DE2343034C2

DE2343034C2 - Tetrapeptide mit phagocytose-stimulierender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Info

Publication number: DE2343034C2
Application number: DE19732343034
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. 6238 Hofheim König; Fritz R. Dr. 3550 Marburg Seiler
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1973-08-25
Filing date: 1973-08-25
Publication date: 1984-08-23
Also published as: DE2343034A1

Description

H-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH

X²-L-Lysyl-L-prolyl-L-arginin

(IB)

in der X² die in Anspruch 1 für X¹ angegebenen Bedeutungen hat sowie L-Seryl und L-Threonyl bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

a) das Tripeptid der Formel II

H-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH

(H)

mit einer Aminosäure der allgemeinen Formel X2_OH, deren Aminogruppe durch eine Benzyloxycarbonyl- oder tert-Butyloxycarbonyl-Gruppe blockiert ist, oder mit einem aktivierten Ester dieser Aminosäuren umsetzt,

b) sofern mit einer N-Benzyloxycarbonyl-Verbindung umgesetzt wurde, diese Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung abspaltet,

c) das tert.-Butyloxycarbonyl-geschützte Tetrapeptid mittels Verteilungschromatographie reinigt und

d) die tert.-Butyloxycarbonyl-Gruppe sauer abspaltet.

4. Verwendung der Tetrapeptide gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Stimulierung der Phagocytose.

Therapeutisch verwendbare Tetrapeptide mit der Aminosäuresequenz Lys-Pro-Arg sind aus der DE-OS 24 003 bekannt.

Die Erfindung betrifft Tetrapeptide der allgemeinen Formel 1-A

X'-L-Lysyl-L-prolyl-L-arginin

(IA)

in der X¹ D-Seryl, L-Pyroglutamyl oder D-Pyroglutamyl bedeutet.

Ein bevorzugtes Tetrapeptid ist L-Pyroglutamy!-L-Iysyl-L-prolyl-L-arginin.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Tetrapeptide der allgemeinen Formel I-B

X-'-L-Lysyl-L-prolyl-L-arginin

(I-B)

in der X² die oben für X¹ angegebenen Bedeutungen hai sowie L-Seryl und L-Threonyl bedeutet, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man jeweils in an sich bekannter Weise

mit einer Aminosäure der allgemeinen Formel X²—OH, deren' Aminogruppe durch eine Bcnzyloxycarbonyl- oder tert. -Butyloxycarbonyl-Gruppe blockiert ist, oder mit einem aktivierten Ester dieser Aminosäuren umsetzt,

ίο b) sofern mit einer N-Benzyloxycarbonyl-Verbindung umgesetzt wurde, diese Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung abspaltet,

c) das tert-Butyloxycarbonyl-geschützte Tetrapeptid mittels Verteilungschromatographie reinigt und

d) die tert-Butyloxycarbonyl-Gruppe sauer abspaltet.

Aus Biochem.Biophys.Acta 310, 1973, 230-237 ist ein Verfahren zur Herstellung von Tuftsin (H-Thr-Lys-Pro-Arg-OH) mit Hilfe der Merrifield-Festkörpermethode bekannt.

Das Tetrapeptid wird durch seinen Rf-Wert und sein elektrophoretisches Verhalten charakterisiert; darüber hinaus werden keine Angaben zur Reinheit bzw. Charakterisierung gemacht

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichbaren Ausbeuten liegen deutlich über denen der o. g. Festkörpermethode. Durch einen, im Vergleich zur Festkörpermethode geringeren Lösemittelverbrauch und der leichteren Zugänglichkeit der verwendeten Aminosäurederivate ist das erfindungsgemäße Verfahren zudem vorteilhafter.

Das erfindungsgamäße Verfahren kann jederzeit ohne besondere Schwierigkeiten in großem Maßstab durchgeführt werden, was bei der automatisierten Festkörpermethode nicht ohne weiteres der Fall ist. Da die Eigenschaften der bei der Festkörpermethode verwendeten Träger von Charge zu Charge sehr schwanken, müssen gewöhnlich für jedes neue Trägerharz neue Synthesebedingungen ausgearbeitet werden. Die Reinigung des nach der Festkörpermethode synthetisierten Tetrapeptids wird durch Gradientenelution an dem Ionenaustauscher Aminex®AG 50 W-X4 mit Hilfe eines Pyridinacetatpuffers zwischen pH 4 und 6 bei 6O⁰C durchgeführt.

« Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kommt man dagegen zu reinen Tetrapeptiden der allgemeinen Formel 1-B, wenn man die Boc-geschützten Tetrapeptide nach einer Vorreinigung an einem schwach basischen Ionenaustauscher, an Sephadex LH 20®, einem quervernetzten, alkylierten Dextran, mittels einer einfachen Verteilungschromatographie in dem System Eisessig/ Butanol/Wasser gut reinigt und erst anschließend die vorhandenen Boc-Gruppen in HCl/Eisessig abspaltet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insofern äußerst überraschend, da nicht, wie sonst üblich, nach Abspaltung der Schutzgruppen das Peptid gereinigt wird, sondern daß die intensive Reinigung auf der Stufe des geschützten Peptids vorgenommen wird und die Abspaltung der Schutzgruppen ohne Nebenreaktionen verläuft.

Zur Bereitung der Trennsäule mischt man 100 bis 200 ml, vorzugsweise 200 ml Eisessig mit 2 Liter Wasser und schüttelt mit 300 bis 500 mi, vorzugsweise mit 400 ml n-Butanol durch. Nimmt man mehr Eisessig, so b^r, muß auch mehr n-Bulanol verwendet werden. Bei einer Mischung aus 300 ml Eisessig und 2 Liter Wasser muß mit mindestens 500 ml n-Butanol geschüttelt werden. Dabei entstehen 2 Schichten.

3 4

Ca. 150 ml der oberen Phase werden mit 120 g Sepha- gung durch Verteilungschromatographie die Boc-Grupdex LH 20®, einem quervernetzten, alkylierten Dextran, pe mit HCI in Eisessig abgespalten. Das erhaltene Tetraverrührt Anschließend suspendiert man das so vorbe- peptid liegt als Trihydrochlorid vor und ist chromatohandelte Sephadex LH 20® in der unteren Phase, läßt graphisch rein. Bei Verwendung von Boc-Serinderivaeinige Stunden quellen und füllt die Säule. Gelöst in 5 ten entsteht als Zwischenprodukt Boc-Ser-Unterphase wird die Rohsubstanz der Boc-geschützten Lys(Boc) Pro-Arg-OH, das durch Verteilungschromato-Tetrapeptide auf die Säule gegeben und mit der unteren graphie gereinigt wird. Die beiden Boc-Gruppen wer-Phase eluiert Das Eluat wird am besten mit einem Frak- den anschließend in HCl/Eisessig abgespalten,
tionssammler aufgefangen. Die Fraktionen, die die ge- Bei der Herstellung von Glu-Lys-Pro-Arg-OH wird wünschte Substanz enthalten, werden eingeengt und in 10 als Zwischenprodukt
HCl/Eisessig von den Aminoschutzgruppen befreit ■—|

Die so hergestellten Tetrapeptide der allgemeinen "-GIu-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH
Formel I-B sind chromatographisch einheitlich, liegen

als Hydrochloride vor und sind biologisch hoch wirk- mittels genannter Verteilungschromatographie gerei-

sam. 15 nigt Die Boc-Gruppe wird anschließend wieder in HCl/

Die als Ausgangsstoff verwendete Verbindung der Eisessig abgespalten.

Formel II kann aus bekannten Ausgangsprodukten ent- Als geeignete Lösungsmittel für die Verknüpfung von

sprechend den allgemeinen Methoden der Peptidcne- H-Lys(Boc)-Pro-Arg-OK mit den entsprechenden

mie hergestellt werden. Ein günstiger Weg ist folgender: Threonin-, Serin- und Pyroglutaminsäurederivaten

