DK168574B1

DK168574B1 - Peptidderivater og salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer samt anvendelsen heraf som substrat til kvantitativ bestemmelse af C1-esterase

Info

Publication number: DK168574B1
Application number: DK274984A
Authority: DK
Inventors: Lars Gundro Svendsen
Original assignee: Pentapharm Ag
Priority date: 1983-06-03
Filing date: 1984-06-01
Publication date: 1994-04-25
Also published as: NO842218L; EP0128118A3; NO166716C; DK274984A; EP0128118B1; EP0128118A2; DK274984D0; IL71941A0; CA1253998A; AU566936B2; AU2890284A; IL71941A; US4629695A; ES8606946A1; ES533079A0; DE3484912D1; NO166716B

Description

i DK 168574 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte peptidderivater og salte med mineralsyrer eller organiske syrer og disses anvendelse som substrater til kvantitativ bestemmelse af enzymer.

Menneskeblod indeholder et stof, der er kendt under navnet C^-este-5 raseproenzym, og som under indvirkning af forbindelsen mellem et antistof og et antigen aktiveres til det aktive enzym C^-esterase.

Dette enzym aktiverer på kaskadeagtig måde yderligere proenzymer til aktive enzymer i komplementsystemer. Disse aktiverede enzymer lyserer cellemembraner hos bakterier eller døde erythrocyter og spiller 10 således en vigtig rolle i det immunologiske forsvar. Plasmaet indeholder også en vigtig inhibitor, der hæmmer C^-esterase, og som bærer navnet C^-esteraseinhibitor. Ved inflammatoriske processer aktiveres C^-esterase hvorved komplementsystemet aktiveres hurtigere eller langsommere alt efter C^-esteraseinhibitomiveauet i blodet.

15 Det er ud fra et klinisk synspunkt ønskeligt i sådanne tilfælde at bestemme såvel C^-esteraseniveauet som C^-esteraseinhibitorniveauet i blodet. Disse bestemmelser udføres for øjeblikket ifølge omstændelige og lidet nøjagtige immunologiske og titrimetriske metoder (jfr. W.J. Canady et al., Immnochemistry 13, 1976, s. 229-233 og D. Ogston et 20 al., Thrombosis Research 9, 1976, s. 217-222).

Det har nu vist sig, at bestemmelsen af C^-esterase kan udføres væsentligt hurtigere og nøjagtigere, når der som substrater anvendes visse enkle peptidderivater, der udgør den foreliggende opfindelses genstand.

25 Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte peptidderivater med den almene formel R2 - Y - NH - CH - CO - X - Arg - R1 (CH2)4 NH - CO - 0 - R3 30 hvor

Ri betegner en p-nitrophenylamino-, 1- eller 2-naphthylamino-, 4-methoxy-2-naphthylamino-, 4-methyl-7-cumarylamino- eller 1,3-di(methoxycarbonyl)-5-phenylaminogruppe, 2 DK 168574 B1 r2 betegner hydrogen eller a) en ligekædet eller forgrenet alkanoylgruppe med 2-6 carbonato-mer, b) en cyclohexylcarbonylgruppe, 5 c) en «-carboxyl-, ω-methoxycarbonyl- eller ω-ethoxycarbonyl- alkanoylgruppe med 2-4 carbonatomer i alkanoyldelen, d) en ligekædet eller forgrenet alkoxycarbonylgruppe med 1-4 car-bonatomer i alkoxydelen, e) en alkylsulfonylgruppe med 1-2 carbona tomer i alkyl delen, 10 eller en phenyl- eller p-toluylsulfonylgruppe, f) en benzoylgruppe, eller g) en benzyloxycarbonylgruppe, betegner benzyl, 4-methylbenzyl, 4-methoxybenzyl eller 2-, 3- eller 4-chlorbenzyl, 15 X betegner en glycyl- eller alanylgruppe, og Y betegner en enkeltbinding eller en gruppe med den almene formel - NH - (CH2)m - CH - CO -20 R4 hvor R4 betegner en benzyl-, phenyl-, cyclohexyl -, cyclohexylmethyl-, 4-hydroxybenzyl- eller 4-hydroxycyclohexylmethylgruppe, og m betegner 0, og den ved Y definerede aminosyre har L- eller D-konfiguration, eller R4 betegner hydrogen, og m betegner 0, 1 eller 2, 25 og salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer.

Fra DE-3202289-Al kendes en fremgangsmåde til bestemmelse af C^-esteraseinhibitoraktiviteten hos C^-esteraseinhibitorholdige prøver under anvendelse af di-, tri- og tetrapeptider. I de beskrevne tri-og tetrapeptider kan den tredje aminosyre være forskellige aminosyrer 30 men kan ikke være lysin. I modsætning hertil er den tredje aminosyre i peptidderivaterne ifølge opfindelsen altid et lys inderivat, og det har overraskende vist sig, at de foreliggende peptidderivater udviser en væsentlig bedre spaltelighed end de fra DE-3202289-A1 kendte derivater, jfr. de nedenfor viste forsøgsresultater.

3 DK 168574 B1

Der udvises særlig høj følsomhed over for C^-esterase hos de peptidderivater med den ovenfor anførte formel, hvor er alkanoyl med 2-6 carbonatomer eller alkoxycarbonyl med 1-4 carbonatomer, Y er en enkeltbinding, og R^ er benzyl, og R·*· og X har de ovenfor anførte 5 betydninger.

Som eksempler på peptidderivater med den ovenfor anførte almene formel kan nævnes følgende forbindelser: BOC-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA.AcOH, 2AcOH. H- Lys ( e - Cbo ) -Gly-Arg-pNA, 10 Ac -Lys ( e - Cbo) -Gly-Arg-pNA.AcOH, CH30C0-Lys (e -Cbo) -Gly-Arg-pNA.AcOH, C2H5OCO- Lys (e-Cbo) -Gly-Arg-pNA. AcOH, iso-ButOCO-Lys(e -Cbo) -Gly-Arg-pNA.AcOH, CH3CH2CO-Lys ( e-Cbo) -Gly-Arg-pNA.AcOH, 15 CH3 (CH2) 2C0-Lys ( e-Cbo) -Gly-Arg-pNA.AcOH, CH3CH2OCO - CH2 - CO - Lys ( c - Cbo) - Gly-Arg -pNA. AcOH, B0C-Lys( e-Cbo) - Ala-Arg-pNA. AcOH, H-Lys(e-Cbo) -Ala-Arg-pNA.2CF3COOH,

Ac-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-pNA.AcOH, 20 CH30C0-Lys(e-Cbo) - Ala-Arg-pNA.AcOH, BOC-Gly-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA. AcOH, 2 CF3 C00H.H-Gly-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA, CH30-C0-Gly-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA.AcOH og CH3-CH2-CO-Gly-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA.AcOH.

25 Peptidderivaterne ifølge opfindelsen kan fremstilles ved de inden for peptidsyntese sædvanligt anvendte metoder, fx ved de i det følgende beskrevne metoder: 1) Den chromogene gruppe R^ anbringes på carboxygruppen af det C-terminale arginin, hvorved dettes os-aminogruppe er beskyttet af en 30 beskyttelsesgruppe, fx en carbobenzoxy- eller tert.butoxycarbonyl-gruppe, og argininets δ -guanidylgruppe er beskyttet ved protonise-ring, fx med HC1, nitrering eller tosylering. Den C-terminale gruppe R^· tjener ligeledes som beskyttelsesgruppe under den trinvise opbygning af peptidkæden. De andre beskyttelsesgrupper kan alt efter behov 4 DK 168574 B1 fraspaltes selektivt for at anbringe de yderligere aminosyrederiva-ter, indtil den ønskede peptidkæde er fuldstændigt opbygget. Til sidst kan de tilbageværende beskyttelsesgrupper fraspaltes fuldstændigt, uden at gruppen R*· fjernes samtidigt (jfr. fx Miklos Bodansky 5 et al., Peptide Synthesis, Interscience Publishers, 1966, s. 163-165).

2) Først opbygges peptidkæden (jfr. Bodansky, loc.cit.), idet argini-nets C-terminale carboxylgruppe dog beskyttes med en sædvanlig estergruppe, fx enmethoxy-, ethoxy- eller benzyloxygruppe. Ester-10 grupperne kan fraspaltes ved basisk hydrolyse med undtagelse af tert.butoxygruppen, der må fraspaltes selektivt ved hjælp af tri-f luoreddikesyre. I det tilfælde, at argininets S - guanidylgruppe er protoniseret, fraspaltes den nævnte estergruppe ved hjælp af trypsin, idet der ikke sker nogen racemisering. Hertil knyttes den chromogene 15 gruppe R^-. Hvis argininets 5 - guanidingruppe er beskyttet af en nitro-eller tosylgruppe, og peptidderivatets N-terminale α-aminogruppe er beskyttet af en carbobenzoxygruppe eller en p-methyl-, p-methoxy-eller p-chlorbenzyloxycarbonylgruppe eller en tert.butoxygruppe, så fraspaltes disse beskyttelsesgrupper samtidigt. Fraspaltningen kan 20 udføres ved behandling af det beskyttede peptidderivat med vandfrit HF ved stuetemperatur, hvorved alle de ovennævnte amino- eller δ-guanidinbesky tteis esgrupper fraspaltes. Fraspaltningen kan også udføres ved behandling med 2N HBr i iseddike ved stuetemperatur, hvis det beskyttede peptidderivat ikke indeholder nogen nitro- eller 25 tosylbeskyttelsesgruppe.

I de følgende udførelseseksempler beskrives fremstillingen af peptidderivaterne ifølge opfindelsen udførligt.

Analyserne af de ifølge eksemplerne vundne eluater og produkter blev udført ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af silicagel-over-30 trukne glasplader (Merck, F 254). Tyndtlagschromatogrammerne blev fremkaldt ved hjælp af følgende opløsningsmiddelsystem: n-Butanol/-eddikesyre/vand (3:1:1).

