ES2618076T3 - Medio de reacción para las bacterias Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA) - Google Patents

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ES2618076T3 ES09755979.3T ES09755979T ES2618076T3 ES 2618076 T3 ES2618076 T3 ES 2618076T3 ES 09755979 T ES09755979 T ES 09755979T ES 2618076 T3 ES2618076 T3 ES 2618076T3
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Abstract

Medio de reacción para la detección y/o la identificación de bacterias Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA) que comprende una asociación predeterminada de dos antibióticos, un primer antibiótico que pertenece a la familia de las cefalosporinas y un segundo antibiótico, estando dicho primer y segundo antibiótico cada uno a una concentración infra-inhibidora.

Description

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DESCRIPCION
Medio de reaccion para las bacterias Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA)
La presente invencion se refiere a un medio de cultivo para la deteccion de las bacterias Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (SARM o MRSA). La invencion se refiere tambien a la utilizacion de este medio, asf como a un metodo para identificar unas bacterias MRSA.
Los Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina son unas cepas de Staphylococcus aureus, caracterizadas por su resistencia a un antibiotico, la meticilina, y a los antibioticos relacionados, tal como la oxacilina. Generalmente, esta resistencia esta conferida por la expresion de un gen, mecA, que conlleva la produccion de una protema modificada, PLP2a (tambien denominada pBP 2a o PBP 2').
Las bacterias MRSA representan un alto porcentaje de las infecciones nosocomiales, y son a menudo el origen de problemas de salud graves y potencialmente mortales. Las MRSA, transmitidas generalmente de manera cruzada entre los pacientes a traves el personal sanitario, son muy contagiosas y responsables de infecciones endemicas muy diffciles de controlar.
Ademas de un tratamiento adecuado, el diagnostico de los portadores de MRSA y el aislamiento de los pacientes colonizados constituye el metodo mas eficaz, actualmente recomendado por los organismos oficiales tales como la Society for Healthcare Epidemiology of America (Sociedad americana para la epidemiologfa hospitalaria). Un diagnostico precoz y sistematico es, por lo tanto, esencial. La deteccion de las MRSA puede llevarse a cabo mediante diferentes tecnicas.
Por lo tanto, asf posible detectar las MRSA mediante tecnicas de biologfa molecular. A este respecto, se puede citar en particular la patente europea EP 0 887 424. Sin embargo, tales metodos siguen siendo costosos en las pruebas de rutina, y requieren un personal cualificado. Es asimismo posible utilizar unos medios de cultivo convencionales para detectar los Staphylococcus aureus, tal como el medio descrito en la patente europea EP 1 390 524. La deteccion de MRSA se lleva a cabo entonces en una etapa suplementaria, mediante un ensayo de aglutinacion espedfico, (Slidex MRSA, bioMerieux) o por un metodo de difusion sobre agar-agar en presencia de un disco de oxacilina (recomendaciones del Comite de Antibiograma de la Sociedad Francesa de Microbiologfa).
Es asimismo posible poner en cultivo las bacterias susceptibles de ser unas MRSA en medios agar-agar en presencia de antibioticos. Tales medios pueden tambien ser cromogenos, lo que facilita la lectura y la deteccion de las MRSA. Se puede citar en particular el medio descrito en la patente europea EP 1 543 147. Sin embargo, al ser poco espedfica la deteccion de una actividad fosfatasa en las condiciones descritas, es necesario combinarla con la deteccion de varias otras actividades enzimaticas, lo que reduce la fertilidad del medio y aumenta su coste.
Ademas, el documento WO 2004/063391 describe unos metodos de deteccion de microorganismos resistentes a antibioticos (por ejemplo MRSA) que comprenden el cultivo de dichos microorganismos en o sobre agar cromogeno previamente suplementado por al menos un antibiotico p-lactamina, por ejemplo cualquier combinacion de cefalosporinas de primera, segunda, tercera y cuarta generacion. En particular, D1 considera la combinacion Cefoxitina-Cefotaxima y menciona tambien la utilizacion de carbapenemas y monobactamas. X-gal y X-glu son citados como agentes cromogenos.
Wertheim H. et al., J. Clin. Microbiol., vol. 39, n° 7, julio de 2001: 2660-2662 describe un metodo de deteccion de MRSA basado en la creacion de un nuevo medio selectivo que contiene rojo fenol, manitol, aztreonam (monobactama) y ceftizoxima (cefalosporina de tercera generacion).
La invencion propone resolver las lagunas del estado de la tecnica presentando un nuevo medio de deteccion sensible, espedfico, y rapido para aislar e identificar unos Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA).
De manera sorprendente, los inventores han puesto en evidencia que la utilizacion de una combinacion de antibioticos, a una concentracion baja y predeterminada, permitfa obtener un excelente medio de deteccion para aislar e identificar unos Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA). Este efecto es tanto mas sorprendente cuando los antibioticos, utilizados por separado, no permiten de ninguna manera diferenciar unas MRSA a las concentraciones segun la invencion.
Antes de seguir, las definiciones siguientes, de ninguna manera limitativas, permitiran comprender mejor la invencion.
En el sentido de la presente invencion, se entiende por medio de reaccion, un medio que comprende todos los elementos necesarios para la supervivencia y/o el crecimiento de microorganismos, tales como los Staphylococcus aureus.
Este medio de reaccion puede servir unicamente o bien de medio de revelacion, o bien de medio de cultivo y de
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revelacion. En el primer caso, el cultivo de los microorganismos se efectua antes de la inoculacion y, en el segundo caso, el medio de reaccion constituye tambien el medio de cultivo.
