JP2001299388A - メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法 - Google Patents
メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法Info
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- JP2001299388A JP2001299388A JP2000121982A JP2000121982A JP2001299388A JP 2001299388 A JP2001299388 A JP 2001299388A JP 2000121982 A JP2000121982 A JP 2000121982A JP 2000121982 A JP2000121982 A JP 2000121982A JP 2001299388 A JP2001299388 A JP 2001299388A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は院内感染の原因菌として問題になって
いるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験
方法を提供する。 【解決手段】本発明の課題は、β−ラクタム薬含有液体
培地とβ−ラクタム薬／メタロ−β−ラクタマーゼ阻害
剤含有液体培地の組合せを用いた微量液体希釈法（ＭＩ
Ｃ測定）によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤
感受性試験方法により達成された。
いるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験
方法を提供する。 【解決手段】本発明の課題は、β−ラクタム薬含有液体
培地とβ−ラクタム薬／メタロ−β−ラクタマーゼ阻害
剤含有液体培地の組合せを用いた微量液体希釈法（ＭＩ
Ｃ測定）によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤
感受性試験方法により達成された。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、β−ラクタム薬含
有液体培地とβ−ラクタム薬／メタロ−β−ラクタマー
ゼ阻害剤含有液体培地の組合せを用いた微量液体希釈法
によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試
験方法に関する。
有液体培地とβ−ラクタム薬／メタロ−β−ラクタマー
ゼ阻害剤含有液体培地の組合せを用いた微量液体希釈法
によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試
験方法に関する。
【０００２】なお、本発明では次の略語を使用すること
がある。
がある。
【略語表】ＭＢＬ：メタロ−β−ラクタマーゼ (Metall
o-Beta-Lactamase) ＥＳＢＬ：基質拡張型β−ラクタマーゼ (Extended Spe
ctrum Beta-Lactamase) ＭＡＡ：メルカプト酢酸 (Mercaptoacetic Acid) ＳＭＡ：メルカプト酢酸ナトリウム (Mercaptoacetic A
cid Sodium salt) ＭＰＡ：２−メルカプトプロピオン酸 (2-Mercaptoprop
ionic Acid) ＳＭＰ：２−メルカプトプロピオン酸ナトリウム (2-Me
rcaptopropionic Acid Sodium salt) ＣＡＺ：セフタジジム ＩＰＭ：イミペネム ＮＣＣＬＳ：米国臨床検査標準委員会 (National Commi
tee for Clinical Laboratory Standards) ＭＩＣ：最小発育阻止濃度 (Minimum Inhibitory Conce
ntration) ＭＨＡ：ミューラー・ヒントン寒天培地 (Mueller Hint
on Agar) ＭＨＢ：ミューラー・ヒントン液体培地 (Mueller Hint
on Broth) ＣＡＭＨＡ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン寒天培
地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Agar) ＣＡＭＨＢ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培
地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Broth)
o-Beta-Lactamase) ＥＳＢＬ：基質拡張型β−ラクタマーゼ (Extended Spe
ctrum Beta-Lactamase) ＭＡＡ：メルカプト酢酸 (Mercaptoacetic Acid) ＳＭＡ：メルカプト酢酸ナトリウム (Mercaptoacetic A
cid Sodium salt) ＭＰＡ：２−メルカプトプロピオン酸 (2-Mercaptoprop
ionic Acid) ＳＭＰ：２−メルカプトプロピオン酸ナトリウム (2-Me
rcaptopropionic Acid Sodium salt) ＣＡＺ：セフタジジム ＩＰＭ：イミペネム ＮＣＣＬＳ：米国臨床検査標準委員会 (National Commi
tee for Clinical Laboratory Standards) ＭＩＣ：最小発育阻止濃度 (Minimum Inhibitory Conce
ntration) ＭＨＡ：ミューラー・ヒントン寒天培地 (Mueller Hint
on Agar) ＭＨＢ：ミューラー・ヒントン液体培地 (Mueller Hint
on Broth) ＣＡＭＨＡ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン寒天培
地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Agar) ＣＡＭＨＢ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培
地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Broth)
【０００３】
【従来の技術および発明が解決すべき課題】β−ラクタ
ム薬（β−ラクタム系抗菌薬）はその分子構造母核中に
β−ラクタム環を持つ抗菌薬の総称でペニシリンの発見
以来、多くのβ−ラクタム薬が開発されている。このβ
−ラクタム薬の開発に伴い、その分子構造中のβ−ラク
タム環を加水分解して、その抗菌作用を無効化する酵素
β−ラクタマーゼを産生する耐性菌（β−ラクタマーゼ
産生菌）が出現した。β−ラクタマーゼはクラスＡ〜Ｄ
型に分類される。このうちクラスＢ型酵素はその活性中
心に亜鉛などの金属イオンを有しているので、メタロ−
β−ラクタマーゼ（ＭＢＬ）と呼ばれる。ＭＢＬの阻害
剤としてはチオール化合物やＥＤＴＡなどが知られてい
る。[1][2][3][4][5][6]。
ム薬（β−ラクタム系抗菌薬）はその分子構造母核中に
β−ラクタム環を持つ抗菌薬の総称でペニシリンの発見
以来、多くのβ−ラクタム薬が開発されている。このβ
−ラクタム薬の開発に伴い、その分子構造中のβ−ラク
タム環を加水分解して、その抗菌作用を無効化する酵素
β−ラクタマーゼを産生する耐性菌（β−ラクタマーゼ
産生菌）が出現した。β−ラクタマーゼはクラスＡ〜Ｄ
型に分類される。このうちクラスＢ型酵素はその活性中
心に亜鉛などの金属イオンを有しているので、メタロ−
β−ラクタマーゼ（ＭＢＬ）と呼ばれる。ＭＢＬの阻害
剤としてはチオール化合物やＥＤＴＡなどが知られてい
る。[1][2][3][4][5][6]。
【０００４】ＭＢＬ産生菌はメタロ−β−ラクタマーゼ
を産生することにより、ペニシリン系からセフェム系、
セファマイシン系、カルバペネム系抗菌薬に至るまでの
幅広い範囲のβ−ラクタム薬に耐性を獲得した。近年に
なって、これらのβ−ラクタム薬に耐性を示す緑膿菌や
セラチア菌などのグラム陰性桿菌（ＭＢＬ産生菌）が各
地の医療施設から分離され問題となっている。メタロ−
β−ラクタマーゼをプラスミド性に産生する菌は、これ
までわが国でのみ分離されてきたが、最近、外国におい
ても分離され、海外の専門家の間でも関心が高まりつつ
ある。[7]。
を産生することにより、ペニシリン系からセフェム系、
セファマイシン系、カルバペネム系抗菌薬に至るまでの
幅広い範囲のβ−ラクタム薬に耐性を獲得した。近年に
なって、これらのβ−ラクタム薬に耐性を示す緑膿菌や
セラチア菌などのグラム陰性桿菌（ＭＢＬ産生菌）が各
地の医療施設から分離され問題となっている。メタロ−
β−ラクタマーゼをプラスミド性に産生する菌は、これ
までわが国でのみ分離されてきたが、最近、外国におい
ても分離され、海外の専門家の間でも関心が高まりつつ
ある。[7]。
【０００５】ＭＢＬ産生菌は、セファロスポリナーゼ過
剰産生株などと類似の薬剤耐性パターンを示すが、後者
がカルバペネム薬に感受性を示すのに対し、ＭＢＬ産生
菌は、当初カルバペネム薬に感受性を示している株も、
カルバペネム薬の存在下で酵素の産生が誘導され、やが
てカルバペネム薬に耐性を示すようになる。従って、有
効かつ適正な化学療法を実施する上で、両者を早期に識
別できる検査方法の確立が必要となっていた。
剰産生株などと類似の薬剤耐性パターンを示すが、後者
がカルバペネム薬に感受性を示すのに対し、ＭＢＬ産生
菌は、当初カルバペネム薬に感受性を示している株も、
カルバペネム薬の存在下で酵素の産生が誘導され、やが
てカルバペネム薬に耐性を示すようになる。従って、有
効かつ適正な化学療法を実施する上で、両者を早期に識
別できる検査方法の確立が必要となっていた。
【０００６】ＭＢＬ産生菌は、第３世代セフェム系、セ
ファマイシン系に高度耐性を示し、カルバペネム系にも
低度〜高度耐性を示す。しかし、同様に第３世代セフェ
ム系に高度耐性を示すセファロスポリナーゼ過剰産生株
などとＭＢＬ産生菌とを病院の検査室において日常的に
実施されている薬剤感受性試験や酵素学的な検査方法に
より識別することはこれまでは不可能であった。ＰＣＲ
法によるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出する方
法以外に確実にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別
する方法はなかった。[8]。
ファマイシン系に高度耐性を示し、カルバペネム系にも
低度〜高度耐性を示す。しかし、同様に第３世代セフェ
ム系に高度耐性を示すセファロスポリナーゼ過剰産生株
などとＭＢＬ産生菌とを病院の検査室において日常的に
実施されている薬剤感受性試験や酵素学的な検査方法に
より識別することはこれまでは不可能であった。ＰＣＲ
法によるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出する方
法以外に確実にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別
する方法はなかった。[8]。
【０００７】この現状に鑑み、本発明者はＭＢＬ産生菌
を容易に判別することが可能なディスク拡散法を開発
し、すでにＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．に文献
発表を行い、また特許出願も行っている。[9][10]。
を容易に判別することが可能なディスク拡散法を開発
し、すでにＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．に文献
発表を行い、また特許出願も行っている。[9][10]。
【０００８】この方法は合計３枚の濾紙ディスクを用い
