DK145799B - Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat med hoej specificitet overfor thrombin og thrombinlignende enzymer - Google Patents

Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat med hoej specificitet overfor thrombin og thrombinlignende enzymer Download PDF

Info

Publication number
DK145799B
DK145799B DK312676AA DK312676A DK145799B DK 145799 B DK145799 B DK 145799B DK 312676A A DK312676A A DK 312676AA DK 312676 A DK312676 A DK 312676A DK 145799 B DK145799 B DK 145799B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
thrombin
arg
substrate
pna
phe
Prior art date
Application number
DK312676AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK312676A (da
DK145799C (da
Inventor
Af Ekenstam B Thuresson
L E Aurell
K G Claeson
B G Karlsson
Original Assignee
Kabi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Ab filed Critical Kabi Ab
Publication of DK312676A publication Critical patent/DK312676A/da
Publication of DK145799B publication Critical patent/DK145799B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK145799C publication Critical patent/DK145799C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/064—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for omega-amino or -guanidino functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/30—Naphthyl amides, e.g. beta-NA, 2-NA, 4-methoxy-beta-naphthylamine, i.e. 4MNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

(19) DANMARK (J
||| 02) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 145799 B
DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET
(21) Ansøgning nr. 3126/76 (51) Int.CI.3 C 07 C 103/52 (22) Indleveringsdag 9· jul. 1976 C12Q1/56 (24) Løbedag 9. Jul. 1976 (41) Aim. tilgængelig 12. jan. I977 (44) Fremlagt 7. mar. 1983 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag - (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -
(30) Prioritet 11. jul. 1975* 7507975, SE
(71) Ansøger AKTIEBOLAGET KABI, S-104 25 Stockholm, SE.
(72) Opfinder Bo Thuresson af Ekenstam, SE: Leif Erik Aurell, SE:
Karl Goeran Claeson, SE: Birgitta Gunilla Karlsson, SE.
(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Lehmann & Ree.
(54) Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromo= gent substrat med høj specificitet overfor thrombin og thrombinlig= nende enzymer.
Den foreliggende opfindelse angår tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat med høj specificitet overfor thrombin og thrombinlignende enzymer.
Tripeptiderne ifølge opfindelsen er særligt egnede til en kvantitativ bestemmelse af thrombin eller til at studere reak-
OO
tioner, hvori thrombin dannes, inhiberes eller nedbrydes,eller til T) undersøgelser af faktorer, som øver indflydelse på eller tager del ^ i sådanne reaktioner, f.eks. til undersøgelse af antithrombin, pro- zt thrombin eller heparin.
f—
Syntetiske substrater til enzymundersøgelser har store Mi fordele sammenlignet med de naturlige, forudsat at de opfylder visse ^ betingelser, såscm stor følsomhed og specificitet overfor enzymet, en god opløselighed i vand eller i den biologiske testopløsning 2 145799 samt let påviselighed af nogle af spaltningsprodukterne.
Et af de hidtil bedste substrater til thrombinundersøgelse er beskrevet i svensk patentskrift nr. 380.257 og består af det kromo-gene tripeptidderivat
Bz-Phe-Val-Arg-pNA (S-2160) A
(med hensyn til forkortelser: se side 4-5).
Denne forbindelse har stor følsomhed overfor thrombin og giver ved enzymatisk hydrolyse det kromofore produkt p-nitroanilin, som let kan bestemmes spektrofotometrisk. S-2160 har imidlertid en begrænsning, som skyldes dets relativt lave opløselighed (1 mg/ml).
En lav opløselighed har den ulempe, at man er nødt til at arbejde meget nær mætningskoncentrationen for substratet for at opnå en tilstrækkelig substratkoncentration. Ved enzymbestemmelse i forskellige biologiske systemer kan en udfældning af substratet eller en kombineret protein/substratudfældning finde sted. De omtalte udfældninger vil forårsage misvisende spektrofotometriske målinger og dermed fejlagtige enzymbestemmelser. Enzymsubstratet S-2160 bliver betydeligt mere opløseligt, hvis benzoylgruppen erstattes med H:
H-Phe-Val-Arg-pNA B
Den nu frie protoniserede aminogruppe på Phe forøger opløseligheden, men bevirker samtidig, at hastigheden, hvormed thrombin spalter substratet, aftager kraftigt (omkring 30 gange, se tabel 1). Endvidere kan substratet i den biologiske testopløsning på en uønsket måde blive nedbrudt af aminopeptidaser fra den N-terminale ende.