El medio de reaccion puede ser solido, semi-solido o Kquido. Por medio solido, se entiende por ejemplo un medio gelificado. Preferiblemente, el medio segun la invencion es un medio gelificado. El agar es el agente gelificante tradicional en microbiologfa para el cultivo de los microorganismos, pero es posible utilizar gelatina o agarosa. Un cierto numero de preparaciones estan disponibles en el mercado, como por ejemplo el agar Columbia, el agar tripcasa-soja, el agar Mac Conkey, el agar Sabouraud o mas generalmente los descritos en el Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
El medio de reaccion segun la invencion puede contener otros aditivos eventuales, como por ejemplo: peptonas, uno o varios factores de crecimiento, hidratos de carbono, uno o varios agentes selectivos, soluciones tampon, uno o varios gelificantes, etc. Este medio de reaccion puede presentarse en forma de lfquido, de gel listo para el uso, es decir listo para la inoculacion en un tubo, frasco o sobre placa de Petri. Cuando la presentacion esta en forma de gel en frasco, se realiza preferiblemente una regeneracion (paso a 100°C) previa del medio antes de verter en placa de Petri.
Preferiblemente, el medio segun la invencion es un medio selectivo, es decir un medio que comprende unos inhibidores que favorecen el crecimiento de las bacterias Staphylococcus aureus. Se puede citar en particular el cloruro de litio (LiCI), la azida de sodio (NaN3), la colistina, la anfotericina, el aztreonam, la colimicina, el cloruro de sodio (NaCl), la deferoxamina, o el compuesto vibriostatico O/129.
En el sentido de la presente invencion, el sustrato de una actividad enzimatica o metabolica se selecciona entre cualquier sustrato que puede ser hidrolizado en un producto que permite la deteccion, directa o indirecta, de una actividad enzimatica o de un metabolismo, tal como en particular una actividad osidasa, preferiblemente una actividad alfa glucosidasa, esterasa, preferiblemente una actividad fosfatasa, pentidasa, preferiblemente una actividad coagulasa, o metabolismo de un hidrato de carbono, preferiblemente el manitol.
Puede tratarse de un sustrato natural o sintetico. El metabolismo del sustrato provoca una variacion de las propiedades ffsico-qmmicas del medio de reaccion o de las celulas de organismos. Esta variacion se puede detectar mediante metodos ffsico-qmmicos, en particular unos metodos opticos para el ojo del operario o con la ayuda de instrumentos, espectrometricos, electricos, magneticos, etc. Preferiblemente, se trata de una variacion de las propiedades opticas, tales como una modificacion de absorcion, de fluorescencia o de luminiscencia.
Como sustrato cromogeno, se pueden citar en particular los sustratos a base de indoxilo, flavona, alizarina, acridina, fenoxazina, nitrofenol, nitroanalina, naftol, catecol, hidroxiquinolina o cumarina. Preferiblemente, el o los sustratos utilizados en la presente invencion son a base de indoxilo.
Como sustrato fluorescente, se pueden citar en particular los sustratos a base de umbeliferona o de cumarina, a base de resorufina, fenoxazina, naftol, naftilamina, 2'-hidroxifenil-heterociclo o 2'-aminofenil-heterociclo o tambien a base de fluorescema.
Como sustrato de actividad enzimatica alfa-glucosidasa, se pueden citar mas particularmente los sustratos 5-bromo- 6-cloro-3-indoxil-alfa-glucosido; dihidroxiflavona-alfa-glucosido; 3,4-ciclohexenoesculetina-alfa-glucosido; 8-
hidroxiquinolina-alfa-glucosido; 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-alfa-glucosido; 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-alfa-
glucosido; 6-cloro-3-indoxil-alfa-glucosido; 5-bromo-3-indoxil-alfa-glucosido; 5-yodo-3-indoxil-alfa-glucosido; 6-fluoro- 3-indoxil-alfa-glucosido; alizarina-alfa-glucosido; nitrofenil-alfa-glucosido; 4-Metilumbeliferil-alfa-glucosido; naftolbenzein-alfa-glucosido; indoxil-N-metil-alfa-glucosido; naftil-alfa-glucosido; aminofenil-alfa-glucosido; dicloroaminofenil-alfa-glucosido.
Preferiblemente, el sustrato utilizado en la presente invencion es el 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-alfa-glucosido, preferiblemente en combinacion con el 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-alfa-glucosido.
Como sustrato de actividad enzimatica fosfatasa, se pueden citar mas particularmente los sustratos 5-bromo-6-cloro- 3-indoxil-fosfato; 3,4-ciclohexenoesculetina-fosfato; 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-fosfato; 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N- metil-fosfato; 6-Cloro-3-indoxil-fosfato; 5-Bromo-3-indoxil-fosfato; 5-yodo-3-indoxil-fosfato; 6-Fluoro-3-indoxil-fosfato; Nitrofenil-fosfato; 4-Metilumbeliferil-fosfato, Indoxil-N-metil-fosfato; Naftil-fosfato.
Como sustrato de coagulasa, se pueden citar mas particularmente los sustratos Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4- metilcumarina, Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilida, Z-Gly-Pro-Arg-4-Metoxi-beta-naftilamida, Plasminogeno. En general estos sustratos son utilizados en combinacion con una fuente de protrombina tal como la protrombina purificada o el plasma sangumeo.
El sustrato utilizado en la presente invencion puede estar en combinacion con otros sustratos, tales como un sustrato de osidasa y en particular beta-glucosidasa o beta-ribosidasa, esterasa y en particular fosfatasa o fosfolipasa, peptidasa y en particular coagulasa.
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Los sustratos de la invencion son utilizables en un amplio intervalo de pH, en particular entre pH 5,5 y 10, preferiblemente entre 6,5 y 10. Cuando el medio segun la invencion comprende un sustrato o varios sustratos de actividad enzimatica alfa glucosidasa, la concentracion en sustrato(s) esta preferiblemente comprendida entre 0,01 y 2 g/l, aun mas preferiblemente entre 0,02 y 0,2 g/l y, ventajosamente, es de 0,1 g/l. En efecto, a esta concentracion de sustrato, se obtiene un mejor contraste de coloracion.