る方法である。まず、直径６．３５mmの濾紙ディスク
に、ＭＢＬ阻害剤としてメルカプト酢酸（ＭＡＡ）、メ
ルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、メルカプトエタノー
ル等のチオール化合物を含浸させたＭＢＬ阻害剤ディス
クを作成する。次いでＣＡＺなどのβ−ラクタム薬を含
有する乾燥ディスク２枚を、被検菌を塗布した寒天平板
上に距離を置いて静置し、一方のＣＡＺディスクに近接
してＭＢＬ阻害剤ディスクを静置し、阻害剤の影響下で
形成される阻止円の形状と、阻害剤の影響のない通常の
阻止円の形状の違いを観察し、ＭＢＬ産生菌であるかど
うかを判定するものである。この方法では、得られる阻
止円の形状・大きさがＭＢＬ阻害剤ディスクの有無で全
く異なるため、容易にＭＢＬ産生菌であるかどうか判定
できる。しかしながら、上記判定方法では、ＭＢＬ産生
菌であるかどうかは定性的に判定できるが、定量的な最
小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めることはできない。ま
た使用したチオール化合物（ＭＢＬ阻害剤）は揮発性で
あるため、阻害剤ディスクは乾燥ができず、用時調製で
用いるしかなく、操作性にやや問題が残った。
る方法である。まず、直径６．３５mmの濾紙ディスク
に、ＭＢＬ阻害剤としてメルカプト酢酸（ＭＡＡ）、メ
ルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、メルカプトエタノー
ル等のチオール化合物を含浸させたＭＢＬ阻害剤ディス
クを作成する。次いでＣＡＺなどのβ−ラクタム薬を含
有する乾燥ディスク２枚を、被検菌を塗布した寒天平板
上に距離を置いて静置し、一方のＣＡＺディスクに近接
してＭＢＬ阻害剤ディスクを静置し、阻害剤の影響下で
形成される阻止円の形状と、阻害剤の影響のない通常の
阻止円の形状の違いを観察し、ＭＢＬ産生菌であるかど
うかを判定するものである。この方法では、得られる阻
止円の形状・大きさがＭＢＬ阻害剤ディスクの有無で全
く異なるため、容易にＭＢＬ産生菌であるかどうか判定
できる。しかしながら、上記判定方法では、ＭＢＬ産生
菌であるかどうかは定性的に判定できるが、定量的な最
小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めることはできない。ま
た使用したチオール化合物（ＭＢＬ阻害剤）は揮発性で
あるため、阻害剤ディスクは乾燥ができず、用時調製で
用いるしかなく、操作性にやや問題が残った。
【０００９】また未発表であるが、本発明者はＭＡＡ、
ＭＰＡ等のチオール化合物（ＭＢＬ阻害剤）とＣＡＺ等
のβ−ラクタム薬を用いた微量液体希釈法によるＭＩＣ
測定も試みた。この方法は、本発明の実施例と一部重複
するが、９６穴マイクロプレートを用い、２倍希釈でＣ
ＡＺを０．２５−１２８μg/ml含有する液体培地の希釈
系列と、一定量のＭＢＬ阻害剤及びＣＡＺ０．２５−１
２８μg/mlを含有する液体培地希釈系列との組合せを用
い、被検菌を培養し、ＭＩＣを測定する方法である。こ
の方法でＣＡＺ単独のＭＩＣ及びＣＡＺ／ＭＰＡ合剤の
ＭＩＣが容易に測定でき、またその差もＭＢＬ産生菌で
は明確であった。しかしながら、使用したチオール化合
物（ＭＢＬ阻害剤）は揮発性であり、悪臭を発する。そ
のため、特に試薬の調製時にその悪臭が、検査室全体に
広がり、このままルーチン検査として用いるには問題が
多いものであった。
ＭＰＡ等のチオール化合物（ＭＢＬ阻害剤）とＣＡＺ等
のβ−ラクタム薬を用いた微量液体希釈法によるＭＩＣ
測定も試みた。この方法は、本発明の実施例と一部重複
するが、９６穴マイクロプレートを用い、２倍希釈でＣ
ＡＺを０．２５−１２８μg/ml含有する液体培地の希釈
系列と、一定量のＭＢＬ阻害剤及びＣＡＺ０．２５−１
２８μg/mlを含有する液体培地希釈系列との組合せを用
い、被検菌を培養し、ＭＩＣを測定する方法である。こ
の方法でＣＡＺ単独のＭＩＣ及びＣＡＺ／ＭＰＡ合剤の
ＭＩＣが容易に測定でき、またその差もＭＢＬ産生菌で
は明確であった。しかしながら、使用したチオール化合
物（ＭＢＬ阻害剤）は揮発性であり、悪臭を発する。そ
のため、特に試薬の調製時にその悪臭が、検査室全体に
広がり、このままルーチン検査として用いるには問題が
多いものであった。
【００１０】従って、本発明の目的は、ルーチン検査に
有用でＭＩＣ測定が可能な微量液体希釈法によるＭＢＬ
産生菌の感受性試験方法及びそのための容器を提供する
こと、さらに乾燥したＭＢＬ阻害剤の濾紙ディスクを提
供すること、さらに進めて、βラクタム薬／ＭＢＬ阻害
剤の２薬を合剤として含有する乾燥濾紙ディスクを提供
することにある。
有用でＭＩＣ測定が可能な微量液体希釈法によるＭＢＬ
産生菌の感受性試験方法及びそのための容器を提供する
こと、さらに乾燥したＭＢＬ阻害剤の濾紙ディスクを提
供すること、さらに進めて、βラクタム薬／ＭＢＬ阻害
剤の２薬を合剤として含有する乾燥濾紙ディスクを提供
することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】かかる実状において本発
明者らは鋭意努力の結果、ＭＢＬ阻害剤としてチオール
化有機酸を用い、それを適当なアルカリ塩とすることに
より、その不揮発化を計り、不揮発化したＭＢＬ阻害剤
が、揮発性のフリーのチオール化有機酸と同様のＭＢＬ
阻害作用があることを見いだし、本発明を完成した。
明者らは鋭意努力の結果、ＭＢＬ阻害剤としてチオール
化有機酸を用い、それを適当なアルカリ塩とすることに
より、その不揮発化を計り、不揮発化したＭＢＬ阻害剤
が、揮発性のフリーのチオール化有機酸と同様のＭＢＬ
阻害作用があることを見いだし、本発明を完成した。
【００１２】本発明は、（１)β−ラクタム薬含有液体
培地とβ−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤含有液体培地との
組合せを用いた微量液体希釈法によるＭＢＬ産生菌の薬
剤感受性試験方法である。 （２)ＭＢＬ阻害剤としては不揮発性のチオール化有機
酸の塩、 （３)特に、メルカプト酢酸またはメルカプトプロピオ
ン酸の塩が好ましく、 （４)またその塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、バリウム塩、第４級アンモニウム塩より選ば
れる。これらのチオール化有機酸の塩は市販品をそのま
ま用いても良いし、遊離のチオール化有機酸溶液に当量
のアルカリ溶液を加えて中和することによっても求めら
れる。たとえば、ＭＰＡのナトリウム塩であれば、ＭＰ
Ａ溶液に当量の水酸化ナトリウム溶液を加えることによ
り調製され、ＭＡＡの第４級アンモニウム塩であれば、
ＭＡＡ溶液に当量の水酸化テトラブチルアンモニウム(T
etra-butyl ammonium hydroxide)を加えることにより調
製される。要は、不揮発性でかつ水溶性のチオール化有
機酸塩をＭＢＬ阻害剤として用いることが本発明にとっ
て、重要なのである。 （５)さらに、本発明で用いるβ−ラクタム薬としては
セフタジジム、セフォタキシム、セフトリアキソン、セ
フポドキシム、セフピロム、セフェピム等の第三・第四
世代セフェム系抗菌薬、セフメタゾール、セフミノクス
等の第二・第三世代セファマイシン系抗菌薬、イミペネ
ム、パニペネム、メロペネム等のカルバペネム系抗菌薬
より選ばれる。その中でもセフタジジム（ＣＡＺ）、イ
ミペネム（ＩＰＭ）が本発明には適している。 （６)本発明に用いる液体培地としてはミューラー・ヒ
ントン液体培地、陽イオン調整ミューラー・ヒントン液
体培地、ブレインハートインフュージョン液体培地、ト
リプトソイ液体培地、ＡＢＣＭ液体培地、溶血液加ミュ
ーラー・ヒントン液体培地、シェドラー液体培地等の微
量液体希釈法に用いられる一般的な液体培地が挙げられ
る。その中でもミューラー・ヒントン液体培地（ＭＨ
Ｂ）、陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地（Ｃ
ＡＭＨＢ）が本発明には適している。 （７)より具体的に本発明は、β−ラクタム薬を０．２
５−１２８μg/ml含有する液体培地と、β−ラクタム薬
０．２５−１２８μg/ml／ＭＢＬ阻害剤１００−１６０
０μg/mlを含有する液体培地との組合せを用いる（１）
−（６）記載の微量液体希釈法によるＭＢＬ産生菌の薬
剤感受性試験方法である。ＭＢＬ阻害剤として用いるチ
オール化有機酸塩は、被検菌によっては３２００μg/ml
以上のＭＩＣを示すので、その濃度は１００−１６００
μg/mlが適当である。５０μg/ml以下ではＭＢＬ阻害作
用が弱くなりすぎ、不適当である。
培地とβ−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤含有液体培地との
組合せを用いた微量液体希釈法によるＭＢＬ産生菌の薬
剤感受性試験方法である。 （２)ＭＢＬ阻害剤としては不揮発性のチオール化有機
酸の塩、 （３)特に、メルカプト酢酸またはメルカプトプロピオ
ン酸の塩が好ましく、 （４)またその塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、バリウム塩、第４級アンモニウム塩より選ば
れる。これらのチオール化有機酸の塩は市販品をそのま
ま用いても良いし、遊離のチオール化有機酸溶液に当量
のアルカリ溶液を加えて中和することによっても求めら
れる。たとえば、ＭＰＡのナトリウム塩であれば、ＭＰ
Ａ溶液に当量の水酸化ナトリウム溶液を加えることによ
り調製され、ＭＡＡの第４級アンモニウム塩であれば、
ＭＡＡ溶液に当量の水酸化テトラブチルアンモニウム(T
etra-butyl ammonium hydroxide)を加えることにより調
製される。要は、不揮発性でかつ水溶性のチオール化有
機酸塩をＭＢＬ阻害剤として用いることが本発明にとっ
て、重要なのである。 （５)さらに、本発明で用いるβ−ラクタム薬としては
セフタジジム、セフォタキシム、セフトリアキソン、セ
フポドキシム、セフピロム、セフェピム等の第三・第四
世代セフェム系抗菌薬、セフメタゾール、セフミノクス
等の第二・第三世代セファマイシン系抗菌薬、イミペネ
ム、パニペネム、メロペネム等のカルバペネム系抗菌薬
より選ばれる。その中でもセフタジジム（ＣＡＺ）、イ
ミペネム（ＩＰＭ）が本発明には適している。 （６)本発明に用いる液体培地としてはミューラー・ヒ
ントン液体培地、陽イオン調整ミューラー・ヒントン液
体培地、ブレインハートインフュージョン液体培地、ト
リプトソイ液体培地、ＡＢＣＭ液体培地、溶血液加ミュ
ーラー・ヒントン液体培地、シェドラー液体培地等の微
量液体希釈法に用いられる一般的な液体培地が挙げられ
る。その中でもミューラー・ヒントン液体培地（ＭＨ
Ｂ）、陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地（Ｃ
ＡＭＨＢ）が本発明には適している。 （７)より具体的に本発明は、β−ラクタム薬を０．２
５−１２８μg/ml含有する液体培地と、β−ラクタム薬
０．２５−１２８μg/ml／ＭＢＬ阻害剤１００−１６０
０μg/mlを含有する液体培地との組合せを用いる（１）
−（６）記載の微量液体希釈法によるＭＢＬ産生菌の薬
剤感受性試験方法である。ＭＢＬ阻害剤として用いるチ
オール化有機酸塩は、被検菌によっては３２００μg/ml
以上のＭＩＣを示すので、その濃度は１００−１６００
μg/mlが適当である。５０μg/ml以下ではＭＢＬ阻害作
用が弱くなりすぎ、不適当である。
【００１３】また本発明は、（８）上記（１）−（７）
記載の薬剤感受性試験に用いる容器であって、多穴容器
の各穴にβ−ラクタム薬を含有する液体培地、及びβ−
ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤を含有する液体培地を分注し