Fra svensk patentskrift nr. 380.257 kendes endvidere throm-binsubstrater med formlerne Bz-D-Phe-Val-Arg-pNA og H-D-Phe-Val-Arg-pNA. Førstnævnte er også kendt fra Thrombosis Research, vol.l (1972) 267-278 men angives dog heri at have en meget langsom hydrolysehastighed overfor thrombin.
Tripeptiderne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de har den almene formel: 3 145799 D-NH2 “ CH - CO - N - CH - CO - NH - CH - CO - NH - R2 CH2 CH2-('cH2)n (CH2)3 f O /\ H2H ™ R1 1 2 hvor R er hydrogen eller hydroxy, R er nitrophenyl, naphthyl -eller methoxynaphthyl, og n er 1, 2 eller 3.
Med forbindelserne ifølge nærværende opfindelse opnås der substrater, der ligesom substratet med formel B er meget opløselige, men ganske overraskende er aktiviteten overfor thrombin ikke formindsket, men i stedet 30-50 gange højere end aktiviteten af det tilsvarende substrat med udelukkende L-aminosyrer (tabel 1). Den N-terminale D-aminosyre hindrer endvidere ikke-ønsket angreb af aminopeptidaser, eftersom de sidstnævnte er specifikke overfor L-aminosyrer.Endelig er de nye substrater omkring 400$ mere aktive end S-2160 og H-D-Phe-Val-Arg-pNA og har en mindre Km-værdi, således at de bindes bedre til thrombinenzymet, hvorfor der kræves en mindre substratmængde til opnåelse af optimale reaktionsbetingelser. K er den såkaldte Michaelis-konstant, som er den substratkoncentration ved hvilken den enzymkatalyserede reaktionshastighed er lig med det halve af den maximale reaktionshastighed under alt andet lige reaktionsbetingelser. Optimale reaktionsbetingelser afhænger udover af substratkoncentrationen også af sådanne forhold som reaktionsmiljøets pH-værdi, ionstyrke og puffersammensætning, således som det iøvrigt findes beskrevet i alment tilgængelige lærebøger i enzymkinetik.
Substratet ifølge opfindelsen adskiller sig fra det fra svensk patentskrift nr. 380.257 kendte substrat, H-D-Phe-Val-Arg-pNA ved, at Val er erstattet med en af de cykliske iminosyrer Aze, Pro eller Pip, og dette giver som nævnt substratet ifølge opfindelsen langt større følsomhed overfor thrombin (jvf. tabel 2) .
Til syntese af de hidtil ukendte tripeptider benyttes sædvanligvis beskyttelsesgrupper og koblingsmetoder, som alle kendes fra peptidkemien.
Som a-aminobeskyttelsesgruppe kan carbobenzoxv- eller t-butyloxycarbonylgrupper med fordel anvendes eller en hvilken som hel.st hermed beslægtet gruppe, som f.eks. p-methoxy-,p-nitro- eller p-methoxyphenylazocarbobenzoxy.
il 145799
Til beskyttelse af arginylgruppens δ-guanidogruppe er det fordelagtigt at anvende protonisering, en NC^-gruppe eller en p-toluensulfonylgruppe.
Til beskyttelse af hydroxygruppen i tyrosingruppen er det fordelagtigt at anvende en t-butyl- eller benzylgruppe. Som en fraspaltelig carboxybeskyttelsesgruppe er det hensigtsmæssigt at anvende methyl-, ethyl- eller benzylester.
