CS209740B1 - Syntetické substráty pro proteolytické enzymy - Google Patents
Syntetické substráty pro proteolytické enzymy Download PDFInfo
- Publication number
- CS209740B1 CS209740B1 CS92780A CS92780A CS209740B1 CS 209740 B1 CS209740 B1 CS 209740B1 CS 92780 A CS92780 A CS 92780A CS 92780 A CS92780 A CS 92780A CS 209740 B1 CS209740 B1 CS 209740B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- amino acid
- synthetic substrates
- phenylalanyl
- acid residues
- proteolytic enzymes
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Vynález se týká synthetických substrátů pro proteolytické enzymy obecného vzorce, ve kterém symboly A a B, stejné nebo různé, značí zbytky aromatických aminokyselin, zejména feny1alaninu, tyrosinu nebo tryptofanu, X a Y, stejné nebo různé, značí zbytky alifatických aminokyselin, zejména glyčinu, alaninu nebo leucinu a R značí metyl nebo etyl.
Description
Vynález se týká synthetických substrátů pro proteolytické enzymy obecného vzorce,
NH
CO-His-A- B-X-Y-OR ve kterém symboly A a B, stejné nebo různé, značí zbytky aromatických aminokyselin, zejména feny1alaninu, tyrosinu nebo tryptofanu, X a Y, stejné nebo různé, značí zbytky alifatických aminokyselin, zejména glyčinu, alaninu nebo leucinu a R značí metyl nebo ety1.
Vynález se týká syntetických substrátů pro proteolytické enzymy obecného vzorce, l^J-CO-His-A-B-X-Y-OR O NM ve kterém symboly A a B, stejné nebo různé, značí zbytky aromatických aminokyselin, zejména fenylalaninu, tyrosinu nebo tryptofanu; X a Y, stejné nebo různé, značí zbytky alifatických aminokyselin, zejména glycinu, alaninu nebo leucinu a R značí metyl nebo etyl.
Syntetické substráty uvedeného vzorce jsou štěpeny proteolytickými enzymy, např. pepsinem, gastricsinem, kathepsinem D aj., v kyselé oblasti pH 1 až 6 jsou použitelné např. v klinické diagnostice žaludečních štáv, při výrobě enzymů, pří základním enzymologickém výzkumu apod.
Specificitasyntetických substrátů štěpených enzymy v kyselé oblasti pH je charakterísována hlavně peptidickou vazbou dvou aromatických aminokyselin, nejčastěji kombinace fenylalanin-tyrosin nebo' fenylalaηίη-tryptofan. Prvními typy zmíněných substrátů byly N-acy1dipeptidy uvedených aromatických aminokyselin s různým alifatickým acylovým zbytkem. Fruton se sp, Adv. Enzymol. 44, 1-36 /1976/, syntetizoval tripeptidy a později i vyšší peptidy s N-terminálním benzy loxykarbonylovým zbytkem histidinu. Tato přídavná část vytvořila nový typ syntetických substrátů, tzv. kationtových substrátů, . dík přítomností ionizovaného imidazo1ového zbytku histidinu v kyselé oblasti pH.
Později bylo zjištěno, že aktivní místa enzymu /obecně/ zahrnují 5 až 7 aminokyselinových zbytků; tím byla určena i odpovídající délka syntetických substrátů.
Bylo zjištěno, že když se hydrofobní zbytek, např. benzyloxykarbony1 ový, v N-terminální části substrátu nahradí hydrofilním zbytkem kyseliny pyroglutamové v kombinaci s histidinem, tj. sekvencí pyroglutamyl-histidinu v peptidech se 4 až 6 aminokyselinovými zbytky, dosáhne se nejen vysoké rozpustnosti substrátu, např. 3.10“3 mol, ale hlavně se mimořádně zvýhodní kinetické konstanty syntetických substrátů. Tato úprava v N-terminální části má i další význam, nebot chrání substrát před enzymaticku degradací. Kinetické konstanty nových syntetických substrátů mají hodnoty /např. u Michaelisovy konstanty/ Km 1,0 až 1,3 mM, u katalytické konstanty kcat až 40 secb
Předmětem vynálezu jsou syntetické substráty pro proteolytické enzymy obecného vzorce oAnh^co_Hís~a“b~x“y“or ve kterém symboly A a B, stejné nebo různé, značí zbytky aromatických aminokyselin, zejména feny1alaninu, tyrosinu nebo tryptofanu, X a Y, stejné nebo různé, značí zbytky alifatických aminokyselin, zejména glycinu, alaninu nebo leucinu a R značí metyl nebo ety 1 .
