JP5390568B2 - 微生物の検出方法 - Google Patents
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Description
本願は2002年5月28日に出願された米国仮出願第60/383,847号および2002年1月31日に出願された同60/354,001号に関する。前記出願の全教示内容は参照により本明細書に組み入れる。
米国では、創傷の感染は、医療費支出の主要な原因である。全手術創の約5%が微生物に感染し、腹部手術を受けた患者については、その数字はかなり高い(10〜20%)。細菌種、例えば、ブドウ球菌(Staphylococci)は、感染した創傷から最も多く単離される生物である。これはおそらく、環境では、ヒトがブドウ球菌の天然の貯蔵所であり、集団の50%までに常にコロニー形成しているからである。病院では、医療従事者の間および患者の間の双方で、コロニー形成率はかなり高い。さらに、病院環境でコロニー形成する生物は、抗生物質が頻繁に用いられる院内環境に存在する強力な選択圧のために、多数の形態の抗菌剤治療に対して耐性である可能性がある。ブドウ球菌は通常、無害の共生動物として保持されるが、表皮が破れると、それらは重篤な、命を脅かすような感染さえも引き起こし得る。
〔1〕a)サンプルと、微生物により産生および/または分泌される酵素の検出可能に標識された基質とを該酵素による該基質の改変を生じる条件下で接触させる工程;および
b)該基質の改変または改変の非存在を検出する工程、
を含み、
該基質の改変が該サンプル中の微生物の存在を示し、該基質の改変の非存在が該サンプル中の微生物の非存在を示す、サンプル中の微生物の存在または非存在を検出する方法
に関する。
分子、例えば、微生物、例えば、細菌または真菌によって分泌されるか、微生物の細胞表面で発現されるか、またはウイルスもしくはプリオンに感染した細胞の表面で発現されるタンパク質は、サンプル、例えば、創傷または体液中の微生物の有無を検出するためのマーカーとして利用できることがわかっている。したがって、本発明は、サンプル中の微生物についての分子マーカーの有無を検出することによってサンプル中の微生物の有無を検出する方法を特徴とする。詳しくは、検出される分子マーカーとしては、タンパク質、例えば、ある種の微生物に特異的である酵素が挙げられる。
多数の微生物は、その通常の増殖プロセスの一環として、多数の酵素を増殖環境に分泌する。これらの酵素は、栄養分の放出、宿主防御からの保護、細胞エンベロープ合成(細菌)および/または維持、ならびにまだ不確定のその他のものを含むがこれらに限定されない多数の機能を有している。多数の微生物はまた、酵素を、細胞外環境に曝される(および相互作用する)細胞表面に産生する。これらの酵素の多くは、それを分泌する微生物に特異的であり、それ自身、微生物の存在の特異的マーカーとして利用できる。産生および/または分泌されるこれらの酵素の存在を検出できる系は、同様に、産生/分泌微生物の存在を示すのに役立ちうる。あるいは、産生および/または分泌されるこれら酵素の非存在を検出できる系は、同様に、産生/分泌微生物が存在しないことを示すのに役立ちうる。そのような検出系は、感染、例えば、創傷感染を検出または診断するのに有用である。
2001年6月18日付けで利用可能であった、以下のインターネットサイト:
http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/select_genomes.spl?showref=true&reforg=0&cutoff=60&logic=AND&showheader=trueにあるTIGR包括的微生物資源マルチゲノム解析ツールを用いて、以下の一般的な創傷病原菌種の完全ゲノム配列を解析した:黄色ブドウ球菌(S.aureus)、表皮ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、緑膿菌、糞便連鎖球菌および大腸菌。具体的には、黄色ブドウ球菌ゲノム中の各遺伝子を、他の前記の特定のゲノムの各々の中の相同体について比較した。5種の病原菌すべてに相同体(アミノ酸レベルで少なくとも45%の同一性を有するもの)をもたない黄色ブドウ球菌遺伝子はいずれも破棄した。残りのプールには、これら6種の主要な創傷病原菌に共通する遺伝子のみが含まれていた。これらの検索はパラメーターとしてデフォルト設定を使用して実施した。