Koblingen mellem to aminosyrer eller et dipeptid og en aminosyre opnås gennem aktivering af α-carboxygruppen. Det aktiverede derivat kan enten være isoleret eller dannet in situ og kan f.eks. være p-nitrophenyl-, trichlorphenyl-, pentachlorphenyl-ellér N-hydroxyravsyreimidester, symmetrisk eller asymmetrisk an-hydrid, syreazid eller N-hydroxybenzotriazolester.
Princippet i syntesen kan være en trinvis kobling af amino-syrerne til den C-terminale arginylgruppe, der enten allerede er forsynet med en koblet kromofor gruppe med egenskaber som en carboxybeskyttelsesgruppe eller er forsynet med en fraspaltelig carboxybeskyttelsesgruppe, og den kromofore gruppe kobles derefter til det beskyttede tripeptidderivat; alternativt er det muligt at syntetisere det N-terminale dipeptidfragment, som derefter kobles til arginylgruppen med eller uden en kromofor gruppe som beskrevet ovenfor.
Uafhængigt af den valgte fremgangsmåde er en rensning af mellem- og slutprodukterne ved gelfiltreringskromatografi hensigtsmæssig, eftersom denne metode gør et hurtigt syntesearbejde muligt samt giver maksimale udbytter.
TLC-analyser er blevet udført dels på eluater fra GPC, dels på fordampede tørrede slut- og mellemprodukter.
Opfindelsen vil blive beskrevet mere detaljeret i de følgende ikke-begrænsende specifikke eksempler.
Forkortelser
Aminosyrer: (hvis andet ikke er nævnt menes L-formen)
Tyr = Tyrosin
Arg = Arginin
Aze = 2-Azetidincarboxylsvre
Phe = Phenylalanin
Pip = Pipecolinsyre
Pro = Prolin
Val = Valin
AcOK = Eddikesyre
Bz = Benzoyl
Cbo- = Carbobenzoxy- DMF = Dimethylformamid
EtgN = Triethylamin 5 145799
EtOAc = Ethylacetat HMPTA = N,N,N,,N,,N",N"-hexamethylphosphorsyretr iamid GPC = Gelfiltreringskromatografi
MeOH = Methanol -OpNP = p-nitrophenoxy -pNA = p-nitroanilid SNA = S-naphthylamid SNA(4-OMe) = 4-methoxy-S-naphthylamid TLC = Tyndtlagskromatografi.
Tyndtlagskromatografi;
Til TLC-analysen anvendes glasplader præpareret med silica-gel *254 (Merck) som absorberende middel. De benyttede opløsnings systemer er:
Px = chloroform:MeOH, 9:1 (volumenforhold) A = n-butanol:AcOHsvand, 3:2:1 (volumenforhold)
Efter endt kromatografering undersøges pladerne under UV-lys (254 nm) og fremkaldes derefter med chlor/o-toluidinreagens efter normal praksis. Når "homogent produkt ifølge TLC" er opnået, udføres analysen med en mængde af størrelsesordenen ug. De angivne R^-værdier er resultater fra separate kromatograferinger.
Den til gelfiltreringen benyttede Sephadex® G-15 er en krydsbundet dextrangel. Sephadex® LH-20 er en hydroxypropyleret krydsbundet dextrangel. Ionbvtterdelen Sephadex® QAE-25 er en krydsbundet dextrangel med diethyl-(2-hydroxy-propyl)amino-ethyl som funktionel gruppe.
