CN100509817C

CN100509817C - 一种检测超氧阴离子自由基的荧光探针及其合成方法和用途

Info

Publication number: CN100509817C
Application number: CNB2006100435634A
Authority: CN
Inventors: 唐波; 徐克花; 刘霞
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2006-04-11
Filing date: 2006-04-11
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2026-04-11
Also published as: CN1837211A

Abstract

本发明提供一种检测超氧阴离子自由基的荧光探针及其合成方法，该方法按如下步骤进行：a.将原料按照荧光染料∶膦酰化试剂∶附酸剂＝1∶2～3.5∶1～3的质量比，先将荧光染料和膦酰化试剂分别溶解于四氢呋喃中，然后混匀，加热回流0.5～1.5小时；b.再将反应混合物冷却至室温，过滤，滤液浓缩至浸膏；c.然后再加苯溶解浸膏，水洗至中性，浓缩得粗品；d.最后硅胶柱层析分离得纯品。

Description

一种检测超氧阴离子自由基的荧光探针及其合成方法和用途

技术领域

本发明属于生物检测技术及临床医学检测领域，涉及活性氧的荧光探针及其合成方法，尤其涉及超氧阴离子自由基的荧光探针及其合成方法，另外，本发明还涉及该荧光探针的用途。

背景技术

自由基是生命活动代谢过程中产生的具有高反应活性的小分子物质，一旦生物体自身不能有效、迅速清除过量存在的自由基，将会极大损伤具有重要生理功能的生物大分子，比如：DNA，脂质及蛋白质。研究表明：人类常见的几种主要疾病，如：癌症、动脉硬化症、神经退化疾病及糖尿病等(Witz G.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1991，198:675；Feig D.I.，Reid T.M.，Leob L.A.，Cancer Res.，1994，54:1890s)；及人类的衰老都与自由基的产生密切相关(Finkl T.，Holbrook N.J.，Nature，2000，408:239)。但由于自由基寿命短、含量低、种类多，对其检测仍是生命科学与化学分析领域最困难的问题之一。尤其是高选择性、高灵敏度、实用性强的检测方法尚未见有公布。作为产生其它活性自由基的前体，超氧阴离子自由基的识别和检测尤其重要。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种效果较好的检测超氧阴离子自由基的荧光探针，为探讨人类疾病及老化的机制，为某些重大疾病的早期诊断与预防，提供良好的辅助手段；目的之二是提供工艺简单、成本低廉的该荧光探针的合成方法；目的之三是提供该荧光探针的用途。

本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现：

本发明的荧光探针结构式为：

X＝O，NHY₁，Y₂＝F，Cl，CH₃，OCH₃ R＝苯基，烷基

本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现：

该合成方法按如下步骤进行：

a.将原料按照荧光染料:膦酰化试剂:附酸剂＝1:2～3.5:1～3的质量比，先将荧光染料和膦酰化试剂分别溶解于四氢呋喃中，然后混匀，加热回流0.5～1.5小时；

b.再将反应混合物冷却至室温，过滤，滤液浓缩至浸膏；

c.然后再加苯溶解浸膏，水洗至中性，浓缩得粗品；

d.最后硅胶柱层析分离得纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。

本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现：

所述的荧光染料选自荧光素及其取代衍生物、萘荧光素及其取代衍生物或罗丹明；所述的荧光素取代衍生物选自2’，4’，5’，7’—四氟荧光素或4’，5’—二甲基荧光素；所述的萘荧光素取代衍生物选自2’，5’，8’，11’—四氟萘荧光素或2’，11’—二甲基萘荧光素；所述的膦酰化试剂选自二苯基膦酰氯或取代二苯基膦酰氯；所述的取代二苯基膦酰氯选自二—2’，4’—二硝基苯基)膦酰氯或二—2’，4’—二甲基苯基膦酰氯；所述的附酸剂选自三乙胺、吡啶或甲基吡啶。

本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现：

将本发明的测定超氧阴离子自由基的荧光探针用于化学体系、化学模拟生物体系中羟基自由基的检测，生物活细胞和活组织内的羟基自由基的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中羟基自由基的检测。

本发明以荧光素、二苯基次膦酰氯和吡啶为原料，制成的荧光探针M.p：118-122°C.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆，TMS)：δ＝8.01(d，³J_H，H＝7.86Hz，1H)，7.96～7.90(m，8H)，7.72(m，2H)，7.67～7.56(m，12H)，7.36(s，2H)，7.28(d，³J_H.H＝7.80Hz，1H)，7.08(d，³J_H，H＝8.76Hz，2H)，6.78(d，³J_H，H＝8.76Hz，2H).IR(KBr，cm^-1)：1768，1606，1486，1392.MS(APCI)：calcd 732.2，found 732.2.³¹P NMR(400MHz，DMSO，85％H₃PO₄)：31.384ppm。

本发明以萘荧光素、二苯基次膦酰氯和吡啶为原料，制成的荧光探针M.p：110-112°C.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆，TMS)：δ＝8.68(d，³J_H，H＝9.1Hz，2H)，8.08(m，1H)，7.95(m，1H)，7.72(d，³J_H，H＝8.0Hz，8H)，7.69(m，2H)，7.50(m，4H)，7.45～7.36(m，12H)，7.20(s，2H)，6.70(d，³J_H，H＝9.1Hz，2H).IR(KBr，cm^-1)：1758，1645，1608，1574，1392，1251，1205，1156.MS(APCI)：calcd 832.7697，found 832.7.³¹PNMR(400MHz，DMSO，85％H₃PO₄)：30.9597ppm。