5 DK 168574 B1

Der anvendes følgende forkortelser:

Ac - Acetyl

Ac2<3 - Eddikesyreanhydrid

AcOH - Eddikesyre 5 Ala - L-Alanin β-kla - jg-Alanin

Arg = L-Arginin BOC = tert.Butoxycarbonyl γ-But = 4-Aminosmørsyre 10 Bz = Benzoyl BZ2O = Benzoesyreanhydrid CHA = L-3-Cyclohexylalanin CHG = L-2-Cyclohexylglycin D-CHG = D-2-Cyclohexylglycin 15 CHT = L-3-(4-Hydroxycyclohexyl)alanin — kernehydrogeneret tyrosin

Cbo = Carbobenzoxy DMF = Dimethylformamid DPA = 5-Amido-isophthalsyre-dimethylester 20 TLC = Tyndtlagschromatogram eller tyndtlagschromatografi

Et - Ethyl

EtO = Ethoxy

EtøN *= Triethylamin

Gly *» Glycin 25 HMPTA = Ν,Ν,Ν',N',N" ,N"-Hexylmethylphosphorsyretriamid iso-BuO - Isobutoxy LMS = Op lø sningsmiddelsys tem

Lys - L-Lysin MCA = 7-Amido-4-methylcumarin 30 MeO = Methoxy

MeOH = Methanol NA = Naphthylamid

OpNP = p-Nitrophenoxy pNA = p-Nitroanilid 35 Ph'Gly = L-2-Phenylglycin

Phe = L-Phenylalanin D-Phe = D-Phenylalanin 6 DK 168574 B1

Sue = Succinyl THF - Tetrahydrofuran

Tos = p-Toluensulfonyl

Hvis intet andet er anført, er aminosyrerne i L-form.

5 EKSEMPEL 1 BOC-Lys ( c -Gbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH la. Cbo-Arg-pNA*HCl I en 250 ml trehalset rundkolbe opløstes 16,0 g (47,0 mmol) Cbo-Arg-OH.HCl, der var tørret i vakuum over P2O5, opløst i 90 ml absolut 10 HMPTA ved 20°C under udelukkelse af fugtighed. Ved stuetemperatur blev der til den fremkomne opløsning først sat en opløsning af 4,74 g (47,0 millimol) Et3N i 10 ml HMPTA og derefter portionsvis 16,4 g (100 millimol) p-nitrophenylisocyanat (100%'s overskud). Efter 24 timers reaktionstid ved 20°C blev størstedelen af HMPTA afdestilleret 15 i vakuum. Remanensen blev ekstraheret flere gange med 30%'s AcOH. Remanensen blev kasseret. De forenede AcOH-ekstrakter blev med henblik på yderligere oprensning anbragt på en med 30%'s AcOH ækvilibreret Sephadex®-G-15-søjle og elueret med 30%'s AcOH. De fraktioner af AcOH-eluatet, der ved trypsinbehandling lod sig spalte 20 under frigørelse af p-nitroanilin, blev frysetørret. Herved fremkom 12,6 g af et amorft pulver, der ifølge TLC i LMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for C2{)h25N605C1: C 51,67 H 5,42 N 18,08 Cl 7,63.

Fundet: C 51,29 H 5,48 N 17,92 Cl 7,50.

25 Ib. 2HBr*H-Arg-pNA

Under udelukkelse af fugtighed blev 4,65 g (10 mmol) af forbindelsen la behandlet med 40 ml 2N HBr i iseddike under omrøring i 45 minutter ved 20eC. Aminosyrederivatet gik derved i opløsning under udvikling af CO2. Reaktionsopløsningen blev under kraftig omrøring dryppet til 7 DK 168574 B1 250 ml absolut ether, hvorved 2HBr.H-Arg-pNA fældede ud. Etherfasen blev suget fra, hvorefter den faste fase blev vasket med endnu 4 x 100 ml absolut ether for at fjerne det som biprodukt dannede benzylbromid såvel som i vid udstrækning at fjerne overskuddet af HBr 5 og AcOH. Remanensen blev opløst i 50 ml MeOH, justeret til pH-værdi 4,5 ved hjalp af ΕίβΝ og inddampet til tørhed i vakuum ved 30BC. Det således fremkomne produkt blev opløst i 75 ml MeOH og fik lov at løbe gennem en med MeOH ækvilibreret søjle af Sephadex® LH-20 (tværbundet dextrangel). Af en fraktion af eluatet fremkom 4,18 g (91,6% teo-10 retisk udbytte) af den amorfe forbindelse lb, der ifølge TLC i LMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for C 31,60 H 4,42 N 18,43 Br 35,03.

Fundet: C 31,15 H 4,35 N 18,84 Br 34,81.

15 lc. Cbo-Gly-Arg-pNA»HBr 4,56 g (10 mmol) af forbindelsen lb blev opløst i 30 ml frisk destilleret DMF, og efter afkøling til -10°C blev der under omrøring tilsat 1,40 ml (10 mmol) Et3N. Det dannede ΕίβΝ'ΗΒΓ blev filtreret fra og vasket med en lille smule koldt DMF. Til filtratet blev der 20 under omrøring ved -10°C sat 3,65 g (11 mmol) Cbo-Gly-OpNP, og blandingen fik under udelukkelse af fugtighed lov til at reagere i 2-3 timer, hvorved reaktionsopløsningens temperatur efterhånden steg til ca. 20°C. Opløsningen blev igen afkølet til -10°C og pufret med 0,70 ml (5 mmol) ΕίβΝ. Reaktionsopløsningen fik lov at reagere ca. 2 25 timer ved -10°C og 3 timer ved stuetemperatur. Denne procedure blev gentaget endnu en gang med 0,70 ml EtjN, og efter yderligere 16 timer blev reaktionsopløsningen inddampet til tørhed i vakuum ved 50eC. Remanensen blev opløst i 75 ml 50%'s AcOH og oprenset ved gelfiltrering på en søjle af Sephadex® G-15, der var ækvilibreret med 30 50%'s AcOH. Den fraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen blev opløst i 150 ml MeOH og endnu en gang inddampet til tørhed. Efter tørring af den fremkomne remanens i vakuumtørreskab ved 60°C over ?2®5 fren&om 8 DK 168574 B1 5,85 g (88,3% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse lc. der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for ^22^8^7^681· C 46,65 H 4,98 N 17,31 Br 14,11.

5 Fundet: C 46,33 H 5,04 N 17,88 Br 14,20.

ld. 2HBr*H-Gly-Arg-pNA

4.56 g (8 mmol) af forbindelsen lc blev under udelukkelse af fugtighed og under omrøring behandlet med 32 ml 2N HBr i iseddike i 40 minutter ved 20°C. Dipeptidderivatet opløstes derved efterhånden 10 under udvikling af C02- Reaktionsopløsningen blev under kraftig omrøring dryppet til 250 ml absolut ether, hvorved 2 HBr»H-Gly- Arg-pNA fældet ud. Etherfasen blev suget fra, hvorefter den faste fase blev vasket med endnu 4 x 100 ml absolut ether for at fjerne det som biprodukt dannede benzylbromid såvel som i vid udstrækning at fjerne 15 overskuddet af HBr og AcOH. Remanensen blev opløst i 50 ml MeOH.

Efter justering af pH-værdien til 4,5 ved hjælp af EtgN blev opløsningen inddampet til tørhed i vakuum ved 30®C. Den således fremkomne remanens blev opløst i 50 ml MeOH og oprenset på en med MeOH ækvilibreret søjle af Sephadex® LH-20. Den fraktion af MeOH-20 eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 30°C. Efter tørring af den fremkomne remanens i vakuumtørreskab ved 40°C over P2O5 f*emkom 3,78 g (92,1% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse ld, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

25 Analyse:

Beregnet for C^i^NyO/^: C 32,77 H 4,52 N 19,11 Br 31,14.

Fundet: C 32,31 H 4,59 N 19,47 Br 30,78.

le. BOC-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA»HBr 2.57 g (5 mmol) af forbindelsen ld blev opløst i 20 ml frisk destil-30 leret DMF, og efter afkøling til -10° C blev der under omrøring tilsat 0,70 ml (5 mmol) ΕίβΝ. Det dannede EtjN'HBr blev filtreret fra og vasket med en smule koldt DMF. Til filtratet blev der under omrø- 9 DK 168574 B1 ring ved -10°C sat 2,76 g (5,5 mmol) BOC-Lys(e-Cbo)-OpNP. Reaktionsblandingen fik under udelukkelse af fugtighed lov at reagere i 2-3 timer, hvor reaktionsopløsningens temperatur efterhånden steg til ca. 20°C. Opløsningen blev igen afkølet til -10eC og pufret med 0,35 ml 5 (2,5 mmol) Et3N. Reaktionsopløsningen fik lov at reagere i ca. 2 timer ved -20°C og i yderligere 3 timer ved stuetemperatur. Denne procedure blev gentaget endnu en gang med 0,35 ml Et3N, og efter yderligere 16 timer blev reaktionsopløsningen inddampet til tørhed i vakuum ved 50°C. Remanensen blev opløst i 50 ml 50%'s AcOH og 10 oprenset ved gelfiltrering på en søjle af Sephadex® G-15, der var ækvilibreret med 50%'s AcOH. Den fraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitro-anilin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40eC. Remanensen blev opløst i 100 ml MeOH, hvorefter opløsningen endnu en gang blev 15 inddampet til tørhed. Efter tørring af den fremkomne remanens i vakuumtørreskab ved 60°C over P2O5 fre®k°® 3,57 g (89,8% af det teoeretiske udbytte) af den amorfe forbindelse le, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse: 20 Beregnet for Cgg^giigOgBr: C 49,87 H 6,09 N 15,86 Br 10,05.

