CN109265373A - 一种氨基酸类底物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氨基酸类底物，其结构通式如图1所示。本发明通过对该氨基酸类底物中二肽的合成工艺及二肽与色原连接工艺的开发创新、提取纯化工艺的创新及应用验证，使得产品各步反应收率有了较大提高，色泽接近白色，减小了底物颜色在鉴定过程中的影响，并较大程度提高了需氧菌群阴道炎检测过程中的灵敏度及检测准确度。本发明制备的底物为盐酸盐形式，以盐酸盐形式进行检测应用时可较大程度提高底物的溶解性；在检测应用中按照需氧菌群阴道炎检测的配制要求进行相应配制工作，并依据检验标准对合成底物显色性能与市场已有的需氧菌群阴道炎检测的显色性能进行对比检验，显色性能优于市场上需氧菌群阴道炎检测试剂的显色性能。

Description

一种氨基酸类底物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及体外检测用试剂，尤其是涉及一种可稳定显色的氨基酸类底物，本发明还涉及该底物的制备方法和用途。

背景技术

需氧菌群阴道炎（AV）是临床新确定的一种阴道炎，与细菌性阴道炎（BV）、滴虫性阴道炎（TV）的病原体不同，治疗方案和结局也不相同。AV患者的临床症状、体征和TV患者极为相似，若不明确诊断，易造成误诊。所以准确区别这两种阴道炎，对阴道感染患者的诊疗具有重要意义。

目前常用的检测需氧菌阴道炎的方法是：①细菌鉴定仪法，该法准确度较高，但存在费用昂贵，无法直接上标本及纯菌培养时间长等缺点；②普通培养加生化鉴定法即金标准法：该法特异性较好，但需进行细菌纯培养，鉴定试验繁琐； ③分子生物学法即PCR法：该法快速敏感，但假阳性难以排出，对人员和设备要求均较高。

由于上述检测技术或成本高、或操作繁琐、或设备要求高、或培养时间较长、或灵敏度较低，因此兼具灵敏度高、特异性好、操作简便、培养时间短等优点的检测方法的开发研究具有重要的市场应用价值。基于此，研究出具有高灵敏度、不需借助紫外照射观察即可稳定显色的底物合成方法及其应用具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可稳定显色的氨基酸类底物，本发明还公开了该底物的制备方法和在需氧菌群阴道炎检测中的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的氨基酸类底物，其结构式为：

。

上述氨基酸类底物的衍生物可以为：

，，

，，

。

本发明所述氨基酸类底物的制备方法包括下述步骤：

第一步，将甘氨酸化合物在一定浓度的氢氧化钠水溶液中与适当量的二碳酸二叔丁酯反应，反应完成后经酸洗淬灭后收集有机相进行干燥并减压浓缩，除去溶剂得到白色固体产物备用；

第二步，将第一步得到的白色固体于二氯甲烷溶液中在催化剂4-二甲氨基吡啶作用与N-羟基丁二酰亚胺反应，反应完成后对反应母液进行过滤，滤液部分进行酸洗，酸洗后对有机相进行干燥，干燥后对有机相进行减压浓缩，除去溶剂，剩余残留物溶于少量乙酸乙酯中并于-20℃条件下进行重结晶，过滤后得到浅黄色固体产物备用；

第三步，将第二步得到的浅黄色固体与L-精氨酸在四氢呋喃中搅拌反应，反应完成后用乙酸乙酯/纯化水对母液进行萃取，收集水相并对水相物质进行柱层析纯化，收集水下物质并减压浓缩，得到雪白色发泡状固体化合物备用；

第四步，将第三步得到的化合物在少量无水甲醇中分散均匀后，滴加相同摩尔量的浓盐酸， 室温条件下搅拌0.5h，除去溶剂得到米白色发泡状固体化合物备用；

第五步，以第四步得到的化合物与 β-萘胺为原料，室温下在二氯甲烷溶液中经缩合试剂催化反应，反应完成后经浓缩、柱层析纯化得到浅黄色发泡状固体化合物备用；

第六步，将第五步得到的化合物在无水甲醇中经氯化氢催化，脱除BOC保护基，待反应完成后用饱和食盐水、乙酸乙酯萃取，收集水相，经柱层析纯化、冻干处理，得到类白色粉末状氨基酸类底物纯品。