20 kommen vor allem Dimethylformamid, Dimethylaceta-

Z-Lys(Boc)-OH und H-Pro-OMe · HCI werden unter mid, Dimethylsulfoxid und Mischungen dieser Lösungs-Zusatz von 1 -Hydroxybenzotriazol und N-Äthylmorp- mittel in Frage. Als Katalysatoren für die Aktivester der holin mit Dicyclohexylcarbodiimid zu Z-Lys(Boc)-Pro- Pyroglutaminsäure sind besonders 1-Hydroxybenzot-OMe umgesetzt Durch Verseifung erhält man daraus riazol, 1-Hyd;oxy-pyridon-2 und 3-Hydroxy-4-oxo-Z-Lys(Boc)-Pro-OH, das wiederum mit H-Arg- 25 3.4-dihydrochinazolin zu empfehlen.
OMe · 2 HCl unter Zusatz von 1-Hydroxy bentriazol, Die Peptide der allgemeinen Formel I-B haben pha-N-Äthyimorpholin und Dicyclohexylcarbodiimid zu Z- gocytosestimulierende Wirkung.
Lys(Boc)-Pro-Arg-OMe umgesetzt wird. Letztere Ver- In einem in vitro-Versuch wurde überraschenderweibindung wird verseift und durch katalytische Hydrie- se gefunden, daß humane Granulocyten Gaffkya tetrarung entcarbobenzoxyliert Man erhält H- 30 gena-Keime unter Zusatz von Pyroglutamyl- oder D-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH-diacetat (Formel II), das durch Seryl-Lys-Pro-Arg-Verbindungen stärker phagocytie-Verteilungschromatographie an Sephadex LH 20®, ei- ren als mit den bekannten Thr-Lys-Pro-Arg(Tuftsin). nem quervernetzten, alkylierten Dextran, in dem Sy- Dieser Befund ist um so überraschender, da in der DE-stem Eisessig/Butanol/Wasser gereinigt werden kann. OS 2124 003 erwähnt ist, daß die Seryl-Verbindung

Doch auch andere Verfahren sind möglich. So läßt 35 schwächer wirkt als die Threonyl-Verbindung.

sich auch der <y-Nitro-argin'uimethylester als Ausgangs- Folgende Tabelle gibt den Prozentanteil an Granulo-

substanz verwenden. Stufenweise kann diese Verbin- zyten dar, der 20 Minuten nach Inkubation die Gaffkya

dung mit Boc-Pro-OH und dann mit Z-Lys(Boc)-OH mit tetragena-ICeime phagocytiert hat.
Dicyclohexylcarbodiimid, gegebenenfalls unter Zusatz
von 1-Hydroxybenzotriazol umgesetzt werden. Auch 40

als Aktivester, wie z. B. p-Nitrophenyl- oder 23.5-Tri- Präparat %

chlorphenylester können Boc-Pro-OH und Z-

Lys(Boc)-OH, gegebenenfalls unter Zusatz einer kataly- H-Thr-Lys-Pro-Arg-OH (Tuftsin) 59.0 ± 2.4
sierenden N-Hydroxyverbindung, aufgesetzt werden.

Die Boc-Gruppe bei Boc-Pro-Arg(N0₂)-OMe kann mit 45 Πλ... , _v<! p-Ara-OH _{7i1 + Jli}
Trifluoressigsäure oder mit HCl in Eisessig abgespalten uiu-Lys-iTo-Arg-un 78.7 ±4.8
werden. Das Tripeptid Z-Lys(Boc)-Pro-Arg(NO₂)-OMe H-D-Ser-Lys-Pro-Arg-OH 78.5 ± 5.0
wird verseift und katalytisch hydriert; wobei das Tripeptid der Formel II entsteht. Tris-Puffer 24.0 ± 3.3

Aus dem Tripeptid der Formel II läßt sich durch Um- 50 nu„„i„ ii.„_mo„\ **λ in

. _n ^r ^r„, __ . , Albumin (human) 24 — JU
Setzung mit Boc-Thr-OBt (Boc-Thr-1-hydroxybenzot-

riazolester) Boc-Thr-LysiBocJ-Pro-Arg-OH, herstellen,

das mittels Verteilungschromatographie gereinigt wird. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Wirkstof-

Die beiden Boc-Gruppen werden anschließend in HCI/ fe. Neben der Phagocytose lebender Keime spielt auch

Eisessig abgespalten. Man erhält das Peptid der allgc- 55 die Beseitigung von Toxinen, insbesondere der Endoto-

meincn Formel !,indem X fürThreonyl sieht. xinc der gramnegativen Bakterien, eine große Rolle.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Dadurch kann eine Toxämie vermieden werden.
Gesamlausbeute an analysenreinen Produkten bezogen

auf eingesetzte Aminosäurederivate von 25% erhalten. Beispiele

Wegen der einfachen Durchführung und Reprodu- bo

zicrbarkeit dieser Synthese und seiner vergleichsweise A. Herstellung der Ausgangsverbindung

f| guten Ausbeute ist das erfindungsgemäße Verfahren H-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH-diacetat(II)
ii den bisher bekannten überlegen.

j j Bei der Herstellung von H-Ser-Lys-Pro-Arg-OH ent- 41,4 g (0,25 Mol) HCI ■ H-Pro-OMe, 95,1 g (0,25 Mo!)