El sustrato puede tambien ser un sustrato metabolico, tal como una fuente de carbono, acoplada a un indicador que produce una coloracion en presencia de uno de los productos del metabolismo. En el caso del metabolismo de un hidrato de carbono, es preferiblemente el manitol acoplado a un indicador de pH.
En el sentido de la presente invencion, un antibiotico que pertenece a la familia de las cefalosporinas es un antibiotico preferiblemente seleccionado entre.
o Una cefalosporina de primera generacion, tal como: Cefalexina, Cefaloridina, Cefalotina, Cefazolina, Cefadroxilo, Cefazedona, Cefatrizina, Cefapirina, Cefradina, Cefacetrilo, Cefrodaxina, Ceftezol
o Una cefalosporina de segunda generacion tal como: Cefoxitina, Cefuroxima, Cefamandol, Cefaclor, Cefotetan, Cefonicido, Cefotiam, Loracarbef, Cefmetazol, Cefprozil, Ceforanida
o Una cefalosporina de tercera generacion, tal como: Cefotaxima, Ceftazidima, Cefsulodina, Ceftriaxona, Cefmenoxima, Latamoxef, Ceftizoxima, Cefixima, Cefodizima, Cefetamet, Cefpiramida, Cefoperazona, Cefpodoxima, Ceftibuten, Cefdinir, Cefditoren, Ceftriaxona, Cefoperazona, Cefbuperazona
o Una cefalosporina de cuarta generacion, tal como Cefepima, Cefpiroma.
Las cefamicinas tales como Cefoxitina, Cefotetan, Cefmetazol, Cefbuperazona, Latamoxef son unas sub-familia de las cefalosporinas.
En el ambito de la presente invencion, el antibiotico que pertenece a la familia de las cefalosporinas es preferiblemente la Cefoxitina, y puede estar en combinacion con la Cefotaxima.
En el sentido de la presente invencion, un antibiotico que pertenece a la familia de los carbapenemas es un antibiotico preferiblemente seleccionado entre Meropenema, Ertapenema, Imipenema, Doreipenema, Faropenema.
En el ambito de la presente invencion, el antibiotico que pertenece a la familia de los carbapenemas es preferiblemente la Ertapenema.
En el sentido de la presente invencion, un antibiotico que pertenece a la familia de los aminosidos es un antibiotico preferiblemente seleccionado entre Amikacina, Gentamicina, Isepamicina, Kanamicina, Betilmicina, Estreptomicina, Tobramicina.
Por concentracion infra-inhibidora, se entiende una concentracion inferior a la concentracion en antibiotico necesaria para la inhibicion de MSSA, en medio de cultivo apto para la busqueda de S. aureus a partir de una muestra biologica, tal como el medio cromID™ S. aureus (bioMerieux). Esta concentracion es inferior a aproximadamente 3 mg/l en el caso de la Cefoxitina, aproximadamente 2 mg/l en el caso de Cefotaxima, aproximadamente 1 mg/l en el caso de Ertapenema, aproximadamente 2 mg/l en el caso de Cefoperazona, aproximadamente 2 mg/l en el caso de Cefpodoxima, aproximadamente 1 mg/l en el caso de Cefdinir.
Por asociacion predeterminada de dos antibioticos, se entiende una asociacion de dos antibioticos particulares, estando cada uno de los 2 a una concentracion infra-inhibidora particular. Tal asociacion se puede determinar en particular mediante en ensayo del ejemplo A.
Por muestra biologica, se entiende una muestra clmica, procedente de una extraccion de aspiracion bronquial, traqueal o pulmonar, de lfquido pleural, de un lavado broncoalveolar, de expectoraciones, de la sangre o de una biopsia pulmonar, de lfquido articular o pericardico; lfquido biologico o una muestra alimenticia, procedente de cualquier alimento. Esta muestra puede asf ser lfquida o solida y se puede citar, de manera no limitativa, una muestra clmica de sangre, de plasma, de orina, de heces, de extracciones de la nariz, del perineo, de la garganta, de piel, de heridas, de lfquido cefalo-raqmdeo o una muestra alimenticia.
A este respecto, la invencion se refiere a un medio de reaccion para la deteccion y/o la identificacion de bacterias Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA) que comprende una asociacion predeterminada de dos antibioticos, un primer antibiotico que pertenece a la familia de las cefalosporinas y un segundo antibiotico, estando dicho primer y segundo antibiotico cada uno a una concentracion infra-inhibidora.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, dicho primer antibiotico pertenece a la sub-familia de las
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cefamicinas. Segun un modo aun mas preferido de realizacion de la invencion, dicho primer antibiotico es la Cefoxitina.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, carbapenemas.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, cefalosporinas.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, aminosidos.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, el medio comprende ademas un sustrato que permite la deteccion de una actividad enzimatica, preferiblemente una actividad osidasa, esterasa o peptidasa, o metabolica, preferiblemente el metabolismo de un hidrato de carbono.
En el caso de una actividad osidasa, es preferiblemente una actividad alfa-glucosidasa. En el caso de una actividad esterasa, es preferiblemente una actividad fosfatasa. En el caso de una actividad peptidasa, es preferiblemente una actividad coagulasa. En el caso del metabolismo de un hidrato de carbono, es preferiblemente el manitol acoplado a un indicador de pH.
Segun un modo de realizacion de la invencion, el sustrato es un sustrato que permite la deteccion de una actividad enzimatica osidasa, preferiblemente alfa-glucosidasa.
Dicho sustrato de una actividad enzimatica alfa-glucosidasa es preferiblemente un indoxil-alfa-glucosido. Preferiblemente, el sustrato utilizado es el 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-mtil-alfa-glucosido (X-N-metil-alfa-glucosido). Preferiblemente, este sustrato esta presente en el medio a una concentracion comprendida entre 0,01 y 2 g/l, preferiblemente entre 0,02 y 0,3 g/l.