1)溶解素;宿主細胞または競合する細菌細胞を溶解するよう機能する酵素。
2)推定エキソトキシン;ブドウ球菌の特定の分泌毒素と相同であるタンパク質。これらのタンパク質は、エキソトキシンのブロック検索により、トポイソメラーゼI、シナプシン様、およびアミノペプチダーゼをはじめとする酵素サインを有する。
3)細胞壁機構;ペプチドグリカンをはじめとする細菌細胞壁構成成分の合成および代謝回転に関与している酵素。
4)マトリックス結合タンパク質;細菌が、宿主環境の細胞外マトリックス分子(フィブロネクチンおよびフィブリノーゲン)に結合するのを可能にするタンパク質。これらのタンパク質は、ブロック検索により、特定のリコンビナーゼ、アデニレートシクラーゼクラスIおよびNADHユビキノンオキシドレダクターゼをはじめとする酵素サインを有する。
5)プロテアーゼ;特異的または非特異的のいずれかで他のタンパク質分子を消化する酵素。
6)加水分解酵素;重合体分子をそのサブユニットに分解する酵素。
7)代謝タンパク質;細胞の種々のハウスキーピング機能、例えば、栄養素の、細胞にとって有用である構成成分への分解を実施するよう設計された広範な種類の酵素。
8)転写因子;DNA転写の制御に関与しているタンパク質。
9)病原性因子;感染を引き起こすために細菌細胞によって必要とされる、一般的な種類のタンパク質。これらのタンパク質は、病原性因子のブロック検索により、グリコシドヒドロラーゼをはじめとする酵素サインを有する。
以下の細菌種各々の培養物を、当技術分野では標準的な方法を使用して、ブレイン・ハート・インフュージョン(BHI)培地で、37℃で激しく攪拌しながら(約200rpm)飽和まで増殖させた:黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、霊菌、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)、大腸菌、緑膿菌および糞便連鎖球菌。一晩増殖させた後(飽和まで)、各培養物の1mLサンプルを採取し、12,000×gで5分間遠心分離することによって培養上清から細胞を回収した。残った培養上清は、必要となるまで(1時間未満)氷上で保存した。細菌は、以下に記載したように特異的酵素の有無についてアッセイした。別法としては、細菌細胞を培養上清から分離せず、アッセイを培養肉汁中の懸濁液中のままの細胞を含有するサンプルで実施する。
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解によるタンパク質の分解に関係している酵素である。プロテアーゼは、その目的に応じて、その標的配列において一般的または特異的のいずれかであり得る。病原性細菌は、本質的に特異的であり、その他の細胞を攻撃する目的か、または防御機構としての目的で、選択されたタンパク質またはペプチドを標的とする、何種類かのプロテアーゼを分泌する。特異的プロテアーゼの標的は、切断部位に隣接するタンパク質のアミノ酸配列によって同定される。
セラチア特異的プロテアーゼが細胞表面に見られるか、または細胞がタンパク質を培地に搬出するかどうかを調べるために、もう1つの実験を実施した。プロテアーゼが搬出されると、その基質に向かって培地中に拡散し得る。そうでなければ、サンプル中の病原菌の存在の検出を可能にするために細菌を基質と接触させなければならない。そのようなアッセイは以下の通りに実施した。
病原菌からの酵素産生および/または搬出の時期も、サンプル中の創傷特異的病原体を検出する方法およびバイオセンサーを設計する際に考慮されるべき因子である。細菌プロテアーゼの合成および搬出は、増殖条件によって調節できる。病原性細菌によって産生されるプロテアーゼのいくつかは、増殖制限条件下で誘導される。霊菌特異的プロテアーゼが発現される増殖条件を調べるために、定常期まで一晩増殖させた細胞によって産生されたプロテアーゼの活性(標的ポリペプチドの切断)を、対数期条件で数時間活発に増殖している細胞によって産生されたプロテアーゼの活性と比較した。