た、微量液体希釈法によるＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試
験に用いる容器でもある。 （９)本発明の多穴容器は使用時まで凍結保存されるこ
とにより、保存性が向上する。つまり生培地を分注した
容器としてとして供給されても良いし、保存性を考えて
凍結状態で保存・供給されても良い。
記載の薬剤感受性試験に用いる容器であって、多穴容器
の各穴にβ−ラクタム薬を含有する液体培地、及びβ−
ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤を含有する液体培地を分注し
た、微量液体希釈法によるＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試
験に用いる容器でもある。 （９)本発明の多穴容器は使用時まで凍結保存されるこ
とにより、保存性が向上する。つまり生培地を分注した
容器としてとして供給されても良いし、保存性を考えて
凍結状態で保存・供給されても良い。
【００１４】（１０)また本発明は、上記（１）−
（７）記載の薬剤感受性試験に用いる容器であって、多
穴容器の各穴にβ−ラクタム薬、及びβ−ラクタム薬／
ＭＢＬ阻害剤を分注し、各穴の薬剤を乾燥固定化したこ
とを特徴とする、微量液体希釈法によるＭＢＬ産生菌の
薬剤感受性試験に用いる容器でもある。 （１１)さらに本発明は上記（１）−（７）記載の薬剤
感受性試験に用いる容器であって、多穴容器の各穴にβ
−ラクタム薬を含有する液体培地、及びβ−ラクタム薬
／ＭＢＬ阻害剤を含有する液体培地を分注し、各穴の薬
剤含有液体培地を乾燥固定化したことを特徴とする、微
量液体希釈法によるＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験に用
いる容器でもある。つまり、薬剤のみを乾燥固着化した
多穴容器として供給されても良いし、薬剤含有液体培地
を乾燥固着化した容器として供給されても良い。乾燥方
法も薬剤や培地成分が変質しない方法であれば、自然乾
燥、送風乾燥、凍結乾燥といった一般的な乾燥方法で良
い。
（７）記載の薬剤感受性試験に用いる容器であって、多
穴容器の各穴にβ−ラクタム薬、及びβ−ラクタム薬／
ＭＢＬ阻害剤を分注し、各穴の薬剤を乾燥固定化したこ
とを特徴とする、微量液体希釈法によるＭＢＬ産生菌の
薬剤感受性試験に用いる容器でもある。 （１１)さらに本発明は上記（１）−（７）記載の薬剤
感受性試験に用いる容器であって、多穴容器の各穴にβ
−ラクタム薬を含有する液体培地、及びβ−ラクタム薬
／ＭＢＬ阻害剤を含有する液体培地を分注し、各穴の薬
剤含有液体培地を乾燥固定化したことを特徴とする、微
量液体希釈法によるＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験に用
いる容器でもある。つまり、薬剤のみを乾燥固着化した
多穴容器として供給されても良いし、薬剤含有液体培地
を乾燥固着化した容器として供給されても良い。乾燥方
法も薬剤や培地成分が変質しない方法であれば、自然乾
燥、送風乾燥、凍結乾燥といった一般的な乾燥方法で良
い。
【００１５】（１２)また本発明は、ＭＢＬ阻害剤とし
てチオール化有機酸の塩を含有するディスクでもある。 （１３)チオール化有機酸の塩としてはメルカプト酢酸
またはメルカプトプロピオン酸の塩が挙げられ、 （１４)特に、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、バリウム塩、第４級アンモニウム塩を含有させた乾
燥濾紙ディスクである。具体的には、ＫＢディスクと同
様の直径６．３５mmの濾紙ディスクに一定量のチオール
化有機酸塩を添加・乾燥したディスクである。その含浸
量は濾紙ディスク一枚当たり１−６mgが適当である。チ
オール化有機酸は塩となったことで不揮発化され、また
水溶性の塩であるので寒天平板上で容易に拡散し、ＭＢ
Ｌ阻害作用を示す。ＫＢディスクＣＡＺ等のβ−ラクタ
ム薬含有ディスクと共に用いられる。 （１５)さらに本発明は、β−ラクタム薬含有ディスク
とβ−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤含有ディスクとの組合
せ、を用いるＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験方法でもあ
る。 （１６)また本発明は、β−ラクタム薬及びメルカプト
酢酸またはメルカプトプロピオン酸のナトリウム塩、カ
リウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、第４級アンモニ
ウム塩より選ばれるチオール化有機酸の塩を含有するデ
ィスクでもある。その含浸量はＳＭＡに換算して濾紙デ
ィスク一枚当たり１−６mgが適当である。β−ラクタム
薬含有ディスクと、β−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤含有
ディスクとを被検菌を接種した寒天平板上に静置し、培
養後の阻止円の直径の違いにより、ＭＢＬ産生菌かどう
かの判定が容易にできる。
てチオール化有機酸の塩を含有するディスクでもある。 （１３)チオール化有機酸の塩としてはメルカプト酢酸
またはメルカプトプロピオン酸の塩が挙げられ、 （１４)特に、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、バリウム塩、第４級アンモニウム塩を含有させた乾
燥濾紙ディスクである。具体的には、ＫＢディスクと同
様の直径６．３５mmの濾紙ディスクに一定量のチオール
化有機酸塩を添加・乾燥したディスクである。その含浸
量は濾紙ディスク一枚当たり１−６mgが適当である。チ
オール化有機酸は塩となったことで不揮発化され、また
水溶性の塩であるので寒天平板上で容易に拡散し、ＭＢ
Ｌ阻害作用を示す。ＫＢディスクＣＡＺ等のβ−ラクタ
ム薬含有ディスクと共に用いられる。 （１５)さらに本発明は、β−ラクタム薬含有ディスク
とβ−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤含有ディスクとの組合
せ、を用いるＭＢＬ産生菌の薬剤感受性試験方法でもあ
る。 （１６)また本発明は、β−ラクタム薬及びメルカプト
酢酸またはメルカプトプロピオン酸のナトリウム塩、カ
リウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、第４級アンモニ
ウム塩より選ばれるチオール化有機酸の塩を含有するデ
ィスクでもある。その含浸量はＳＭＡに換算して濾紙デ
ィスク一枚当たり１−６mgが適当である。β−ラクタム
薬含有ディスクと、β−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤含有
ディスクとを被検菌を接種した寒天平板上に静置し、培
養後の阻止円の直径の違いにより、ＭＢＬ産生菌かどう
かの判定が容易にできる。
【００１６】（１７）さらに本発明は、β−ラクタム薬
含有ディスクとメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤含有寒
天平板培地とを用いるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌
の薬剤感受性試験方法でもある。 （１８）また本発明は、メルカプト酢酸またはメルカプ
トプロピオン酸のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウ
ム塩、バリウム塩、第４級アンモニウム塩より選ばれる
チオール化有機酸の塩を含有する寒天培地でもある。こ
の方法はＭＢＬ阻害剤含有寒天培地平板と、阻害剤を含
有しない寒天培地平板に被検菌を接種し、その上にβ−
ラクタム薬含有ディスク（ＣＡＺ等）を静置し、培養後
それぞれの培地上で形成された阻止円の直径の違いによ
り、ＭＢＬ産生菌かどうかを判定する。寒天培地のＭＢ
Ｌ阻害剤の濃度は１００−１６００μg/mlが適当であ
る。
含有ディスクとメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤含有寒
天平板培地とを用いるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌
の薬剤感受性試験方法でもある。 （１８）また本発明は、メルカプト酢酸またはメルカプ
トプロピオン酸のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウ
ム塩、バリウム塩、第４級アンモニウム塩より選ばれる
チオール化有機酸の塩を含有する寒天培地でもある。こ
の方法はＭＢＬ阻害剤含有寒天培地平板と、阻害剤を含
有しない寒天培地平板に被検菌を接種し、その上にβ−
ラクタム薬含有ディスク（ＣＡＺ等）を静置し、培養後
それぞれの培地上で形成された阻止円の直径の違いによ
り、ＭＢＬ産生菌かどうかを判定する。寒天培地のＭＢ
Ｌ阻害剤の濃度は１００−１６００μg/mlが適当であ
る。
【００１７】
【発明の実施の形態】従来から、ＭＢＬ阻害剤としてＭ
ＰＡやＭＡＡが有効であることが知られていた。また、
それらをそのままディスクに含有させ、ＭＢＬ阻害剤と
して用いたＭＢＬ産生菌判別方法をすでに本発明者は発
表した[9][10]。また未発表であるが、ＭＰＡ等を用い
た微量液体希釈法によりＭＩＣ測定が可能であることも
見いだした。しかしながら、ＭＰＡ等の遊離のチオール
化有機酸は低分子であるので揮発性が高く、その含浸デ
ィスクを乾燥すると、乾燥工程中にＭＰＡが揮散してし
まい、乾燥ディスクとしての供給ができなかった。微量
液体希釈法に用いると、液体培地中の遊離のチオール化
有機酸が培養中に揮発し、微生物培養装置のみならず、
検査室までその強い悪臭で汚染されてしまう欠点があっ
た。本発明者は、チオール化有機酸を塩として用いると
その揮発性はなくなるが、ＭＢＬ阻害作用には変化がな
いことを見いだし、本発明を完成した。チオール化有機
酸塩はまず、不揮発性であることが重要である。不揮発
性であることにより、悪臭の発生や、乾燥による揮散・
無効化が防止された。次いで、水溶性であることが重要
である。水溶性であることで、乾燥ディスクから寒天平
板内に容易にチオール化有機酸塩が拡散する。また微量
液体希釈法では、容易に溶解し、透明な液体培地とな
る。もし、ＭＰＡの銅塩といった不溶性の塩を用いる
と、ディスク法では拡散が起こらず、液体希釈法では沈
殿が生じ、ＭＢＬ阻害剤としての作用を示さなくなる。
ＰＡやＭＡＡが有効であることが知られていた。また、
それらをそのままディスクに含有させ、ＭＢＬ阻害剤と
して用いたＭＢＬ産生菌判別方法をすでに本発明者は発
表した[9][10]。また未発表であるが、ＭＰＡ等を用い
た微量液体希釈法によりＭＩＣ測定が可能であることも
見いだした。しかしながら、ＭＰＡ等の遊離のチオール
化有機酸は低分子であるので揮発性が高く、その含浸デ
ィスクを乾燥すると、乾燥工程中にＭＰＡが揮散してし
まい、乾燥ディスクとしての供給ができなかった。微量
液体希釈法に用いると、液体培地中の遊離のチオール化
有機酸が培養中に揮発し、微生物培養装置のみならず、
検査室までその強い悪臭で汚染されてしまう欠点があっ
た。本発明者は、チオール化有機酸を塩として用いると
その揮発性はなくなるが、ＭＢＬ阻害作用には変化がな
いことを見いだし、本発明を完成した。チオール化有機
酸塩はまず、不揮発性であることが重要である。不揮発
性であることにより、悪臭の発生や、乾燥による揮散・
無効化が防止された。次いで、水溶性であることが重要
である。水溶性であることで、乾燥ディスクから寒天平
板内に容易にチオール化有機酸塩が拡散する。また微量
液体希釈法では、容易に溶解し、透明な液体培地とな
る。もし、ＭＰＡの銅塩といった不溶性の塩を用いる