Segun un modo particular de realizacion de la invencion, dicho medio comprende un segundo sustrato enzimatico o metabolico. Este sustrato puede ser un sustrato de alfa-glucosidasa u otro sustrato. Preferiblemente, este segundo sustrato es un sustrato de alfa-glucosidasa. Cuando dicho medio comprende un segundo sustrato de alfa- glucosidasa, este sustrato es preferiblemente el 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-alfa-glucosido (X-alfa-glucosido). Preferiblemente, este segundo sustrato esta presente en el medio a una concentracion comprendida entre 0,01 y 2 g/l, preferiblemente entre 0,02 y 0,3 g/l.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, dicho primer y/o segundo antibiotico que pertenece a la familia de las cefalosporinas se selecciona entre
o Una cefalosporina de primera generacion, tal como: Cefalexina, Cefaloridina, Cefalotina, Cefazolina, Cefadroxilo, Cefazedona, Cefatrizina, Cefapirina, Cefradina, Cefacetrilo, Cefrodaxina, Ceftezol
o Una cefalosporina de segunda generacion tal como: Cefoxitina, Cefuroxima, Cefamandol, Cefaclor, Cefotetan, Cefonicida, Cefotiam, Loracarbef, Cefmetazol, Cefprozil, Ceforanida
o Una cefalosporina de tercera generacion, tal como: Cefotaxima, Ceftazidima, Cefsulodina, Ceftriaxona, Cefmenoxima, Latamoxef, Ceftizoxima, Cefixima, Cefodizima, Cefetamet, Cefpiramida, Cefoperazona, Cefpodoxima, Ceftibuten, Cefdinir, Cefditoren, Ceftriaxona, Cefoperazona, Cefbuperazona
o Una cefalosporina de cuarta generacion, tal como Cefepima, Cefpiroma.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, dicho segundo antibiotico que pertenece a la familia de los carbapenemas se selecciona entre Meropenema, Ertapenema, Imipenema.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, la combinacion de dos antibioticos se selecciona entre las combinaciones Cefoxitina - Cefotaxima o Cefoxitina - Ertapenema.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, el medio puede comprender, ademas, al menos un inhibidor que favorece el crecimiento de las bacterias Staphylococcus aureus, tal como el cloruro de litio (LiCI), la azida de sodio (NaN3), la colistina, la anfotericina, el aztreonam, la colimicina, el cloruro de sodio (NaCl) y la deferoxamina.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, el medio comprende, ademas, una mezcla de inhibidores, que comprende cuatro inhibidores, que favorece el crecimiento de las bacterias del genero Staphylococcus, que son LiCl, compuesto vibriostatico O/129, aztreonam y amfotericina.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, la asociacion de dos antibioticos comprende la Cefoxitina y

dicho segundo antibiotico pertenece a la familia de los

dicho segundo antibiotico pertenece a la familia de las

dicho segundo antibiotico pertenece a la familia de los
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la Cefotaxima. Preferiblemente, dicha concentracion infra inhibidora en Cefoxitina esta comprendida entre 0,25 y 1,5 mg/l, preferiblemente entre 0,5 y 1 mg/l. Preferiblemente, dicha concentracion infra-inhibidora en Cefotaxima esta comprendida entre 0,25 y 1,5 mg/l, preferiblemente entre 0,5 y 1 mg/l.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, la asociacion de dos antibioticos comprende la Cefoxitina y la ceftriaxona. Preferiblemente, dicha concentracion infra inhibidora en Cefoxitina esta comprendida entre 0,25 y 1,5 mg/l, preferiblemente entre 0,5 y 1 mg/l. Preferiblemente, dicha concentracion infra-inhibidora en ceftriaxona esta comprendida entre 0,25 y 1,5 mg/l, preferiblemente entre 0,5 y 1 mg/l.
Segun un modo de realizacion de la invencion, la asociacion de dos antibioticos comprende la Cefoxitrina y el Ertapenema. Preferiblemente, dicha concentracion infra-inhibidora en Cefoxitina esta comprendida entre 0,25 y 1,5 mg/l, preferiblemente entre 0,5 y 1 mg. Preferiblemente, dicha concentracion infra-inhibidora en Ertapenema esta comprendida entre 0,5 y 0,75 mg/l.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, la asociacion de dos antibioticos comprende Cefoxitina y Cefpodoxima. Preferiblemente, dicha concentracion infra-inhibidora en Cefoxitina esta comprendida entre 0,25 y 1,5 mg/l, preferiblemente entre 0,5 y 1 mg/l. Preferiblemente, dicha concentracion infra-inhibidora en Cefpodoxima esta comprendida entre 0,75 y 1 mg/l, preferiblemente entre 0,5 y 1 mg/l.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, la asociacion de dos antibioticos comprende Cefoxitina y Cefoperazona. Preferiblemente, dicha concentracion infra-inhibidora en Cefoxitina esta comprendida entre 0,25 y 1,5 mg/l, preferiblemente entre 0,5 y 1 mg/l. Preferiblemente, dicha concentracion infra-inhibidora en Cefoperazona esta comprendida entre 0,5 y 0,75 mg/l, preferiblemente entre 0,75 y 1 mg/l.
Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, la asociacion de dos antibioticos comprende Cefoxitina y Cefdinir. Preferiblemente, dicha concentracion infra-inhibidora en Cefoxitina esta comprendida entre 0,25 y 1,5 mg/l, preferiblemente entre 0,25 y 0,75 mg/l. Preferiblemente, dicha concentracion infra-inhibidora en Cefdinir esta comprendida entre 0,05 y 0,5 mg/l, preferiblemente entre 0,1 y 0,25 mg/l.
La invencion se refiere tambien a la utilizacion in vitro de un medio de reaccion tal como se ha definido anteriormente para aislar e identificar unas bacterias Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA).
Durante la utilizacion de este medio, las MRSA son preferiblemente detectadas por una actividad a-glucosidasa espedfica que permite obtener unas colonias coloreadas o fluorescentes. Las otras especies de Staphylococcus aureus aparecen incoloras o de un color o fluorescencia diferente de la de las colonias de S. aureus.