Fundet: C 49,38 H 6,00 N 16,03 Br 9,85.

Aminosyreanalyse viste de forventede aminosyrer i det rigtige forhold:

Gly: 1,00 - Lys: 0,99 - Arg: 0,97.

25 lf. BOC-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA*AcOH

7,95 g (10 mmol) BOC-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA*HBr (fremstillet ifølge afsnit le) blev opløst i 75 ml 60%'s vandig MeOH. Opløsningen blev sat på en søjle af Amberlite® JRA-401 på acetatform. Søjlen blev elueret ved hjælp af 60%'s vandig MeOH, hvorved HBr ved ionbytning 30 blev erstattet med AcOH. Eluatet blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40°C. Efter tørring i vakuumtørreskab ved 40°C over P2O5 fremkom 7,58 g bromidfrit BOC-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA*AcOH (97,9% af det teoretiske udbytte).

10 DK 168574 B1

Ved denne metode kan der ud fra det ovennævnte tripeptidderivat også fremstilles andre tilsvarende salte med organiske syrer, fx myresyre, prop ionsyre, oxalsyre, vinsyre, citronsyre, mælkesyre, benzoesyre, chlorbenzoesyre, salicylsyre eller phthalsyre. Der kan som ionbytter 5 fx anvendes Amberlite® JRA-401 på hydrochloridform og overføres til den ønskede syresaltform, idet den nævnte ioribytter ved behandling med natriumhydroxidopløsning omdannes til den basiske OH-form og derefter behandles med en opløsning af en l:l-blanding af den ønskede organiske syre og denne natriumsalt i 60%'s vandig MeOH.

10 EKSEMPEL 2

BOC-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-MCA.AcOH 2b. 2HBr.H-Arg-MCA

13,0 g (25,9 mmol) kommerciel tilgængeligt Cbo-Arg-MCA*HCl blev analogt med eksempel lb deblokeret med 104 ml (208 mmol) af en 15 opløsning af 2N HBr i iseddike. Den tørrede remanens blev opløst i 400 ml MeOH og oprenset på en søjle af Sephadex® LH-20. Den fraktion af MeOH-eluatet, der lod sig spalte ved trypsinbehandling under frigørelse af 4-methyl-7-amino-cumarin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 30°G. Efter tørring af den fremkomne remanens i vakuum -20 tørreskab ved 40°C over P2O5 fremkom 11,2 g (87,7% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 2b, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for C16H23N503Br2: C 38,96 H 4,70 N 14,20 Br 32,40.

25 Fundet: C 39,40 H 4,61 N 14,48 Br 31,90.

2c. Cbo-Gly-Arg-MCA*HBr 4,93 g (10 mmol) af forbindelsen 2b og 3,65 g (11 mmol) Cbo-Gly-OpNP blev sat til 75 ml frisk destilleret DMF. Efter afkøling til -10°C blev der under omrøring først tilsat 1,40 ml (10 mmol) og derefter 30 0,70 ml (5 mmol) EtjN. Under udelukkelse af fugtighed fik blandingen 11 DK 168574 B1 lov til at reagere først 3 timer ved -10°C og derefter yderligere 4 timer ved stuetemperatur. Reaktionsopløsningen blev på ny afkølet til -10°C, puf ret med 0,70 ml Et3N og omrørt natten over ved 20° C. Reaktionsblandingen blev inddampet til tørhed i vakuum ved 50eC, 5 hvorefter remanensen blev opløst i 200 ml 50%'s AcOH og oprenset på en søjle af Sephadex® G-15. Den fraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methyl-7-amino-cumarin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40eC. Efter tørring af den fremkomne remanens i vakuumtørre skab ved 60° C over 10 P2°5 fremkom 4,98 g (82,5% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 2c, der ifølge TLC i LMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for ^g^j^gOgBr: C 51,75 H 5,18 N 13,93 Br 13,24.

Fundet: C 51,48 H 5,24 N 13,70 Br 13,14.

15 2d. 2HBr*H-Gly-Arg-MCA

4,83 g (8 mmol) af forbindelsen 2c blev ifølge eksempel ld deblokeret med 32 ml 2N HBr i iseddike. Det fremkomne råprodukt blev opløst i 100 ml MeOH og oprenset på en søjle af Sephadex® LH-20. Den fraktion af MeOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under 20 frigørelse af 4-methyl-7-amino-cumarin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 30"C. Efter tørring af den fremkomne remanens i vakuum-tørreskab ved 40°C over ]?2®5 fremkom 4,05 g (92,0% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 2d, der ifølge TLC i LMS var ensartet.

25 Analyse:

Beregnet for C^gH2g^604^r2: C 39,29 H 4,76 N 15,27 Br 29,04.

Fundet: C 39,02 H 4,78 N 15,39 Br 28,72.

2e. BOC-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-MCA»HBr 2,75 g (5 mmol) af forbindelsen 2d blev analogt med eksempel le 30 omsat med 2,76 g (5,5 mmol) B0C-Lys(€-Cbo)-OpNP. Det fremkomne råprodukt blev opløst i 75 ml 50%'s AcOH og oprenset på en søjle af Sephadex® G-15. Den fraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved 12 DK 168574 B1 behandling med trypsin under frigørelse af 4-methyl - 7 - amino - cumarin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40°C. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 60“C over P2O5 fremkom 3,41 g (82,0% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 2e, der ifølge TLC 5 i IMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for C37H5j%09Br: C 53,43 H 6,18 N 13,47 Br 9,61.

Fundet: C 53,13 H 6,24 N 13,76 Br 9,45.

10 Aminosyreanalyse viste de forventede aminosyrer i det rigtige forhold:

Gly: 1,00 - Lys: 1,02 - Arg: 0,98.

2f. BOC-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-MCA»AcOH

8,32 g (10 mmol) af forbindelsen 2e blev analogt med eksempel lf 15 omdannet til det tilsvarende acetatsalt. Dette gav 7,95 g (98,0% af det teoretiske udbytte) af dette produkt.

EKSEMPEL 3 BOC-Lys ( e -Cbo) -Gly-Arg-DPA*AcOH 3a. Cbo-Arg-DPA»HCl 20 I en 1000 ml trehalset rundkolbe opløstes 34,48 g (0,1 mol) tørret

Cbo-Arg-0H«HCl i en blanding af 150 ml frisk destilleret vandfrit DMF og 300 ml absolut THF ved 20°C. Til den til -10°C afkølede opløsning blev der under omrøring og udelukkelse af fugtighed sat 10,2 g (0,1 mol) EtgN. Derefter blev der til blandingen inden for 20 minutter 25 dråbevis sat en opløsning af 13,65 g (0,1 mol) chlormyresyreisobutyl-ester i 50 ml THF, idet reaktions temperaturen ikke fik lov at stige til over -5eC. Efter en yderligere reaktionstid på 10 minutter ved en temperatur på fra -10“C til -5eG blev der til reaktionsblandingen dråbevis sat en opløsning af 20,92 g (0,1 mol) 5-amino-isophthalsyre-30 dimethylester i 75 ml DMF i løbet af 30 minutter, idet reaktions- 13 DK 168574 B1 temperaturen hele tiden blev holdt under -5“C. Reaktionsblandingen fik derefter lov at reagere videre i endnu 1 time ved -5°C. Blandingen blev derefter omrørt natten over ved 20°C og derefter afkølet til -15°C for at lade Et3N*HCl udkrystallisere. Det dannede Et3N.HCl blev 5 filtreret fra og vasket med en smule kold DMF. Filtratet blev sammen med vaskeopløsningen inddampet til tørhed i vakuum ved 50°C. Remanensen blev opløst i 1000 ml 50%'s AcOH og oprenset ved gelfiltrering på en søjle af Sephadex® G-15, der var ækvilibreret med 50%'s AcOH. Den fraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med 10 trypsin under frigivelse af 5-amino-isophthalsyre-dimethylester, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40°C. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 50°C over P2O5 fremkom 24,6 g (45,9% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 3a, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

15 Analyse:

Beregnet for C24h30N5O7C1: C 53,78 H 5,64 N 13,07 Cl 6,62.

Fundet: C 53,21 H 5,71 N 13,20 Cl 6,52.

3b. 2HBr*H-Arg-DPA

21,44 g (40 mmol) af forbindelsen 3a blev deblokeret analogt med 20 eksempel Ib. Efter oparbejdelse blev det fremkomne råprodukt opløst i 250 ml MeOH og oprenset ved gelfiltrering på en søjle af Sephadex® LH-20. Den fraktion af MeOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin tinder frigivelse af 5-amino-isoph thalsyredime thyl-ester, blev inddampet til tørhed i vakuum. Efter tørring af remanen-25 sen i vakuumtørreskab ved 40°C over P2O5 fremkom 19,63 g (93,1% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 3b, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for ci6H25^505®r2: C 36,45 H 4,78 N 13,28 Br 30,31.

30 Fundet: C 36,82 H 4,67 N 13,45 Br 29,85.

14 DK 168574 B1 3c. Cbo-Gly-Arg-DPA*HBr 5,27 g (10 mmol) af forbindelsen 3b blev omsat med 3,65 g (11 mmol) Cbo-Gly-OpNP analogt med eksempel lc. Det efter oparbejdning fremkomne råprodukt blev opløst i 200 ml 50%'s AcOH og oprenset på en 5 søjle af Sephadex® G-15. Den fraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 5-amino-isophthalsyre-dimethylester, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40eC. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 60°C over P2O5 fremkom 5,29 g (83% af det teoretiske udbytte) af den amorfe 10 forbindelse 3c, der ifølge TLC i LMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for C26H33N6OgBr: C 48,99 H 5,22 N 13,18 Br 12,53.