Disse geler er fra Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige. Beskrivelse af synteserne I. Cbo-Arg (NO^). -pNA
35,3 g (10 mmol) tør Cbo-Arg(NO2)-OH opløses i 200 ml tør nydestilleret HMPTA ved stuetemperatur, hvorefter 10,1 g (100 mmol)
EtgN og 24,6 g (150 mmol) p-nitrophenylisocyanat tilsættes under omrøring og under vandfrie betingelser. Efter en reaktionstid på 24 timer ledes opløsningen over i 2 1 2% natriumbicarbonatopløsning under omrøring. Det dannede bundfald fjernes ved filtrering og vaskes med 2% bicarbonatopløsning, vand, 0,5 N HC1 (vandig) og vand og til slut tørres det. Råproduktet ekstraheres med varmt MeOH , og tungtopløselige biprodukter filtreres fra. Filtratet renses ved kromatografi på en ko- (R\ lonne af Sephadex ' LD-20,der er kvældet i og elueret med MeOH. Udbytte: 29,8 g (63%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P^ (R^: 0,34) 24 n [a)D +20,5 (c 1,9 DMF) 6 145799
II. Cbo-Pro-Arg(NC^)-pNA
4.8 g (10 mmol) Cbo-Arg(N02)-pNA opslemmes i 25 ml tør AcOH, hvorefter 15 ml 5,6 N HBr i AcOH tilsættes. Efter en reaktionstid på 50 minutter ved stuetemperatur hældes opløsningen under kraftig omrøring til 300 ml tør æter. Æterfasen suges fra det dannede bundfald, hvorefter bundfaldet vaskes med to portioner æter af 100 ml. Det således dannede HBr H-Arg(N02) -pNA tørres i vakuum over NaOH ved 40°C i 16 timer. Derefter opløses det i 25 ml DMF,og opløsningen afkøles til -10°C. Et^N tilsættes nu i en mængde, der er tilstrækkelig til, at et fugtet pH-papir holdt umiddelbart over opløsningens overflade viser svag basisk reaktion (1,9 ml). Udfældet Et^N HBr fjernes ved filtrering, og 4,1 g (11 mmol) Cbo-Pro-OpNP tilsættes. Efter 1 time tilsættes yderligere 0,7 ml Et3N og tillige efter 4 timer. Opløsningen henstår natten over for at indstille sig til stuetemperatur. For at undgå at overskud af Cbo-Pro-OpNP kontaminerer slutproduktet under GPC, da de har sammenlignelige elueringsvoluminer i det anvendte kromatografiske system, tilsættes 0,5 ml (5 mmol) n-butylamin. Efter 30 minutter tilsættes 10 mmol fortyndet HC1, reaktionsopløsningen ihcLdampes på rotationsinddamper, omrøres med et par portioner vand, som fjernes ved dekantering. Remanensen opløses i MeOH og kromatograferes på en kolonne af Sephadex ® LH-20, som er kvældet i og elueret med MeOH. Det opnåede produkt er homogent ifølge TLC.
Udbytte: 5,5 g (96%)
Analyser: TLC i P^ (R^: 0,28) [a]^4 -33,0° (c 1,0 DMF)
Ilf. Cbo-Pip-Arg(N02)-pNA
Udført som beskrevet i II.
Udbytte: 5,1 g (86%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P^ (R^: o,30) [a]^4 -26,2° (c 1,0 DMF)
IV. Cbo-D-Phe-Pip-Arg(N02)-pNA
2.9 g (5 mmol) Cbo-Pip-Arg(N02)-pNA decarbobenzoxyleres i HBr i AcOH,udfældes og vaskes med æter og tørres som beskrevet i II. HBr.H-Pip-Arg(N02)-pNA opløses derefter i 15 ml DMF. Opløsningen køles til -10°C, gøres svagt basisk med 0,9 ml Et3N og filtreres. 3,0 g 7 145793 (7,15 mmol) Cbo-D-PheHDpNP tilsættes og derefter 0,65 g (5 mmol) N-hydro-xybenzotriazol som katalysator. Efter 1 time tilsættes yderligere 0,35 ml EtgN, og det samme gentages efter 4 timer. Reaktionsopløsningen henstår natten over for at indstille sig til stuetemperatur. Opløsningen inddampes til tørhed i en rotationsinddamper. Remanensen opløses i EtOAc og behandles med 2% natriumbicarbonatopløsning og vand, hvorefter der inddampes. Remanensen opløses nu i MeOH og kromatograferes på Sephadex^ LH-2o, der er kvældet i og elueret med MeOH. Det opnåede produkt er ifølge TLC homogent.
Udbytte: 2,6 g (70%)
Analyser: TLC i P^ (R^: 0,44) [ct]£4 -38,4° (c: 1,0 DMF)
V. Cbo-D-Phe-Pro-Arg(N02)-pNA
Udført som beskrevet i IV.