本发明所述氨基酸类底物在需氧菌群阴道炎检测中的应用。

本发明合成工艺简单科学，通过对合成、提取、纯化工艺进行改进后，使得各步骤的反应收率均有了较大提高，得到的成品底物色泽接近白色，减小了底物颜色在鉴定过程中的影响，并较大程度提高了需氧菌群阴道炎的检测灵敏度及检测准确度。

本发明制备的底物为盐酸盐形式，以盐酸盐形式进行检测应用时，较大程度提高了底物的溶解性；作为底物在需氧菌群阴道炎检测中应用时，需要首先按照需氧菌群阴道炎检测的配制要求进行相应配制工作，并依据检验标准对合成底物显色性能与市场已有的需氧菌群阴道炎检测中所用底物的显色性能进行对比检验后，其显色性能优于市场上需氧菌群阴道炎检测试剂的显色性能。

附图说明

图1是本发明底物的结构通式。

图2 a~图2e为图1通式底物的五种具体结构图。

图3为图2a所示底物的质谱图。

图4为本发明底物的反应流程图。

具体实施方式

本发明制备的氨基酸类底物，其结构通式如图1所示。

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解，实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的范围。

如无特殊说明，本发明所用试剂和仪器为本领域常用的市售产品，本发明所用试验等方法为本领域常规方法。

实施例1 制备氨基酸类底物2a（甘氨酰-精氨酰-β-萘胺盐酸盐）

其具体流程如图4所示：

第一步，称取化合物甘氨酸20g加入盛有0.75mol/L氢氧化钠溶液500mL的三口瓶中，然后加入73mL二碳酸二叔丁酯，室温条件下于氩气氛围内进行搅拌反应，TLC监测反应进程；反应完成后用1mol/L的HCl将反应体系的pH调至2~3，然后用500mL乙酸乙酯萃取2次，收集有机相并对其用无水硫酸钠进行干燥，干燥后减压浓缩即可得白色固体产物（BOC-甘氨酸）43.26g；收率95%左右，TLC显示仅一个点；mp 87-90 ; 1 H NMR (300 MHz, CDCl3) δ5.02 (br, 1H), 3.96 (s, 2H), 1.46 (s, 9H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 174.9,156.2, 80.7, 42.5, 28.5; IR (KBr) ν 3354, 2980, 1729, 1714, 1251 cm−1 ; HRMS(ESI-TOF) calcd for C7H13NO4Na [M+Na]+ 198.0742, found 198.0737。

第二步，称取第一步制得的BOC-甘氨酸25g溶于300mL二氯甲烷中，加入N-羟基丁二酰亚胺23.92g、4-二甲氨基吡啶1.75g，将反应体系温度降至0℃后，向反应体系中滴加含有44.15g二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液200mL，滴加完后继续在0℃反应45分钟，然后将体系温度逐渐升至室温继续反应16小时；反应完成后用0.05mol/L的HCl溶液（2×100mL）进行洗涤，收集有机相并对其用无水硫酸钠进行干燥，干燥后减压浓缩除去溶剂，将残留物溶于最小体积的乙酸乙酯中，并与-20℃下进行结晶，过滤得浅黄色固体产物（BOC-甘氨酸-OSu）29.15g，收率75%左右；1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 5.03 (br s, 1H), 4.29 (d,2H), 2.85 (s, 4H), 1.43 (s, 9H). MS (ESI) m/z = 273.2 [M + 1]。

第三步，称取第二步制得的BOC-甘氨酸-OSu 12g，加入200mL四氢呋喃溶液中，然后向体系中加入10mL三乙胺，室温搅拌30分钟后加入25g 式（3）化合物，继续反应18小时，TLC监测反应进程，反应完成后，用（3×300mL）乙酸乙酯对母液进行萃取，收集水相并通过多次加入乙醇后减压浓缩进行除水，残余物用无水甲醇溶解后加入硅胶拌样，并经过柱层析纯化操作，获得雪白色发泡状固体产物（BOC-甘氨酸-精氨酸）纯品24.65g，收率在80%，TLC显示只有一个点; MS(ESI)：m/z(%)332.1[M+H]+；¹H NMR (CDCl3)： δ11.62 (s, 1H,COOH), 8.22 (s, 1H,CONH), 7.66 (s, 1H, CONH), 7.45 (s, 1H,=NH), 6.63 (s, 2H,-NH2), 4.55 (s, 1H,CH), 3.82 (s, 2H,CH2), 3.35 (t, 2H,CH2), 2.55 (s, 1H,NH),1.78 (m, 2H,CH2), 1.66(m, 2H,CH2), 1.42 (s, 9H,BOC)。