;■■■' stehl bei Verwendung von Z-Seiinderivaten als Zwi- b5 Z-Lys(Boc)-OH, 33,75 g (0,25 Mol) HOBt und 35 ml Tri-

j. schenprodukt Z-Ser-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH. Diese Ver- äthylamin werden in 800 ml Tetrahydrofuran gegeben.

fei bindung wird katalytisch hydriert. Aus den resultieren- Zu dieser Mischung gibt man bei 0^cC unter Rühren eine

I' den H-Ser-Lys(Boc)-Prog-Arg-OH wird nach der Reini- kalte Lösung von 55 g Dicyclohexylcarbodiimid in Te-

trahydrofuran zu. Man läßt 1 Stunde bei 0°C und

1 Stunde bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird in 800 ml Essigester gelöst und nacheinander zweimal mit NaHCOj-Lösung, einmal mit KHSO₄-Lösung und einmal mit NaHCO₃-LoSUn? ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt Das resultierende öl wird in Essigester gelöst und über 300 g basisches AI2O3 (Woelm, Aktivstufe I) chromatog^raphiert Das Eluat wird eingeengt. Es bleiben 112,3 g eines gelben Öls zurück (Z-LyS(BoC)-FrO-OMe).

Das oben gewonnene öl (112,3 g) wird in 300 ml Dioxan gelöst Dazu gibt man 60 ml Wasser und titriert gegen Thymolphthalein mit insgesamt 240 ml 1 η Na-OH. Anschließend wird neutralisiert, eingeengt, und der Rückstand zwischen Äther und 1 η H₂SO* unter Eiskühlung verteilt Der Äther wird getrocknet und eingeengt Es bleiben 103,9 g eines steifen Öls zurück (Z-Lys(Boc)-Pro-OH).

Das oben gewonnene öl (103,9 g) uird in 475 ml Dimethylformamid gelöst Dazu gibt man 49,4 g (189 mMol) 2 HCl · H-Arg-OMe, 51,1 g HOBt und 24,65 ml N-Äthylmorpholin. Bei 0⁰C gibt man 41,6 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 1 Stunde bei 0⁰C,

2 Stunden bei Raumtemperatur und läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt, das Filtrat eingeengt und der Rückstand zwischen Essigester und 2 η Sodalösung verteilt Die Essigesterphase wird mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird dreimal mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet Es entstehen 113 g eines amorphen klebrigen Schaums (Z-Lys(Boc)-Pro-Arg-OMe).

Die oben gewonnene Substanz (113 g) wird in 500 ml Dioxan gelöst Man gibt 100 ml Wasser zu und titriert mit 2 η NaOH gegen Thymolphthalein. Es werden ca. 61,6 ml 2 η NaOH verbraucht. Anschließend wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand in 450 ml Wasser gelöst Unter Rühren und Eiskühlung versetzt man mit 61,6 ml 2 η H2SO4, mit der gleichen Menge, wie 2 η Na-OH verbraucht worden war. Es fällt ein steifes öl aus. Das Wasser wird abdekantiert und das öl noch zweimal mit Wasser verrieben. Der Rückstand wird in Äthanol gelöst und eingeengt. Der Rückstand wird mehrmals mit Äther verrieben. Der Äther wird jeweils abdekantiert und der Rückstand zum Schluß am Hochvakuum getrocknet. Es entstehen 81 g einer amorphen Masse (Z-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH).

Die so gewonnene amorphe Masse (81 g) wird in 400 ml 95%iger Essigsäure gelöst und mit Wasserstoff in Gegenwart eines Pd-Katalysators hydriert. Nach beendigter Hydrierung wird der Katalysator abgesaugt und das Filtrat eingeengt Der Rückstand wird zweimal mit Äther und einmal mit Essigester verrieben und abgesaugt Es bleiben 70,8 g (= 46% bezogen auf HCl · H-Pro-OMe) eines amorphen Produkts zurück (H-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH, 2 AcOH), das in 20 g Portionen an einer 100 · 8 cm Verteiiungschromatographiersäule (siehe unter B) gereinigt wird.

Ausbeute 75% bezogen auf Rohsubstanz. [a]»-21,0° (c= !,Methanol).