La invencion se refiere finalmente a un procedimiento de deteccion y/o de identificacion de bacterias Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA) en una muestra biologica segun la cual
a) se inocula la muestra biologica susceptible de contener unas bacterias de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA) en un medio de reaccion tal como se ha definido anteriormente
b) se incuba
c) se identifican las colonias de MRSA.
La incubacion se realiza preferiblemente a una temperatura comprendida entre 30°C y 42°C. Las MRSA se detectan preferiblemente por una actividad a-glucosidasa espedfica que permite obtener unas colonias coloreadas o fluorescentes. Las otras especies de Staphylococcus aureus aparecen incoloras o de un color o fluorescencia diferente de la de las colonias de S. aureus.
Los ejemplos siguientes se dan a tttulo ilustrativo y no tienen ningun caracter limitativo. Permitiran comprenden mejor la invencion.
Ejemplo A - Ensayo para determinar la asociacion predeterminada de dos antibioticos segun la invencion
El ensayo siguiente se puede llevar a cabo para definir la asociacion predeterminada de dos antibioticos segun la invencion, que depende de los antibioticos empleados y mas generalmente de la formulacion del medio de reaccion.
Para ayudar a su comprension, este ensayo se lleva a cabo a continuacion en el caso de una combinacion Cefoxitina y Cefotaxima, a partir de un kit de cepas de microorganismos, que comprende MSSA y MRSA, pero este ensayo se puede llevar a cabo, por supuesto, para otros antibioticos.
Se utilizan diez medios de reaccion aptos para la busqueda de S. aureus en una muestra biologica (tal como un medio cromID™ S. aureus, bioMerieux) y diferentes concentraciones en Cefoxitina (entre 0 y 3 mg/l) y Cefoxatima (entre 0 y 2 mg/l) para obtener unas concentraciones en antibioticos comprendidas entre 0 y 5 mg/l. Las diferentes
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
concentraciones son espaciadas de manera regular, por ejemplo segun una distribucion aritmetica o geometrica.
Cada uno de los medios se alfcuota de manera que cada cepa de microorganismo pueda ser inoculada en cultivo puro sobre cada uno de los medios. Despues de un tiempo de incubacion adecuado, preferiblemente 18 a 24 horas, a una temperatura apropiada, preferiblemente 30 a 37°C, los medios se examinan con el fin de seleccionar el medio que comprende una asociacion en Cefoxitina y Cefotaxima que permita revelar el mayor numero de MRSA diferenciandolos al mismo tiempo del mayor numero de cepas MSSA.
Puede ser necesario repetir el experimento adaptando las concentraciones en cada uno de los antibioticos.
Ejemplo B - Medio segun la invencion que comprende un sustrato alfa-glucosidasa
1. Preparacion del medio segun la invencion
Los medios ensayados en los experimentos siguientes eran unos medios que comprendfan como medio de base el medio cromID MRSA (bioMerieux ref. 43 451), y que comprendfan los elementos siguientes
Medio T: medio control chromID MRSA (ref. 43 451), que comprende en particular un sustrato X-N-metil-alfa- glucosido a una concentracion de 0,1 g/l y Cefoxitina a 4 mg/l.
Medio S: medio T, que comprende ademas un sustrato X-alfa-Glucosido, a una concentracion de 25, 37, 45 o 50 mg/l
Medio A: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l siendo la Cefoxitina sustituida por Ceftriaxona, a una concentracion de 1; 2; 4; 8; 16; 32 mg/l
Medio B: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l siendo la Cefoxitina sustituida por Cefotaxima a una concentracion de 1; 2; 4; 8; 16; 32 mg/l
Medio C: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por Ertapenema a una concentracion de 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1 mg/l
Medio D: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por Cefoperazona a una concentracion de 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l
Medio E: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por Cefpodoxima a una concentracion de 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l
Medio F: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por una combinacion Cefoxitina/Cefotaxima en las concentraciones siguientes
[Cefoxitinal en mg/l
0,5 0,5 1 1
[Cefotaximal en mg/l
0,5 1 0,5 1
Medio G: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por una combinacion Cefoxitina/Ceftriaxona a las concentraciones siguientes
[Cefoxitinal en mg/l
0,5 0,5 1 1
[Ceftriaxonal en mg/l
0,5 1 0,5 1
Medio H: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por una combinacion Cefoxitina/Ertapenema a las concentraciones siguientes
[Cefoxitinal en mg/l
0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75
[Ertapenemal en mg/l
0,25 0,5 0,75 1 0,25 0,5 0,75 1
Medio I: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por una combinacion Cefoxitina/Cefpodoxima a las concentraciones siguientes
[Cefoxitinal en mg/l
0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75
[Cefpodoximal en mg/l
0,5 1 1,5 2 0,5 1 1,5 2
Medio J: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por una combinacion Cefoxitina/Cefoperazona a las concentraciones siguientes
5
10
15
20
25
30
[Cefoxitinal en mg/l
0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75
[Cefoperazonal en mg/l
0,5 0,75 1 1,5 0,5 0,75 1 1,5
Medio K: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por una combinacion Cefoxitina/Cefotaxima, a las concentraciones siguientes, que comprende ademas una mezcla de inhibidores que favorece el crecimiento de los Staphylococcus aureus.
[Cefoxitinal en mg/l
0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
[Cefotaximal en mg/l
0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75
Medio L: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por Cefdinir a una concentracion de 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 mg/l
Medio M: medio S (concentracion X-alfa-glucosido: 45 mg/l), siendo la Cefoxitina sustituida por una combinacion Cefoxitina/Cefdinir, a las concentraciones siguientes
[Cefoxitinal en mg/l
0,25 0,5 0,75 0,25 0,5 0,75 0,25 0,5 0,75
[Cefdinirl en mg/l
0,1 0,1 0,1 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5
2. Inoculacion y lectura de los medios
Diferentes juegos de cepas de bacterias, todas procedentes de la coleccion de la solicitante, puestas en suspension en agua fisiologica, se han inoculado para dar unas colonias aisladas en el medio. Las placas se han inoculado a 37°C durante 48 horas. Las colonias formadas se han examinado visualmente despues de 18h o 24 horas de incubacion. Se ha observado tambien la intensidad de coloracion segun una escala de 0 a 4 (0: ausencia de coloracion, 4: coloracion muy intensa).