第四步，称取第三步制得的BOC-甘氨酸-精氨酸24.00g于100mL无水乙醇中与5.4mL浓盐酸反应0.5小时，然后减压浓缩除去溶剂、旋除溶剂后得米白色发泡状固体产物（BOC-甘氨酸-精氨酸盐酸盐）26.5g，收率在84%，TLC显示只有一个点; MS(ESI)：m/z(%)332.1[M+H]+；¹H NMR (CDCl3)： δ11.62 (s, 1H,COOH), 8.22 (s, 1H,CONH), 7.84(s,1H,=NH),7.66 (s, 1H, CONH), 7.01 (s, 2H,-NH2), 4.55 (s, 1H,CH), 3.82 (s, 2H,CH2), 3.35 (t, 2H,CH2), 2.92(s, 1H,NH), 1.78 (m, 2H,CH2), 1.66(m, 2H,CH2),1.42 (s, 9H,BOC)。

第五步，称取第四步制得的BOC-甘氨酸-精氨酸盐酸盐25g（68.12mmol）加入盛有350mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的单口瓶中，氩气保护下加入10.24g（81.91mmol）的4-二甲氨基吡啶（DMAP），然后加入17.30g（81.91mmol）的二环己基碳二亚胺（DCC），室温下搅拌1小时后加入12.00g（83.91mmol）的β-萘胺12g，继续搅拌反应24h，TLC监测反应完成后，减压抽滤，并用50mLDMF冲洗滤饼，滤液于60℃下减压蒸馏除去溶剂，剩余的残余物重新分散于500mL无水乙醇中，硅胶拌样后继续减压浓缩，除去溶剂后通过柱层析纯化得到23.8g浅黄色发泡状固体产物（BOC-甘氨酸-精氨酸-β-萘胺），收率约76.78%；¹H NMR (CDCl3)： δ9.70 (s, 1H,CONH), 8.42 (s, 1H,ArH), 8.02 (s, 1H,ArH), 7.95 (s, 1H,CONH),7.91(d, 1H,ArH), 7.84 (s, 1H,=NH), 7.81 (d, 1H, ArH), 7.64 (dd, 1H,ArH), 7.56 (d,1H,ArH), 7.41 (dd, 1H,ArH),7.01 (s, 2H,-NH2), 4.55 (s, 1H,CH), 3.82 (s, 2H,CH2), 3.35 (t, 2H,CH2), 2.92(s, 1H,NH), 1.78 (m, 2H,CH2), 1.66(m, 2H,CH2),1.42 (s, 9H,BOC)。

第六步，称取第五步制得的BOC-甘氨酸-精氨酸-β-萘胺20g加入新制备的450mL氯化氢乙酸乙酯溶液中，室温下搅拌反应3-5分钟，待反应体系变为溶清状态，继续搅拌反应，反应体系逐渐析出淡粉色固体，搅拌反应2小时后减压抽滤，用100mL丙酮洗涤滤饼；经TLC检测，滤液中无产物存在，产物为滤饼；所得滤饼用100mL无水乙醇溶解后减压蒸馏除去大部分溶剂，剩余油状物逐滴滴加进600mL丙酮中，边滴加边搅拌，滴加完成后过滤，收集滤饼，并用100mL纯化水溶解滤饼，溶解澄清后用乙酸乙酯（3×100mL）进行萃取，收集水相并进行冻干处理，冻干后得13.5g类白色粉末状固体产物（甘氨酰-精氨酰-β-萘胺盐酸盐），其质谱图如图3所示，证明所得产物与甘氨酰-精氨酰-β-萘胺盐酸盐的分子量一致，其结构式如图2a所示。HPLC纯度为96.8%；MS(ESI)：m/z(%) 357.3[M+H]⁺；¹H NMR (DMSO)： δ 9.70(s, 1H,CONH), 8.42 (s, 1H,ArH), 8.31（s,2H,NH2）, 8.02 (s, 1H,ArH), 7.95 (s,1H,CONH),7.91(d, 1H,ArH), 7.84 (s, 1H,=NH), 7.81 (d, 1H, ArH), 7.64 (dd, 1H,ArH), 7.56 (d, 1H,ArH), 7.41 (dd, 1H,ArH),7.01 (s, 2H,-NH2), 4.55 (s, 1H,CH),3.82 (s, 2H,CH2), 3.35 (t, 2H,CH2), 2.92(s, 1H,NH), 1.78 (m, 2H,CH2), 1.66(m,2H,CH2)。