Fundet: C 48,50 H 5,28 N 12,92 Br 12,33.

3d. 2HBr»H-Gly-Arg-DPA

15 5,10 g (8 mmol) af forbindelsen 3c blev deblokeret med 32 ml 2N HBr i iseddike analogt med eksempel ld. Det efter oparbejdningen fremkomne råprodukt blev opløst i 100 ml MeOH og oprenset på en søjle af Sephadex® LH-20. Den fraktion af MeOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 5-amino-isophthalsyre-20 dimethylester, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 30°C. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 40“C over P2O5 fremkom 4,25 g (90,9% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 3d, der ifølge TLC i LMS var ensartet.

Analyse: 25 Beregnet for C^gj^gNgOgB^: C 37,00 H 4,83 N 14,38 Br 27,35.

Fundet: C 36,85 H 4,90 N 14,72 Br 26,95.

3e. BOC-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-DPA«HBr 2,92 g (5 mmol) af forbindelsen 3d blev omsat med 2,76 g (5,5 mmol) BOC-Lys(e-Cbo)-OpNP analogt med eksempel le. Det efter oparbejdning 30 fremkomne råprodukt blev opløst i 100 ml 50%'s AcOH og oprenset på en søjle af Sephadex® G-15. Den fraktion af AcOH-eluatet, der lod sig 15 DK 168574 B1 spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 5-amino-isophthalsyre-dimethylester, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40eC. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 60°C over P2O5 fremkom 3,64 g (84,1% af det teoretiske udbytte) af den amorfe 5 forbindelse 3e, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for C37H53N8°nBr: C 51,33 H 6,17 N 12,94 Br 9,23.

Fundet: C 51,05 H 6,25 N 13,26 Br 9,10.

Aminosyreanalyse viste de forventede aminosyrer i det rigtige 10 forhold:

Gly: 1,00 - Lys: 1,00 - Arg: 0,97.

3f. B0C-Lys( e -Cbo) - Gly - Ar g - DPA · AcOH

8,66 g (10 mmol) af forbindelsen 3e blev, analogt med eksempel lf, omdannet til det tilsvarende acetatsalt. Dette gav 8,24 g (97,5% af 15 det teoretiske udbytte) af dette produkt.

EKSEMPEL 4

BOC-Lys(e-Cbo) -Ala-Arg-2-NA*AcOH 4b. 2HBr«H-Arg-2-NA

9,40 g (20 mmol) kommercielt tilgængeligt Cbo-Arg-2-NA*HCl blev, 20 analogt med eksempel lb, deblokeret med en opløsning af 80 ml 2N HBr i iseddike. Det efter oparbejdning fremkomne produkt blev opløst i 150 ml MeOH og oprenset på en søjle af Sephadex® LH-20. Den fraktion af MeOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 2-naphthylamin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 25 30°C. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 40“C over P2O5 fremkom 8,60 g (93,2% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 4b, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

16 DK 168574 B1

Analyse:

Beregnet for G16H23N5OBr2: C 41,67 H 5,03 N 15,19 Br 34,65.

Fundet: C 42,08 H 5,12 N 14,68 Br 33,96.

4c. Cbo-Ala-Arg-2-NA»HBr 5 4,6 g (10 mmol) af forbindelsen 4b blev omsat med 3,80 g (11 mmol)

Cbo-Ala-OpNP analogt med eksempel lc. Det efter oparbejdning fremkomne råprodukt blev opløst i 150 ml 50%'s AcOH og oprenset på en søjle af Sephadex® G-15. Den fraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 2-naphthylamin, 10 blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40°G. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 60°C over P2O5 fremkom 4,95 g (84,5% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 4c, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse: 15 Beregnet for C27H33N604Br: C 55,39 H 5,68 N 14,35 Br 13,65.

Fundet: C 55,72 H 6,73 N 14,68 Br 13,42.

4d. 2HBr · H - Ala - Ar g - 2 - NA

4,68 g (8 mmol) af forbindelsen 4c blev deblokeret med 28 ml 2N HBr i iseddike analogt med eksempel ld. Det efter oparbejdning fremkomne 20 råprodukt blev opløst i 100 ml MeOH og oprenset på en søjle af

Sephadex® LH-20. Den fraktion af MeOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 2-naphthylamin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 30°C. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 40°C over P2G5 fremk°m 4,08 g (95,8% af det 25 teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 4d, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for ^91123^6¾1¾ ’ C 42,87 H 5,30 N 15,79 Br 30,02.

Fundet: C 43,9 H 5,32 N 16,02 Br 29,68.

17 DK 168574 B1 4e. B0C-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-2-NA»HBr 2,66 (5 nunol) af forbindelsen 4d blev analogt med eksempel le, omsat med 2,76 g (5,5 mmol) BOC-Lys(e-Cbo)-OpNP. Det efter oparbejdning fremkomne råprodukt blev opløst i 100 ml 50%'s AcOH og oprenset på en 5 søjle af Sephadex® G-15. Den første hovedfraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 2-naphthylamin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40° C og derefter tørret i vakuumtørreskab ved 60°C over P2O5. Dette gav 3,45 g (84,8% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 4e, der ifølge 10 TLC i LMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for ^gHggNgO^Br: C 56,08 H 6,56 N 13,77 Br 9,82.

Fundet: C 55,88 H 6,63 N 14,02 Br 9,80.

Aminosyreanalyse viste de forventede aminosyrer i det rigtige 15 forhold:

Ala: 1,00 - Lys: 1,02 - Arg: 0,97.

4f. BOC-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-2-NA*Ac0H

8,14 g (10 mmol) af forbindelsen 4e blev, analogt med eksempel lf, omdannet til det tilsvarende acetatsalt. Det gav 7,65 g (96,5% af 20 det teoretiske udbytte) af dette produkt.

EKSEMPEL 5 BOC-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-l-NA»Ac0H 5a. Cbo- Arg-1 -NA·HG1 3,45 g (10 mmol) grundigt tørret Cbo-Arg-OH*HC1 blev opløst i 100 ml 25 tør HMPTA under udelukkelse af fugtighed. Efter afkøling til -10°C blev der til opløsningen sat 1,39 ml (10 mmol) EtjN, hvorefter der i løbet af 15 minutter blev tildryppet en opløsning af 1,35 g (10 mmol) chlormyresyreisobutylester i 20 ml HMPTA, idet temperaturen 18 DK 168574 B1 blev holdt mellem -10°C og -5®C. Til den fremkomne opløsning blev der derefter dryppet en opløsning af 1,72 g (12 mmol) 1-naphthylamin i 15 ml HMPTA, idet den ovenfor nævnte temperatur blev holdt. Reaktions-blandingen blev inddampet til tørhed i vakuum ved 80°C. Remanensen 5 blev opløst i 100 ml MeOH og oprenset ved gelfiltrering på en søjle af Sephadex® LH-20. Den fraktion af eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 1-naphthylamin, viste sig ved TLC i IMS at være ensartet. Denne fraktion blev inddampet til tørhed. Dette gav 2,82 g af den amorfe forbindelse 5a (60,1% af det 10 teoretiske udbytte).

Analyse:

Beregnet for ^2^1128^5^3^1 C 61,33 H 6,01 N 14,90 Cl 7,54.

Fundet: C 61,07 H 6,10 N 15,05 Cl 7,38.

5b. 2HBr*H-Arg-l-NA

15 9,40 g (20 mmol) af forbindelsen 5a blev, analogt med eksempel lb, deblokeret med en opløsning af 80 ml 2N HBr i iseddike. Det efter oparbejdning fremkomne produkt blev opløst i 150 ml MeOH og oprenset på en søjle af Sephadex® LH-20. Den fraktion af MeOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 1-naphthyl-20 amin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 30°C. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 40°C over P2O5 fremkom 8,40 g (90,8% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 5b, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse: 25 Beregnet for 0^6Η23%0^Γ2 · C 41,67 H 5,03 N 15,19 Br 34,65.

Fundet: C 42,20 H 5,08 N 15,33 Br 34,10.

5c. Cbo-Ala-Arg-l-NA«HBr 4,6 g (10 mmol) af forbindelsen 5b blev, analogt med eksempel 1c, omsat med 3,80 g (11 mmol) Cbo-Ala-OpNP. Det efter oparbejdning 30 fremkomne råprodukt blev opløst i 150 ml 50%'s AcOH og oprenset på en søjle af Sephadex® G-15. Den fraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 1-naphthylamin, 19 DK 168574 B1 blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40°C. Efter tørring af remanensen i vakuumtørre skab ved 60° C over Ρ203 fremkom 4,80 g (82,1% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 5c, der ifølge TLG i LMS var ensartet.

5 Analyse:

Beregnet for c27H33N604Br: C 55,39 H 5,68 N 14,35 Br 13,65.

Fundet: G 55,62 H 6,70 N 14,63 Br 13,35.

5d. 2HBr*H-Ala-Arg-l-NA

4,68 g (8 ramol) af forbindelsen 5c blev, analogt med eksempel ld, 10 deblokeret med 28 ml 2N HBr i iseddike. Det efter oparbejdning fremkomne råprodukt blev opløst i 100 ml MeOH og oprenset på en søjle af Sephadex® LH-20. Den fraktion af MeOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 1-naphthylamin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 30°C. Efter tørring af remanensen i 15 vakuumtørreskab ved 40°C over P203 fremkom 3,85 g (90,3% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 5d, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for : C 42,87 H 5,30 N 15,79 Br 30,02.