Předností syntetických substrátů podle vynálezu je možnost stanovení ninhydrinovou metodou /ale i jinými barevnými reakcemi citlivými na -/-aminoskupínu/. Ve srovnání se známými kationtovými substráty, které také využívají barevné ninhydrinové reakce, např. zmíněné Frutonovy substráty, mají substráty podle vynálezu o 2 řády vyšší katalytickou konstantu kcat. Citlivost metody stanovení je také umožněna 2- až 3krát vyšším extinkčníra koeficientem C-terminálního štěpného produktu, např. metylesteru fenylalanyl-alanyl-leucinu, ve srovnání s chromogenním substrátem, využívajícím změny absorbance 4-nitrofenyl-alaninu.
Výhodné kinetické konstanty syntetických substrátů podle vynálezu umožňují např. stanovení pepsínu nebo jiných podobných enzymů ve velmi nízkých koncentracích,
1x10”9 mol/litr.
Výchozí látky, které se používají k syntéze substrátů, jsou bu3 známé a komerčně dostupné sloučeniny nebo jsou připravítelné analogicky podle údajů literatury. Vlastní syntéza jednotlivých meziproduktů i produktů konečných je realizovatelná metodami obecně známými z chemie aminokyselin a peptidu. Konečné produkty jsou látky krystalující z běžných organických rozpouštědel, dobře charakterizovateIné teplotou tání a aminokyselinovou analýzou.
Bližší podrobnosti přípravy syntetických substrátů podle vynálezu jsou patrné z následujících příkladů provedení:
Příklady provedení
Příklad 1 a/ Metylester benzyloxykarbonylfenylalanyl-f eny lal anyl-glycyl glycinu .
K roztoku 4,46 g benzyloxykarbonylfenylalany1-feny1alaninu a 1,4 g N-hydroxybenztriazolu ve 20 ml dimety1formamidu byl přidán roztok 1,82 g hydrochloridu metylesteru glycyl-glycinu a 1,4 ml N-etylpi.peridinu ve 20 ml dimety1formamidu. Ke směsí vychlazené na 0 °C bylo přidáno 2,28 g N,N ”-dicyk1ohexy1 karbodiimídu a směs byla míchána 2 hodiny při 0 °C. Po 20 hodinách stání, při teplotě raístnosti byla vyloučená N , N *-d i cy k 1 ohe xy 1močovina odfiltrována, filtrát byl vakuově odpařen, olejovitý odparek byl rozpuštěn ve směsi 150 ml octanu etylnatého s 10 ml vody, organická fáze vytřepána 1 M kyselinou chlorovodíkovou, vodou 5£ním roztokem kyselého uhličitanu sodného, vysušena bezvodým síranem sodným a vakuově odpařena. Odparek byl krystalován z 2-propanolu a petroleteru. Bylo získáno 4,39 g /76 X teorie/ produktu s t. t. 144 až 146 °C.
b/ Hydrobromid metylesteru fenylalanyl-fenylalanyl-glycyl-glycinu.
K roztoku 2,8 g předešlé li o produktu ve 2 ml ledové kyseliny octové byle přidáno 5 ml 35Zního roztoku bromovodíku v ledové kyselině octové a po 1 hodině stání při teplotě místnosti bylo k reakční směsi přidáno 100 ml eteru. Vyloučený hydrobromid byl odfiltrován, promyt éterem a vysušen v exíkátoru nad hydroxidem sodným a kysličníkem fosforečným. Bylo získáno 2,5 g /95 % teorie/ hydrobromidu s t. t. 196 až 198 °C.
c / Metylester pyroglutamyl-histidyl-fenylalanyl-fenylalanyl-glycyl-glycinu.
