CN109942504A

CN109942504A - 一种检测次氯酸的荧光探针分子及其制备方法

Info

Publication number: CN109942504A
Application number: CN201910229186.0A
Authority: CN
Inventors: 吕光磊; 杨佳佳; 郑武斌; 沈扬; 李春霞
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2039-03-25
Also published as: CN109942504B

Abstract

本发明公开了一种检测次氯酸的荧光探针分子及其制备方法。该荧光探针分子具体涉及一种HClO特异性响应的荧光探针分子。该荧光探针分子由合成路线方法制成。本发明的优点在于可以通过改变R1来设计不同类型的荧光探针，探针分子对HClO的选择特异性强、响应速度快、荧光强度的变化具有浓度依赖性，可实现定量分析，在复杂的体系中对HClO具有较高的选择性和特异性。

Description

一种检测次氯酸的荧光探针分子及其制备方法

技术领域

本发明属于HClO检测技术领域，具体涉及一种HClO特异性响应的荧光探针分子。

背景技术

次氯酸(HClO)是生物体内重要的活性氧(ROS)之一，它在生命体中属于一种内源性活性氧(ROS)，是在髓过氧化物酶(MPO)催化下由H₂O₂和Cl^-反应产生的，主要发生在白细胞中(如单核细胞，嗜酸性细胞，嗜中性粒细胞等)。

作为一种高效杀菌剂，HClO被用于杀灭入侵性细菌、病毒、孢子以及一些原生类微生物。更重要的是，它在生物系统的氧化还原平衡调控中发挥着至关重要的作用和维持细胞的正常功能的作用。一方面，高度活跃的次氯酸是一个关键的细胞信号传导因子，它通过体内平衡和抗感染防御机制，在抗炎和细胞凋亡的调控中发挥着重要的作用。另一方面，由于HClO能与各种生物分子反应，包括DNA、核糖核酸、脂肪酸、胆固醇、蛋白质等，细胞免疫反应产生的过量或不可控的次氯酸导致细胞组织损伤，会引发神经退行疾病、心血管疾病、肺损伤、动脉粥样硬化、骨关节炎和癌症等疾病。

因次，开发高特异性和高灵敏的荧光探针分子用于次氯酸的非侵入式和快速可视化检测具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种新的HClO检测的荧光探针分子及其制备方法，该探针分子对次氯酸具有良好的选择性和响应性。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的检测次氯酸的荧光探针分子，是一种HClO特异性响应的荧光探针分子，结构式为：

结构式中，R1是各自独立地选自氢原子，烷基或醚链，或环烷基，取代的烷基或环烷基。

所述的检测次氯酸的荧光探针分子，其采用2-6个碳的烷基或醚链，或环烷基，取代的烷基或环烷基。

所述的检测次氯酸的荧光探针分子，用于次氯酸的非侵入式和快速可视化检测。

本发明提供的检测次氯酸的荧光探针分子的制备方法，具体是采用以下合成路线方法制备上述的检测次氯酸的荧光探针分子：

上述符号中：S1是碱性蓝3，S2是酰硫类化合物；a代表反应条件为：连二亚硫酸钠、碳酸钠、超纯水、二氯甲烷，b代表反应条件为：碳酸钠、二氯甲烷。

本发明检测次氯酸的荧光探针分子的制备方法，其制备过程是：

(1)将化合物S1溶解在水中搅拌均匀，加入二氯甲烷和Na₂CO₃，然后混合物在40℃和氮气下搅拌均匀；

(2)将连二亚硫酸钠溶解在水中，用注射器将其直接注入上述反应体系中，再将反应液在40℃和氮气下搅拌直至溶液变色，然后将该体系在冰水浴下冷却；

(3)冷却至室温后，将体系中上层水相用注射器吸出；

(4)将酰硫类化合物S2溶解在二氯甲烷中，然后，冰浴条件下，将其滴加至上步骤(3)所述体系中并在室温下搅拌2小时，反应结束后，用二氯甲烷萃取并合并有机相；

(5)将所得有机相用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩用柱层析色谱法纯化。

(6)柱层析色谱法纯化，洗脱液采用乙酸乙酯和石油醚。

上述制备过程中，所述投料配比和洗脱液比例：

(1)将化合物S1(1.0g，0.77mmol)溶解在8mL水中搅拌均匀，加入4mL二氯甲烷和(326mg、3.08mmol、4.0当量)Na₂CO₃，然后混合物在40℃和氮气下搅拌均匀；

(2)将(1.07g、30.8mmol、4.0当量的)连二亚硫酸钠溶解在10mL水中，用注射器将其直接滴加上述反应体系中，再将反应液在40℃和氮气下搅拌直至溶液变色，然后将该体系在冰水浴下冷却；

(3)将体系中上层水相用注射器吸出，将(100mg1.0当量)酰硫类化合物S2溶解在5mL二氯甲烷中，然后，冰浴条件下，将其滴加至上述体系中并在室温下搅拌2小时，反应结束后，用二氯甲烷萃取并合并有机相；