20 Fundet: C 43,09 H 5,38 N 16,10 Br 29,80.

5e. BOC-Lys(€-Cbo)-Ala-Arg-l-NA*HBr 2,66 g (5 mmol) af forbindelsen 5d blev, analogt med eksempel le, omsat med 2,76 g (5,5 mmol) BOC-Lys(e-Cbo)-OpNP. Det efter oparbejdning fremkomne råprodukt blev opløst i 100 ml 50%'s AcOH og oprenset 25 på en søjle af Sephadex® G-15. Den første hovedfraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 1-naphthylamin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40° C og derefter tørret i vakuumtørreskab ved 60° C over P2O5· Dette gav 3,46 g (85% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 30 5e, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

20 DK 168574 B1

Analyse:

Beregnet for CggH^NgOyBr: C 56,08 H 6,56 N 13,77 Br 9,82.

Fundet: C 55,98 H 6,68 N 13,02 Br 9,80.

Aminosyreanalyse viste de forventede aminosyrer i det rigtige 5 forhold:

Ala: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,97.

5 f. BOC- Lys (e-Cbo)-Ala-Arg-l-NA·AcOH

8,14 g (10 mmol) af forbindelsen 5e blev, analogt med eksempel lf, omdannet til det tilsvarende acetats alt. Dette gav 7,77 g (98,0% af 10 det teoretiske udbytte) af dette produkt.

EKSEMPEL 6

BOC-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-4-Me0-2-NA*HBr 6b. 2HBr*H-Arg-4-Me0-2-NA

10,0 g (20 mmol) kommercielt tilgængeligt Cbo-Arg-4-MeO-2-NA«HCl 15 blev, analogt med eksempel lb, deblokeret med 80 ml 2N HBr i iseddike. Det efter oparbejdning fremkomne produkt blev opløst i 150 ml MeOH og oprenset på en søjle af Sephadex® LH-20. Den hovedfraktion af MeOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methoxy-2-naphthylamin, blev inddampet til tørhed i 20 vakuum ved 30°G. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 40°C over P2O5 fremkom 8,98 g (91,4% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 6b, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for C : C 41,57 H 5,13 N 14,26 Br 32,53.

25 Fundet: C 41,22 H 5,19 N 14,40 Br 32,01.

21 DK 168574 B1 6c. Cbo-Ala-Arg-4-MeO-2-NA»HBr 4,91 g (10 mmol) af forbindelsen 6b blev, analogt med eksempel lc, omsat med 3,80 g (11 mmol) Cbo-Ala-OpNP. Det efter oparbejdning fremkomne råprodukt blev opløst i 150 ml 50%'s AcOH og oprenset på en 5 søjle af Sephadex® G-15. Den første hovedfraktion af AcOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methoxy-2-naphthylamin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40eC.

Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 60°C over P2O5 fremkom 4,86 g (79,0% af det teoretiske udbytte) af den amorfe 10 forbindelse 6c, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for C2gH35N6°5Br: C 54,64 H 5,73 N 13,65 Br 12,98.

Fundet: C 54,38 H 5,81 N 13,93 Br 12,75.

6d. 2HBr*H-Ala-Arg-4-MeO-2-NA

15 4,31 g (7 mmol) af forbindelsen 6c blev, analogt med eksempel ld, deblokeret med 28 ml 2N HBr i iseddike. Det efter oparbejdning fremkomne råprodukt blev opløst i 100 ml MeOH og oprenset på en søjle af Sephadex® LH-20. Den hovedfraktion af MeOH-eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under dannelse af 4-methoxy- 2-20 naphthylamin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 30°C. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 40° C over P2O5 fremkom 3,74 g (95,0% af det teoretiske udbytte) af den amorfe forbindelse 6d, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse: 25 Beregnet for C20H30N6°3Br2: C 42,72 H 5,38 N 14,95 Br 28,42.

Fundet: C 43,01 H 5,44 N 15,25 Br 28,03.

6e. BOC-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-4-MeO-2-NA*HBr | 2,81 g (5 mmol) af forbindelsen 6d blev, analogt med eksempel le, omsat med 2,76 g (5,5 mmol) BOC-Lys(e-Cbo)-OpNP. Det efter oparbejd-30 ning fremkomne råprodukt blev opløst i 125 ml 50%'s AcOH og oprenset på en søjle af Sephadex® G-15. Den første hovedfraktion af AcOH- 22 DK 168574 B1 eluatet, der lod sig spalte ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methoxy-2-naphthylamin, blev inddampet til tørhed i vakuum ved 40°C. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 60°C over P2O5 fremkom 3,31 g (78,5% af det teoretiske udbytte) af 5 den amorfe forbindelse 6e, der ifølge TLC i IMS var ensartet.

Analyse:

Beregnet for σ39Η55Ν808ΒΓ: C 55,51 H 6,57 N 13,28 Br 9,47.

Fundet: C 55,05 H 6,63 N 13,40 Br 9,30.

6f. BOC-Lys(e-Cbo) -Ala-Arg-4-Me0-2-NA*Ac0H

10 8,44 g (10 mmol) af forbindelsen 6e blev, analogt med eksempel lf, omdannet til det tilsvarende acetatsalt. Dette gav 8,05 g (97,8% af det teoretiske udbytte) af dette produkt.

EKSEMPEL 7

Slutprodukt: H-Lys(e -Cbo)-Gly-Arg-pNA·2CF3COOH

15 C32H41^9°llFf>*

Udgangsmateriale: le (100 mmol), CF3COOH (115 ml) .

Metode, udbytte: Eks. Id, 94,6%.

Analyse:

Beregnet: C 45,66 H 4,91 N 14,98 F 13,54.

20 Fundet: C 45,48 H 5,01 N 15,12 F 13,35.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,02 - Arg: 0,98.

EKSEMPEL 8

Slutprodukt: Ac-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA*AcOH

25 C32H45N9°10· 23 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), AC2O (15 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 80,8%.

Analyse:

Beregnet: C 53,70 H 6,34 N 17,61.

5 Fundet: C 53,62 H 6,38 N 17,80.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,99.

EKSEMPEL 9

Slutprodukt: MeO. CO-Lys ( e -Cbo) -Gly-Arg-pNA«AcOH

10 C32H45N9°11'

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), MeO.CO.Cl (12 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 82,0%.

Analyse:

Beregnet: C 52,52 H 6,20 N 17,23.

15 Fundet: C 52,37 H 6,21 N 17,19.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,00 - Arg: 0,98.

EKSEMPEL 10

Slutprodukt: EtO. CO-Lys (e-Cbo) - Gly - Ar g - pNA · Ac OH

20 C33H47N9°11 ‘

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), EtO.CO.Cl (12 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 81,5%.

24 DK 168574 B1

Analyse:

Beregnet: C 53,15 H 6,35 N 16,90.

Fundet: C 53,00 H 6,42 N 17,14.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,88 - Arg: 1,01.

5 _ EKSEMPEL 11

Slutprodukt: isoBuO. CO-Lys ( e -Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH

G35H51N9°11·

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol) , isoBuO.CO.Cl (12 mmol) .

10 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 79,6%.

Analyse:

Beregnet: C 54,32 H 6,64 N 16,29.

Fundet: C 54,19 H 6,68 N 16,35.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 1,01.

15 EKSEMPEL 12

Slutprodukt: Propionyl-Lys ( e-Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH

C33h47N9°10·

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), propionylanhydrid (15 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 83,3%.

20 Analyse:

Beregnet: C 54,31 H 6,49 N 17,27.

Fundet: C 54,12 H 6,54 N 17,40.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,99.

Slutprodukt: Butyryl-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA*AcOH

C34H49N9°10· EKSEMPEL 13 25 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), butyrylchlorid (12 mmol).

5 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 86,1%.

Analyse:

Beregnet: C 54,90 H 6,64 N 16,95.

Fundet: C 54,81 H 6,67 N 17,17

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98.

10 _ EKSEMPEL 14

Slutprodukt: EtO*C0· CI^CO-Lys (e-Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH

C35h49N9°12‘

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), EtO.CO.Cl^CO'Cl (12 mmol).

15 Metode, udbytte: Eks. le og if, 76,4%.

Analyse:

Beregnet: C 53,36 H 6,27 N 16,00.

Fundet: C 53,48 H 6,25 N 16,16.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,00 - Arg: 1,02.

20

' Slutprodukt: Suc-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA· AcOH

C34H47N9°12· EKSEMPEL 15 26 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), succinylanhydrid (14 mmol).

5 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 73,4%.

Analyse:

Beregnet: C 52,77 H 6,12 N 16,29.

Fundet: C 52,59 H 6,18 N 16,33.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,99.

10 _ EKSEMPEL 16

Slutprodukt: Bz -Lys ( e -Cbo) -Gly-Arg-pNA· AcOH

G37H47N9°10·

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), benzoesyreanhydrid (15 mmol).

15 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 84,7%.

Analyse:

Beregnet: C 57,13 H 6,09 N 16,21.

Fundet: C 56,89 H 6,11 N 16,31.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,00 - Arg: 0,98.

20 _ EKSEMPEL 17

Slutprodukt: Tos -Lys ( e -Cbo) -Gly-Arg-pNA* AcOH

C37H49N9°iis· 27 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), tosylchlorid (12 mmol) .

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 85,2%.

Analyse:

Beregnet: C 53,68 H 5,97 N 15,23 S 3,87.

5 Fundet: C 53,58 H 6,00 N 15,38 S 3,75.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,97 - Arg: 1,01.

EKSEMPEL 18

Slutprodukt: Caproyl-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA·AcOH

10 C36H53N9°10·

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), caproyl-OpNP (11,5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 84,9%.

Analyse:

Beregnet: C 56,02 H 6,92 N 16,33.

15 Fundet: C 55,95 H 7,00 N 16,39.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,99 - Arg: 0,99.

EKSEMPEL 19 S lutprodukt: MeO - CO - 0¾ - CH2 - CO - Lys (e-Cbo)-Gly - Arg-

20 pNA*Ac0H

C35H49N9°12 *

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), Me0»C0*CH2*CH2*C0»Cl (12 mmol).

DK 168574 B1 28

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 83,8%.