Udbytte: 3,1 g (86%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P^ (R^: 0,46) [a]p4 -6,2° (c 1,0 DMF) VI. H-D-Phe-Pro-Arg-pNA,2HC1
Fra 175 mg (0,246 mmol) Cbo-D-Phe-Pro-Arg(N02)-pNA fjernes beskyttelsesgrupperne ved reaktion med 5 ml tør HF under tilstedeværelse af 0,3 ml anisol i et apparatur beregnet til dette formål ifølge Saka-kibara i 60 min. ved 0°C. Efter endt reaktion og fradestillering af alt HF renses råproduktet og underkastes ionbytning i to trin: a) GPC på en kolonne af Sephadex ^ G-15 kvældet i 33% AcOH i vand med det samme medium anvendt til opløsning og eluering. Det rene produkt frysetørres fra AcOH (vandig).
/ r\ b) Ionbytning på en kolonne af Sephadex QAE-25 på chlorid-form kvældet i MeOH:vand (95:5) med samme medium som anvendt til opløsning og eluering. Det rene produkt frysetørres fra vand.
Udbytte: 120 mg (80%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i A (Rf: 0,29)
Chloridindhold 11,53% (teoretisk 11,6%) 24 n [u]p -122 (c 0,5, 50% AcOH (vandig)).
145799 8 VII.H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HC1 Udført som beskrevet i VI .
Udbytte: Homogent ifølge TLC i A (R^: 0,44)
Chloridindhold 11,4% (teoretisk 11,3%) [a]p4 -109° (c 0,4, 50% AcOH (vandig)).
VIII.Cbo-D-Tyr ( Bz) —Pip-Arg(N02) -pNA Udført som beskrevet i IV Udbytte: 3,2 g (75%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P^ (R^: 0,50)
IX. H-D-Tyr-Pip-Arg-pNA
Udført som beskrevet i VI .
Udbytte: (68%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P^ (R^: 0,44)
Chloridindhold 10,8% (teoretisk 11,1%) 24 o [a]D -75,2 (c 0,5, 50% AcOH (vandig)).
X. Cbo-Aze-Arg(NO2)-pNA
Udført som beskrevet i II.
Udbytte: 4,2 g (75%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P^ (Rf: 0,27)
. XI. Cbo-D-Phe-Aze-Arg(NO2)-pNA
Udført som beskrevet i IV.
Udbytte: 2,4 g (69%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P1 (Rf: 0,47) XII. H-D-Phe-Aze-Arg-pNA.2HC1 Udført som beskrevet i VI.
9 1A579S
Udbytte: (71%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i A (Rf: 0,21)
Chloridindhold 11,6% (teoretisk 11,9%) [a]p4 -130° (c 0,5, 50% AcOH) XIII. Cbo-Arg(N02)-βΝΑ 7,2 g(20 mmol) tørt Cbo-Arg(N02)-OH opløses i 400 ml THF.
2,0 g (20 mmol) Et^N tilsættes, hvorefter opløsningen afkøles til -10°C i fuldstændig vandfrie omgivelser. 2,7 g (20 mmol) isobutyl-chlorformiat opløses i 20 ml THF og tilsættes til den afkølede opløsning over 10 min., og efter yderligere 10 min. tilsættes 3,44 g (20 mmol) β-naphthylamin. Reaktionsblandingen får lov at indstille sig til stuetemperatur og henstår ved denne i 24 timer. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed i vakuum, behandles 3-5 gange med destilleret vand, 3-5 gange med en 5% natriumbicarbonatopløsning og igen 3-5 gange med destilleret vand, hvorefter det tørres i vakuum. Produktet opløses i MeOH og kromatograferes på en kolonne af Sephadex ® LD-20, kvældet i og elueret med MeOH.
Det opnåede produkt er homogent ifølge TLC i p Udbytte: 8,1 g (84%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P^ (R^: 0,40) [a]33 +7,4° (c 1,0 DMF)
XIV. Cbo-Pip-Arg(N02)-8NA
Udført som beskrevet i II.