(4)将所得有机相用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩用柱层析色谱法纯化，柱层析色谱法中洗脱液采用乙酸乙酯/石油醚＝1/10。

所述的次氯酸可以特异性的响应分子中硫酰胺单元。

所述的硫酰胺单元在合成路线过程中，硫酰胺单元的引入方法，以及在S1(碱性蓝3)上的引入位点。

本发明方法制备的检测次氯酸的荧光探针分子，用于次氯酸的非侵入式和快速可视化检测。

本发明与现有技术相比，具有以下主要的优点：

首次选用近红外荧光团碱性蓝3作为荧光分子骨架构筑HClO响应的探针分子，并巧妙运用还原态和氧化态的转变实现荧光开启；该类探针分子对HClO的响应速度快且检测限低；目标探针分子采用“一锅法”合成，所需装置简便，操作简单，目标产物易于纯化，所需原料简单易得、毒性小、成本低。在共轭骨架上不饱和的伯胺N原子上首次引入(酰硫双键)并能特异响应HClO，而且可以通过改变R1来设计不同类型的荧光探针，探针分子对HClO的选择特异性强、响应速度快、荧光强度的变化具有浓度依赖性，可实现定量分析，在复杂的体系中对HClO具有较高的选择性和特异性。

附图说明

图1是BR-1浓度为10μM，在不同浓度活性氧(H₂O₂、NO·、ROO·、ROOH和·OH)下存在荧光强度的变化示意图，HClO浓度为1μM。

图2是BR-1浓度为10μM，在0.25μM，0.5μM，1μM HClO存在下，反应动力学测试曲线图。

图3是BR-1浓度为10μM，在一定浓度范围HClO存在下，荧光强度随HClO浓度变化的示意图。

图4是BR-1浓度为10μM，在一定浓度范围HClO存在下，灵敏度的检测标准曲线示意图。

图5是BR-1浓度为10μM，HClO浓度为1μM时，对一些常见无机阳离子反应性能检测示意图，图中A-J分别为Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、NH₄ ⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺。阳离子浓度为100μM。

图6是BR-1浓度为10μM，HClO浓度为1μM时，对一些常见无机阴离子反应性能检测示意图，A'-H'分别为CO₃ ^2-、I^-、SO₄ ^2-、S₂O₃ ^2-、NO^2-、CH₃COO^-、F^-、Cl^-，阴离子浓度为100μM。

图7是BR-1浓度为10μM，HClO浓度1μM，氨基酸类化合物浓度100μM，检测其对氨基酸类化合物的响应示意图，其中A-Q分别为Cys、Phe、Ala、Gly、Asn、Glu、Gln、Met、Lys、Tyr、Pro、Typ、Ser、Thr、Val、Ile。

图8是BR-1浓度为10μM，巯基化合物(谷胱甘肽(GSH)浓度为0，10，25，50，100μM)时对探针的干扰测试示意图。

图9是BR-1浓度为10μM，巯基化合物(N-乙酰半胱氨酸(NAC))浓度为0，10，25，50，100μM)时对探针的干扰测试示意图。

图10是BR-1浓度为10μM，醛类化合物(甲醛)浓度为(0，10，25，50，100μM)时对探针的干扰测试示意图。

图11是BR-1浓度为10μM，醛类化合物(葡萄糖)浓度为(0，10，25，50，100μM)时对探针的干扰测试示意图。

图12是碱性蓝3浓度为10μM，HClO浓度为50μM时，探针光稳定性的测试。

具体实施方式

下面将结合实施例及附图对本发明作进一步说明，但不限定本发明。

实施例1

一种HClO特异性响应的荧光探针分子，结构式为：

实施例2

本实施例选取BR-1为案例做详细的说明。

称取纯度为25％碱性蓝3(1g，0.77mmol，1.0当量)溶解在8mL水中并搅拌均匀，再往体系中加入二氯甲烷(4mL)和Na₂CO₃(326mg，3.08mmol，4.0当量)，然后混合物在40℃和氮气下搅拌均匀。将连二亚硫酸钠(1.07g，30.8mmol，4.0当量)溶解在10mL水中，然后用注射器将其直接注入上述反应体系中。该反应液在40℃和氮气下搅拌直至溶液变色(通常在15-30分钟内)，然后将混合物用冰水浴冷却后将上层水相用注射器抽出。将二甲基硫代氨基甲酰氯(100mg，0.77mmol，1.0当量)溶解在5mL二氯甲烷中，然后将其用注射器滴加至上述溶液中并在室温下搅拌2小时。反应结束后，用二氯甲烷萃取并合并有机相，所得有机相用盐水洗涤，之后用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩用柱层析色谱法(乙酸乙酯/石油醚＝1/10)纯化，分离提纯后的黄绿色固体粉末100mg产率31％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝6.60(s,1H),6.26(d,J＝2.6Hz,2H),5.32(s,3H),3.44(s,6H),3.28(s,8H),1.14(t,J＝7.0Hz,12H).