B. Chromatographibches Trennungsverfahren

a. Aufbau der Trennsäule

In einem Scheidelrichter werden 400 ml Eisessig,4 Liter Wasser und 800 ml n-Butanol geschüttelt Nachdem sich die beiden Phasen getrennt haben, trennt man diese und verrührt 300 ml der oberen Phase mit 240 g Sephadex LH 20®, einem quervernetzten, alkylierten Dextran. Dabei wird das gesamte Lösungsmittelgemisch aufgesaugt Diese so vorbehandelte Säulenfüllung wird nun in einer entsprechenden Menge der unteren Phase suspendiert man läßt ca. 3 Stunden quellen und füllt damit die SSuIe(IOO-4 cm).

b. Trennung an der Säule

Die zu chromatographierende Substanz wird in möglichst wenig der unteren Phase gelöst und auf die Säule aufgetragen. Mit der unteren Phase wird eluiert. Zur Elution kann man auch ein Lösungsmittelgemisch von 43 Liter Wasser, 350 ml Essigsäure und 430 ml n-Butanol verwenden. Die Fraktionen, die die gewünschte Substanz enthalten, werden gereinigt und im Vakuum eingeengt.

Beispiel 1 H-Thr-Lys-Pro-Arg-OH - 3 HCI

H₂O

	O₁₀: (619.7)	H	7,97,	N	15,82
ber.:	C 50,40.	H	7,9,	N	15,8.
ge f.:	C 50.6,

70,8 g rohes H-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH · 2 AcOH werden in 300 ml Dimethylformamid gelöst Dazu gibt man bei Raumtemperatur 43 g (128 mMol) Boc-Thr-OBt und läßt einen Tag bei Raumtemperatur stehen.

Nun wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand mit

Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. In 120 ml einer Mischung aus Methanol/Wasser (1 : l)wird der Rückstand gelöst und über 950 ml breite Amberlite IR 45® (OH^e-Form), einen schwach basischen Austauscher, filtriert. Mit einer Methanol/Wasser-Mischung (1 :1) wird eluiert. Das Eluat wird eingeengt. Ausbeute 69,5 g (Boc-Thr-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH). In 6 Portionen werden die oben gewonnenen 69,5 g öl über eine 100-8 cm-Sephadex LH 20®-Säule (siehe B) chromatographier·.

Die Fraktionen, die das Boc-Thr-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH enthalten, werden vereinigt und im Vakuum eingeengt.

Der Rückstand (ca. 42 g) wird in 195 ml Essigsäure gelöst und mit 500 ml 1 n-HCI/Eisessig versetzt. Man läßt 30 Minuten stehen, wobei sich der Großteil des Peptids als öl abscheidet.

Man engt ein, löst den Rückstand in Wasser und gefriertrocknet. Ausbeute 32,5 g Thr-Lys-Pro-Arg · 3 HCI · 2 H₂O (= 2O<>/o bezogen auf Z- Lys(Boc)-OH oder 25% bezogen auf eingesetzte Aminosäurederivate). Die Substanz ist amorph.

Analyse

berechnet für C₂)H₄₀N₈O₆ · 3 HCl ■ 2 H₂O:(646,0) ber.: C39,05, H 7,34, N 17,34, Cl 16,45, gef.: C 39,0, H 7,3, N 17,1, Cl 16,3.

[WP_O ^O~68.2° (c = 1, Wasser) f> Herstellung von Boc-Thr-OBt

28,6 g Boc-Thr-OH und 12,87 g 1-Hydroxyben/otria-/.ol werden in Tclrahvdrofuran gelöst Bei O¹¹C gibl man

7 8

20,1 g Dicyclohexylcarbodiimid, in 50 ml Tetrahydrofu- Ausbeute 1,5 g

ran gelöst, hin/.u. Man läßt 1 Stunde bei 0^cC und über

Nacht bei Raumtemperatur rühren, saugt den Nieder- [«]£■ —73,7° (c = 1,H/))

schlag ab und engt das Filtrat ein. Aus Äther/Petrolä-

ther läßt sich die Substanz kristallisieren. s Beispiel 4

Ausbeute 30 g, Schmelzpunkt 96 bis 98°C ^L Glu-Lys-Pro-Arg-OH · 2 HCI · H₂O

Analyse berechnet WrCi₅H₂ON₄O₅:(336,35) 3,1g (5 mMol) H-Ly^BocJ-Pro-Arg-OH-diacetat

ber.: C 53,57, H 5,99, N 16,66, ι ο werden zusammen mit 675 mg (5 mMol) HOBt in 20 ml

gef.: C 53,6, H 6,0, N 16,5. Dimethylformamid gelöst. Dazu gibt man bei Raumtemperatur 1,54 g (5 mMol) Beispiel 2 ι—| :

l-Glu-OTcp H-Ser-Lys-Pro-Arg-OH · 3 HCl · H₂O 15

und läßt über Nacht stehen, Anderntags wird eingeengt -

Zu einer Suspension von 24,8 g (40 mMol) H- und der Rückstand mehrmals mit Äther verrieben und