アッセイの適用範囲を決定するために、病原菌検出アッセイが適している条件を調べた。いくつかの関連パラメーターとして、pH、温度、塩濃度および栄養素利用能が挙げられる。これらのパラメーターのうちいくつかについては生理学的データが知られているが、創傷の状態はpHおよび栄養素利用能などの点で異なり得る。これらの問題に対応するために、さらなる実験を実施して、セラチアプロテアーゼ活性のpH範囲を調べた。
細菌では数種のプロテアーゼが見出され、活性部位に用いられる触媒基によって分類されている。最も一般的な細菌プロテアーゼはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼである。メタロプロテアーゼは、活性部位に触媒亜鉛イオンを含むために、そう名づけられている。一般に、結合している亜鉛イオンは不安定であり、キレート化によって除去され得る。したがって、アッセイバッファーへのキレート剤の添加による活性の低下が、プロテアーゼがおそらくメタロプロテアーゼであることを示す。
霊菌(S.marcescens)特異的プロテアーゼを検出するための、ひいては、霊菌を検出するためのバイオセンサーの一例を以下に続ける。霊菌特異的標的ペプチド基質を、弱い正の電荷を有する表面、例えば、少量がDEAEで置換されている繊維性セルロース(Cell Debris Remover, Whatman, Inc.)に結合させた。このマトリックスをフィルム、例えば、図6Cに示すような透明な包帯の下に置き、セラチアの存在下で蛍光を検出した。このバイオセンサーの効力は、霊菌特異的プロテアーゼ標的ペプチドが結合していないセル・デブリス・リムーバー(Cell Debris Remover)を含むバイオセンサー(図6A、陰性対照バイオセンサー)、または霊菌特異的プロテアーゼが標的ポリペプチドを含むセル・デブリス・リムーバーを含むバイオセンサー(図6B)を、霊菌抽出物に曝露することによって証明した。対照バイオセンサーからは極めて少ない蛍光しか発されなかったが、標的ペプチドを含むバイオセンサーでは蛍光は容易に検出された。これらの結果は、セル・デブリス・リムーバーに結合しているペプチドからなるこのような固相創傷感染バイオセンサーは、創傷または何らかの他のサンプルまたは病原菌を含む表面中のセラチア病原菌を検出するために使用できることを証明する。
特定の細菌は、その生存および/または病原性機構の一環としてリパーゼをその環境に分泌する。リパーゼは、増殖環境中の脂質を分解し栄養素を放出するよう働く。リパーゼはまた、感染の際の哺乳類宿主防御を和らげることにおいても役割を果たしている可能性がある。リパーゼは、先に概説したリストからは分泌された加水分解酵素のカテゴリーに分類される。
自己溶菌酵素は、ペプチドグリカン、細菌細胞エンベロープの構成成分を分解する酵素である。自己溶菌酵素は、ペプチドグリカンを、親生物のものであれば、細胞分裂および代謝回転機能の一環として、または競合する細菌の細胞壁を分解する一手段として分解するよう働く。自己溶菌酵素は、先に詳説したカテゴリーのリストのうちの「細胞壁機構」のカテゴリーに分類される。
ほとんどの細菌種は、β-ガラクトシダーゼを、エネルギー源としてのラクトースの代謝のための細胞質酵素として発現する。しかしながら、連鎖球菌の特定の種は、酵素を細胞表面に提示する。したがって、β-ガラクトシダーゼの基質として作用する標識した合成分子(例えば、オルトニトロフェニルb-D-ガラクトピラノシド(ONP-GP))を、環境中の連鎖球菌を検出する手段として使用できる。