本发明根据超氧阴离子自由基独特的亲核性发明了基于亚膦酸酯的荧光探针，用于检测超氧阴离子自由基的识别和检测，具有高选择性、高灵敏度和实用性强的积极效果，解决了目前生命科学与化学分析领域中的一大难题；通过超氧与探针的特异性反应，利用共聚焦扫描显微镜实现了细胞内原位超氧阴离子自由基的直接有效检测。本发明的荧光探针为研究超氧介导的生化反应、自由基损伤生物大分子的作用机理、损伤与疾病的关系及临床治疗提供了较好的理论基础与实验方法。本发明的方法工艺简单，操作方便，设备投入少，生产和运行成本低。

本发明的重要贡献还在于成功的合成了萘系列远可见—近红外荧光探针(600—900nm)，避开了生物体自身荧光的干扰，为生物样品中低含量的自由基检测提供了可能。而荧光素系列则为食品，环境方面的检测提供了更好的灵敏度。总之，本发明的荧光探针及其合成必将极大促进自由基生物化学领域的发展。

附图说明

图1是本发明合成的二苯基亚膦酸荧光素酯用于氧化胁迫下小鼠腹膜巨噬细胞(Balb/c)内超氧阴离子检测的荧光成像。

图2是本发明合成的二苯基亚膦酸萘荧光素酯用于氧化胁迫下巨噬细胞(RAW264.7)内超氧阴离子检测的荧光成像。

具体实施方式

实施例1：

先分别向置有1.0克荧光素、2.3克二苯基膦酰氯的烧瓶中加入可使荧光素、二苯基膦酰氯完全溶解的四氢呋喃溶剂，然后向溶有二苯基膦酰氯的四氢呋喃溶液中于磁搅拌下先加入3毫升吡啶，再于室温下缓慢加入溶有荧光素的四氢呋喃溶液，加热回流0.5小时；再将反应混合物冷却至室温，过滤除去反应液中的固体残渣，滤液减压浓缩至浸膏，然后再加苯溶解浸膏，用15％稀氨水、30℃的水依次洗涤至中性，分出有机层，硫酸钠干燥，减压浓缩得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇—三氯甲烷(3：7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。

实施例2：

先分别向置有1.0克荧光素、3.5克二苯基膦酰氯的烧瓶中加入可使荧光素、二苯基膦酰氯完全溶解的四氢呋喃溶剂，然后向溶有二苯基膦酰氯的四氢呋喃溶液中于磁搅拌下先加入1毫升吡啶，再于室温下缓慢加入溶有荧光素的四氢呋喃溶液，加热回流1.5小时；再将反应混合物冷却至室温，过滤除去反应液中的固体残渣，滤液减压浓缩至浸膏，然后再加苯溶解浸膏，用5％稀氨水、40℃的水依次洗涤至中性，分出有机层，硫酸钠干燥，减压浓缩得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇—三氯甲烷(5：5v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。

实施例3：

将三乙胺替换吡啶，其他分别同实施例1、2。

实施例4：

将甲基吡啶替换吡啶，其他分别同实施例1、2。

实施例5：

将二(2，4—二硝基苯基)膦酰氯替换二苯基次膦酰氯，其他分别同实施例1～4。

实施例6：

将二(2，4—二甲基苯基)膦酰氯替换二苯基次膦酰氯，其他分别同实施例1～4。

实施例7：

将2’，4’，5’，7’—四氟荧光素替换荧光素，其他分别同实施例1～6。

实施例8：

将4’，5’—二甲基荧光素替换荧光素，其他分别同实施例1～6。

实施例9：

将萘荧光素替换荧光素，其他分别同实施例1～6。

实施例10：

将2’，5’，8’，11’—四氟萘荧光素替换荧光素，其他分别同实施例1～6。

实施例11：

将或2’，11’—二甲基萘荧光素替换荧光素，其他分别同实施例1～6。

实施例12：

将罗丹明替换荧光素，其他分别同实施例1～6。

Claims

1、一种测定超氧阴离子自由基的荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式为：

X＝O，NH Y₁，Y₂＝F，Cl，CH₃，OCH₃ R＝苯基，烷基。

2、权利要求1所述的测定超氧阴离子自由基的荧光探针的合成方法，其特征在于该方法以荧光染料、膦酰化试剂和附酸剂为原料，按如下步骤进行：

a.将原料按照荧光染料:膦酰化试剂:附酸剂＝1:2～3.5:1～3的质量比，先将荧光染料和膦酰化试剂分别溶解于四氢呋喃中，然后混匀，加热回流0.5～1.5小时；所述的荧光染料选自荧光素及其取代衍生物、萘荧光素及其取代衍生物或罗丹明，所述的膦酰化试剂选自二苯基膦酰氯或取代二苯基膦酰氯；

b.再将反应混合物冷却至室温，过滤，滤液浓缩至浸膏；

c.然后再加苯溶解浸膏，水洗至中性，浓缩得粗品；

d.最后硅胶柱层析分离得纯品。

3、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的荧光素取代衍生物选自2’，4’，5’，7’—四氟荧光素或4’，5’—二甲基荧光素。

4、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的萘荧光素取代衍生物选自2’，5’，8’，11’—四氟萘荧光素或2’，11’—二甲基萘荧光素。

5、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的取代二苯基膦酰氯选自二—2’，4’—二硝基苯基膦酰氯或二—2’，4’—二甲基苯基膦酰氯。

6、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的附酸剂选自三乙胺、吡啶或甲基吡啶。

7、权利要求1所述的测定超氧阴离子自由基的荧光探针用于化学体系、化学模拟生物体系中羟基自由基的检测，生物活细胞和活组织内的羟基自由基的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中羟基自由基的检测。