Las cepas detectadas corresponden a las cepas que forman unas colonias coloreadas en el medio.
3. Resultados:
3.1 Medio para detectar MRSA que comprenden 2 sustratos de alfa-glucosidasa
Los resultados obtenidos durante la utilizacion de uno o dos sustratos de alfa-glucosidasa se presentan en la tabla 1. Tabla 1 - Intensidad de coloracion de las colonias durante la utilizacion de 2 sustratos de alfa-glucosidasa
Medio T Medio S [X a GIu] = 25 mg/l Medio [X a Glu] = 37 mg/l Medio [X a Glu] = 50 mg/l
Cepas
Incubacion Intensidad de coloracion verde Intensidad de coloracion verde Intensidad de coloracion verde Intensidad de coloracion verde
MRSA
18h 2 2 2,5 3
24h
2 2 3 3
> 40h
2 2,5 3 3
MRSA
18h 0 0 0 0
24h
2 2 2,5 3
> 40h
3 3 4 4
MRSA
18h 1,5 1,5 2 3
24h
2 2 4 4
> 40h
2 3 4 4
MRSA
18h 2 2 3 3
24h
2 2 4 4
> 40h
2,5 2,5 4 4
MRSA
18h 0,5 0,5 0 0
24h
1 0,5 1,5 2,5
> 40h
2,5 3 4 4
MRSA
18h 2 2 2,5 3
24h
2,5 2,5 2,5 2,5
> 40h
2,5 3 4 4
MRSA
18h 0 0 0 0
24h
1 1 3 4
> 40h
2 3 4 4
MRSA
18h 0 0 0 0
24h
0 0 0 0
Medio T Medio S [X a Glu] = 25 mg/l Medio [X a Glu] = 37 mg/l Medio [X a Glu] = 50 mg/l
Cepas
Incubacion Intensidad de coloracion verde Intensidad de coloracion verde Intensidad de coloracion verde Intensidad de coloracion verde
> 40h 3 3 4 4
MRSA
18h 1,5 1,5 3 2,5
24h
2 2 4 4
> 40h
2,5 3 4 4
MRSA
18h 0 0 0 0
24h
0 0 2 3
> 40h
2,5 3 4 4
La adicion de un segundo sustrato de alfa-glucosidasa permitfa intensificar fuertemente la coloracion de las colonias, permitiendo as^ localizar mejor las colonias de MRSA.
5 3.2 Medio para detectar unas MRSA que comprenden un antibiotico seleccionado entre la Ceftriaxona, la
Cefotaxima, el Ertapenema, la Cefoperazona, la Cefpodoxima o el Cefdinir
Los resultados obtenidos durante la sustitucion de la Cefoxitina por otro antibiotico se presentan en las tablas 2a a 2f.
10
Tabla 2a - Sustitucion de la Cefoxitina por la Ceftriaxona
Medio T A
Antibiotico
Cefoxitina Ceftriaxona
Concentracion (mg/l)
4 1 2 4 8 16 32
MRSA (N° de cepas detectadas / N° de cepas)
Lectura 18h 7/10 9/10 8/10 3/10
Lectura 24h
8/10 10/10 10/10 6/10 3/10
MSSA (N° de cepas detectadas / N° de cepas)
Lectura 18h 3/10 9/10 7/10 3/10
Lectura 24h
3/10 9/10 7/10 3/10
Tabla 2b - Sustitucion de la Cefoxitina por la Cefotaxima
Medio T B
Antibiotico
Cefoxitina Cefotaxima
Concentracion (mg/l)
4 1 2 4 8 16 32
MRSA (N° de cepas detectadas / Nb de cepas)
Lectura 18h 7/10 6/10 3/10 1/10
Lectura 24h
9/10 9/10 5/10 3/10
MSSA (N° de cepas detectadas / N° de cepas)
Lectura 18h 3/10 7/10 3/10
Lectura 24h
3/10 7/10 3/10
Tabla 2c - Sustitucion de la Cefoxitina por Ertapenema
Medio T C
Antibiotico
Cefoxitina Ertapenema
Concentracion (mg/l)
4 0,1 0,25 0,5 0,75 1
MRSA (N° de cepas detectadas / N° de cepas)
Lectura 18h 7/10 9/10 9/10 8/10 8/10 5/10
Lectura 24h
7/10 10/10 10/10 10/10 9/10 9/10
MSSA (N° de cepas detectadas / N° de cepas)
Lectura 18h 10/10 10/10 10/10 8/10 4/10
Lectura 24h
10/10 10/10 10/10 9/10 6/10
20 Tabla 2d - Sustitucion de la Cefoxitina por la Cefoperazona
Medio T D
Antibiotico
Cefoxitina Cefoperazona
Concentracion (mg/l)
4 0,5 1 1,5 2
MRSA (N° de cepas detectadas / N° de cepas)
Lectura 18h 5/10 8/10 8/10 5/10 4/10
Lectura 24h
5/10 10/10 8/10 6/10 5/10
MSSA (N° de cepas detectadas / N° de cepas)
Lectura 18h 10/10 9/10 5/10 4/10
Lectura 24h
10/10 9/10 6/10 4/10
Tabla 2e - Sustitucion de la Cefoxitina por la Cefpodoxima
Medio T E
Antibiotico
Cefoxitina Cefpodoxima
Concentracion (mg/l)
4 0,5 1 1,5 2
MRSA (N° de cepas detectadas / N° de cepas)
Lectura 18h 5/10 9/10 8/10 8/10 5/10
Lectura 24h
5/10 10/10 9/10 8/10 7/10
MSSA (N° de cepas detectadas / N° de cepas)
Lectura 18h 10/10 10/10 8/10 6/10
Lectura 24h
10/10 10/10 8/10 6/10
Tabla 2f - Sustitucion de la Cefoxitina por Cefdinir 5
Medio T L
Antibiotico Cefoxitina Cefdinir
(Concentracion (mg/l) 4 0,25 0,5 1 2 4 8
MRSA (N° de cepas detectadas / N° de
Lectura 18h 5/10 3/10 3/10 2/10
cepas)
Lectura 24h 6/10 4/10 4/10 4/10 1/10
MSSA (N° de cepas detectadas / N° de
Lectura 18h
cepas)
Lectura 24h 5/10 1/10
Los antibioticos Cefoxatima, Ceftriaxona, Ertapenema, Cefpodoxima, Cefoperazona y Cefdinir no permitian obtener solos una sensibilidad y una especificidad que permitiera la discriminacion de MRSA y de MSSA.