底物2b、2c、2d、2e的合成方法与2a相同，不再赘述。

实施例2 本发明实施例1制备的氨基酸类底物在需氧菌群阴道炎检测中的应用验证

1、配制检测试剂盒

分别取磷酸盐缓冲液200mmol/L（pH 7.0）98mL、甘氨酰-精氨酰-β-萘胺盐酸盐50mg、二甲基甲酰胺2mL、PVPK30 5g混合均匀，经0.2μm微孔滤膜过滤，采用棕色瓶对滤液以5mL/瓶的规格进行分装，密封保存。

2、检测

用棉签取阴道分泌物，放入软塑料试管中，加入生理盐水，用手挤压试管，使分泌物与样品稀释液混匀，取出棉签，用吸管取稀释后的样品，加底物溶液10μL，37℃反应30min，通过观察颜色变化，判断样本中凝固酶活性，红色代表凝固酶阳性。结果表明凝固酶呈阳性的为需氧菌群感染。

3、统计数据

取405例患者的阴道分泌物标本，分别采用实施例2制备的试剂盒和《实用临床微生物学检测与图谱》中普通培养加生化鉴定法（金标准法）进行检测对比，其结果如下表所示：

实施例2制备的试剂盒的敏感性为95.0%；特异性为96.4%。

由此可见，本发明的显色底物在需氧菌群阴道炎的检测方面，敏感性与特异性均在90%以上，可满足检测需求。

Claims (4)

1.一种氨基酸类底物，其特征在于：所述底物的结构式为

。

2.根据权利要求1所述的氨基酸类底物，其特征在于：所述底物的衍生物为

，，，，。

3.权利要求1所述氨基酸类底物的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

第一步，将甘氨酸化合物在一定浓度的氢氧化钠水溶液中与适当量的二碳酸二叔丁酯反应，反应完成后经酸洗淬灭后收集有机相进行干燥并减压浓缩，除去溶剂得到白色固体产物备用；

第二步，将第一步得到的白色固体于二氯甲烷溶液中在催化剂4-二甲氨基吡啶作用与N-羟基丁二酰亚胺反应，反应完成后对反应母液进行过滤，滤液部分进行酸洗，酸洗后对有机相进行干燥，干燥后对有机相进行减压浓缩，除去溶剂，剩余残留物溶于少量乙酸乙酯中并于-20℃条件下进行重结晶，过滤后得到浅黄色固体产物备用；

第三步，将第二步得到的浅黄色固体与L-精氨酸在四氢呋喃中搅拌反应，反应完成后用乙酸乙酯/纯化水对母液进行萃取，收集水相并对水相物质进行柱层析纯化，收集水下物质并减压浓缩，得到雪白色发泡状固体化合物备用；

第四步，将第三步得到的化合物在少量无水甲醇中分散均匀后，滴加相同摩尔量的浓盐酸， 室温条件下搅拌0.5h，除去溶剂得到米白色发泡状固体化合物备用；

第五步，以第四步得到的化合物与 β-萘胺为原料，室温下在二氯甲烷溶液中经缩合试剂催化反应，反应完成后经浓缩、柱层析纯化得到浅黄色发泡状固体化合物备用；

第六步，将第五步得到的化合物在无水甲醇中经氯化氢催化，脱除BOC保护基，待反应完成后用饱和食盐水、乙酸乙酯萃取，收集水相，经柱层析纯化、冻干处理，得到类白色粉末状氨基酸类底物纯品。

4.权利要求1所述氨基酸类底物在需氧菌群阴道炎检测中的应用。