Analyse:

Beregnet: C 53,36 H 6,27 N 16,00.

Fundet: C 53,19 H 6,29 N 16,15.

5 Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,98 - β-Ala: 0,95.

EKSEMPEL 20

Slutprodukt: BOC-Gly-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH

10 C37H54n10°12·

Udgangsmateriale: 7 (lOmmol), BOC-Gly-OpNP (11,5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 80,6%.

Analyse:

Beregnet: C 53,48 H 6,55 N 16,86.

15 Fundet: G 53,50 H 6,61 N 16,98.

Aminosyreanalyse: Gly: 2,00 - Lys: 0,99 - Arg: 0,98.

EKSEMPEL 21

Slutprodukt: H-Gly-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA* 2CF3COOH

2° G34H44N10°12F6‘

Udgangsmateriale: 20 (5 mmol), CF3COOH (10 ml).

Metode, udbytte: Eks. Id, 93,4%.

Analyse:

Beregnet: C 45,44 H 4,93 N 15,59 F 12,68.

Fundet: C 45,38 H 4,97 N 15,69 F 12,40.

29 DK 168574 B1

Aminosyreanalyse: Gly: 2,00 - Lys: 0,99 - Arg: 0,97.

5 _______ EKSEMPEL 22

S lutprodukt: MeO. CO - Gly - Lys (e - Cbo)-Gly-Arg- pNA· AcOH

C34h48n10°12'

Udgangsmateriale: 21 (2 mmol), MeO*CO»Cl (2,4mmol).

10 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 80,7%.

Analyse:

Beregnet: C 51,77 H 6,13 N 17,76.

Fundet: C 51,68 H 6,16 N 17,95.

Aminosyreanalyse: Gly: 2,00 - Lys: 1,00 - Arg: 0,97.

15 __________ EKSEMPEL 23

Slutprodukt: Bz-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH

C39H50N10°11*

Udgangsmateriale: 21 (2 mmol), benzoesyreanhydrid (3 mmol).

20 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 83,5%.

Analyse:

Beregnet: C 56,11 H 6,04 N 16,78.

Fundet: C 55,91 H 6,04 N 16,99.

DK 168574 Bl 30

Aminosyreanalyse: Gly: 2,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,98.

EKSEMPEL 24

Slutprodukt: Prop ionyl-Gly-Lys ( e-Cbo) -Gly-Arg-pNA· AcOH

5 C35h50n10°11·

Udgangsmateriale: 21 (2 mmol), propionylanhydrid (3 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 84,6%.

Analyse:

Beregnet: C 53,43 H 6,41 N 17,80.

10 Fundet: C 53,28 H 6,43 N 18,02.

Aminosyreanalyse: Gly: 2,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98.

EKSEMPEL 25

S lutprodukt: E tO. CO - Gly - Lys ( e-Cbo)-Gly-Arg- pNA · AcOH

15 C35H50N10°12'

Udgangsmateriale: 21 (2 mmol), Et0»C0«Cl (2,4 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 83,1%.

Analyse:

Beregnet: C 52,36 H 6,28 N 17,45.

20 Fundet: C 52,30 H 6,35 N 17,67.

Aminosyreanalyse: Gly: 2,00 - Lys: 0,99 - Arg: 0,98.

Slutprodukt: Cbo-Gly-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA*AcOH

C40h52n10°12 * EKSEMPEL 26 31 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), Cbo-Gly-OpNP (11,5 mmol).

5 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 80,9%.

Analyse:

Beregnet: C 55,55 H 6,06 N 16,20.

Fundet: C 55,25 H 6,10 N 16,28.

Aminosyreanalyse: Gly: 2,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,99.

10 _ EKSEMPEL 27

Slutprodukt: BOC-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-pNA·AcOH

C36h53N9°11·

Udgangsmateriale: 2HBr*H-Ala-Arg-pNA (10 mmol), 15 BOC-Lys(e-Cbo-OpNP (11,5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 84,3%.

Analyse:

Beregnet: C 54,88 H 6,78 N 16,00.

Fundet: C 54,66 H 6,82 N 16,20.

20 Aminosyreanalyse: Ala: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 1,02.

EKSEMPEL 28

Slutprodukt: H-Lys(e-Cbo) -Ala-Arg~pNA»2CF3COOH

C33h43N9°11F6' 32 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 27 (10 mmol), CF3COOH (15 ml).

5 Metode, udbytte: Eks. Id, 93,7%.

Analyse:

Beregnet: C 46,32 H 5,06 N 14,73 F 13,32.

Fundet: C 46,20 H 5,11 N 14,96 F 13,15.

Aminosyreanalyse: Ala: 1,00 - Lys: 0,99 - Arg: 1,01.

10 _ EKSEMPEL 29

Slutprodukt: Ac-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-pNA·AcOH

C33H47N9°10'

Udgangsmateriale: 28 (2 mmol) , AC2O (3 mmol) .

15 Metode, udbytte: Eks. le og If, 88,4%.

Analyse:

Beregnet: C 54,31 H 6,49 N 17,27.

Fundet: C 54,08 H 6,56 N 17,37.

Aminosyreanalyse: Ala: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 1,00.

20 _ EKSEMPEL 30

Slutprodukt: MeO.CO-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-pNA· AcOH

C33h47N9°ii· 33 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 28 (2 mmol), MeO»CO»Cl (2,4 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 86,0%.

Analyse:

Beregnet: C 53,15 H 6,35 N 16,90.

5 Fundet: C 52,96 H 6,34 N 17,08.

Aminosyreanalyse: Ala: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,99.

EKSEMPEL 31

Slutprodukt: Bz-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-pNA»AcOH

10 C38H49N9°10‘

Udgangsmateriale: 28 (2 mmol), benzoesyreanhydrid (3 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 85,8%.

Analyse:

Beregnet: C 57,64 H 6,24 N 15,92.

15 Fundet: C 57,50 H 6,25 N 16,03.

Aminosyreanalyse: Ala: 1,00 - Lys: 0,99 - Arg: 0,98.

EKSEMPEL 32

Slutprodukt: CH3»S02-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-pNA»AcOH

20 C32h47N901:LS.

Udgangsmateriale: 28 (2 mmol), CH3»S02*C1 (2,4 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 90,2%.

Analyse:

Beregnet: C 50,19 H 6,19 N 16,46 S 4,19.

Fundet: C 49,96 H 6,25 N 16,60 S 4,05.

34 DK 168574 B1

Aminosyreanalyse: Ala: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,98.

5 _ EKSEMPEL 33

Slutprodukt: BOC-jS-Ala-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA· AcOH

G38H56N10°12·

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), BOC-/3-Ala-OpNP (11,5 mmol).

10 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 84,9%.

Analyse:

Beregnet: C 54,02 H 6,68 N 16,58.

Fundet: C 53,85 H 6,73 N 16,66.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,99 - Arg: 1,01 - /J-Ala: 15 0,97.

EKSEMPEL 34

Slutprodukt: H-/3-Ala-Lys (e -Cbo) -Gly-Arg-pNA*2CF3COOH.

C35H46N10°12F6‘ 20 Udgangsmateriale: 33 (5 mmol), CF3COOH (10 ml).

Metode, udbytte: Eks. Id, 96,%1.

Analyse:

Beregnet: C 46,05 H 5,08 N 15,35 F 12,49.

Fundet: C 45,84 H 5,12 N 15,50 F 12,45.

DK 168574 Bl 35

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 1,00 - /?-Ala: 5 0,96.

EKSEMPEL 35

Slutprodukt: Ac-/?-Ala-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH

C35H50N10°11' 10 Udgangsmateriale: 34 (2 mmol), AC2O (3 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 83,6%.

Analyse:

Beregnet: C 53,43 H 6,41 N 17,80.

Fundet: C 53,40 H 6,48 N 17,75.

15 Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98 - /3-Ala: 0,96.

EKSEMPEL 36

S lutprodukt: MeO ·CO-£-Ala- Lys (e - Cbo) - Gly - Arg - pNA· AcOH

2° C35H50»10°12·

Udgangsmateriale: 34 (2 mmol), Me0*C0*Cl (2,4 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 85,0%.

Analyse:

Beregnet: C 52,36 H 6,28 N 17,45.

Fundet: C 52,46 H 6,29 N 17,58.

36 DK 168574 B1

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,99 - Arg: 0,98 - fi-Ala: 5 0,97.

EKSEMPEL 37

Slutprodukt: Propionyl-/3-Ala-Lys (e-Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH

C36H52HioOii· 10 Udgangsmateriale: 34 (2 mmol), propionylanhydrid (3 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 86,2%.

Analyse:

Beregnet: C 53,99 H 6,54 N 17,49.

Fundet: C 54,00 H 6,63 N 17,55.

15 Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,99 - β-Ala: 0,98.- EKSEMPEL 38

Slutprodukt: EtO· C0-j9-Ala-Lys (e -Cbo) -Gly-Arg-pNA· AcOH

20 C36H52N10°12·

Udgangsmateriale: 34 (2 mmol), EtO·CO*Cl (2,4 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 84,5%.

37 DK 168574 B1

Analyse:

Beregnet: C 52,93 H 6,42 N 17,15.

Fundet: C 52,86 H 6,41 N 17,19.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98 - j8-Ala: 5 0,96.

EKSEMPEL 39

Slutprodukt: Bz -/3-Ala-Lys ( e-Cbo) -Gly-Arg-pNA· AcOH

G40H52N10°11' 10 Udgangsmateriale: 34 (2 mraol), benzoesyreanhydrid (3 rrnnol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 86,0%.

Analyse:

Beregnet: C 56,59 H 6,17 N 16,50.

Fundet: C 56,30 H 6,15 N 16,65.

15 Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,00 - Arg: 0,98 - Ø-Ala: 0,95.

