたが、最近、外国においても分離され、海外の専門家の間でも関心が高まりつつある（Lancet.,352,546;1998)。
【０００５】
ＭＢＬ産生菌は、セファロスポリナーゼ過剰産生株などと類似の薬剤耐性パターンを示すが、後者がカルバペネム薬に感受性を示すのに対し、ＭＢＬ産生菌は、当初カルバペネム薬に感受性を示している株も、カルバペネム薬の存在下で酵素の産生が誘導され、やがてカルバペネム薬に耐性を示すようになる。従って、有効かつ適正な化学療法を実施する上で、両者を早期に識別できる検査方法の確立が必要となっていた。
【０００６】
ＭＢＬ産生菌は、第３世代セフェム系やセファマイシン系に高度耐性を示し、カルバペネム系にも低度〜高度耐性を示す。しかし、同様に第３世代セフェム系に高度耐性を示すセファロスポリナーゼ過剰産生株などとＭＢＬ産生菌とを病院の検査室において日常的に実施されている薬剤感受性試験や酵素学的な検査方法により識別することはこれまでは不可能であった。このため、ＰＣＲ法によるＭＢＬ遺伝子を検出する方法以外に確実にＭＢＬを判別する方法はなかった（臨床と微生物.,26(2),153,1999)。
【０００７】
この現状に鑑み、国立感染症研究所の荒川らはＭＢＬ産生菌を容易に判別することが可能なディスク拡散法を開発し、既にＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．に文献発表を
行い(J.Clin.Microbiol.,38(1),40,2000)、また特許出願も行っている(特願平１１−２６８９７号)。
この方法は合計３枚の濾紙ディスクを用いる方法である。まず、直径６．３５mmの濾紙ディスクに、ＭＢＬ阻害剤としてメルカプト酢酸（ＭＡＡ）、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、メルカプトエタノール等のチオール化合物を含浸させたＭＢＬ阻害剤ディスクを作成する。
次いで、ＣＡＺなどのβ−ラクタム薬を含有する乾燥ディスク２枚を、被検菌を塗布した寒天平板上に距離を置いて静置し、一方のＣＡＺディスクに近接してＭＢＬ阻害剤ディスクを静置し、阻害剤の影響下で形成される阻止円の形状と、阻害剤の影響のない通常の阻止円の形状の違いを観察し、ＭＢＬ産生菌であるかどうかを判定するものである。この方法では、得られる阻止円の形状・大きさがＭＢＬ阻害剤ディスクの有無で全く異なるため、ＭＢＬ産生菌であるかどうか容易に判定することができる。
【０００８】
しかしながら、上記判定方法では、ＭＢＬ産生菌であるかどうかは定性的に判定できるが、定量的な最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めることはできない。また、使用したチオール化合物（ＭＢＬ阻害剤）は揮発性であるため、阻害剤ディスクは乾燥ができず、用時調製で用いるしかなく、操作性にやや問題が残った。
【０００９】
また、本発明者らはＭＡＡ、ＭＰＡ、ＳＭＡ等のチオール化合物（ＭＢＬ阻害剤）とＣＡＺ等のβ−ラクタム薬を用いた微量液体希釈法によるＭＩＣ測定も試みた。この方法は、９６穴マイクロプレートを用い、２倍の希釈系列でＣＡＺ０．２５−１２８μg/mlを含有する液体培地の希釈系列と、一定量のＭＢＬ阻害剤及びＣＡＺ０．２５−１２８μg/mlを含有する液体培地希釈系列との組合せを用い、被検菌を培養し、ＭＩＣを測定する方法である。この方法でＣＡＺ単独のＭＩＣ及びＣＡＺ／ＭＰＡ合剤のＭＩＣが容易に測定でき、またその差もＭＢＬ産生菌では明確であった。
【００１０】
しかしながら、使用したチオール化合物（ＭＢＬ阻害剤）は、揮発性であり、悪臭を発する。そのため、特に試薬の調製時にその悪臭が検査室全体に広がり、このままルーチン検査として用いるには問題が多いものであった。
このため、本発明者らは、ＭＢＬ阻害剤としてチオール化有機酸を用い、この有機酸を適当なアルカリ塩とすることにより、その不揮発化を図り、不揮発化したＭＢＬ阻害剤が揮発性のチオール化有機酸と同様なＭＢＬ阻害作用があることを見出し、この阻害剤を用いたメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法を既に提案している（特願２０００−１２１９８２号）。
【００１１】
【発明が解決すべき課題】
しかしながら、本発明者のその後の研究によれば、使用したＭＢＬ阻害剤とβ−ラクタム薬とを混合して乾燥を行うと、β−ラクタム薬の保存安定性が悪く、短期間で力価の低下が認められた。特にカルバペネム系抗菌薬では、乾燥直後に力価の低下が顕著であった。そのため、９６穴マイクロプレートを乾燥してルーチン検査として用いるには未だ問題があった。
【００１２】
従って本発明は、β−ラクタム薬の保存安定性が良く、長期間に亘ってβ−ラクタム薬の力価を安定時に維持できるので、ルーチン検査に有用でＭＩＣ測定が可能なＭＢＬ産生菌の感受性試験方法及びそれに使用する多穴容器を提供でき、さらにβラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤の２薬を合剤として含有する乾燥した濾紙ディスクを提供すること、さらに進めて、βラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤の２薬を合剤として含有する乾燥したＭＩＣ測定用の多穴容器を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、メルカプト基を有さない、キレート作用の強いジカルボン酸誘導体をＭＢＬ阻害剤として用いることにより、β−ラクタム系抗菌薬の力価の低下をきたすことなく、チオール化有機酸と同様のＭＢＬ阻害作用があることを見いだし、本発明を完成した。
【００１４】
本発明は、β−ラクタム薬を含有する液体培地と、β−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸誘導体を含有する液体培地との組合せを用いるＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験方法を提供する。
【００１５】
本発明に使用するＭＢＬ阻害剤であるジカルボン酸誘導体は、β−ラクタム系抗菌薬の力価に影響を及ぼすことなく、かつ細菌毒性の少ないジカルボン酸誘導体である限り、公知のものの中から適宜選択することができる。
そのようなジカルボン酸誘導体の中でも、特にピリジン置換誘導体が好ましい。このピリジン置換誘導体としては、例えば、２，３−ピリジンジカルボン酸、２，４−ピリジンジカルボン酸、２，５−ピリジンジカルボン酸、２，６−ピリジンジカルボン酸、３，４−ピリジンジカルボン酸、および３，５−ピリジンジカルボン酸から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられるが、特に２，６−ピリジンジカルボン酸（ＤＰＡ：ジピコリン酸）が好ましい。
【００１６】
また、本発明で用いるβ−ラクタム薬は、その分子構造母核中にβ−ラクタム環を持つ抗菌薬の中から適宜選択すれば良い。その具体例としては、セフタジジム、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフポドキシム、セフピロム、セフェピムなどの第三・第四世代セフェム系抗菌薬、セフメタゾール、セフミノクスなどの第二・第三世代セファマイシン系抗菌薬、イミペネム、パニペネム、メロペネムなどのカルバペネム系抗菌薬から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
これらのβ−ラクタム薬の中でも、セフタジジム（ＣＡＺ）やイミペネム（ＩＰＭ）が好ましく用いられる。
【００１７】
本発明のＭＢＬ生産菌の薬剤感受性試験方法をより具体的に説明すると、β−ラクタム薬０．２５−１２８μg/mlを含有する液体培地と、β−ラクタム薬０．２５−１２８μg/mlおよびＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸誘導体１００−１６００μg/mlを含有する液体培地との組合せを用いる。
β−ラクタム薬の含有量が０．２５μg/ml未満になると、その抗菌作用が低下し、逆に１２８μg/mlを超えると、抗菌薬が溶解し難くなる。
また、ＭＢＬ阻害剤であるジカルボン酸の含有量が１００μg/ml未満になると、ＭＢＬ阻害効果が得られず、逆に１６００μg/mlを超えると、菌の発育を阻害する。
【００１８】
本発明に用いる液体培地としては、微量液体希釈法に用いられる一般的な液体培地であれば、特に制限されない。その具体例としては、ミューラー・ヒントン液体培地、陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地、ブレインハートインフュージョン液体培地、トリプトソイ液体培地、ＡＢＣＭ液体培地、溶血液加ミューラー・ヒントン液体培地、シェドラー液体培地、ブルセラ液体培地、溶血液添加ブルセラ液体培地が挙げられる。
これらの液体培地の中でも、特にミューラー・ヒントン液体培地（ＭＨＢ）や陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地（ＣＡＭＨＢ）が好ましく用いられる。
【００１９】
また、本発明は、上記で説明したＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験に用いる多穴容器であって、多穴容器の各穴にβ−ラクタム薬を含有する液体培地と、β−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸誘導体を含有する液体培地とを分注したＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験に用いる多穴容器も提供する。
多穴容器としては、この業界で通常使用されているものであれば、特に限定されないが、一般的には９６穴マイクロプレートが好ましく用いられる。
この多穴容器は、生培地などの液体培地を分注した容器として供給されても良いが、保存安定性を考慮すると、使用時まで凍結保存した形態で供給されることが好ましい。
本発明においては、各穴の薬剤のみを乾燥固定化した多穴容器として供給されても良いし、薬剤を含有する液体培地を乾燥固定化した多穴容器として供給されても良い。
乾燥固定化方法としては、薬剤や培地成分が変質しない限り、特に制限されず、自然乾燥、送風乾燥、凍結乾燥といった一般的な乾燥方法が挙げられる。
【００２０】
更に、本発明は、ＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸誘導体を含有するディスクをも提供する。