表皮ブドウ球菌(S.epidermidis)によって分泌される酵素を検出するための、ひいては、表皮ブドウ球菌を検出するためのバイオセンサーの一例を以下に続ける。20mM カプリン酸p-ニトロフェニル(イソプロパノール中)の100mM溶液を、2.5cmガラスマイクロファイバーフィルター(Whatman GF/A)に供した。イソプロパノールを、室温で30分間蒸発させ、基質をフィルターに結合させた。フィルターを完全に乾燥させた後、フィルターの各四分円に1滴の細菌培養物を供した。四分円1には、黄色ブドウ球菌を供し、四分円2には表皮ブドウ球菌を供し、四分円3にはストレプトコッカス・サリバリウスを供し、四分円4には対照として培地を供した。このフィルターを37℃で30分間インキュベートし、黄色色素を検出し、これは細菌中の酵素による基質の改変が検出されたことを示す。図10に示すように、四分円1、3または4では標識された基質の改変は検出されなかった。四分円2では、標識された基質の改変が検出された。これらの結果は、サンプル中の微生物の有無を検出するためにバイオセンサーをどのように使用できるかを証明する。
緑膿菌の3種のペプチド基質を同定し、合成した。3種のペプチドを表1に示す。
PAPA1 Edans-KAAHKSALKSAE-Dabcyl(配列番号:3)
PALA1 Edans-KHLGGGALGGGAKE-Dabcyl(配列番号:4)
PAGA1 Edans-KHLGGGGGAKE-Dabcyl(配列番号:5)
緑膿菌の存在を検出するためのプロテアーゼアッセイを以下の通りに実施した。3株の緑膿菌細菌(P1、「スチューデント・フレンドリー(student friendly)」株、PA14、病原性モデルとして受託されている標準株、およびZK45、マサチューセッツ州ボストンのChildren's Hospitalの臨床単離物)を、5mLのBHI(ブレイン・ハート・インフュージョン)培地中で37℃のインキュベーター中で一晩増殖させた。得られた培養物を、遠心分離によって沈降させ、上清を回収した。アッセイは、150mM NaClを添加した20mM trisバッファー(pH7.5)で実施した。反応は、37℃で、100μLの総容量中、3μLの上清および7μLの標識した基質(図11に示したような)を用いて実施した。反応に続いて、蛍光定量的プレートリーダーで485nmの吸光度を測定した。結果を図11に示す。図11に示すように、papa1ペプチド基質がシュードモナスによって切断された。
本明細書に記載したように、DNA代謝酵素は、創傷病原菌に共通する遺伝子のバイオインフォマティクス検索で同定される、ある種の酵素である。この知識に基づいて、培養で増殖させた創傷病原菌を用いて検出できる、DNA代謝活性の種類(エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ)を以下の通りに決定した。10μgのpUC19DNAをEcoRI酵素で消化することによって直線化した。次いで、10mLの一晩培養した黄色ブドウ球菌、糞便連鎖球菌、大腸菌、緑膿菌、S.サリバリウス(S.salivarius)、霊菌および表皮ブドウ球菌を増殖させた。70μLの細菌細胞に5μLのDNAを加えた。次いで、このサンプルを、1時間、3時間および一晩の間インキュベートした。示した時間間隔で、サンプルのアリコートを採取し、新しい試験管に入れた。反応は、10×DNAサンプルバッファーを用いて停止させ、サンプルを-20℃で保存し、その後、1.2%TBEアガロースゲルで泳動させた(80V、定電力)。種々の細菌培養物によるDNA代謝活性を図15に示す。
分子の表面への結合は、いくつかの異なる種類の相互作用を使用することによって実施できる。通常、タンパク質は、疎水性、静電気的または共有結合による相互作用を使用して表面に結合させることができる。種々の表面特性を有する市販のメンブランおよび樹脂が多数ある。表面はまた、必要な表面特性を提供するよう化学的に修飾することもできる。
papal (dabcyl-K)AAHKSALKSA(E-edans)(配列番号:3)
papa2 KKAS(E-edans)AAHKSALKSAE(K-dabcyl)(配列番号:9)
papa3 CHHHAS(E-edans)AAHKSALKSAE(K-dabcyl)(配列番号:10)