¹³C NMR:(100MHz,CDCl₃),δ＝186.3,145.0,144.3,120.2,116.1,106.9,100.8,44.5,42.2,12.5.

HR-MS(ESI,m/z):calcd for C₂₃H₃₂N₄OS[M+H]⁺,413.2370,found 413.2374.

由以上的实施案例合成出来的化合物BR-1对不同类型的活性氧进行检测时，其对HClO具有较好的选择性，当大幅度地增大其他活性氧的浓度时，荧光强度变化不明显(附图1)。

本发明利用反应动力学，我们探究了在三种不同浓度HClO存在的条件下，荧光强度随时间的变化。实验发现，加入HClO后，荧光强度短时间内迅速增加并达到平衡，其响应时间和荧光强度均与HClO浓度相关，HClO浓度越高，响应时间越短，荧光强度越高，反之亦然(附图2)。

本发明采用荧光光谱测定研究BR-1对HClO的检测限，在一定的浓度范围内检测BR-1对HClO的检测限为3.7nM(附图3-4)，在所有已报道的检测次氯酸的探针该检测限相对较低，说明该探针分子对次氯酸的检测具有很高的灵敏度。

本发明通过荧光光谱测定研究BR-1对一些常见的阴离子、阳离子的选择性检测，发现即使在较高的浓度条件下，所用的阴阳离子也不会引起荧光强度的变化(附图5-6)；同时我们测试了该探针分子对其他生物活性物质(氨基酸类化合物)的选择性，HClO同样即使在较高浓度条件下也不会引起荧光强度的显著变化(附图7)。以上实验说明了该探针分子对次氯酸具有非常好选择性。

本发明测试了巯基化合物(谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC))和醛类化合物(醛和葡萄糖)对探针的干扰。低浓度还原性物质GSH和NAC不会引起BR-1对HClO的干扰检测，当还原性物质GSH和NAC的浓度增加时，由于这些物质会消耗次氯酸，因此观察到荧光强度显著降低，这从侧面说明只有当次氯酸存在时，探针分子才会有荧光的增强(附图8-9)。当甲醛、葡萄糖，醛类化合物存在时，荧光强度没有明显变化(附图10-11)，说明这些化合物不会对次氯酸的检测造成干扰。

本发明进一步测试了BR-1与HClO响应后生成的碱性蓝3的光稳定性，在高浓度HClO存在的条件下，一个小时内探针在不同培养基中荧光强度没有明显的变化，说明该化合物具有较高的稳定性(附图12)。

上述实施例的技术方案，体现了本发明的以下特点：

(1)首次构筑硫酰胺基团用于特异响应HClO，实现HClO的特异性检测。

(2)首次应用还原态的碱性蓝3构筑次氯酸响应的荧光点亮的荧光探针分子；

(3)该类探针分子采用“一锅法”合成，所需装置简便，易于操作，且产物易纯化，所需原料简单易得、毒性小、成本低。

上述实施例为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改、变化、变通或替换方案，均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测次氯酸的荧光探针分子，其特征是一种HClO特异性响应的荧光探针分子，结构式为：

2.根据权利要求1所述的检测次氯酸的荧光探针分子，其特征是R1采用2-6个碳的烷基或醚链，或环烷基，取代的烷基或环烷基。

3.根据权利要求1或2所述的检测次氯酸的荧光探针分子，用于次氯酸的非侵入式和快速可视化检测。

4.一种检测次氯酸的荧光探针分子的制备方法，其特征在于采用以下合成路线方法制备权利要求1或2所述的检测次氯酸的荧光探针分子：

5.根据权利要求4所述的检测次氯酸的荧光探针分子的制备方法，其特征在于制备过程是：

(3)冷却至室温后，将体系中上层水相用注射器吸出；

(6)柱层析色谱法纯化，洗脱液采用乙酸乙酯和石油醚。

6.根据权利要求5所述的检测次氯酸的荧光探针分子的制备方法，其特征在于投料配比和洗脱液比例：

(1)将(1.0g，0.77mmol)化合物S1溶解在8mL水中搅拌均匀，加入4mL二氯甲烷和(326mg、3.08mmol、4.0当量)Na₂CO₃，然后混合物在40℃和氮气下搅拌均匀；

(2)将(1.07g、30.8mmol、4.0当量)连二亚硫酸钠溶解在10mL水中，用注射器将其直接滴加上述反应体系中，再将反应液在40℃和氮气下搅拌直至溶液变色，然后将该体系在冰水浴下冷却；

7.根据权利要求4所述的次氯酸的荧光探针分子的制备方法，其特征在于次氯酸可以特异性的响应分子中硫酰胺单元。

8.根据权利要求4所述的检测次氯酸的荧光探针分子的制备方法，其特征在于硫酰胺单元在合成路线过程中，硫酰胺单元的引入方法，以及在S1(碱性蓝3)上的引入位点。

9.权利要求1至8中任一所述方法制备的检测次氯酸的荧光探针分子，用于次氯酸的非侵入式和快速可视化检测。