10 3.3 - Medio para detectar unas MRSA que comprenden una combinacion de antibioticos seleccionada entre
Cefoxitina/Ceftriaxona, Cefoxitina/Cefotaxima, Cefoxitina/Ertapenema, Cefoxitina/Cefoperazona o Cefoxitina/Cefpodoxima
Los resultados obtenidos durante la utilizacion de combinaciones de antibioticos se presentan en la tabla 3.
15
Tabla 3 - Deteccion de colonias MRSA durante la utilizacidn de una combinacion de antibioticos (deteccion expresada en numero de cepas detectadas por numero de cepas totales)
Medio T F T G T H
Antibiotico 1 Cefoxitina Cefoxitina Cefoxitina Cefoxitina Cefoxitina Cefoxitina
Concentracion antibiotico 1 (mg/l) 4 0,5 1 0,5 1 4 0,5 1 0,5 1 4 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75
Antibiotico 2 Ninguno Cefotaxima Ninguno Ceftriaxona Ninguno Ertapenema
Concentracion antibiotico 2 (mg/l) 0 0,5 0,5 1 1 0 0,5 0,5 1 1 0 1 0,25 0,5 0,75 1 0,25 0,5 0,75 1
Lectura 18h 6/10 9/10 8/10 6/10 5/10 6/10 9/10 8/10 9/10 8/10 6/10 7/10 8/10 7/10 7/10 6/10 7/10 7/10 7/10 2/10
MRSA
Lectura 24h 8/10 10/10 8/10 6/10 6/10 8/10 10/10 10/10 10/10 8/10 6/10 8/10 8/10 8/10 8/10 7/10 8/10 8/10 8/10 4/10
Lectura 18h 4/10 1/10 1/10 6/10 4/10 4/10 3/10 3/10 9/10 6/10 2/10 7/10 3/10 10/10
MSSA
Lectura 24h 5/10 2/10 1/10 6/10 5/10 4/10 4/10 5/10 9/10 8/10 5/10 10/10 6/10 10/10
Medio T I T J
Antibiotico 1
Cefoxitina Cefoxitina Cefoxitina
Concentracion Antibiotico 1 (mg/l)
4 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75 4 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75
Antibiotico 2
Ninguno Cefpodoxima Ninguno Cefoperazona
Concentracion Antibiotico 2 (mg/l)
0 2 0,5 1 1,5 2 0,5 1 1,5 2 0 1,5 0,5 0,75 1 1,5 0,5 0,75 1 1,5
MRSA
Lectura 18h 5/10 5/10 8/10 5/10 5/10 1/10 6/10 5/10 4/10 1/10 5/10 5/10 6/10 5/10 5/10 2/10 5/10 5/10 5/10 1/10
Lectura 24h
5/10 5/10 8/10 5/10 5/10 5/10 7/10 5/10 5/10 3/10 5/10 7/10 9/10 5/10 5/10 4/10 6/10 6/10 5/10 2/10
MSSA
Lectura 18h 4/10 6/10 2/10 6/10 4/10 3/10 2/10 4/10 3/10 1/10
Lectura 24h
4/10 7/10 1/10 5/10 7/10 5/10 4/10 3/10 1/10 4/10 4/10 2/10 1/10
20
Medio T M
Antibiotico 1
Cefoxitina Cefoxitina
Concentracion 1 (mg/1)
4 0,25 | 0,5 | 0,75 | 0,25 | 0,5 | 0,75 | 0,25 | 0,5 | 0,75
Antibiotico 2
Ninguno Cefdinir
Concentracion Antibiotico 2 (mg/1)
0 0,1 0,1 0,1 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5
MRSA
Lectura 18h 6/10 7/10 6/10 6/10 4/10 4/10 5/10 4/10 3/10 2/10
Lectura 24h
7/10 8/10 7/10 7/10 4/10 5/10 5/10 4/10 4/10 4/10
MSSA
Lectura 18h 4/10 1/10 1/10 1/10
Lectura 24h
5/10 1/10 1/10 1/10 1/10
Las asociaciones de antibioticos anteriores permitfan obtener una especificidad y una sensibilidad superior a las obtenidas durante la utilizacion de un unico antibiotico.
3.4 - Medio para detectar unas MRSA que comprende una combinacion de antibioticos Cefoxitina/Cefotaxima y una mezcla de inhibidores que favorece el crecimiento de los Staphylococcus aureus.
Los resultados obtenidos durante la utilizacion de combinaciones de antibioticos se presentan en la tabla 4.
5
Tabla 4 - Deteccion de colonias MRSA durante la utilizacion de una combinacion de antibioticos Cefoxitina/Cefotaxima y una mezcla de inhibidores (deteccion expresada en numero de cepas detectadas por
numero de cepas totales)
Medio T K
Antibiotico 1
Cefoxitina Cefoxitina
Concentracion antibiotico 1 (mg/l)
4 0,5 | 0,55 | 0,6 | 0,65 | 0,7 | 0,75
Antibiotico 2
ninguno Cefotaxima
Concentracion antibiotico 2 (mg/l)
0 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
MRSA
Lectura 18h 5/10 5/10 5/10 5/10 5/10 5/10 5/10
Lectura 24h
9/10 8/10 9/10 8/10 8/10 8/10 9/10
MSSA
Lectura 18h - - - - - - -
Lectura 24h
- 3/10 2/10 1/10 - - -
10
La combinacion de antibioticos Cefoxitina/Cefotaxima asociada a una mezcla de inhibidores que favorece el crecimiento de los Staphylococcus aureus permitia obtener una excelente especificidad y sensibilidad.
Ejemplo C - Medio segun la invencion que comprende un sustrato fosfatasa 15
Se han realizado los experimentos similares a los presentados en el ejemplo B, siendo el sustrato alfa-glucosidasa sustituido por un sustrato de fosfatasa 6-cloro-3-indoxilfosfato (Fosfato Rosa), siendo la asociacion en antibioticos Cefoxitina y Cefotaxima
20 Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 5.
Tabla 5 - Deteccion de colonias MRSA durante la utilizacion de un sustrato de fosfatasa y de una combinacion de
antibioticos Cefoxitina/Cefotaxima
Medio T M
Antibiotico 1
Cefoxitina Cefoxitina
Concentracion antibiotico 1 (mg/l)
4 0,75 | 0,75 | 0,75 | 0,75 | 1 | 1
Antibiotico 2
Ninguno Cefotaxima
Concentracion antibiotico 2 (mg/l)
0 0 0,5 0,75 1 0,5 0,75
MRSA
Lectura 18h 10/10 10/10 9/10 10/10 10/10 10/10 10/10
Lectura 24h
10/10 10/10 9/10 10/10 10/10 10/10 10/10
MSSA
Lectura 18h - 10/10 - - - - -
Lectura 24h
- 10/10 2/10 - - - -
25
La combinacion de antibioticos Cefoxitina/Cefotaxima asociada al sustrato 6-cloro-3-indoxilfosfato (Fosfato Rosa) permitia obtener una excelente especificidad y sensibilidad.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Medio de reaccion para la deteccion y/o la identificacion de bacterias Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA) que comprende una asociacion predeterminada de dos antibioticos, un primer antibiotico que pertenece a la familia de las cefalosporinas y un segundo antibiotico, estando dicho primer y segundo antibiotico cada uno a una concentracion infra-inhibidora.
  2. 2. Medio de reaccion segun la reivindicacion 1, segun el cual dicho primer antibiotico pertenece a la sub-familia de las cefamicinas.
  3. 3. Medio de reaccion segun la reivindicacion 1 o 2, segun el cual dicho segundo antibiotico pertenece a la familia de los carbapenemas.
  4. 4. Medio de reaccion segun la reivindicacion 1 o 2, segun el cual dicho segundo antibiotico pertenece a la familia de las cefalosporinas.
  5. 5. Medio de reaccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, segun el cual comprende ademas un sustrato que permite la deteccion de una actividad enzimatica o metabolica.
  6. 6. Medio de reaccion segun la reivindicacion 5, segun el cual dicha actividad enzimatica es una actividad osidasa, esterasa o peptidasa.
  7. 7. Medio de reaccion segun la reivindicacion 6, segun el cual dicha actividad enzimatica osidasa es una actividad alfa-glucosidasa.
  8. 8. Medio de reaccion segun la reivindicacion 5, segun el cual dicha actividad metabolica es el metabolismo de un hidrato de carbono.
  9. 9. Medio de reaccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, segun el cual comprende, ademas, un segundo sustrato de una actividad enzimatica o metabolica.
  10. 10. Medio de reaccion segun la reivindicacion 9, segun el cual dicho segundo sustrato es un sustrato de una actividad enzimatica alfa-glucosidasa.
  11. 11. Medio de reaccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, segun el cual dicho primer y/o segundo antibiotico que pertenece a la familia de las cefalosporinas se selecciona entre:
    o Una cefalosporina de primera generacion, preferiblemente seleccionada entre Cefalexina, Cefaloridina, Cefalotina, Cefazolina, Cefadroxilo, Cefazedona, Cefatrizina, Cefapirina, Cefradina, Cefacetrilo, Cefrodaxina, Ceftezol;
    o Una cefalosporina de segunda generacion, preferiblemente seleccionada entre Cefoxitina, Cefuroxima, Cefamandol, Cefaclor, Cefotetan, Cefonicida, Cefotiam, Loracarbef, Cefmetazol, Cefprozil, Ceforanida;
    o Una cefalosporina de tercera generacion, preferiblemente seleccionada entre Cefotaxima, Ceftazidima, Cefsulodina, Ceftriaxona, Cefmenoxima, Latamoxef, Ceftizoxima, Cefixima, Cefodizima, Cefetamet, Cefpiramida, Cefoperazona, Cefpodoxima, Ceftibuten, Cefdinir, Cefditoren, Ceftriaxona, Cefoperazona, Cefbuperazona;
    o Una cefalosporina de cuarta generacion, preferiblemente seleccionada entre Cefepima, Cefpiroma.
  12. 12. Medio de reaccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, segun el cual dicho segundo antibiotico que pertenece a la familia de los carbapenemas se selecciona entre Meropenema, Ertapenema, Imipenema.
  13. 13. Medio de reaccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, segun el cual la combinacion de dos antibioticos se selecciona entre la combinacion Cefoxitina - Cefotaxima o Cefoxitina - Ertapenema.
  14. 14. Utilizacion in vitro de un medio de reaccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para aislar e identificar unas bacterias Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA).
  15. 15. Procedimiento de deteccion y/o de identificacion de bacterias Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA) en una muestra biologica segun el cual
    a) se inocula la muestra biologica susceptible de contener unas bacterias de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA) en un medio de reaccion segun una cualquiera de las reivindicaciones1 a 13
    b) se incuba
    c) se identifican las colonias como unas colonias de MRSA.
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