と、ディスク法では拡散が起こらず、液体希釈法では沈
殿が生じ、ＭＢＬ阻害剤としての作用を示さなくなる。
【００１８】
【発明の効果】現在、ＭＢＬ産生菌を確認する方法に、
ＰＣＲ法がある。ＰＣＲ法は最も確実な方法であるが、
特殊な手技や機器が必要であり、操作性・コストなどに
問題があり、一般病院の臨床微生物検査室ではまだ普及
していない。本発明者の開発したディスク確認法[9][1
0]が簡便かつ低コストで、どこの微生物検査室でも手軽
に検査することが可能と思われた。しかし遊離のＭＰＡ
等を用いるため、試薬が用時調製となり試薬調製に手間
がかかり、また、乾燥ディスクとして作製・保存できな
いので、一定品質のディスクの供給に問題があった。一
方、細菌の薬剤感受性検査は定性的なディスク法から定
量的な微量液体希釈法にシフトしつつある。そこで遊離
ＭＰＡを用いた微量液体希釈法（未発表）を開発した
が、機器や検査室の悪臭汚染が発生し、実用性に問題が
あった。本発明は、ＭＰＡ等のチオール化有機酸をアル
カリ塩として用いると、そのＭＢＬ阻害作用には影響な
しにそれが不揮発化することを見いだし、その揮発性に
伴う問題を解決した。チオール化有機酸塩をＭＢＬ阻害
剤として用いた微量液体希釈法は、悪臭汚染なしにＭＩ
Ｃ測定が可能であった。さらに９６穴プレート等の多穴
容器に各薬剤を分注した形態でも、ＭＢＬ阻害剤の喪失
が無いので、一定品質の製品の供給も可能となった。さ
らに薬剤を乾燥固着した乾燥状態の多穴容器も供給可能
となり、これは一般検査室でのＭＢＬ産生菌のＭＩＣ測
定に有用である。またこれは、一般病院や検査センター
の細菌検査の自動化・システム化にも対応可能である。
またディスク法においても、一定品質のＭＢＬ阻害剤含
有の乾燥ディスクの供給が可能となり、これは検査室で
のＭＢＬ産生菌の判定に有用である。さらに本発明によ
り、β−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤含有ディスクの製造
及び供給が可能となった。これにより、β−ラクタム薬
含有ディスクとβ−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤含有ディ
スクとの組合せを用いるＭＢＬ産生菌鑑別方法の開発が
容易となった。
ＰＣＲ法がある。ＰＣＲ法は最も確実な方法であるが、
特殊な手技や機器が必要であり、操作性・コストなどに
問題があり、一般病院の臨床微生物検査室ではまだ普及
していない。本発明者の開発したディスク確認法[9][1
0]が簡便かつ低コストで、どこの微生物検査室でも手軽
に検査することが可能と思われた。しかし遊離のＭＰＡ
等を用いるため、試薬が用時調製となり試薬調製に手間
がかかり、また、乾燥ディスクとして作製・保存できな
いので、一定品質のディスクの供給に問題があった。一
方、細菌の薬剤感受性検査は定性的なディスク法から定
量的な微量液体希釈法にシフトしつつある。そこで遊離
ＭＰＡを用いた微量液体希釈法（未発表）を開発した
が、機器や検査室の悪臭汚染が発生し、実用性に問題が
あった。本発明は、ＭＰＡ等のチオール化有機酸をアル
カリ塩として用いると、そのＭＢＬ阻害作用には影響な
しにそれが不揮発化することを見いだし、その揮発性に
伴う問題を解決した。チオール化有機酸塩をＭＢＬ阻害
剤として用いた微量液体希釈法は、悪臭汚染なしにＭＩ
Ｃ測定が可能であった。さらに９６穴プレート等の多穴
容器に各薬剤を分注した形態でも、ＭＢＬ阻害剤の喪失
が無いので、一定品質の製品の供給も可能となった。さ
らに薬剤を乾燥固着した乾燥状態の多穴容器も供給可能
となり、これは一般検査室でのＭＢＬ産生菌のＭＩＣ測
定に有用である。またこれは、一般病院や検査センター
の細菌検査の自動化・システム化にも対応可能である。
またディスク法においても、一定品質のＭＢＬ阻害剤含
有の乾燥ディスクの供給が可能となり、これは検査室で
のＭＢＬ産生菌の判定に有用である。さらに本発明によ
り、β−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤含有ディスクの製造
及び供給が可能となった。これにより、β−ラクタム薬
含有ディスクとβ−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤含有ディ
スクとの組合せを用いるＭＢＬ産生菌鑑別方法の開発が
容易となった。
【００１９】現在、類似のβ−ラクタマーゼを産生する
基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別
はディスク法及び希釈法による国際標準法が実施されて
いる（２０００年１月発行、ＮＣＣＬＳドキュメント、
Ｍ１００−Ｓ１０（Ｍ２）及びＭ１００−Ｓ１０（Ｍ
７））。ＭＢＬ産生菌は、ＥＳＢＬ産生菌よりも臨床上
の薬剤耐性の問題は大きいが、未だ標準的な国際試験法
が確立されていない。本発明により一般的な検査室で簡
易にＭＢＬ産生菌の鑑別・ＭＩＣ測定が可能となったの
で、このような国際標準法の作製に拍車がかかるものと
思われる。
基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌の鑑別
はディスク法及び希釈法による国際標準法が実施されて
いる（２０００年１月発行、ＮＣＣＬＳドキュメント、
Ｍ１００−Ｓ１０（Ｍ２）及びＭ１００−Ｓ１０（Ｍ
７））。ＭＢＬ産生菌は、ＥＳＢＬ産生菌よりも臨床上
の薬剤耐性の問題は大きいが、未だ標準的な国際試験法
が確立されていない。本発明により一般的な検査室で簡
易にＭＢＬ産生菌の鑑別・ＭＩＣ測定が可能となったの
で、このような国際標準法の作製に拍車がかかるものと
思われる。
【００２０】以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細
に説明する。なお、下記実施例は単に説明のためのもの
であり、本発明を何ら限定するものではない。
に説明する。なお、下記実施例は単に説明のためのもの
であり、本発明を何ら限定するものではない。
【００２１】実施例１ 薬剤感受性試験用マイクロプレ
ートの作成 ＮＣＣＬＳ標準法の微量液体希釈法に準じてβ−ラクタ
ム薬としてＣＡＺ、ＩＰＭを０．２５−１２８μg/ml含
有するＣＡＭＨＢの２倍希釈系列を作成し、９６穴マイ
クロプレートに１００μlずつ分注した。同様にその希
釈系列にＭＢＬ阻害剤５０−３２００μg/mlを添加した
ＣＡＭＨＢ２倍希釈系列を９６穴マイクロプレートに１
００μlずつ分注した。 (1)ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/ml (2)ＣＡＺ／ＭＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (3)ＣＡＺ／ＳＭＰ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (4)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml (5)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml (6)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml (7)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (8)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml (9)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml (10)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml (11)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml (12)ＩＰＭ ０．２５−１２８μg/ml (13)ＩＰＭ／ＭＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (14)ＩＰＭ／ＳＭＰ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (15)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml (16)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml (17)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml (18)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (19)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml (20)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml (21)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml (22)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml 上記(1)−(22)の希釈系列マイクロプレートにＭＢＬ産
生菌（K.pneumoniae 4134）及び非産生菌（K.pneumonia
e 4153）それぞれ１株を接種し、３５℃で１晩培養した
ところ、遊離のＭＢＬ阻害剤を含む(2)(13)は、強い悪
臭がしたが、ＭＢＬ産生菌、非産生菌で明らかな発育の
違いが見られた。ＭＢＬ阻害剤２５〜５０μg/mlを含む
(4)(5)(15)(16)ではＭＢＬ産生菌、非産生菌とも発育
し、阻害剤を含まない(1)(9)と同様であり、産生菌非産
生菌の区別がつかなかった。ＭＢＬ阻害剤３２００μg/
mlを含む(11)(22)ではＭＢＬ産生菌、非産生菌とも発育
せず、その区別がつかなかった。ＭＢＬ阻害剤を１００
−１６００μg/mlを含むその他の系列ではＭＢＬ産生
菌、非産生菌で明らかな発育の違いが見られた。なお、
本プレートを、−７０℃で凍結保存したが、６ヶ月後で
も使用可能であった。
ートの作成 ＮＣＣＬＳ標準法の微量液体希釈法に準じてβ−ラクタ
ム薬としてＣＡＺ、ＩＰＭを０．２５−１２８μg/ml含
有するＣＡＭＨＢの２倍希釈系列を作成し、９６穴マイ
クロプレートに１００μlずつ分注した。同様にその希
釈系列にＭＢＬ阻害剤５０−３２００μg/mlを添加した
ＣＡＭＨＢ２倍希釈系列を９６穴マイクロプレートに１