Udbytte: 4,8 g (82%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P^ (Rf: 0,36) XV. Cbo-D-Phe-Pip-Arg(NQ2)-βΝΑ
Udført som beskrevet i IV.
Udbytte: 2,6 g (71%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P^ (R^: 0,48).
10 14579S
XVI. H-D-Phe-Pip-Arg-SNA -2HC1
Udført som beskrevet i VI·
Udbytte: (68%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i A (R^: 0,44)
Chloridindhold 11,2% (teoretisk 11,3%).
[a]^4 -105° (c 0,5, 50% AcOH (vandig)).
XVII. cbo-Arg(N02)-βΝΑ (4-OMe)
Udført som beskrevet i XIII,
Udbytte: 7,lg (70%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i P^ (Rf: 0.42) XVIII. Cbo-Pip-Arg(NQ2)-βΝΑ (4-OMe)
Udført som beskrevet i II.
Udbytte: 4,9 g (79%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i ρχ (Rfi 0,38) XIX. Cbo-D-Phe-Pip-Arg(NQ0)-βΝΑ (4-OMe)
Udført som beskrevet i IV.
Udbytte: 2,7 g (70%)
Analyse: Homogent ifølge TLC i P·^ (R^: 0,51) XX. H-D-Phe-Pip-Arg-βΝΑ (4-OMe).2HC1
Udført som beskrevet i VI·
Udbytte: (64%)
Analyser: Homogent ifølge TLC i A (R^: 0,44)
Chloridindhold 10,4% (teoretisk 10,7%) [cc]^4 -102° (c 0,5, 50% AcOH (vandig)).
11 145799
Bestemmelse af thrombin ved hjælp af kromogene substrater:
Substraterne,som er syntetiseret i overensstemmelse med eksemplerne VI og VII benyttes til undersøgelse af thrombin, som nedenfor beskrevet.
Princippet i undersøgelsen er baseret på det faktum, at spaltningsproduktet dannet ved den enzymatiske hydrolyse har et UV-spektrum, som er væsentligt forskelligt fra substratets. Således har substratet ifølge eksempel VII, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA et absorptionsmaksimum ved 315 nm og en molær ekstinktionskoefficient på 12500. Ved 405 nm er absorptionen af substratet næsten fuldstændig ophørt. p-Nitroanilin, der er fraspaltet substratet under den enzymatiske hydrolyse, har et absorptionsmaksimum ved 380 nm og en mol^r ekstinktionskoefficient på 13200, som ved 405 nm kun er formindsket til 9620. Ved spektrofotometrisk bestemmelse ved 405 nm er det således muligt let at følge mængden af det dannede p-nitroanilin, som er proportional med graden af enzymatisk hydrolyse, som på sin side bestemmes af den aktive mængde thrombin. For andre substrater ifølge opfindelsen eksisterer der lignende betingelser, og på grund af dette er bestemmelserne konsekvent blevet foretaget ved 405 nm.
Tabel 1 viser en sammenligning af de relative reaktionshastigheder for det tidligere omtalte substrat S-2160, dets ikke-ben-zoylerede form samt modifikationer heraf indeholdende cykliske imino-syrer og to af substraterne ifølge opfindelsen. Denne tabel viser tydeligt fortrinnene ved substraterne ifølge opfindelsen. De reagerer fire gange hurtigere med thrombin end det hidtil bedste substrat S-2160 og er endvidere ca. 10 gange mere opløseligt i vand end S-2160.
Tabel 1
Relative reaktionshastigheder mellem thrombin (0,4 NIH/ml) og substrat (0,1 ymol/ml).
Substrat. Relativ reak- Opløselighed i tionshastighed. vand(mg/ml) A (S-2160) Bz-Phe-Val-Arg-pNA 100 0,1 B H-Phe-Val-Arg-pNa 3 1 C* H-Phe-Pro-Arg-pNA 15 1 VI H-D-Phe-Pro-Arg-pNa 400 3 D * H-Phe-Pip-Arg-pNA 9 1 VII H-D-Phe-Pip-Arg-pNA 420 3 sk
Forbindelserne C og D blev fremstillet analogt med tripeptiderne ifølge eksempel VI og VII.