K roztoku 1,54 g hydrazidu pyrog1utamy1-histidinu ve směsi 30 ml dimety1formamidu a 2 ml konc. kyseliny chlorovodíkové, ochlazenému na -20 °C byl přidán roztok 0,385 g dusitanu sodného v 1,54 ml vody. Po 10 minutách míchání při -20 °C bylo pH reakčního roztoku upraveno N-etylpiperidinem na hodnotu 6,9 a k roztoku byl přidán roztok hydrobromidu metylesteru fenylalanyl-fenylalanyl-glycyl-glycinu a 0,7 ml N-etylpiperidinu ve 30 ml dimety1formamidu. Potom byla reakční směs ponechává v klidu 20 hodin při 0 °C a vakuov-ě. odpařena. Odparek byl rozpuštěn ve 12 ml metanolu a produkt byl čištěn sloupcovou chromáto graf i i na silikagelu, ekvilibrovaném me ty1enchloridem a metanolem /4:1/, průtokovou rychlostí 20 ral/hod.· Homogenní frakce /positivní na Paulyho reagens/ byly spojeny, vakuově odpařeny a odparek byl krystalován z 2-propanolu a octanu etylnatého. Bylo získáno 1,4 g /36 % teorie/ produktu s t. t. 143 až 146 °C.
Aminokyselinová analýza: kyselina glutamová /1,07/, histidin /1,00/, fenylalanin /1,89/, glycin /2,02/.
Příklad 2
Chromatografie produktů byla provedena na tenké vrstvě silikagelu v systémech butanol-kyselina octová-voda /4:1:1/ /Sj/ a butanol-kyselina octová-pyrídin-voda /15:3:10:6/ /S2/.
a/ Metylester benzyloxykarbonylfenylalanyl-fenylalanyl-alanyl-alani nu
Byl připraven obdobně jako látka v přikladu 1a/ ve výtěžku 90 Z teorie, t. t. 187 až 192 °C, analytický vzorek po krystalizaci z 2-propanolu tál při 117 až 218 °C.
b/ Hydrobromid metylesteru fenylalanyl-fenylalany1-alany1-alaninu
Byl připraven obdobně jako hydrobromid v příkladu 1b/. Rf 0,64 /Sj; 0,74 /S2/.
c/. Metylester pyroglutamyl-histidyl-fenylalanyl-fenylalanyl-alanyl-alaninu
Byl připraven obdobně jako odpovídající hexapeptid uvedený v příkladu 1c/ ve výtěžku 33/í teorie s t. t. 209 až 211 °C,
Aminokyselinová analýza: kyselina glutamová /1,02/, histidin /0,96/, fenylalanin /2,04/, alanin /1,98/.
Příklad 3 a/ Metylester benzyloxykarbonylfenylalanyl-f enylalany1-alany1-1eucinu
Byl přípraven obdobně jako látka z příkladu 1a/ ve výtěžku 60 % teorie s t. t.
199 až 202 °C. Analytický vzorek po krystalizací z octanu etylnatého tál při 201 až 203 °C.
b/ Hydrobromid metylesteru fenylalanyl-fenylalanyl-alanyl-leucinu
Byl připraven obdobně jako hydrobromid v příkladu 1b/. Rf 0,63 /Sj/; 0,84 /S2/.
c/ Metylester pyroglutamyl-histidyl-fenylalanyl-fenylalanyl-alanyl-leucinu
Byl přípraven obdobně jako hexapeptid uvedený v příkladu 1c/ ve výtěžku 26 Z teorie s t. t. 240 až 244 °C. Analytický vzorek po krystalizací z metanolu a 2-propanolu tál při 244 az 246 °C.
Aminokyselinová analýza: kyselina glutamová /1,03/, histidin /1,03/, fenylalanin /1,99/, alanin /0,96/, leucin /0,96/.