００μlずつ分注した。 (1)ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/ml (2)ＣＡＺ／ＭＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (3)ＣＡＺ／ＳＭＰ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (4)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml (5)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml (6)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml (7)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (8)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml (9)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml (10)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml (11)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml (12)ＩＰＭ ０．２５−１２８μg/ml (13)ＩＰＭ／ＭＰＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (14)ＩＰＭ／ＳＭＰ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (15)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／２５−１２８／２５μg/ml (16)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／５０−１２８／５０μg/ml (17)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／１００−１２８／１００μg/ml (18)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／２００−１２８／２００μg/ml (19)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml (20)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／８００−１２８／８００μg/ml (21)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／１６００−１２８／１６００μg/ml (22)ＩＰＭ／ＳＭＡ ０．２５／３２００−１２８／３２００μg/ml 上記(1)−(22)の希釈系列マイクロプレートにＭＢＬ産
生菌（K.pneumoniae 4134）及び非産生菌（K.pneumonia
e 4153）それぞれ１株を接種し、３５℃で１晩培養した
ところ、遊離のＭＢＬ阻害剤を含む(2)(13)は、強い悪
臭がしたが、ＭＢＬ産生菌、非産生菌で明らかな発育の
違いが見られた。ＭＢＬ阻害剤２５〜５０μg/mlを含む
(4)(5)(15)(16)ではＭＢＬ産生菌、非産生菌とも発育
し、阻害剤を含まない(1)(9)と同様であり、産生菌非産
生菌の区別がつかなかった。ＭＢＬ阻害剤３２００μg/
mlを含む(11)(22)ではＭＢＬ産生菌、非産生菌とも発育
せず、その区別がつかなかった。ＭＢＬ阻害剤を１００
−１６００μg/mlを含むその他の系列ではＭＢＬ産生
菌、非産生菌で明らかな発育の違いが見られた。なお、
本プレートを、−７０℃で凍結保存したが、６ヶ月後で
も使用可能であった。
【００２２】実施例２ 微量液体希釈法（ＭＩＣ法）に
よるＭＢＬ産生菌および非産生菌の確認 ＰＣＲ法によりＭＢＬ産生菌であることが確認されてい
るKlebsiella pneumoniae ２株、Pseudomonas aerugino
sa １３株、Serratia marcescens ３４株、およびＭＢ
Ｌ非産生菌としてＥＳＢＬ産生Klebsiella pneumoniae
２株、ペニシリナーゼ（ＰＣＮ）産生Klebsiella pneum
oniae ２株、セファロスポリナーゼ（ＣＰＮ）産生Kleb
siella pneumoniae ２株を試験菌として用い、実施例１
で作製したマイクロプレートのＣＡＺ ０．２５−１２
８μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）と
ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μ
g/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）との組
合せ、及びＩＰＭ ０．２５−１２８μg/mlを含有する
ＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）とＩＰＭ／ＳＭＡ０．
２５／４００−１２８／４００μg/mlを含有するＣＡＭ
ＨＢ液体培地（希釈系列）との組合せを用い、ＮＣＣＬ
Ｓガイドラインに従い、微量液体希釈法で試験菌を培養
し、ＭＩＣを測定した。純培養した試験菌の集落を釣菌
し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎ
ｄ濁度が０．５になるまで培養したものを希釈し、培地
１mlあたりの菌数が約１０4個になるようにマイクロタ
イタープレートの各穴に接種し、３５℃で１８時間好気
培養したのち、それぞれの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
を測定した。β−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤合剤のＭＩ
Ｃがβ−ラクタム薬単独のＭＩＣより３管（８倍）以上
離れているものをＭＢＬ産生菌と判定した。結果を表１
に示す。なお、本実施例の判定基準はＮＣＣＬＳのＥＳ
ＢＬ産生菌判定基準に準拠し、それと同一にした。
よるＭＢＬ産生菌および非産生菌の確認 ＰＣＲ法によりＭＢＬ産生菌であることが確認されてい
るKlebsiella pneumoniae ２株、Pseudomonas aerugino
sa １３株、Serratia marcescens ３４株、およびＭＢ
Ｌ非産生菌としてＥＳＢＬ産生Klebsiella pneumoniae
２株、ペニシリナーゼ（ＰＣＮ）産生Klebsiella pneum
oniae ２株、セファロスポリナーゼ（ＣＰＮ）産生Kleb
siella pneumoniae ２株を試験菌として用い、実施例１
で作製したマイクロプレートのＣＡＺ ０．２５−１２
８μg/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）と
ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μ
g/mlを含有するＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）との組
合せ、及びＩＰＭ ０．２５−１２８μg/mlを含有する
ＣＡＭＨＢ液体培地（希釈系列）とＩＰＭ／ＳＭＡ０．
２５／４００−１２８／４００μg/mlを含有するＣＡＭ
ＨＢ液体培地（希釈系列）との組合せを用い、ＮＣＣＬ
Ｓガイドラインに従い、微量液体希釈法で試験菌を培養
し、ＭＩＣを測定した。純培養した試験菌の集落を釣菌
し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎ
ｄ濁度が０．５になるまで培養したものを希釈し、培地
１mlあたりの菌数が約１０4個になるようにマイクロタ
イタープレートの各穴に接種し、３５℃で１８時間好気
培養したのち、それぞれの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
を測定した。β−ラクタム薬／ＭＢＬ阻害剤合剤のＭＩ
Ｃがβ−ラクタム薬単独のＭＩＣより３管（８倍）以上
離れているものをＭＢＬ産生菌と判定した。結果を表１
に示す。なお、本実施例の判定基準はＮＣＣＬＳのＥＳ
ＢＬ産生菌判定基準に準拠し、それと同一にした。
【００２３】
【表１】 ──────────────────────────────── 菌名 type 薬剤名 ──────────────────────────────── CAZ IPM ────────────────────────────────Klebsiella pneumoniae 4134 MBL MBL MBLKlebsiella pneumoniae 4137 MBL MBL MBLKlebsiella pneumoniae 4153 PCNKlebsiella pneumoniae 4154 PCNKlebsiella pneumoniae 4144 CPNKlebsiella pneumoniae 4145 CPNKlebsiella pneumoniae 4120 ESBLKlebsiella pneumoniae 4124 ESBLPseudomonas aeruginosa 5103 MBL MBL Pseudomonas aeruginosa 5106 MBL MBL Pseudomonas aeruginosa 5109 MBL MBL MBLPseudomonas aeruginosa 5110 MBL MBL Pseudomonas aeruginosa 5112 MBL MBL Pseudomonas aeruginosa 5101 MBL MBL MBLPseudomonas aeruginosa 5100 MBL MBL MBLPseudomonas aeruginosa 5107 MBL MBL Pseudomonas aeruginosa 5108 MBL MBL Pseudomonas aeruginosa 5111 MBL MBL Pseudomonas aeruginosa 5104 MBL MBL MBLPseudomonas aeruginosa 5105 MBL Pseudomonas aeruginosa 5102 MBL MBLSerratia marcescens 5118 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5147 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5113 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5135 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5131 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5142 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5146 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5123 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5143 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5130 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5141 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5114 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5116 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5158 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5134 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5144 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5145 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5150 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5138 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5154 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5161 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5115 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5125 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5119 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5140 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5139 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5132 MBL MBLSerratia marcescens 5159 MBL Serratia marcescens 5162 MBL Serratia marcescens 5133 MBL MBLSerratia marcescens 5122 MBL MBL MBLSerratia marcescens 5151 MBL MBLSerratia marcescens 5149 MBL MBLSerratia marcescens 5152 MBL MBL MBL ──────────────────────────────── 感度 90% 73% ──────────────────────────────── 特異性 100% 100% ──────────────────────────────── 一致率 91% 76% ────────────────────────────────
【００２４】上表において、感度とは（ＭＢＬ産生菌と
正しく判定された菌数）／（全ＭＢＬ産生菌数）を表
し、特異性とは（非ＭＢＬ産生菌と正しく判定された菌
数）／（全非ＭＢＬ産生菌数）を表し、一致率とは（Ｍ
ＢＬ・非ＭＢＬ産生菌と正しく判定された菌数）／（全
検体数）を表している。言い換えれば、感度はＭＢＬ産
生菌がＭＢＬ産生菌として正しく判定される確率をい
い、特異性はＭＢＬ産生菌でないものがＭＢＬ産生菌で
ないと判定される確率をいい、一致率はそれぞれが正し
く判定される確率を表す。つまりＣＡＺで言えば、感度
は４４／４９＝９０％となり、特異性は６／６＝１００
％となり、一致率は５０／５５＝９１％となる。
正しく判定された菌数）／（全ＭＢＬ産生菌数）を表
し、特異性とは（非ＭＢＬ産生菌と正しく判定された菌
数）／（全非ＭＢＬ産生菌数）を表し、一致率とは（Ｍ
ＢＬ・非ＭＢＬ産生菌と正しく判定された菌数）／（全
検体数）を表している。言い換えれば、感度はＭＢＬ産
生菌がＭＢＬ産生菌として正しく判定される確率をい
い、特異性はＭＢＬ産生菌でないものがＭＢＬ産生菌で
ないと判定される確率をいい、一致率はそれぞれが正し
く判定される確率を表す。つまりＣＡＺで言えば、感度
は４４／４９＝９０％となり、特異性は６／６＝１００
％となり、一致率は５０／５５＝９１％となる。
【００２５】表１の結果より、ＣＡＺでＭＢＬ産生菌と
判定された菌数は４４株であるので、その感度は４４／
４９＝９０％であり、また特異性は１００％であった。
ＭＢＬの一致率は９１％と高く、本発明は一般の微生物
検査室でのＭＢＬ産生菌の簡易スクリーニング法として
有用性が高いと考えられる。さらにＩＰＭと組み合わせ
れば、ＭＢＬ産生菌は２株増えて４６株と判定される。
つまり感度は４６／４９＝９４％、特異性は６／６＝１
００％、一致率は５２／５５＝９５％とさらに高率とな
る。被検菌数をさらに増やして確認すれば、本方法はＭ
ＢＬ産生菌の確認試験として使用できる可能性がある。
判定された菌数は４４株であるので、その感度は４４／
４９＝９０％であり、また特異性は１００％であった。
ＭＢＬの一致率は９１％と高く、本発明は一般の微生物
検査室でのＭＢＬ産生菌の簡易スクリーニング法として
有用性が高いと考えられる。さらにＩＰＭと組み合わせ
れば、ＭＢＬ産生菌は２株増えて４６株と判定される。
つまり感度は４６／４９＝９４％、特異性は６／６＝１
００％、一致率は５２／５５＝９５％とさらに高率とな
る。被検菌数をさらに増やして確認すれば、本方法はＭ
ＢＬ産生菌の確認試験として使用できる可能性がある。
【００２６】実施例３ 薬剤固定化乾燥プレートの作成
及びＭＩＣ測定 液体培地１００μlを加えて溶解した時に下記の濃度と
なるＣＡＺ及びＣＡＺ／ＳＭＡの薬剤２倍希釈系列溶液
を調製し、９６穴マイクロプレートに適量分注し、４５
℃で送風乾燥し、薬剤固定化乾燥プレートを作成した。 (1)ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/ml (2)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml 薬剤固定化乾燥プレートの各穴にＣＡＭＨＢ１００μl
を分注し薬剤を溶解し、実施例２で使用したＭＢＬ産生
菌４９株、非ＭＢＬ産生菌６株を接種し、実施例２と同
様に操作し、ＭＩＣを測定した。その結果、本薬剤固定
化乾燥プレートも、実施例２と同様の菌の発育を示し、
感度・特異性・一致率も同一成績であった。ＭＢＬ阻害
剤は不揮発性のナトリウム塩であるので、乾燥プレート
として作製・保存してもそのＭＢＬ阻害作用は保持され
ていた。
及びＭＩＣ測定 液体培地１００μlを加えて溶解した時に下記の濃度と
なるＣＡＺ及びＣＡＺ／ＳＭＡの薬剤２倍希釈系列溶液
を調製し、９６穴マイクロプレートに適量分注し、４５
℃で送風乾燥し、薬剤固定化乾燥プレートを作成した。 (1)ＣＡＺ ０．２５−１２８μg/ml (2)ＣＡＺ／ＳＭＡ ０．２５／４００−１２８／４００μg/ml 薬剤固定化乾燥プレートの各穴にＣＡＭＨＢ１００μl
を分注し薬剤を溶解し、実施例２で使用したＭＢＬ産生
菌４９株、非ＭＢＬ産生菌６株を接種し、実施例２と同
様に操作し、ＭＩＣを測定した。その結果、本薬剤固定
化乾燥プレートも、実施例２と同様の菌の発育を示し、
感度・特異性・一致率も同一成績であった。ＭＢＬ阻害
剤は不揮発性のナトリウム塩であるので、乾燥プレート
として作製・保存してもそのＭＢＬ阻害作用は保持され
ていた。
【００２７】実施例４ ＭＢＬ阻害剤含有乾燥ディスク
の作製及び保存安定性 遊離のチオール化有機酸、及びチオール化有機酸の塩を
含む乾燥ディスクを作製し、ディスク拡散法を行い阻止
円直径を測定した。 (1)ＳＭＡ（２．９mg/ディスク含有） (2)ＭＰＡ（２．７mg/ディスク含有） (3)ＳＭＰ（３．２mg/ディスク含有） 市販のＳＭＡ、ＭＰＡを精製水に溶解し、１．０モルの
水溶液を作製した。ＳＭＰは、ＭＰＡ水溶液に当量の水
酸化ナトリウム溶液を加えて中和し、最終濃度１．０モ
ルのＳＭＰ水溶液を作製した。ＫＢディスク用の直径
６．３５mmの濾紙ディスクに上記の各調製溶液２５μl
を滴下し、５０℃で６０分間乾燥し、ＳＭＡディスク、
ＭＰＡディスク、ＳＭＰディスクを作製した。ＰＣＲ法
であらかじめＭＢＬ産生菌であることが確認されている
肺炎桿菌（K.pneumoniae）１株、および霊菌（S.marces
cens）１株、緑膿菌（P.aeruginosa）２株を用いて、
[9]J.Clin.Microbiol.、３８（１）、４０、２０００と
同様に操作し、その阻止円の直径を測定した。ＮＣＣＬ
Ｓのディスク法（標準法）に準じて、純培養した試験菌
の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させ、Ｍ
ｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したもの
を綿棒を用いてミューラーヒントン寒天培地（ＭＨＡ）
表面に均一に接種した。その上にＫＢディスクＣＡＺ
（栄研化学製）と３cm以上離してもう一枚のＫＢディス
クＣＡＺを置き、このＫＢディスクＣＡＺより１．５cm
間隔に隣接してＳＭＡディスク、ＭＰＡディスク、もし
くはＳＭＰディスクを載せ、３５℃で１８時間好気培養
し、各ＣＡＺディスクの周囲に形成された阻止円直径を
シャーレの裏からmm単位で正確に測定した。また上記作
製の各ＭＢＬ阻害剤含有ディスクを３７℃に保存して１
週間毎に試験を行い、４週目まで測定を行った。結果を
表１〜表５に示す。
の作製及び保存安定性 遊離のチオール化有機酸、及びチオール化有機酸の塩を
含む乾燥ディスクを作製し、ディスク拡散法を行い阻止
円直径を測定した。 (1)ＳＭＡ（２．９mg/ディスク含有） (2)ＭＰＡ（２．７mg/ディスク含有） (3)ＳＭＰ（３．２mg/ディスク含有） 市販のＳＭＡ、ＭＰＡを精製水に溶解し、１．０モルの
水溶液を作製した。ＳＭＰは、ＭＰＡ水溶液に当量の水
酸化ナトリウム溶液を加えて中和し、最終濃度１．０モ
ルのＳＭＰ水溶液を作製した。ＫＢディスク用の直径
６．３５mmの濾紙ディスクに上記の各調製溶液２５μl
を滴下し、５０℃で６０分間乾燥し、ＳＭＡディスク、
ＭＰＡディスク、ＳＭＰディスクを作製した。ＰＣＲ法
であらかじめＭＢＬ産生菌であることが確認されている
肺炎桿菌（K.pneumoniae）１株、および霊菌（S.marces
cens）１株、緑膿菌（P.aeruginosa）２株を用いて、
[9]J.Clin.Microbiol.、３８（１）、４０、２０００と
同様に操作し、その阻止円の直径を測定した。ＮＣＣＬ
Ｓのディスク法（標準法）に準じて、純培養した試験菌
の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させ、Ｍ
ｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したもの
を綿棒を用いてミューラーヒントン寒天培地（ＭＨＡ）
表面に均一に接種した。その上にＫＢディスクＣＡＺ
（栄研化学製）と３cm以上離してもう一枚のＫＢディス
クＣＡＺを置き、このＫＢディスクＣＡＺより１．５cm
間隔に隣接してＳＭＡディスク、ＭＰＡディスク、もし
くはＳＭＰディスクを載せ、３５℃で１８時間好気培養
し、各ＣＡＺディスクの周囲に形成された阻止円直径を
シャーレの裏からmm単位で正確に測定した。また上記作
製の各ＭＢＬ阻害剤含有ディスクを３７℃に保存して１
週間毎に試験を行い、４週目まで測定を行った。結果を
表１〜表５に示す。
【００２８】
【表２】 ＭＢＬ産生菌 ディスク作製当日測定成績 ──────────────────────────────── 菌名 薬剤名 （阻止円直径 mm） ──────────────────────────────── CAZ CAZ/SMA CAZ/MPA CAZ/SMP ────────────────────────────────K.pneumoniae 4635 7 24 11 24S.marcescens 4636 7 24 11 24P.aeruginosa 4637 7 23 10 23P.aeruginosa 4638 7 23 10 23 ────────────────────────────────
【００２９】
【表３】 ＭＢＬ産生菌 ディスク作製後３７℃１週間保存の測定成績 ──────────────────────────────── 菌名 薬剤名 （阻止円直径 mm） ──────────────────────────────── CAZ CAZ/SMA CAZ/MPA CAZ/SMP ────────────────────────────────K.pneumoniae 4635 7 24 0 24S.marcescens 4636 7 24 0 24P.aeruginosa 4637 7 23 0 23P.aeruginosa 4638 7 23 0 23 ────────────────────────────────
【００３０】
【表４】 ＭＢＬ産生菌 ディスク作製後３７℃２週間保存の測定成績 ──────────────────────────────── 菌名 薬剤名 （阻止円直径 mm） ──────────────────────────────── CAZ CAZ/SMA CAZ/MPA CAZ/SMP ────────────────────────────────K.pneumoniae 4635 7 24 0 24S.marcescens 4636 7 24 0 24P.aeruginosa 4637 7 23 0 23P.aeruginosa 4638 7 23 0 23 ────────────────────────────────
【００３１】
【表５】 ＭＢＬ産生菌 ディスク作製後３７℃３週間保存の測定成績 ──────────────────────────────── 菌名 薬剤名 （阻止円直径 mm） ──────────────────────────────── CAZ CAZ/SMA CAZ/MPA CAZ/SMP ────────────────────────────────K.pneumoniae 4635 7 24 0 24S.marcescens 4636 7 24 0 24P.aeruginosa 4637 7 23 0 23P.aeruginosa 4638 7 23 0 23 ────────────────────────────────
【００３２】
【表６】 ＭＢＬ産生菌 ディスク作製後３７℃４週間保存の測定成績 ──────────────────────────────── 菌名 薬剤名 （阻止円直径 mm） ──────────────────────────────── CAZ CAZ/SMA CAZ/MPA CAZ/SMP ────────────────────────────────K.pneumoniae 4635 7 24 0 24S.marcescens 4636 7 24 0 24P.aeruginosa 4637 7 23 0 23P.aeruginosa 4638 7 23 0 23 ────────────────────────────────
【００３３】各菌の阻止円直径は表２−表６に示すとお
りであった。本実施例の判定基準はＮＣＣＬＳ法のＥＳ
ＢＬ産生菌確認試験と同様に、本発明におけるＣＡＺデ
ィスクとＣＡＺ／ＳＭＡ（ＳＭＰ）ディスクの阻止円直
径の差が５mm以上の時、試験菌をＭＢＬ産生菌と判定す
ることにした。表２において、各菌（ＭＢＬ産生菌）は
ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＡディスクの組合せにお
いては、K.pneumoniae 4635株および S.marcescens 4
636株、P.aeruginosa 4637株、P.aeruginosa 4638株
の阻止円径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定さ
れた。またＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＰディスクに
関しても同様に全ての菌においてその阻止円径の差が５
mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。しかしＣＡＺ
ディスクとＣＡＺ／ＭＰＡディスクに関しては全ての菌
の阻止円径の差が５mm未満であるのでＭＢＬとは判定さ
れなかった。これは、ＭＰＡディスク作製の乾燥時にＭ
ＰＡが揮発し、ディスク中のＭＰＡ含有量が減少した影
響と考えられる。表３−表６においても同様な結果であ
り、ＣＡＺ／ＳＭＡディスクとＣＡＺ／ＳＭＰのディス
クは３７℃保存で少なくとも４週間安定してＭＢＬを判
定することが可能であった。これは冷所保存であれば１
年間以上の保存安定性に相当する。
りであった。本実施例の判定基準はＮＣＣＬＳ法のＥＳ
ＢＬ産生菌確認試験と同様に、本発明におけるＣＡＺデ
ィスクとＣＡＺ／ＳＭＡ（ＳＭＰ）ディスクの阻止円直
径の差が５mm以上の時、試験菌をＭＢＬ産生菌と判定す
ることにした。表２において、各菌（ＭＢＬ産生菌）は
ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＡディスクの組合せにお
いては、K.pneumoniae 4635株および S.marcescens 4
636株、P.aeruginosa 4637株、P.aeruginosa 4638株
の阻止円径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定さ
れた。またＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＰディスクに
関しても同様に全ての菌においてその阻止円径の差が５
mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。しかしＣＡＺ
ディスクとＣＡＺ／ＭＰＡディスクに関しては全ての菌
の阻止円径の差が５mm未満であるのでＭＢＬとは判定さ
れなかった。これは、ＭＰＡディスク作製の乾燥時にＭ
ＰＡが揮発し、ディスク中のＭＰＡ含有量が減少した影
響と考えられる。表３−表６においても同様な結果であ
り、ＣＡＺ／ＳＭＡディスクとＣＡＺ／ＳＭＰのディス
クは３７℃保存で少なくとも４週間安定してＭＢＬを判
定することが可能であった。これは冷所保存であれば１
年間以上の保存安定性に相当する。
【００３４】実施例５ 同一ディスクにＣＡＺ／ＳＭＡ
を含有する乾燥ディスクの作成及び使用 栄研化学（株）製直径６．３５mmのＫＢディスクＣＡＺ
（３０μg含有）に１．０モルＳＭＡ溶液２５μlを滴下
し、５０℃で６０分間乾燥し、ＣＡＺ／ＳＭＡディスク
を作製した。また、同様にＫＢディスク用の直径６．３
５mmの濾紙ディスクにＳＭＡ溶液２５μlを滴下し、５
０℃で６０分間乾燥し、ＳＭＡディスクを作製し、実施
例４と同様に操作し、その阻止円直径を測定した。ＰＣ
Ｒ法であらかじめＭＢＬ産生菌であることが確認されて
いる肺炎桿菌１株、および霊菌１株、緑膿菌２株を用い
て、ＮＣＣＬＳのディスク法に準じて純培養した試験菌
の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃ
Ｆａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを
綿棒を用いてＭＨＡ表面に均一に接種した。その上にＫ
ＢディスクＣＡＺをおき、それより３cm以上離してＣＡ
Ｚ／ＳＭＡディスクを置き、さらに３cm以上離してＳＭ
Ａディスクを置き、３５℃で１８時間好気培養し、ＣＡ
ＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＡディスク、ＳＭＡディスク
の阻止円直径を測定した。
を含有する乾燥ディスクの作成及び使用 栄研化学（株）製直径６．３５mmのＫＢディスクＣＡＺ
（３０μg含有）に１．０モルＳＭＡ溶液２５μlを滴下
し、５０℃で６０分間乾燥し、ＣＡＺ／ＳＭＡディスク
を作製した。また、同様にＫＢディスク用の直径６．３
５mmの濾紙ディスクにＳＭＡ溶液２５μlを滴下し、５
０℃で６０分間乾燥し、ＳＭＡディスクを作製し、実施
例４と同様に操作し、その阻止円直径を測定した。ＰＣ
Ｒ法であらかじめＭＢＬ産生菌であることが確認されて
いる肺炎桿菌１株、および霊菌１株、緑膿菌２株を用い
て、ＮＣＣＬＳのディスク法に準じて純培養した試験菌
の集落を釣菌し、トリプトソイブイヨンに懸濁させＭｃ
Ｆａｒｌａｎｄ濁度が０．５になるまで培養したものを
綿棒を用いてＭＨＡ表面に均一に接種した。その上にＫ
ＢディスクＣＡＺをおき、それより３cm以上離してＣＡ
Ｚ／ＳＭＡディスクを置き、さらに３cm以上離してＳＭ
Ａディスクを置き、３５℃で１８時間好気培養し、ＣＡ
ＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＡディスク、ＳＭＡディスク
の阻止円直径を測定した。
【００３５】
【表７】 ＭＢＬ産生菌の測定成績 ──────────────────────────────── 菌名 薬剤名 （阻止円直径 mm） ──────────────────────────────── CAZ CAZ/SMA SMA ────────────────────────────────K.pneumoniae 4635 7 24 11 S.marcescens 4636 7 24 11 P.aeruginosa 4637 7 23 10 P.aeruginosa 4638 7 23 10 ────────────────────────────────
【００３６】各菌の阻止円直径は表７に示すとおりであ
った。表７において、各菌（ＭＢＬ産生菌）はＣＡＺデ
ィスクとＣＡＺ／ＳＭＡディスクの組合せにおいて、全
ての菌の阻止円直径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬ
と判定された。またＳＭＡディスク単独での発育阻止は
ＣＡＺ／ＳＭＡディスクの発育阻止に比べて顕著に小さ
く、故にＳＭＡ自身の抗菌力は、ほとんど無視できると
考えられ、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＡディスクの
組み合わせでＭＢＬの判定が可能であった。
った。表７において、各菌（ＭＢＬ産生菌）はＣＡＺデ
ィスクとＣＡＺ／ＳＭＡディスクの組合せにおいて、全
ての菌の阻止円直径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬ
と判定された。またＳＭＡディスク単独での発育阻止は
ＣＡＺ／ＳＭＡディスクの発育阻止に比べて顕著に小さ
く、故にＳＭＡ自身の抗菌力は、ほとんど無視できると
考えられ、ＣＡＺディスクとＣＡＺ／ＳＭＡディスクの
組み合わせでＭＢＬの判定が可能であった。
【００３７】実施例６ ＭＢＬ阻害剤含有寒天培地平板
の作製とその使用 ＳＭＡを含有するＣＡＭＨＡとＳＭＡを含有しないＣＡ
ＭＨＡを２分画シャーレに分注し、寒天平板を作成し
た。ＫＢディスクＣＡＺを静置し、その阻止円の形成を
観た。市販のＳＭＡを精製水に溶解し、８０００μg/ml
のＳＭＡ溶液を作製した。あらかじめ１２１℃１５分間
の高圧滅菌したＣＡＭＨＡ培地を５０℃に冷却し、ＣＡ
ＭＨＡ１９mlに対してＳＭＡ溶液１mlを加えて撹拌し均
一な寒天培地溶液にした。分画シャーレの一画にＣＡＭ
ＨＡを１０ml分注し、もう一画にＳＭＡを含有したＣＡ
ＭＨＡを１０ml分注した。寒天培地が固化後、シャーレ
の蓋をずらして寒天表面の凝水を乾燥させ、ＣＡＭＨＡ
平板を作製した。ＰＣＲ法であらかじめＭＢＬ産生菌で
あることが確認されている肺炎桿菌１株、および霊菌１
株、緑膿菌２株を用いて、ＮＣＣＬＳのディスク法に準
じて純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブ
イヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５にな
るまで培養したものを綿棒を用いてＣＡＭＨＡ表面とＳ
ＭＡ含有のＣＡＭＨＡに均一に接種した。２分画シャー
レの各培地上にＫＢディスクＣＡＺを１枚ずつおき、培
養後各ＣＡＺディスクの阻止円直径を測定した。
の作製とその使用 ＳＭＡを含有するＣＡＭＨＡとＳＭＡを含有しないＣＡ
ＭＨＡを２分画シャーレに分注し、寒天平板を作成し
た。ＫＢディスクＣＡＺを静置し、その阻止円の形成を
観た。市販のＳＭＡを精製水に溶解し、８０００μg/ml
のＳＭＡ溶液を作製した。あらかじめ１２１℃１５分間
の高圧滅菌したＣＡＭＨＡ培地を５０℃に冷却し、ＣＡ
ＭＨＡ１９mlに対してＳＭＡ溶液１mlを加えて撹拌し均
一な寒天培地溶液にした。分画シャーレの一画にＣＡＭ
ＨＡを１０ml分注し、もう一画にＳＭＡを含有したＣＡ
ＭＨＡを１０ml分注した。寒天培地が固化後、シャーレ
の蓋をずらして寒天表面の凝水を乾燥させ、ＣＡＭＨＡ
平板を作製した。ＰＣＲ法であらかじめＭＢＬ産生菌で
あることが確認されている肺炎桿菌１株、および霊菌１
株、緑膿菌２株を用いて、ＮＣＣＬＳのディスク法に準
じて純培養した試験菌の集落を釣菌し、トリプトソイブ
イヨンに懸濁させＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度が０．５にな
るまで培養したものを綿棒を用いてＣＡＭＨＡ表面とＳ
ＭＡ含有のＣＡＭＨＡに均一に接種した。２分画シャー
レの各培地上にＫＢディスクＣＡＺを１枚ずつおき、培
養後各ＣＡＺディスクの阻止円直径を測定した。
【００３８】
【表８】 ＭＢＬ産生菌の測定成績 ──────────────────────────────── 菌名 培地（CAZディスクの阻止円直径 mm） ──────────────────────────────── CAMHA SMA含有CAMHA ────────────────────────────────K.pneumoniae 4635 7 24S.marcescens 4636 7 24P.aeruginosa 4637 7 23P.aeruginosa 4638 7 23 ────────────────────────────────
【００３９】各菌の阻止円直径は表８に示すとおりであ
った。表８において、各菌（ＭＢＬ産生菌）はＣＡＭＨ
Ａ上のＣＡＺディスクとＳＭＡ含有のＣＡＭＨＡ上のＣ
ＡＺディスクとの組合せにおいて、全ての菌の阻止円直
径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。
った。表８において、各菌（ＭＢＬ産生菌）はＣＡＭＨ
Ａ上のＣＡＺディスクとＳＭＡ含有のＣＡＭＨＡ上のＣ
ＡＺディスクとの組合せにおいて、全ての菌の阻止円直
径の差が５mm以上であるので、ＭＢＬと判定された。
【００４０】
[1]医学の歩み、１８５（５）、３１３、１９９８ [2]臨床と微生物、２６（２）、１０３、１９９９ [3]臨床と微生物、２６（２）、１２７、１９９９ [4]Antimicrobial Agents and Chemotherapy、４１
（１）、１３５、１９９７ [5]Biol. Pharm. Bull.、２０（１１）、１１３６、１
９９７ [6]Arch. Biochem. Biophys.、３６８（１）、１、１９
９９ [7]Lancet、３５２、５４６、１９９８ [8]臨床と微生物、２６（２）、１５３、１９９９ [9]J.Clin.Microbiol.、３８（１）、４０、２０００ [10]特願平１１−２６８９７号
（１）、１３５、１９９７ [5]Biol. Pharm. Bull.、２０（１１）、１１３６、１
９９７ [6]Arch. Biochem. Biophys.、３６８（１）、１、１９
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:22） Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｑ 1/34 (Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｃ１２Ｒ 1:385） Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｑ 1/34 (Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｃ１２Ｒ 1:43） Ｃ１２Ｒ 1:43） (Ｃ１２Ｍ 1/34 (Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:22） Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｍ 1/34 (Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:385） Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｍ 1/34 (Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:43） Ｃ１２Ｒ 1:43） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:22） Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:385） Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:43） Ｃ１２Ｒ 1:43） (72)発明者 阿部 敏明 栃木県下都賀郡野木町野木143 栄研化学 株式会社生物化学研究所 Ｆターム(参考） 4B029 AA08 BB02 CC02 CC07 GA01 GA03 GB04 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ17 QQ18 QR67 QR68 QX01 4B065 AA29X AA44X AA48X AC10 BB11 BB12 BC50 CA46
Claims (18)
- 【請求項１】β−ラクタム薬含有液体培地とβ−ラクタ
ム薬／メタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤含有液体培地と
の組合せを用いた微量液体希釈法によるメタロ−β−ラ
クタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法 - 【請求項２】メタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤がチオー
ル化有機酸の塩である請求項１記載のメタロ−β−ラク
タマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法 - 【請求項３】チオール化有機酸の塩が、メルカプト酢酸
またはメルカプトプロピオン酸の塩である請求項２記載
のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方
法 - 【請求項４】チオール化有機酸の塩が、ナトリウム塩、
カリウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、第４級アンモ
ニウム塩より選ばれる請求項２記載のメタロ−β−ラク
タマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法 - 【請求項５】β−ラクタム薬がセフタジジム、セフォタ
キシム、セフトリアキソン、セフポドキシム、セフピロ
ム、セフェピム、セフメタゾール、セフミノクス、イミ
ペネム、パニペネム、メロペネムより選ばれる請求項１
−４記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受
性試験方法 - 【請求項６】液体培地がミューラー・ヒントン液体培
地、陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地、ブレ
インハートインフュージョン液体培地、トリプトソイ液
体培地、ＡＢＣＭ液体培地、溶血液加ミューラー・ヒン
トン液体培地、シェドラー液体培地より選ばれる請求項
１−５記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感
受性試験方法 - 【請求項７】β−ラクタム薬を０．２５−１２８μg/ml
含有する液体培地と、β−ラクタム薬０．２５−１２８
μg/ml／メタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤１００−１６
００μg/mlを含有する液体培地との組合せを用いる請求
項１−６記載の微量液体希釈法によるメタロ−β−ラク
タマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法 - 【請求項８】請求項１−７記載の薬剤感受性試験に用い
る容器であって、多穴容器の各穴にβ−ラクタム薬を含
有する液体培地、及びβ−ラクタム薬／メタロ−β−ラ
クタマーゼ阻害剤を含有する液体培地を分注した、微量
液体希釈法によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬
剤感受性試験に用いる容器 - 【請求項９】使用時まで凍結保存されることを特徴とす
る請求項８記載の多穴容器。 - 【請求項１０】請求項１−７記載の薬剤感受性試験に用
いる容器であって、多穴容器の各穴にβ−ラクタム薬、
及びβ−ラクタム薬／メタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤
を分注し、各穴の薬剤を乾燥固定化したことを特徴とす
る、微量液体希釈法によるメタロ−β−ラクタマーゼ産
生菌の薬剤感受性試験に用いる容器 - 【請求項１１】請求項１−７記載の薬剤感受性試験に用
いる容器であって、多穴容器の各穴にβ−ラクタム薬を
含有する液体培地、及びβ−ラクタム薬／メタロ−β−
ラクタマーゼ阻害剤を含有する液体培地を分注し、各穴
の薬剤含有液体培地を乾燥固定化したことを特徴とす
る、微量液体希釈法によるメタロ−β−ラクタマーゼ産
生菌の薬剤感受性試験に用いる容器 - 【請求項１２】メタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤として
チオール化有機酸の塩を含有するディスク - 【請求項１３】チオール化有機酸の塩がメルカプト酢酸
またはメルカプトプロピオン酸の塩である請求項１２記
載のディスク - 【請求項１４】チオール化有機酸の塩が、ナトリウム
塩、カリウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、第４級ア
ンモニウム塩より選ばれる請求項１２記載のディスク - 【請求項１５】β−ラクタム薬含有ディスクとβ−ラク
タム薬／メタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤含有ディスク
との組合せ、を用いるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌
の薬剤感受性試験方法 - 【請求項１６】β−ラクタム薬及びメルカプト酢酸また
はメルカプトプロピオン酸のナトリウム塩、カリウム
塩、カルシウム塩、バリウム塩、第４級アンモニウム塩
より選ばれるチオール化有機酸の塩を含有するディスク - 【請求項１７】β−ラクタム薬含有ディスクとメタロ−
β−ラクタマーゼ阻害剤含有寒天平板培地とを用いるメ
タロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法 - 【請求項１８】メルカプト酢酸またはメルカプトプロピ
オン酸のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、バ
リウム塩、第４級アンモニウム塩より選ばれるチオール
化有機酸の塩を含有する寒天培地
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| JP2000121982A JP2001299388A (ja) | 2000-04-24 | 2000-04-24 | メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の薬剤感受性試験方法 |
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