12 145799
Substratet ifølge eksempel VI i nærværende beskrivelse ér også blevet afprøvet i forhold til de i indledningen nævnte, fra svensk patentskrift nr. 380.257 kendte substrater, H-D-Phe-Val-Arg-pNA (F) og Bz-D-Phe-Val-Arg-pNA (E). De fremkomne afprøvningsresultater fremgår af nedenstående tabel 2.
Tabel 2
Thrombin/ Relativ K (M) Optimal substratkon- aktivitet m centration (2 x Km)
S-2160 100 1-10-4 0,2 mM
Bz-D-Phe-Val-Arg-pNA (E) 5 ? ? -4
H-D-Phe-Val-Arg-pNA (F) 95 2*10 0,4 mM
H-D-Phe-Pro-Arg-pNA (VI) 400 1*10"5 0,02 mM
Det fremgår af ovenstående afprøvningsresultater, at substratet fra eksempel VI ifølge nærværende opfindelse er mere end 400# følsommere end den mest følsomme af de fra svensk patentskrift nr. 380.257 kendte D-aminosyreholdige forbindelser, substrat (F), og der behøves til opnåelse af optimal koncentration kun 1/10 af substratet ifølge opfindelsen i forhold til substrat S-2160 og 1/20 i forhold til substrat (F).
DK312676A 1975-07-11 1976-07-09 Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat med hoej specificitet overfor thrombin og thrombinlignende enzymer DK145799C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7507975 1975-07-11
SE7507975-6A SE407405B (sv) 1975-07-11 1975-07-11 Nya kromogena trombinsubstrat

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK312676A DK312676A (da) 1977-01-12
DK145799B true DK145799B (da) 1983-03-07
DK145799C DK145799C (da) 1983-08-29

Family

ID=20325116

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK312676A DK145799C (da) 1975-07-11 1976-07-09 Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat med hoej specificitet overfor thrombin og thrombinlignende enzymer

Country Status (22)

Country Link
JP (1) JPS5224590A (da)
AT (1) AT348686B (da)
AU (1) AU497547B2 (da)
BE (1) BE843970A (da)
CA (1) CA1068261A (da)
CH (1) CH622287A5 (da)
CS (1) CS196314B2 (da)
DD (1) DD128691A5 (da)
DE (1) DE2629195C3 (da)
DK (1) DK145799C (da)
ES (1) ES449739A1 (da)
FI (1) FI56525C (da)
FR (1) FR2317280A1 (da)
GB (1) GB1510926A (da)
IL (1) IL49829A (da)
IT (1) IT1062605B (da)
NL (1) NL188355C (da)
NO (1) NO142576C (da)
PL (1) PL103003B1 (da)
SE (1) SE407405B (da)
SU (1) SU719492A3 (da)
ZA (1) ZA763586B (da)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK155051B (da) * 1980-05-06 1989-01-30 Pentapharm Ag Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5255593A (en) * 1975-10-30 1977-05-07 Ajinomoto Kk Measuring method of enzyme activity
DE2757992A1 (de) * 1977-12-24 1979-06-28 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur prothrombin-bestimmung
DE2812943C3 (de) * 1978-03-23 1981-05-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagens zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin im Plasma
US4289498A (en) * 1979-01-08 1981-09-15 Ortho Diagnostics, Inc. One-stage prothrombin assay and compositions useful therein
FR2471410A2 (fr) * 1979-12-17 1981-06-19 Jozefonvicz Marcel Perfectionnements apportes a un procede de dosage des proteases et des anti-proteases et notamment des proteases et antiproteases des systemes de la coagulation et du complement
EP0018002B1 (de) * 1979-04-24 1983-02-09 Marcel Jozefonvicz Neues Bestimmungsverfahren für Proteasen und Antiproteasen
DE3005540A1 (de) * 1980-02-14 1981-08-20 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagens zur bestimmung der biologischen aktivitaet von heparin im plasma
JPS5856695A (ja) * 1981-09-28 1983-04-04 Nitto Boseki Co Ltd 新規なトロンビン測定用基質
DE3211254A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens
DK201084A (da) * 1983-04-28 1984-10-29 Kimberly Clark Co Fremgangsmaade til bestemmelse af cathepsin b i naervaerelse af andre proteolytiske enzymer, og forbindelser til anvendelse ved fremgangsmaaden
US20090075298A1 (en) 2005-05-20 2009-03-19 Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. Method of analyzing enzyme

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE380258B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trypsin och andra enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
SE380257B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK155051B (da) * 1980-05-06 1989-01-30 Pentapharm Ag Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf

Also Published As

Publication number Publication date
IT1062605B (it) 1984-10-20
ES449739A1 (es) 1978-01-16
DE2629195C3 (de) 1983-11-17
NO762407L (da) 1977-01-12
NL7607104A (nl) 1977-01-13
DE2629195A1 (de) 1977-01-13
SU719492A3 (ru) 1980-02-29
CA1068261A (en) 1979-12-18
IL49829A0 (en) 1976-08-31
DK312676A (da) 1977-01-12
AU497547B2 (en) 1978-12-14
AT348686B (de) 1979-02-26
SE407405B (sv) 1979-03-26
NO142576C (no) 1980-09-10
ATA463976A (de) 1978-07-15
BE843970A (fr) 1976-11-03
PL103003B1 (pl) 1979-05-31
FI56525C (fi) 1980-02-11
CS196314B2 (en) 1980-03-31
AU1530576A (en) 1978-01-05
GB1510926A (en) 1978-05-17
FI762010A (da) 1977-01-12
DD128691A5 (de) 1977-12-07
DK145799C (da) 1983-08-29
NL188355C (nl) 1992-06-01
FI56525B (fi) 1979-10-31
CH622287A5 (en) 1981-03-31
IL49829A (en) 1978-12-17
JPS5615239B2 (da) 1981-04-09
ZA763586B (en) 1977-05-25
DE2629195B2 (de) 1980-01-10
NL188355B (nl) 1992-01-02
FR2317280A1 (fr) 1977-02-04
JPS5224590A (en) 1977-02-24
NO142576B (no) 1980-06-02
FR2317280B1 (da) 1980-05-16
SE7507975L (sv) 1977-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SU1277904A3 (ru) Способ получени трипептидов
US4061625A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
FI56829C (fi) Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specifitet foer trypsin och andra enzymer av typen peptidylpeptidhydrolaser
US4214049A (en) Assay of serine proteases using novel chromogenic enzyme substrates
NO142074B (no) Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser
JPH0253040B2 (da)
DK145799B (da) Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat med hoej specificitet overfor thrombin og thrombinlignende enzymer
EP0170797B1 (en) Novel substrate for determining the activity of blood coagulation factor xa (stuart-prower factor)
Kunimoto et al. Mechanism of inhibition of pepsin by pepstatin. II
US4138394A (en) Peptide derivatives and a method of measuring collagenase activity
US4247454A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4169015A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4176009A (en) Method of measuring collagenase activity
JPH059068B2 (da)
AU602527B2 (en) Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use
EP0149593B1 (en) Novel thiopeptolide substrates for vertebrate collagenase
DK168574B1 (da) Peptidderivater og salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer samt anvendelsen heraf som substrat til kvantitativ bestemmelse af C1-esterase
JPS59499B2 (ja) ペプチド誘導体
JPS5843389B2 (ja) ペプチド遊導体及びペプチド誘導体を用いるコラゲナ−ゼ活性の測定方法
JPH0755942B2 (ja) 酵素活性測定用ペプチド誘導体及びその使用法
JPH01221395A (ja) ポリペプチド誘導体
NITECKI SYNTHESIS OF CYCLO-L-TYROSYLGLYCYLGLYCYLGLYCYL L-HISTIDYLGLYCYL
JPH0822842B2 (ja) アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド
JPH0244839B2 (da)
JPH0136480B2 (da)

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed