JP6326606B2 - γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ(GGCT)の新規基質およびそれを用いたGGCT活性測定法 - Google Patents
γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ(GGCT)の新規基質およびそれを用いたGGCT活性測定法 Download PDFInfo
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- WTABUEPUQMAYKM-UHFFFAOYSA-N CNOc(cc1)ccc1[N+]([O-])=O Chemical compound CNOc(cc1)ccc1[N+]([O-])=O WTABUEPUQMAYKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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Description
[1]
式I:
[式中、
XはH、またはCOOHであり、
YはNHであり、
ZはO、NH、N−C1−6アルキル、S、またはCH2であり、
mは1、2、3、または4であり、
nは0、1、または2であり、
cargoは発色団である]
の化合物またはその薬理的に許容しうる塩;
nが1である、上記[1]〜[2]のいずれか1つに記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩;
XがCOOHである、上記[1]〜[3]のいずれか1つに記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩;
上記[1]〜[6]のいずれか1つに記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩を基質として用いることを特徴とする、GGCT活性測定法;および
本明細書で用いられている用語「アルキル」は、炭素数1〜6個(C1−6アルキル)、好ましくは炭素数1〜3個(C1−3アルキル)の飽和直鎖状または分岐鎖状炭化水素を指す。本発明で用いられる「アルキル」としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、sec−ペンチル、tert−ペンチル、ネオペンチル、2−メチルブチル、1,2−ジメチルプロピル、n−ヘキシル、イソヘキシル、sec−ヘキシル、tert−ヘキシル、ネオヘキシル、3−メチルペンチル、1,2−ジメチルブチル、1−エチルブチル、および2−エチルブチル等を挙げることができる。
siRNA:低分子干渉RNA
Ala :アラニン
Cys :システイン
Glu :グルタミン酸
Ser :セリン
Lys :リシン
NADH :還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
NAD :酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
MU :4−メチルウンベリフェロン
Boc :tert−ブトキシカルボニル
NSu :スクシンイミド
tBu :tert−ブチル
MgSO4:硫酸マグネシウム
A2pr :2,3−ジアミノプロピオン酸
A2bu :2,4−ジアミノ酪酸
Cbz :ベンジルオキシカルボニル
pNP :p−ニトロフェノール
MeOH :メタノール
HCl :塩酸
DMF :ジメチルホルムアミド
DMSO :ジメチルスルホキシド
THF :テトラヒドロフラン
K2CO3:炭酸カリウム
DNs :2,4−ジニトロベンゼンスルホニル
Et :エチル
iPr :イソプロピル
IPTG :イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド
HPLC :高速液体クロマトグラフィー
1H NMR(CF3COOD,400MHz):δ7.91(d,J=8.8Hz,1H),7.34(s,1H),7.29(d,J=8.8Hz,1H),6.63(s,1H),4.93−4.81(m,1H),4.60−4.49(m,1H),3.07−2.90(m,4H),2.69−2.49(m,6H),2.43−2.30(m,1H);13C NMR(CF3COOD,100MHz):δ178.29,177.90,176.44,174.72,169.24,160.80,155.50,155.48,128.63,121.64,121.07,114.87,112.79,55.84,54.58,33.84,32.31,28.07,27.15,19.58;HRMS(FAB):C20H22N2NaO9(M+Na)+計算値:457.1223,実測値:457.1220.
1H NMR(CF3COOD,400MHz):δ7.93−7.85(m,1H),7.40−7.27(m,2H),6.62(s,1H),5.17−5.07(m,1H),4.94−4.76(m,2H),4.59−4.48(m,1H),3.07−2.87(m,2H),2.70−2.47(m,5H);13C NMR(CF3COOD,100MHz):δ177.78,175.38,174.73,169.10,160.59,156.18,155.60,155.39,128.72,121.17,120.92,115.03,112.22,69.84,55.82,54.43,33.73,27.12,19.54;HRMS(FAB):C19H20N2NaO10(M+Na)+計算値:459.1016,実測値:459.1011.
γ−Glu−A 2 pr(CO−pNP)(LISA−7)の合成
1H NMR(CF3COOD,400MHz)δ8.36−8.25(m,2H),7.40−7.25(m,2H),5.07−4.83(m,1H),4.46(t,1H,J=5.8Hz),4.13−3.82(m,2H),2.98−2.80(m,2H),2.61−2.40(m,2H);MS(ESI):(M+H)+計算値:399.1,実測値:399.0.
γ−Glu−Lys(CO−MU)(LISA−10)の合成
1H NMR(CF3COOD,400MHz)δ7.88(s,1H),7.86(s,1H),7.31(s,1H),6.59(s,1H),4.73−4.60(m,1H),4.55−4.44(m,1H),3.60−3.30(m,2H),3.00−2.86(m,2H),2.61(s,3H),2.59−2.41(m,2H),2.19−1.48(m,4H);MS(ESI):(M+H)+計算値:478.2,実測値:478.2.
γ−Glu−A 2 bu(N γ −Et−N γ −CO−レソルフィン)(LISA−101)の合成
MS(ESI):(M+H)+計算値:752.3,実測値:752.3.
MS(ESI):(M+H)+計算値:522.3,実測値:522.3.
1H NMR(DMSO−d6(2%D2Oおよび3%CF3COOD含有),400MHz)δ7.84(d,J=8.8Hz,1H),7.54(d,J=10Hz,1H),7.34(dd,J=15,2.4Hz,1H),7.21(dt,J=8.8,8.8,2.4Hz,1H),6.82(dd,J=10,2.0Hz,1H),6.30(d,J=2.0Hz,1H),4.30−4.21(m,1H),3.98−3.87(m,1H),3.59−3.19(m,4H),2.42−2.24(m,2H),2.17−1.80(m,4H),1.16(dt,J=32,6.8,6.8Hz,3H);MS(ESI):(M+H)+計算値:515.2,実測値:515.2.
γ−Glu−A 2 bu(N γ −iPr−N γ −CO−レソルフィン)(LISA−102)の合成
1H NMR(DMSO−d6,400MHz)δ8.25(d,1H,J=7.6Hz),7.13(d,1H,J=7.6Hz),4.28−4.18(m,1H),3.82−3.72(m,1H),3.29−3.21(m,1H),3.00−2.80(m,2H),2.20(t,2H,J=7.6Hz),2.07−1.64(m,4H),1.44−1.31(m,27H),1.19(d,6H,J=6.4Hz);MS(ESI):(M+H)+計算値:502.3,実測値:502.3.
1H NMR(DMSO−d6(3%D2Oおよび3%CF3COOD含有),400MHz)δ7.83(d,J=8.4Hz,1H),7.54(d,J=10Hz,1H),7.37−7.28(m,1H),7.21(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),6.82(dd,J=10,2.4Hz,1H),6.28(d,J=2.0Hz,1H),4.31−4.02(m,2H),3.97−3.84(m,1H),3.46−3.10(m,2H),2.38−2.24(m,2H),2.14−1.80(m,4H),1.30−1.09(m,6H);MS(ESI):(M+H)+計算値:529.2,実測値:529.2.
実施例7〜12で用いたGGCT(リコンビナントGGCT)は、以下のように調製した。
GGCT(accession no.NM_024051)のオープン・リーディング・フレームをpDEST17ベクター(His−tagベクター;Thermo Fisher Scientific社、ウォルサム、マサチューセッツ州)に挿入したプラスミドを調製し、大腸菌(BL21 DE3株)に形質転換した。コロニーをピックアップして2mLのアンピシリン100μg/mL含有LB培地で数時間培養した後、10mLのアンピシリン100μg/mL含有LB培地に植え継ぎ、一晩培養した。培養液をよく懸濁して600nmの吸光度を測定し、0.1〜0.2になるようにアンピシリン100μg/mL含有LB培地で希釈し、50mLまでかさ上げした後、2〜3時間培養した。600nmの吸光度が0.4まで上昇した後、IPTG[ナカライテスク株式会社(京都、日本)、製品番号19742−81]を0.1mMになるように添加し、さらに4〜6時間培養を続けた。培養液を遠心し、培養液上清を取り除き、大腸菌のペレットを得た後、Probond purification system(Thermo Fisher Scientific社、ウォルサム、マサチューセッツ州)を用いて精製し、大腸菌由来のリコンビナントタンパク質を調製した。
LISA−4を基質としたGGCT酵素反応のHPLCによる追跡アッセイ
GGCTの酵素反応による本発明の化合物の切断を追跡するために、GGCTとLISA−4を反応させ、放出される4−メチルウンベリフェロン(MU)をHPLCによって追跡した。
以下の溶液1および溶液2を作製した。
溶液1:pH6.5トリス塩酸緩衝液(100mM)にて作製したLISA−4の2mM溶液
溶液2:pH6.5トリス塩酸緩衝液(100mM)にて作製したGGCT溶液(7μL、0.98mg/mL)を3.5倍希釈した溶液(計24.5μL)
次に、溶液1(131μL)を、溶液2の全量に投入し、反応を開始した(初期濃度:1.68mM)。各時点で、サンプリングした溶液(8μL)にトリフルオロ酢酸(5μL)を加え、反応を止めた。サンプルは、HPLC測定まで4℃にて保管した。
装置:LC−2010CHT(株式会社島津製作所)
検出器:SPD−M10Avp(株式会社島津製作所)
カラム:YMC−Pack ODS−A(4.6x150mm、粒径5μm、孔径12nm)(株式会社ワイエムシィ)
カラム温度:40℃
移動相:A液−0.1%トリフルオロ酢酸含有水、B液−0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル
濃度勾配制御:B液10%−95%(25分)
流速:1mL/分
注入量:7μL
結果は、図1に示す。
LISA−4とMUの蛍光スペクトル比較
GGCTの酵素反応による本発明の化合物の切断を蛍光強度で追跡できるかどうかを確認するために、LISA−4とMUの蛍光スペクトルをそれぞれ測定した。
pH6.5トリス塩酸緩衝液(100mM)でそれぞれ0.07mMのLISA−4溶液およびMU溶液を作製し、それぞれの溶液について蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトル測定は、以下の条件で行った。
装置:F−2500(株式会社日立ハイテクノロジーズ)
励起波長:371nm
測定波長:300−800nm
結果は、図2に示す。
LISA−4を基質としたGGCT酵素反応の蛍光光度計によるモニター
LISA−4からのMUの放出を蛍光光度計にてモニターした。
pH6.5トリス塩酸緩衝液(100mM)で以下の溶液を作製し、すぐに用いた。
基質:LISA−4 0.07mM
酵素:GGCT 0.196mg/mL
基質溶液(140μL)を酵素溶液(10μL)に添加し、45分間室温にて蛍光を測定した。終濃度は、LISA−4 0.065mM、GGCT 0.013mg/mL(0.62μM)とした。測定は以下の条件で行った。
装置:F−2500(株式会社日立ハイテクノロジーズ)
励起波長:371nm
測定波長:466nm
結果は、図3に示す。
LISA−101またはLISA−102を基質としたGGCT酵素反応のHPLCによる追跡アッセイ
GGCTの酵素反応による本発明の化合物の切断を追跡するために、GGCTとLISA−101またはLISA−102を反応させ、放出されるレソルフィンをHPLCによって追跡した。
以下の溶液1および溶液2を作製した。
溶液1:pH8.0トリス塩酸緩衝液(100mM)にて作製したLISA−101またはLISA−102の0.3mM溶液
溶液2:pH8.0トリス塩酸緩衝液(100mM)にて作製したGGCT溶液(4μL、0.70mg/mL)を3.5倍希釈した溶液(計14μL)
次に、溶液1(40μL)を、溶液2の全量に投入し、反応を開始した(LISA−101またはLISA−102の初期濃度:0.22mM)。各時点で、サンプリングした溶液(6μL)にトリフルオロ酢酸(6μL)を加え、反応を止めた。サンプルは、HPLC測定まで4℃にて保管した。
装置:LC−2010CHT(株式会社島津製作所)
検出器:SPD−M10Avp(株式会社島津製作所)
カラム:YMC−Pack ODS−A(4.6x150mm、粒径5μm、孔径12nm)(株式会社ワイエムシィ)
カラム温度:40℃
移動相:A液−0.1%トリフルオロ酢酸含有水、B液−0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル
濃度勾配制御:B液10%−90%(25分)
流速:1mL/分
注入量:4μL
結果は、図4に示す。
なお、pH6.5トリス塩酸緩衝液を用いた同様の実験系により、GGCTによる酵素反応によってLISA−7およびLISA−10からそれぞれp−ニトロフェノールおよび4−メチルウンベリフェロンが放出されることも確認できた。
LISA−101およびLISA−102とレソルフィンの蛍光スペクトル比較
GGCTの酵素反応による本発明の化合物の切断を蛍光強度で追跡できるかどうかを確認するために、LISA−101およびLISA−102とレソルフィンの蛍光スペクトルをそれぞれ測定した。
5%DMSOを含むpH8.0トリス塩酸緩衝液(100mM)でそれぞれ1μMのLISA−101およびLISA−102溶液、ならびにレソルフィン溶液を作製し、それぞれの溶液について蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトル測定は、以下の条件で行った。
装置:F−2500(株式会社日立ハイテクノロジーズ)
励起波長:530nm
測定波長:400−800nm
結果は、図5に示す。
LISA−101を基質としたGGCT酵素反応の蛍光プレートリーダーによるモニター(リコンビナントGGCT使用)
LISA−101からのレソルフィンの放出を蛍光プレートリーダーにてモニターした。
以下の溶液を作製した。
A液:50μg/mL(100mMトリス塩酸緩衝液pH8.0)のリコンビナントGGCT
B液:4mMのLISA−101(100mMトリス塩酸緩衝液pH8.0)を100mMトリス塩酸緩衝液pH8.0で50μMに希釈したもの
A液(20μL、終濃度:5μg/mL)、B液(20μL、終濃度:5μM)、および100mMトリス塩酸緩衝液pH8.0(160μL)を、96ウェルブラックプレートのウェル中で混合し、37℃に設定したプレートリーダーにてインキュベートし、5分ごとに励起波長530nm、蛍光波長590nmで蛍光を測定した。測定は以下の装置を用いて行った。
使用機器:Synergy HT(BioTek Instruments社、ウィヌースキ、バーモント州)
使用フィルター:励起530nm/25nm、蛍光590nm/35nm
結果は、図6に示す。
LISA−101を基質としたGGCT酵素反応の蛍光プレートリーダーによるモニター(細胞破砕物中のGGCT使用)
リコンビナントGGCTの代わりにGGCT強制発現細胞の破砕物中のGGCTを用いて、LISA−101からのレソルフィンの放出を蛍光プレートリーダーにてモニターした。
破砕物中のGGCTは、以下のようにして調製した。
NIH−3T3細胞にレトロウィルスベクターを用いてGGCTを強制発現させたディッシュ上の細胞(500,000個)をリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄し、0.5%のプロテアーゼインヒビターカクテル[ナカライテスク株式会社(京都、日本)、商品コード25955−11]と0.1%のトリトンX−100を含有する100mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)100μL中、スクレイパーで剥がした。その後、ソニケーションで細胞を破砕し、細胞破砕液(A)とした。
LISA−101を100mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解し、50μMのLISA−101ストックソリューション(B)とした。
得られた細胞破砕液(A)20μL、LISA−101ストックソリューション(B)20μL、および100mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)160μLを混合し、37℃に設定したプレートリーダーにてインキュベートした。5分ごとに、励起波長530nm、蛍光波長590nmで蛍光を測定した。(終濃度LISA−101:5μM、総溶液量:200μL)。測定は実施例12と同様の装置を用いて行った。
結果は、図7に示す。
Claims (5)
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩を基質として用いることを特徴とする、GGCT活性を測定する方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩を含む、GGCT活性を測定するための組成物。
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CS209740B1 (cs) | Syntetické substráty pro proteolytické enzymy |
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