EKSEMPEL 40

Slutprodukt: BOC-Phe-Lys(é-Cbo)-Gly-Arg-pNA* AcOH

2° C44H60N10°12'

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), BOC-Phe-OpNP (11,5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 79,8%.

Analyse:

Beregnet: C 57,38 Η 6,57 N 15,21.

Fundet: C 57,10 H 6,66 N 15,34.

OK 168574 B1 38

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,98 - Phe: 1,02.

5 __ EKSEMPEL 41

Slutprodukt: H-Phe-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA*2CF3COOH

C41h50nio°12F6'

Udgangsmateriale: 40 (5 mmol), CF3COOH (10 ml).

10 Metode, udbytte: Eks. Id, 94,7%.

Analyse:

Beregnet: C 49,80 H 5,10 N 14,16 F 11,53.

Fundet: C 49,71 H 5,12 N 14,24 F 11,44

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,99 - Arg: 1,01 - Phe: 0,99.

15 ___ EKSEMPEL 42

Slutprodukt: BOC-D-Phe-Lys ( e-Cbo) -Gly-Arg-pNA· AcOH

G44h60n10°12 ’

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), BOC-Phe-OpNP (11,5 mmol).

20 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 82,9%.

Analyse:

Beregnet: C 57,38 H 6,57 N 15,21.

Fundet: C 57,18 H 6,60 N 15,38.

39 DK 168574 B1

Aminosyreanalyse: G ly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98 - D-Phe: 1,01.

EKSEMPEL 43

5 Slutprodukt: H-D-Phe-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA*2CF3COOH

C41H50N10°12F6’

Udgangsmateriale: 42 (5 nunol), CF3COOH (10 ml).

Metode, udbytte: Eks, ld, 94,5%.

Analyse: 10 Beregnet: C 49,80 H 5,10 N 14,16 F 11,53.

Fundet: G 49,66 H 5,11 N 14,32 F 11,39.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,99 - Arg: 0,98 - D-Phe: 1,02.

15 EKSEMPEL 44

Slutprodukt: BOC-CHA-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH

C44H66N10°12 ·

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), B0C-CHA-0pNP (11,5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 82,6%.

20 Analyse:

Beregnet: C 57,00 H 7,18 N 15,11.

Fundet: C 56,82 H 7,23 N 15,25.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 1,00 - CHA: 0,96.

EKSEMPEL 45

Slutprodukt: H-CHA-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA· 2CF3COOH

C41h56N10°12F6‘ 40 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 44 (5 mmol) , CF3COOH (10 ml).

5 Metode, udbytte: Eks. Id, 93,1%.

Analyse:

Beregnet: C 49,49 H 5,67 N 14,08 F 11,46.

Fundet: C 49,28 H 5,66 N 14,14 F 11,25.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98 - CHA: 0,95.

10 _ EKSEMPEL 46

Slutprodukt: B0C-7-But-Lys(e-Cbo) - Gly - Ar g - pNA · AcOH

C39H58N10°12·

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), B0C-7-But-0pNP (11,5 mmol).

15 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 81,7%.

Analyse:

Beregnet: C 54,53 H 6,81 N 16,31.

Fundet: C 54,54 H 6,91 N 16,40.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,02 - Arg: 0,98 - γ-But: 20 0,94.

Slutprodukt: H-7-But-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA»2CF3COOH

C36h48n10°12F6· EKSEMPEL 47 41 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 46 (5 nunol), CF3COOH (10 ml).

5 Metode, udbytte: Eks. Id, 92,9%.

Analyse:

Beregnet: C 46,65 H 5,22 N 15,11 F 12,30.

Fundet: C 46,39 H 5,27 N 15,10 F 12,16.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,99 - Arg: 1,01 - 7-But: 10 0,95.

EKSEMPEL 48

Slutprodukt: BOC-Ph' Gly-Lys (e -Cbo) -Gly-Arg-pNA· AcOH

G43h58N10°12· 15 Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), BOC-Ph'Gly-OpNP (11,5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 79,8%.

Analyse:

Beregnet: C 56,94 H 6,45 N 15,44.

Fundet: C 56,80 H 6,48 N 15,62.

20 Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98 - Ph'Gly: 1,02.

Slutprodukt: H-Ph' Gly-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA· 2CF3COOH

C40h48n10°12F6· EKSEMPEL 49 42 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 48 (5 mmol) , CF3COOH (10 ml).

5 Metode, udbytte: Eks. id, 92,9%.

Analyse:

Beregnet: C 49,28 H 4,96 N 14,37 F 11,69.

Fundet: C 48,96 H 5,01 N 14,40 F 11,55.

Amino syreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98 - Ph'Gly: 10 0,99.

EKSEMPEL 50

Slutprodukt: BOC-CHG-Lys ( ε -Cbo) -Gly-Arg-pNA· AcOH

C43h64n10°12‘ 15 Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), BOC-CHG-OpNP (11,5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 83,4%.

Analyse:

Beregnet: C 56,56 H 7,07 N 15,34.

Fundet: C 56,29 H 7,15 N 15,49.

20 Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,02 - Arg: 1,00 - CHG: 0,97.

Slutprodukt: H-CHG-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA*2CF3COOH

G40h54n10°12F6 ' EKSEMPEL 51 43 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 50 (5 mmol), CF3COOH (10 ml).

5 Metode, udbytte: Eks. Id, 96,0%.

Analyse:

Beregnet: C 48,98 H 5,55 N 14,28 F 11,62.

Fundet: C 48,86 H 5,60 N 14,21 F 11,60.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,00 - Arg: 0,98 - CHG: 0,96.

10 _ EKSEMPEL 52

Slutprodukt: BOC-D-CHG-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA·AcOH

C43h64n10°12*

Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), BOC-D-CHG-OpNP (11,5 mmol).

15 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 81,5%.

Analyse:

Beregnet: C 56,56 H 7,07 N 15,34.

Fundet: C 56,40 H 7,06 N 15,50.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,97 - D-CHG: 20 0,94.

Slutprodukt: H-D-CHG-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA* 2CF3COOH

C40h54n10°12F6’ EKSEMPEL 53 44 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 52 (5 mmol), CF3COOH (10 ml).

5 Metode, udbytte: Eks. Id, 93,7%.

Analyse:

Beregnet: C 48,98 H 5,55 N 14,28 F 11,62

Fundet: C 49,11 H 5,63 N 14,38 F 11,48.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98 - D-CHG: 10 0,95.

EKSEMPEL 54

Slutprodukt: BOC-CHT-Lys (e -Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH

G44H66N10°13* 15 Udgangsmateriale: 7 (10 mmol), BOC-CHT-OpNP (11,5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 83,1%.

Analyse:

Beregnet: C 56,04 H 7,05 N 14,85.

Fundet: C 55,79 H 7,11 N 15,09.

20 Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 1,00 - CHT: 0,96.

Slutprodukt: H-CHT-Lys (e-Cbo) -Gly-Arg-pNA· 2CF3COOH

G41H56n10°13F^‘ DK 168574 B1 EKSEMPEL 55 45

Udgangsmateriale: 54 (5 mmol), CF3COOH (10 ml).

5 Metode, udbytte: Eks. Id, 93,6%.

Analyse:

Beregnet: C 48,71 H 5,58 N 13,86 F 11,28.

Fundet: C 48,68 H 5,63 N 14,04 F 11,10.

Aminosyreanalyse: G ly: 1,00 - Lys: 1,00 - Arg: 0,97 - CHT: 0,97.

10 _ EKSEMPEL 56

Slutprodukt: B0C-Lys(e-4-Me0*Cbo) -Gly-Arg-pNA»AcOH

C36h53N9°12*

Udgangsmateriale: ld (10 mmol), B0C-Lys(e-4-Me0*Cbo)-OpNP

15 (11,5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 76,8%.

Analyse:

Beregnet: C 53,79 H 6,65 N 15,68.

Fundet: C 53,58 H 6,67 N 15,70.

20 Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,99.

Slutprodukt: BOC-Lys(e-4-Me·Cbo)-Gly-Arg-pNA·AcOH

C36%3K9°11· EKSEMPEL 57 46 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: ld (10 mmol), BOC-Lys(e-4-Me.Cbo)-OpNP (11,5 5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og If, 79,5%.

Analyse:

Beregnet: C 54,88 H 6,78 N 16,00.

Fundet: C 54,54 H 6,83 N 16,18.

10 Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,99 - Arg: 0,98.

EKSEMPEL 58

Slutprodukt: BOC-Lys(e-4-Cl·Cbo)-Gly-Arg-pNA·AcOH

C35H50N9°11C3"

15 Udgangsmateriale: Id (10 mmol), B0C-Lys(e-4-Cl»Gbo)-OpNP

(11,5 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 84,9%.

Analyse:

Beregnet: C 52,01 H 6,24 N 15,60 Cl 4,39.

20 Fundet: C 51,83 H 6,25 N 15,76 Cl 4,28.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,00 - Arg: 1,02.

EKSEMPEL 59

Slutprodukt: H-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-MCA-2CF3COOH

C36H44N8°11F6· 47 DK 168574 B1

Udgangsmateriale: 2e (5 mmol), CF3COOH (10 ml).

5 Metode, udbytte: Eks. Id, 68,5%.

Analyse:

Beregnet: C 49,20 H 5,05 N 12,75 F 12,97.

Fundet: G 49,11 H 5,10 N 13,01 F 12,80.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98.

10 _ EKSEMPEL 60

Slutprodukt: MeO* CO-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-MCA* AcOH

C36H48N8°11·

Udgangsmateriale: 59 (2 mmol), MeOCO*Cl (2,4 mmol).

15 Metode, udbytte: Eks. le og lf, 84,0%.

Analyse:

Beregnet: C 56,24 H 6,29 N 14,58.

Fundet: C 56,05 H 6,33 N 14,69.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,99.