創傷における酵素活性の存在を調べるために、ブタで作製した創傷感染から得たサンプルで、緑膿菌を検出するための細菌プロテアーゼアッセイを実施した。細菌は、5mLのブレイン・ハート・インフュージョン(BHI)培地中で、37℃のインキュベーター中で一晩増殖させた。得られた培養物の各々を、150mM NaCl(PBSバッファー)を含むpH7.2のリン酸ナトリウムバッファーで希釈して、100μL中に合計105、104および103個の細菌を含むサンプルを得た。ブタに一連の部分的に深い創傷を作製するための手術を実施した直後、創傷表面を塩化カルシウム溶液で短時間処理し、次いで、軽くたたいて乾燥させた。希釈した細菌培養物を含むバッファー溶液を、創傷表面においた。次いで、創傷を覆い、3日間感染を増殖させた。ブタから包帯を除去した後、感染の程度について創傷のスコアをとり、創傷表面に100μLのPBSバッファーを加え、抽出した創傷液をピペットで回収した。各サンプルを半分に分け、50μLをBHIプレートに播種するために使用し、残りの50μLはプラスチック試験管に入れ、-80℃で直ちに凍結した。
[1]a)サンプルと、微生物により産生および/または分泌される酵素の検出可能に標識された基質とを該酵素による該基質の改変を生じる条件下で接触させる工程;および
b)該基質の改変または改変の非存在を検出する工程、
を含み、
該基質の改変が該サンプル中の微生物の存在を示し、該基質の改変の非存在が該サンプル中の微生物の非存在を示す、サンプル中の微生物の存在または非存在を検出する方法。
[2]前記微生物が創傷特異的細菌である[1]記載の方法。
[3]前記創傷特異的細菌が黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、緑膿菌、糞便連鎖球菌、プロテウス・ミラビリス、霊菌、エンテロバクター・クロカエ、アセチノバクター・アニトラタス、肺炎桿菌、および大腸菌からなる群より選ばれる[2]記載の方法。
[4]前記創傷特異的細菌が霊菌である[3]記載の方法。
[5]前記創傷特異的細菌が緑膿菌である[3]記載の方法。
[6]前記創傷特異的細菌が黄色ブドウ球菌である[3]記載の方法。
[7]前記創傷特異的細菌が糞便連鎖球菌である[3]記載の方法。
[8]前記創傷特異的細菌が表皮ブドウ球菌である[3]記載の方法。
[9]前記酵素がプロテアーゼである[3]記載の方法。
[10]前記酵素が溶解素、エキソトキシン、細胞壁酵素、マトリックス結合酵素、プロテアーゼ、加水分解酵素、ビルレンス因子酵素、および代謝酵素である[1]記載の方法。
[11]前記酵素がプロテアーゼである[10]記載の方法。
[12]前記加水分解酵素がリパーゼである[10]記載の方法。
[13]前記溶解素が自己溶解素である[10]記載の方法。
[14]前記代謝酵素がβ-ガラクトシダーゼである[10]記載の方法。
[15]前記サンプルが被験体の創傷表面および体液からなる群より選ばれる[1]記載の方法。
[16]前記基質が固相支持体上にある[1]記載の方法。
[17]前記支持体が微生物夾雑物を含まないことを必要とする材料を含有する[16]記載の方法。
[18]前記固相支持体が、創傷包帯、体液保持用コンテナ、ディスク、スコープ、フィルター、レンズ、泡状物質、布、紙、縫合糸、およびスワブからなる群より選ばれる[16]記載の方法。
[19]前記体液保存用コンテナが、尿収集バッグ、血液収集バッグ、血漿収集バッグ、テストチューブ、カテーテルおよびマイクロプレートのウェルからなる群より選ばれる[18]記載の方法。
[20]a)被験体の創傷から得られたサンプルと、微生物により産生および/または分泌される酵素の検出可能に標識された基質とを該酵素による該基質の改変を生じる条件下で接触させる工程;および
b)該基質の改変または改変の非存在を検出する工程、
を含み、
該基質の改変が該被験体における創傷感染の存在を示し、該基質の改変の非存在が該被験体における感染の非存在を示す、被験体における創傷感染の存在または非存在を検出する方法。
[21]前記微生物が創傷特異的細菌である[20]記載の方法。
[22]前記創傷特異的細菌が黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、緑膿菌、糞便連鎖球菌、プロテウス・ミラビリス、霊菌、エンテロバクター・クロカエ、アセチノバクター・アニトラタス、肺炎桿菌、および大腸菌からなる群より選ばれる[21]記載の方法。
[23]前記創傷特異的細菌が霊菌である[22]記載の方法。
[24]前記創傷特異的細菌が緑膿菌である[22]記載の方法。
[25]前記創傷特異的細菌が黄色ブドウ球菌である[22]記載の方法。
[26]前記創傷特異的細菌が糞便連鎖球菌である[22]記載の方法。
[27]前記創傷特異的細菌が表皮ブドウ球菌である[22]記載の方法。
[28]前記酵素がプロテアーゼである[22]記載の方法。
[29]前記酵素が溶解素、エキソトキシン、細胞壁酵素、マトリックス結合酵素、プロテアーゼ、加水分解酵素、ビルレンス因子酵素、および代謝酵素である[20]記載の方法。
[30]前記酵素がプロテアーゼである[29]記載の方法。
[31]前記加水分解酵素がリパーゼである[29]記載の方法。
[32]前記溶解素が自己溶解素である[29]記載の方法。
[33]前記代謝酵素がβ-ガラクトシダーゼである[29]記載の方法。
[34]前記サンプルが体液である[20]記載の方法。
[35]前記基質が固相支持体上にある[20]記載の方法。
[36]前記支持体が微生物夾雑物を含まないことを必要とする材料を含有する[35]記載の方法。
[37]前記固相支持体が、創傷包帯、体液保持用コンテナ、ディスク、スコープ、フィルター、レンズ、泡状物質、布、紙、縫合糸、およびスワブからなる群より選ばれる[35]記載の方法。
[38]前記体液保存用コンテナが、尿収集バッグ、血液収集バッグ、血漿収集バッグ、テストチューブ、カテーテルおよびマイクロプレートのウェルからなる群より選ばれる[37]記載の方法。
[39]a)微生物により産生および/または分泌される酵素による基質の改変を生じる条件下で、被験体の創傷と、微生物により産生および/または分泌される酵素の検出可能に標識された基質とを接触させる工程
b)該基質の改変または改変の非存在を検出する工程、
を含み、
該基質の改変が該被験体における創傷感染の存在を示し、該基質の改変の非存在が該被験体における感染の非存在を示す、被験体における創傷感染の存在または非存在を検出する方法。
[40]前記微生物が創傷特異的細菌である[39]記載の方法。
[41]前記創傷特異的細菌が黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、緑膿菌、糞便連鎖球菌、プロテウス・ミラビリス、霊菌、エンテロバクター・クロカエ、アセチノバクター・アニトラタス、肺炎桿菌、および大腸菌からなる群より選ばれる[40]記載の方法。
[42]前記創傷特異的細菌が霊菌である[41]記載の方法。
[43]前記創傷特異的細菌が緑膿菌である[41]記載の方法。
[44]前記創傷特異的細菌が黄色ブドウ球菌である[41]記載の方法。
[45]前記創傷特異的細菌が糞便連鎖球菌である[41]記載の方法。
[46]前記創傷特異的細菌が表皮ブドウ球菌である[41]記載の方法。
[47]前記酵素がプロテアーゼである[41]記載の方法。
[48]前記酵素が溶解素、エキソトキシン、細胞壁酵素、マトリックス結合酵素、プロテアーゼ、加水分解酵素、ビルレンス因子酵素、および代謝酵素である[39]記載の方法。
[49]前記酵素がプロテアーゼである[48]記載の方法。
[50]前記加水分解酵素がリパーゼである[48]記載の方法。
[51]前記溶解素が自己溶解素である[48]記載の方法。
[52]前記代謝酵素がβ-ガラクトシダーゼである[48]記載の方法。
[53]前記基質が固相支持体上にある[39]記載の方法。
[54]前記支持体が創傷包帯である[53]記載の方法。
[55]固相支持体および微生物により産生および/または分泌された酵素に特異的な検出可能に標識された基質を含有してなり、該基質が該固相支持体に付着されている、サンプル中の微生物の存在または非存在を検出するためのバイオセンサー。
[56]固相支持体が微生物夾雑物を含まないことを必要とする材料を含有してなる[55]記載のバイオセンサー。
[57]前記固相支持体が、創傷包帯、体液保持用コンテナ、ディスク、スコープ、フィルター、レンズ、泡状物質、布、紙、縫合糸、およびスワブからなる群より選ばれる[55]記載のバイオセンサー。
[58]前記体液保存用コンテナが、尿収集バッグ、血液収集バッグ、血漿収集バッグ、テストチューブ、カテーテルおよびマイクロプレートのウェルからなる群より選ばれる[57]記載のバイオセンサー。
[59]前記微生物が創傷特異的細菌である[55]記載のバイオセンサー。
[60]前記細菌が黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、緑膿菌、糞便連鎖球菌、プロテウス・ミラビリス、霊菌、エンテロバクター・クロカエ、アセチノバクター・アニトラタス、肺炎桿菌、および大腸菌からなる群より選ばれる[59]記載のバイオセンサー。
[61]記創傷特異的細菌が霊菌である[60]記載のバイオセンサー。
[62]前記創傷特異的細菌が緑膿菌である[60]記載のバイオセンサー。
[63]前記創傷特異的細菌が黄色ブドウ球菌である[60]記載のバイオセンサー。
[64]前記創傷特異的細菌が糞便連鎖球菌である[60]記載のバイオセンサー。
[65]前記創傷特異的細菌が表皮ブドウ球菌である[60]記載のバイオセンサー。
[66]前記バイオセンサーが前記創傷と直接接触する[55]記載のバイオセンサー。
[67]サンプル中の微生物の存在または非存在を検出するためのバイオセンサー、および創傷感染を引き起こす微生物により産生および/または分泌される酵素を検出するための1つ以上の試薬を含有してなる創傷感染の検出用キットであって、該バイオセンサーは固相支持体および該微生物により産生および/または分泌される酵素に特異的な検出可能に標識された基質を含有し、該基質は該固相支持体に付着している、キット。
Claims (3)
- a)創傷サンプルと、病原性細菌により産生および/または分泌されるが、非病原性細菌または被験体によっては産生および/または分泌されないプロテアーゼの検出可能に標識された基質とを、該プロテアーゼによる該基質の改変を生じる条件下で接触させる工程、ここで、該病原性細菌は、緑膿菌および霊菌からなる群より選択される;ならびに
b)該基質の改変または改変の非存在を検出する工程、ここで、該基質の改変が該創傷サンプル中の該病原性細菌の存在を示し、該基質の改変の非存在が該創傷サンプル中の該病原性細菌の非存在を示す、
を含み、該基質は、配列番号:2、3、9または10のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、被験体の創傷サンプル中の感染の存在または非存在を検出するための方法。 - 被験体の創傷から得られたサンプルにおける緑膿菌の存在または非存在を検出するための方法であって、該方法は、
a)該サンプルと、該緑膿菌により産生および/または分泌されるが、非病原性細菌または被験体によっては産生および/または分泌されないプロテアーゼの検出可能に標識された基質とを、該プロテアーゼによる該基質の改変を生じる条件下で接触させる工程;ならびに
b)該基質の改変または改変の非存在を検出する工程、ここで、該基質の改変が該サンプル中の緑膿菌の存在を示し、該基質の改変の非存在が該サンプル中の緑膿菌の非存在を示す、
を含み、該基質は、配列番号:3、9または10のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項1記載の方法。 - 被験体の創傷サンプル中の感染の存在または非存在を検出するためのバイオセンサーであって、該バイオセンサーは、
固体支持体、ならびに
プロテアーゼの検出可能に標識された基質、ここで、該プロテアーゼは、緑膿菌および霊菌からなる群より選択される病原性細菌によって産生および/または分泌されるが、非病原性細菌または被験体によっては産生および/または分泌されないものである、
を含み、該基質は、該固体支持体に結合され、該基質は、配列番号:2、3、9または10のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、バイオセンサー。
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