本発明のディスクは、円形である限りその直径は特に問わないが、一般的に使用されているＫＢディスクと同様の直径６．３５mmの濾紙ディスクに一定量のジカルボン酸誘導体を添加・乾燥したものが好ましい。ジカルボン酸誘導体の含浸量は、濾紙ディスク一枚当たり０．１−３mgが適当である。
【００２１】
本発明に用いるジカルボン酸誘導体としては、上述したように、公知のものの中から適宜選択することができ、その中でも、特にピリジン置換誘導体が好ましい。このピリジン置換誘導体としては、例えば、２，３−ピリジンジカルボン酸、２，４−ピリジンジカルボン酸、２，５−ピリジンジカルボン酸、２，６−ピリジンジカルボン酸、３，４−ピリジンジカルボン酸、および３，５−ピリジンジカルボン酸から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられるが、特に２，６−ピリジンジカルボン酸（ＤＰＡ：ジピコリン酸）が好ましい。
【００２２】
本発明は、β−ラクタム薬を含有するディスクとβ−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤を含有するディスクとの組合せを用いるＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験方法でもあり得る。
本発明においては、β−ラクタム薬を含有するディスクと、β−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤を含有するディスクとを被検菌を接種した寒天平板上に静置し、培養後の阻止円の直径の違いにより、ＭＢＬ産生菌かどうか容易に判定することができる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明は、チオール基を有していないキレート作用を有するジカルボン酸誘導体をＭＢＬ阻害剤として用いているので、β−ラクタム薬系抗菌剤の保存安定性を向上させることができる。従って本発明によれば、β−ラクタム薬系抗菌剤の力価に影響を及ぼすことなく、一般検査室でのＭＢＬ産生菌のＭＩＣ測定が可能となると共に、一般病院や検査センターの細菌検査の自動化・システム化にも対応が可能である。
【００２４】
また、本発明は、β−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸を含有するディスクの製造および供給が可能となる。従って本発明によれば、β−ラクタム薬を含有するディスクとβ−ラクタム薬およびＭＢＬ阻害剤としてジカルボン酸を含有するディスクとの組合せを用いるＭＢＬ産生菌鑑別方法の開発が容易となる。
【００２５】
ＭＢＬ産生菌は、ＥＳＢＬ産生菌よりも臨床上の薬剤耐性の問題は大きいが、未だ標準的な国際試験法が確立されていないのが現状である。本発明により、一般的な検査室で簡易にＭＢＬ産生菌の鑑別やＭＩＣ測定が可能となるので、このような国際標準法の作製が可能となる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２７】
実施例１ 薬剤感受性試験用マイクロプレートの作成
ＮＣＣＬＳ標準法の微量液体希釈法に準じてβ−ラクタム薬としてＣＡＺおよびＩＰＭ０．２５−１２８μg/mlを含有するＣＡＭＨＢの２倍希釈系列を作成し、９６穴マイクロプレートに１００μlずつ分注した。同様にその希釈系列にＭＢＬ阻害剤２５−３２００μg/mlを添加したＣＡＭＨＢ２倍希釈系列を９６穴マイクロプレートに１００μlずつ分注した。
【００２８】
(1)ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/ml
(2)ＣＡＺ／ＭＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(3)ＣＡＺ／ＳＭＰ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(4)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml
(5)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml
(6)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml
(7)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(8)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml
(9)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml
(10)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml
(11)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml
(12)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml
(13)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml
(14)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml
(15)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(16)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml
(17)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml
(18)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml
(19)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml
(20)ＩＰＭ ０．２５−１２８μg/ml
(21)ＩＰＭ／ＭＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(22)ＩＰＭ／ＳＭＰ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(23)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml
(24)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml
(25)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml
(26)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(27)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml
(28)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml
(29)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml
(30)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml
(31)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml
(32)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml
(33)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml
(34)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml
(35)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml
(36)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml
(37)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml
(38)ＩＰＭ／ＤＰＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml
【００２９】
上記(1)−(38)の希釈系列マイクロプレートにＭＢＬ産生菌（K.pneumoniae 4134）および非産生菌（K.pneumoniae 4153）それぞれ１株を接種し、３５℃で１晩培養したところ、遊離のＭＢＬ阻害剤としてＭＰＡを含む(2),(21)は、強い悪臭がしたが、ＭＢＬ産生菌と非産生菌とでは、ＭＩＣ値の顕著な（３管＝８倍以上）相違が認められた。
同様に、ＭＢＬ阻害剤１００−１６００μg/mlを含むその他の系列ではＭＢＬ産生菌と非産生菌とで明らかな発育の違いが見られた。
これに対し、ＭＢＬ阻害剤２５〜５０μg/mlを含む(4),(5),(12),(13),(23),(24),(31),(32)ではＭＢＬ産生菌と非産生菌ともに発育し、阻害剤を含まない(1),(20)と同様であり、産生菌と非産生菌との区別がつかなかった。
また、ＭＢＬ阻害剤３２００μg/mlを含む(11),(19),(30),(38)ではＭＢＬ産生菌と非産生菌とも発育せず、それぞれの区別がつかなかった。
なお、本プレートを−７０℃で凍結保存したが、６ヶ月後でも使用可能であった。
【００３０】
実施例２ 微量液体希釈法（ＭＩＣ法）によるＭＢＬ産生菌および非産生菌の確認
ＰＣＲ法によりＭＢＬ産生菌であることが確認されているKlebsiella pneumoniae ２株、Pseudomonas aeruginosa １３株、Serratia marcescens ３４株、および同様にＰＣＲ法によりＭＢＬ非産生菌として確認されているＥＳＢＬ産生Klebsiella pneumoniae ２株、ペニシリナーゼ（ＰＣＮ）産生Klebsiella pneumoniae ２株、セファロスポリナーゼ（ＣＰＮ）産生Klebsiella pneumoniae ２株を試験菌として用い、実施例１で作製したマイクロプレートのＣＡＺ０．２５−１２８μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）とＣＡＺ／ＤＰＡ０．２５／４００−１２８／４００μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）との組合せ、及びＩＰＭ０．２５−１２８μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）とＩＰＭ／ＤＰＡ０．２５／４００−１２８／４００μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）との組合せを用い、ＮＣＣＬＳガイドラインに従い、微量液体希釈法で試験菌を培養し、ＭＩＣを測定した。