Claims (1)
- PŘEDMĚTSyntetické substráty pro proteolytické enzymy obecného vzorce, NH>- CO-Hi«-A— B-X-Y-ORVYNÁLEZU ve kterém symboly A a B, stejné nebo různé, značí zbytky aromatických aminokyselin, zejména fenylalanínu, tyrosinu nebo tryptofanu, X a Y, stejné nebo různé, značí zbytky alifatických aminokyselin, zejména glyci nu, alaninu nebo leucinu, a R značí metyl nebo etyl.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS92780A CS209740B1 (cs) | 1980-02-12 | 1980-02-12 | Syntetické substráty pro proteolytické enzymy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS92780A CS209740B1 (cs) | 1980-02-12 | 1980-02-12 | Syntetické substráty pro proteolytické enzymy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS209740B1 true CS209740B1 (cs) | 1981-12-31 |
Family
ID=5342371
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS92780A CS209740B1 (cs) | 1980-02-12 | 1980-02-12 | Syntetické substráty pro proteolytické enzymy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS209740B1 (cs) |
-
1980
- 1980-02-12 CS CS92780A patent/CS209740B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1136124A (en) | Easily split substrates for the quantification of proteases | |
| KASAFÍREK et al. | p‐Nitroanilides of 3‐Carboxypropionyl‐peptides: Their Cleavage by Elastase, Trypsin, and Chymotrypsin | |
| US4457866A (en) | Chromogenic compounds and their use as enzyme substrates | |
| US5304470A (en) | Process for the enzymatic preparation of protected and unprotected di- and oligopeptides in aqueous solutions | |
| Agarwal et al. | An improved cathepsin-D substrate and assay procedure | |
| US4448715A (en) | Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein | |
| Evin et al. | Synthesis of peptides related to the prosegment of mouse submaxillary gland renin precursor: an approach to renin inhibitors. | |
| Lutsky et al. | Peptide ligation via side-chain auxiliary | |
| Ye et al. | Enzymatic syntheses of N-protected Leu-enkephalin and some oligopeptides in organic solvents | |
| Izumiya et al. | ACTION OF CARBOXYPEPTIDASE ON SYNTHETIC SUBSTRATES I. ACTION OF CARBOXYPEPTIDASE ON MONO-, DI-, TRI-, TETRA-AND PENTA-GLYCYL-L-TYROSINE | |
| DK145799B (da) | Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat med hoej specificitet overfor thrombin og thrombinlignende enzymer | |
| Morikawa et al. | Inhibitors of procollagen N-protease. Synthetic peptides with sequences similar to the cleavage site in the pro. alpha. 1 (I) chain | |
| Dezelee et al. | Structure of the peptidoglycan in Escherichia coli B and Bacillus megaterium KM. Stereospecific synthesis of two meso-diaminopimelic acid peptides with the tetrapeptide subunit of bacterial cell wall peptidoglycan | |
| Makowski et al. | Synthesis of Tetrapeptide p‐nitrophenylanilides containing dehydroalanine and dehydrophenylalanine and their influence on cathepsin C activity | |
| US5776903A (en) | Peptide derivatives usable as zinc endopeptidase 24-15 inhibitors | |
| CS209740B1 (cs) | Syntetické substráty pro proteolytické enzymy | |
| Abe et al. | Synthesis of cyclo-diglycyl-L-lysyl-diglycyl-L-lysyl and hydrolysis by trypsin | |
| US4797472A (en) | New peptide derivatives | |
| US4569907A (en) | Thiopeptolide substrates for vertebrate collagenase | |
| Orlowski et al. | Generation of methionine and leucine-enkephalin from precursor molecules by cation-sensitive neutral endopeptidase of bovine pituitary | |
| US5097014A (en) | Chromogenic tripeptides | |
| JPH049800B2 (cs) | ||
| Nakatani et al. | Studies on Bitter Peptides from Casein Hydrolyzate. XIV. Bitter Taste of Synthetic Analogs of Octapeptide, Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val, Corresponding to the C-Terminal Portion of. BETA.-Casein. | |
| Waki et al. | Ribonuclease T1 peptides. II. Synthesis of a protected pentapeptide corresponding to sequence 12–16 | |
| Nishino et al. | Action of Trypsin on Synthetic Substrates: IV. Hydrolyses of Synthetic Insulin Fragments by Trypsin |