20 _ EKSEMPEL 61

Slutprodukt: H-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-DPA*2CF3COOH

C36%6NS°13F6· DK 168574 Bl 48

Udgangsmateriale: 3e (5 mmol), CF3COOH (10 ml).

Metode, udbytte: Eks. Id, 90,6%.

Analyse:

Beregnet: C 47,37 H 5,08 N 12,28 F 12,49.

5 Fundet: G 47,49 H 5,15 N 12,36 F 12,40.

Amino syreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,98.

EKSEMPEL 62

Slutprodukt: Propionyl-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-DPA*AcOH

10 C37H52N8°12'

Udgangsmateriale: 61 (2 mmol), propionylanhydrid (3 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 84,3%.

Analyse:

Beregnet: C 55,49 H 6,54 N 13,99.

15 Fundet: C 55,22 H 6,58 N 14,18.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,97.

EKSEMPEL 63

Slutprodukt: Et0»C0-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-DPA*AcOH

2° C37h52N8°13·

Udgangsmateriale: 61 (2 mmol), EtO*CO»Cl (2,4 mmol).

Metode, udbytte: Eks. le og lf, 84,8%.

49 DK 168574 B1

Analyse:

Beregnet: C 54,40 H 6,42 N 13,72.

Pundet: C 54,20 H 6,51 N 13,96.

Aminosyreanalyse: Gly: 1,00 - Lys: 1,01 - Arg: 0,99.

5 _

Nedenstående tabel indeholder data, der angår spalteligheden med C^-esterase for peptidderivateme ifølge opfindelsen. De angivne værdier blev bestemt på følgende måde: Til en blanding af 1,8 ml trisimida-zolpuffer og 0,015 ml af en opløsning, der indeholdt 800 tosyltyrosi-10 nethylester-enheder (TTEE) C^-esterase pr. ml, blev der ved 37eC sat 0,2 ml af en 2 x 10molær peptidderivatopløsning. Derefter måltes ved 405 nm forøgelsen af den optiske tæthed Δ OD, der blev forårsaget af det ved spaltningen af peptidderivatet opståede spaltningsprodukt (fx p-nitroanilin eller 4-methoxy-2-naphthylamin eller 4-methyl-7-15 aminocumarin) inden for et tidsrum på 5 minutter. X tilfælde af fluorescerende spaltningsprodukter (fx 1- eller 2-naphthylamin eller l,3-di(methoxycarbonyl)-5-aminobenzen) blev forøgelsen af den optiske tæthed målt ved den tilsvarende emissionsbølgelængde. Ud fra gennemsnitsværdierne af forøgelsen af den optiske tæthed pr. tidsenhed 20 beregnes, ud fra den molære ekstinktionskoefficient, den pr. tidsenhed dannede mængde af spaltningsproduktet målt i nanomol.

50 DK 168574 B1

TABEL

Forbindelse Spaltelighed Forbindelse Spaltelighed 5 1 2,97 2 2,50 3 2,60 4 2,33 5 2,50 6 2,27 7 2,97 8 5,27 9 7,27 10 6,47 10 11 5,87 12 5,60 13 4,93 14 4,13 15 2,57 16 2,67 17 1,00 18 3,67 19 4,13 20 9,50 15 21 5,90 22 8,00 23 9,87 24 7,63 25 6,50 26 2,10 27 2,93 28 2,83 29 3,57 30 4,63 20 31 2,67 32 1,87 33 3,67 34 4,00 35 4,60 36 5,80 37 5,13 38 6,40 39 9,53 40 1,00 25 41 10,50 42 0,67 43 4,90 44 0,67 45 3,30 46 3,17 47 4,50 48 1,00 49 7,27 50 0,83 30 51 3,70 52 0,67 53 1,00 54 0,50 55 3,30 56 3,10 57 3,17 58 2,83 59 2,33 60 5,83 35 61 2,67 62 5,00 63 5,67

Claims

51 DK 168574 B1 Spalteligheden er udtrykt i nanomol af det spaltningsprodukt, der dannes pr. minut ved hjælp af én TTEE Cj[-esterase. Til sammenligning med de ovenstående resultater udviser de fra DE-3202289-A1 kendte peptider Z-L-(Me)Val-L-Leu-L-Arg-pNA og 5 Z-L-Igln-Gly-L-Arg-pNA, omregnet til nanomol af spaltningsproduktet dannet pr. minut, spalteligheder på henholdsvis 0,26 og 0,17, og det fremgår således klart, at peptidderivaterne ifølge opfindelsen har en overraskende højere spaltelighed end de kendte peptidderivater. Bestemmelsen af C^-esteraseinhibitorniveauet i blodplasma kan udføres 10 på følgende måde: En blanding af 1,6 ml trisimidazolpuffer med en pH-værdi på 7,4 og ionstyrke 0,2 samt 0,1 ml citratplasma inkuberes med 0,1 ml renset C^-esterase ved 37°C i 4 minutter. Til inkubatet sættes 0. 2 ml af en 2 x 10molær vandig opløsning af et substrat ifølge opfindelsen. Hvis substratet som chromogen gruppe (rA) bærer en p- 15 nitroanilingruppe, måles den mængde af spaltningsproduktet p-nitro-anilin (rA-H) , der dannes pr. minut, spektrofotometrisk ved 405 nm. I et testsystem, der ikke indeholder noget plasma, men ellers er sammensat på samme måde, måles den mængde af spaltningsproduktet p-nitroanilin, der dannes pr. minut, som beskrevet ovenfor. Ud fra 20 forskellen mellem de to måleværdier beregnes Cj^-esteraseinhibitor-niveauet i blodplasmaet.
1. Peptidderivater med den almene formel R2 - Y - NH - CH - CO - X - Arg - R1 I 25 (CH2)4 NH - CO - 0 - R3 hvor R·*· betegner en p-nitrophenylamino-, 1- eller 2-naphthylamino-, 4-methoxy-2-naphthylamino-, 4-methyl-7-cumarylamino- eller 30 1,3-di(methoxycarbonyl)- 5-phenylaminogruppe, R2 betegner hydrogen eller 52 DK 168574 B1 a) en ligekædet eller forgrenet alkanoylgruppe med 2-6 carbonato-mer, b) en cyclohexylcarbonylgruppe, c) en ω-carboxyl-, ω-methoxycarbonyl- eller ω-ethoxycarbonyl- 5 alkanoylgruppe med 2-4 carbonatomer i alkanoyIdelen, d) en ligekædet eller forgrenet alkoxycarbonylgruppe med 1-4 carbonatomer i alkoxydelen, e) en alkylsulfonylgruppe med 1-2 carbonatomer i alkyldelen, eller en phenyl- eller p-toluylsulfonylgruppe, 10 f) en benzoylgruppe, eller g) en benzyloxycarbonylgruppe, R1 betegner benzyl, 4-methylbenzyl, 4-methoxybenzyl eller 2-, 3- eller 4-chlorbenzyl, X betegner en glycyl- eller alanylgruppe, og 15 Y betegner en enkeltbinding eller en gruppe med den almene formel - NH - (CH2)m - CH - GO -R2 hvor rA betegner en benzyl-, phenyl-, cyclohexyl-, cyclohexylmethyl-, 20 4-hydroxybenzyl- eller 4-hydroxycyclohexylmethylgruppe, og m betegner 0, og den ved Y definerede aminosyre har L- eller D-konfiguration, eller R^ betegner hydrogen, og m betegner 0, 1 eller 2, og salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer.
2. Peptidderivater ifølge krav 1, 25 kendetegnet ved, at R^ er en alkanoylgruppe med 2-6 carbonatomer eller en alkoxycarbonylgruppe med 1-4 carbonatomer i alkoxydelen, Y er en enkeltbinding, og R1 er en benzylgruppe, og R1 og X har de i krav 1 og 2 definerede betydninger. Peptidderivater ifølge krav 1 eller 2, 30 kendetegnet ved, at de er BOC-Lys (e -Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH, 2Ac0H*H-Lys ( e-Cbo) -Gly-Arg-pNA, Ac-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH, 2 CH30C0-Lys ( e -Cbo) -Gly-Arg-pNA*AcOH,
35 C2H50C0-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA*Ac0H, 53 DK 168574 B1 iso-ButOCO-Lys ( e -Cbo) - Gly - Ar g - pNA · AcOH, CH3CH2CO-Lys ( e-Cbo)-Gly-Arg-pNA· AcOH, CH3(CH2)2CQ-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA· AcOH, CH3 CH2 OCO - CH2 - CO - Ly s ( e - Cb o) - Gly - Ar g - pNA · AcOH,
5 BOC- Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-pNA·AcOH, H-Lys(e-Cbo)-Ala-Arg-pNA»2CF3COOH, Ac-Lys(c-Cbo)-Ala-Arg-pNA·AcOH, CH3OCO-Lys (c -Cbo) -Ala-Arg-pNA·AcOH, BOC-Gly-Lys (e -Cbo) -Gly-Arg-pNA· AcOH, 10 2CF3COOH*H-Gly-Lys(e-Cbo) -Gly-Arg-pNA, CH30-C0-Gly-Lys(e-Cbo)-Gly-Arg-pNA*AcOH og CH3 - CH2 - CO - Gly - Lys ( e - Cbo ) - Gly - Arg - pNA · AcOH.
4. Anvendelse af peptidderivater ifølge krav 1 til kvantitativ bestemmelse af enzymet C^-esterase i et medium, der indeholder det 15 nævnte enzym, hvor mængden af det ved den katalytiske hydrolytiske virkning af enzymet på peptidderivatet pr. tidsenhed frigjorte spaltningsprodukt rA-H (hvor rA har samme betydning som i krav 1) måles ved fotometriske, spektrofotometriske, fluorescensspektrofoto-metriske eller elektrokemiske metoder.