純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを希釈し、培地１mlあたりの菌数が約１０４個になるようにマイクロタイタープレートの各穴に接種し、３５℃で１８時間好気培養したのち、それぞれの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。β−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤合剤のＭＩＣがβ−ラクタム薬単独のＭＩＣより３管（８倍）以上離れているものをＭＢＬ産生菌と判定した。その結果を表１に示す。
なお、本実施例の判定基準はＮＣＣＬＳのＥＳＢＬ産生菌判定基準に準拠し、それと同一にした。
【００３１】
【表１】
上記表１において、感度とは（ＭＢＬ産生菌と正しく判定された菌数）／（全ＭＢＬ産生菌数）を表し、特異性とは（非ＭＢＬ産生菌と正しく判定された菌数）／（全非ＭＢＬ産生菌数）を表し、一致率とは（ＭＢＬ・非ＭＢＬ産生菌と正しく判定された菌数）／（全検体数）を表している。言い換えれば、感度はＭＢＬ産生菌がＭＢＬ産生菌として正しく判定される確率をいい、特異性はＭＢＬ産生菌でないものがＭＢＬ産生菌でないと判定される確率をいい、一致率はそれぞれが正しく判定される確率を表す。
つまりＣＡＺで言えば、感度は４７／４９＝９６％となり、特異性は６／６＝１００％となり、一致率は５３／５５＝９６％となる。
【００３３】
表１の結果より、ＣＡＺでＭＢＬ産生菌と判定された菌数は４７株であるので、その感度は４７／４９＝９６％であり、また特異性は１００％であった。ＭＢＬの一致率は９６％と高く、本発明は一般の微生物検査室でのＭＢＬ産生菌の簡易スクリーニング法として有用性が高いと考えられる。さらにＩＰＭと組み合わせれば、ＭＢＬ産生菌は２株増えて４９株と判定される。つまり感度は４９／４９＝１００％、特異性は６／６＝１００％、一致率は５５／５５＝１００％とさらに高率となる。被検菌数をさらに増やして確認すれば、本方法はＭＢＬ産生菌の確認試験として使用できる可能性がある。
【００３４】
実施例３ 薬剤を固定化乾燥したプレートの作成及びＭＩＣの測定
液体培地１００μlを加えて溶解した時に下記の濃度となるようにＣＡＺ及びＣＡＺ／ＤＰＡの薬剤２倍希釈系列溶液を調製し、９６穴マイクロプレートに適量分注し、４５℃で６０分間送風乾燥し、薬剤を固定化乾燥したプレートを作成した。
(1)ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/ml
(2)ＣＡＺ／ＤＰＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml
薬剤を固定化乾燥したプレートの各穴にＣＡＭＨＢ１００μlを分注し薬剤を溶解し、実施例２で使用したＭＢＬ産生菌４９株、ＭＢＬ非産生菌６株を接種し、実施例２と同様に操作し、ＭＩＣを測定した。
その結果、本薬剤を固定化乾燥したプレートも、実施例２と同様の菌の発育を示し、感度・特異性・一致率も同一成績であった。
ＭＢＬ阻害剤は不揮発性の有機酸であるので、乾燥プレートとして作製・保存してもそのＭＢＬ阻害作用は保持されていた。
【００３５】
実施例４ ＭＢＬ阻害剤を含有した乾燥ディスクの作製及び保存安定性
遊離のチオール化有機酸、及びチオール化有機酸の塩を含む乾燥ディスクと、チオール基を有していない有機酸を含む乾燥ディスクとを作製し、ディスク拡散法を行い阻止円直径を測定した。
(1)ＳＭＡ（２．９mg/ディスク含有）
(2)ＭＰＡ（２．７mg/ディスク含有）
(3)ＤＰＡ（０．５mg/ディスク含有）
市販のＳＭＡ、ＭＰＡを精製水に溶解し、１．０モルの水溶液を作製した。ＤＰＡは、０．０５モルのＥＨＥＰＥ緩衝液ｐＨ７．０に溶解し、最終濃度０．１２モルのＤＰＡ水溶液を作製した。ＫＢディスク用の直径６．３５mmの濾紙ディスクに上記の各調製溶液２５μlを滴下し、５０℃で６０分間乾燥し、ＳＭＡディスク、ＭＰＡディスク、ＤＰＡディスクを作製した。
ＰＣＲ法であらかじめＭＢＬ産生菌であることが確認されている肺炎桿菌（K.pneumoniae)１株、および霊菌（S.marcescens）１株、緑膿菌（P.aeruginosa）２株を用いて、J.Clin.Microbiol.,38(1),40,2000に従った方法で操作し、その阻止円の直径を測定した。
ＮＣＣＬＳのディスク法（標準法）に準じて、純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させ、ＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを綿棒を用いてミューラーヒントン寒天培地（ＭＨＡ）表面に均一に接種した。菌を接種した寒天平板培地表面上に２枚のＫＢディスクＣＡＺ（栄研化学製）を３〜５cm離して接置し、どちらか片方のＫＢディスクＣＡＺからさらに１．５〜２ｃｍ離してＭＢＬ阻害剤ディスク（ＳＭＡディスク、ＭＰＡディスク、もしくはＤＰＡディスク）を載せ、３５℃で１８時間好気培養し、各ＣＡＺディスクの周囲に形成された阻止円直径をシャーレの裏からmm単位で正確に測定した。また上記作製の各ＭＢＬ阻害剤を含有したディスクを３７℃に保存して１週間毎に試験を行い、４週目まで測定を行った。その結果を表２〜表６に示す。
【００３６】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
各菌の阻止円直径は表２−表６に示すとおりであった。
本実施例の判定基準はＮＣＣＬＳ法のＥＳＢＬ産生菌確認試験と同様に、本発明におけるＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＡ（ＤＰＡ）ディスクの阻止円直径の差が５mm以上の時、試験菌をＭＢＬ産生菌と判定することにした。
表２において、各菌（ＭＢＬ産生菌）はＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＡディスクの組合せで阻止円径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。またＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＤＰＡディスクに関しても同様に全ての菌においてその阻止円径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。しかし、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＭＰＡディスクに関しては全ての菌の阻止円径の差が５mm未満であるのでＭＢＬとは判定されなかった。これは、ＭＰＡディスク作製の乾燥時にＭＰＡが揮発し、ディスク中のＭＰＡ含有量が減少した影響と考えられる。
表３−表６においても同様な結果であり、ＣＡＺ／ＳＭＡディスクとＣＡＺ／ＤＰＡのディスクは３７℃保存で少なくとも４週間安定してＭＢＬを判定することが可能であった。これは冷所保存であれば１年間以上の保存安定性に相当する。
【００４２】
実施例５ 同一ディスクにＣＡＺ／ＤＰＡを含有する乾燥ディスクの作成及び使用
栄研化学（株）製の直径６．３５mmのＫＢディスクＣＡＺ（３０μg含有）に０．１２モルのＤＰＡ溶液２５μlを滴下し、５０℃で６０分間乾燥し、ＣＡＺ／ＤＰＡディスクを作製した。また、同様にＫＢディスク用の直径６．３５mmの濾紙ディスクにＤＰＡ溶液２５μlを滴下し、５０℃で６０分間乾燥し、ＤＰＡディスクを作製した。
ＰＣＲ法であらかじめＭＢＬ産生菌であることが確認されている肺炎桿菌１株、霊菌１株、および緑膿菌２株を用いて、ＮＣＣＬＳのディスク法に準じて純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを綿棒を用いてＭＨＡ表面に均一に接種した。その上にＫＢディスクＣＡＺを置き、それより３cm以上離してＣＡＺ／ＤＰＡディスクを置き、さらに３cm以上離してＤＰＡディスクを置き、３５℃で１８時間好気培養し、ＣＡＺディスク、ＣＡＺ／ＤＰＡディスク、およびＤＰＡディスクの阻止円直径を測定した。
【００４３】
【表７】
各菌の阻止円直径は表７に示すとおりであった。
表７に示すように、各菌（ＭＢＬ産生菌）はＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＤＰＡディスクとの組合せにおいて、全ての菌の阻止円直径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。
また、ＤＰＡディスク単独での発育阻止はＣＡＺ／ＤＰＡディスクの発育阻止に比べて顕著に小さく、故にＤＰＡ自身の抗菌力は、ほとんど無視できると考えられ、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＤＰＡディスクとの組み合わせでＭＢＬの判定が可能であった。
【００４５】
実施例６ ＭＢＬ阻害剤を含有した寒天培地平板の作製とその使用
ＤＰＡを含有するＣＡＭＨＡとＤＰＡを含有しないＣＡＭＨＡとを２分画シャーレに分注し、寒天平板を作成した。ＫＢディスクＣＡＺを静置し、その阻止円の形成を観た。
市販のＤＰＡを０．０５モルのＥＨＥＰＥ緩衝液ｐＨ７．０に溶解し、８０００μg/mlのＤＰＡ溶液を作製した。あらかじめ１２１℃で１５分間の高圧滅菌したＣＡＭＨＡ培地を５０℃に冷却し、ＣＡＭＨＡ１９mlに対してＤＰＡ溶液１mlを加えて撹拌し均一な寒天培地溶液にした。分画シャーレの一画にＣＡＭＨＡ１０mlを分注し、もう一画にＤＰＡを含有したＣＡＭＨＡ１０mlを分注した。寒天培地が固化後、シャーレの蓋をずらして寒天表面の凝水を乾燥させ、ＣＡＭＨＡ平板を作製した。
ＰＣＲ法であらかじめＭＢＬ産生菌であることが確認されている肺炎桿菌１株、霊菌１株、および緑膿菌２株を用いて、ＮＣＣＬＳのディスク法に準じて純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させてＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを綿棒を用いてＣＡＭＨＡ表面とＤＰＡを含有したＣＡＭＨＡ表面とに均一に接種した。２分画シャーレの各培地上にＫＢディスクＣＡＺを１枚ずつおき、培養後各ＣＡＺディスクの阻止円直径を測定した。
【００４６】
【表８】
各菌の阻止円直径は表８に示すとおりであった。
表８に示すように、各菌（ＭＢＬ産生菌）はＣＡＭＨＡ上のＣＡＺディスクとＳＭＡＤＰＡを含有したＣＡＭＨＡ上のＣＡＺディスクとの組合せにおいて、全ての菌の阻止円直径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。
【００４８】
Claims (8)
- β−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネムを含有する液体培地と、β−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネム、およびメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤として２，６−ピリジンジカルボン酸を含有する液体培地との組合せを用いることを特徴とするメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法。
- β−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネム０．２５−１２８μｇ/ｍｌを含有する液体培地と、β−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネム０．２５−１２８μｇ/ｍｌ、およびメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤として２，６−ピリジンジカルボン酸１００−１６００μｇ/ｍｌを含有する液体培地との組合せを用いる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法。
- 液体培地がミューラー・ヒントン液体培地、陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地、ブレインハートインフュージョン液体培地、トリプトソイ液体培地、ＡＢＣＭ液体培地、溶血液添加ミューラー・ヒントン液体培地、シェドラー液体培地、ブルセラ液体培地、および溶血液添加ブルセラ液体培地から成る群から選択される請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法。
- 請求項１乃至３記載の薬剤感受性試験に用いる多穴容器であって、該多穴容器の各穴にβ−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネムを含有する液体培地と、β−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネム、およびメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤として２，６−ピリジンジカルボン酸を含有する液体培地とを分注したことを特徴とするメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験に用いる多穴容器。
- 使用時まで凍結保存されている請求項４記載の多穴容器。
- 請求項１乃至３記載の薬剤感受性試験に用いる多穴容器であって、該多穴容器の各穴にβ−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネムを含有する液体培地と、β−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネム、およびメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤として２，６−ピリジンジカルボン酸を含有する液体培地とを分注し、各穴の薬剤を乾燥固定化したことを特徴とするメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験に用いる多穴容器。
- 請求項１乃至３記載の薬剤感受性試験に用いる多穴容器であって、該多穴容器の各穴にβ−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネムを含有する液体培地と、β−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネム、およびメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤として２，６−ピリジンジカルボン酸を含有する液体培地とを分注し、各穴の薬剤を含有する液体培地を乾燥固定化したことを特徴とするメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験に用いる多穴容器。
- β−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネムを含有するディスクと、β−ラクタム薬としてセフタジジムおよびイミペネム、およびメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤として２，６−ピリジンジカルボン酸を含有するディスクとの組合せを用いることを特徴とするメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法。
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