Lys(Boc)-Pro-Arg-OH-diacetat in 150 ml Dimethylfor- abgesaugt. Die amorphe Substanz (3,9 g) wird an einer mamid gibt man bei O⁰C 15,4 g (40 mMol) Z-Ser-OOBt. 100 · 4 cm Sephadex LH 20*-Säule (siehe B) chromato-Man rührt 1 Stunde bei 0⁰C und dann bei Raumtempe- 20 graphiert. Man erhält 2,7 g einer reinen Fraktion, die in ratur bis alles gelöst ist. Man engt ein und verreibt den 20 ml Eisessig gelöst wird. Zu dieser Lösung gibt man

Rückstand mit Äther. Der Äther wird abdekantiert und 20 ml 2 η HCl/Eisessig, läßt 15 Minuten bei Raumtemder Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die resul- peratur stehen und engt ein. Der Rückstand wird in tierende Substanz wird in einer Methanol/Wasser-Mi- Wasser gelöst und gefriergetrocknet schung (1 :1) gerade gelöst und über 300 ml Amberlite® 25

IR 45 (OH-Form) filtriert Mit Methanol/Wasser (1 :1) Ausbeute 1,63 g

wird eluiert Das Eluat wird eingeengt Es bleiben 39 g

eines Öls zurück, das in 200 ml 90%iger Essigsäure ge- [λ] i' -73,0° (c = 1, H₂O).

löst wird. Man setzt Pd-Katalysator zu und leitet unter

Rühren Wasserstoff durch die Lösung bis kein CO₂ 30

mehr entweicht. Vom Katalysator wird abgesaugt und

das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mehrmals mit

Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. In

zwei Portionen wird der Rückstand über eine

100-8 cm-Sephadex LH 20®-Säule (siehe B) chromato- 35

graphiert. Die vereinigten Fraktionen werden eingeengt

und der Rückstand (29,9 g) in 160 ml Eisessig gelöst.

Dazu gibt man 300 ml 2 η HCl/Eisessig und läßt 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Anschließend wird

am Hochvakuum eingeengt und der Rückstand in Was- 40

ser gelöst und gefriergetrocknet

Ausbeute 18,28 g

O]S¹ -60,0° (c= 1,H₂O) 45

Beispiel 3
H-D-Ser-Lys-Pro-Arg-OH ■ 3 HCl

Zu einer Lösung von 1,1 g (5 mMol) Boc-D-Ser-NH- 50 · ; NH₂ in 10 ml Dimethylformamid gibt man bei —30^cC
!,45 m! 6,9 η HCl/Dioxan '!0 mMoP und 0,6 m! tert-Butylnitrit Man läßt auf ca. — 15°C kommen und rührt
15 Minuten bei dieser Temperatur. Danach gibt man

3,1g (5 mMol) H-Lys(Boc)-Pro-Arg-OH-diacetat und 55 #

bei —40⁰C 2,6 ml N-Äthylmorpholin zu. Man läßt bei f

—20 bis — 10⁰C rühren und gibt im Laufe einiger Stun- £

den etwas N-Äthylmorpholin zu, um einen pH von 7 bis ζ!

8 zu erhalten. Nach etwa 5 Stunden ist alles gelöst Man ?.

stellt über Nacht in den Eisschrank und engt anderntags ω **

im Vakuum ein. Der Rückstand wird mit Äther verrie- - 1

ben. Die Substanz (4,4 g) wird an einer 100 · 4 cm Se- !

phadex LH 20®-Säule (siehe B) chromatographiert Das ~

Peptid enthaltende Eluat wird eingeengt Der Rück- %

stand wird in 20 ml Eisessig gelöst und mit 20 ml 2 η 65 S^

HCl/Eisessig versetzt Man läßt 15 Minuten bei Raum- ';

temperatur stehen, engt ein, löst in Wasser und gefrier- 5^J

trocknet fe!

Claims

Patentansprüche:

!.Tetrapeptide der allgemeinen Formel I-A X'-L-Lysyl-L-proiyl-L-arginin (1-A)

in der X¹ D-Seryl, L-Pyroglutamyl oder D-Pyroglutamyl bedeutet.

iL-Pyroglutamyl-L-lysyl-L-prolyl-L-arginin.

3. Verfahren zur Herstellung der Tetrapeptide der allgemeinen Formel 1-B

a) das Tripeptid der Formel 11