CN114380856B - 用于脑部硫化氢检测的硅罗丹明衍生物及制备方法与应用 - Google Patents
用于脑部硫化氢检测的硅罗丹明衍生物及制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域,具体公开了一种用于脑部硫化氢检测的硅罗丹明衍生物及制备方法与应用。所述硅罗丹明衍生物的化学式如(式I)所示,其中,R选自氢、羟基或甲氧基。所述硅罗丹明衍生物基于吲哚盐和硅罗丹明设计,以近红外荧光染料硅罗丹明(SiR)为主体荧光团,甲氧基或羟基取代的吲哚盐被引入以进一步调节分子的亲疏水性和电荷强度,使分子探针可以穿过血脑屏障。所述硅罗丹明衍生物可在体外或体内对H2S产生灵敏反应,通过反应产物亲疏水性的显著变化影响荧光强度的改变。本发明进一步将所述硅罗丹明衍生物用于脑部H2S的检测,为精神分裂症的病理研究和早期检测提供了有效解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种用于脑部硫化氢检测的硅罗丹明衍生物及制备方法与应用。
背景技术
大脑作为人类神经系统的最高层次,与阿尔茨海默病、精神分裂、帕金森病等多种疾病密切相关。其中精神分裂症是一种严重的慢性精神疾病,主要发生在青春期晚期和成年早期。精神分裂症的典型症状是幻觉、妄想和认知缺陷。由于这种疾病的复杂性,人们对精神分裂症的病理和发展还缺乏足够的认识。最近,Yoshikawa等人发现硫化氢的过度产生可能是精神分裂症的病理生理基础(EMBO.Mol.Med.2019,11,e10695)。然而,由于血脑屏障的存在,目前还没有可以实时监测脑部硫化氢水平变化的有效手段。
血脑屏障(BBB)是一种连续的内皮膜,主要由脑毛细血管内皮细胞组成,细胞间紧密连接密封,由血管壁细胞和血管周围星形胶质细胞末端包裹。BBB几乎阻止100%的大分子和98%的小分子(Neurobiol.dis.2010,37,48–57)。一些结构设计策略可以帮助有机小分子更容易穿过血脑屏障,例如增强有机小分子的脂溶性,LogP最好在3-5之间(LogP是脂水分配系数,LogP较大的化合物易溶于脂相,而LogP较小的化合物易溶于水相。);很少的氢键供体(少于3个);分子柔韧性低,可旋转键数少。然而,生物体内的环境十分复杂,上述策略也是仅供参考的可能因素,并不能通过这些策略就确定该分子一定能通过BBB。此外,用于生物体的小分子探针要求激发和发射波长优选在近红外区域,并且探针需要对目标分析物呈现响应。这些问题对于设计适合脑部硫化氢(H2S)检测的荧光探针非常苛刻。
罗丹明染料是经典的荧光标记试剂之一,具有高抗光漂白性。近年来,化学家通过用Si原子取代罗丹明分子中的O原子,获得了一种基于Si-罗丹明(SiR)的荧光探针。该类分子保留了罗丹明染料优良的光学特性,同时光谱明显红移,激发和发射基本达到NIR-I区(650-900nm)。而据我们所知,目前还没有关于血脑屏障通透性和检测脑内小信号分子的SiR的报道。硫化氢作为信号分子存在于哺乳动物细胞的细胞质和线粒体中,大脑是其产生和发挥功能的主要场所之一。近年来,虽然已经报道了许多可用于检测细胞内和体内硫化氢的近红外荧光探针,但还没有用于检测和成像动物脑内硫化氢的荧光探针。且根据Yoshikawa的报道,已知精神分裂症与脑内的硫化氢水平增加存在高度相关性。
因此,若开发出能够检测并成像脑内硫化氢的荧光探针,可为精神分裂症的病理研究和早期检测提供一种有效解决方案。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一类可以穿过血脑屏障的近红外荧光探针,并且可以灵敏的响应体外和体内的H2S,最终实现通过荧光强度的变化监测动物脑内H2S水平改变的目标。
为了实现本发明目的,本发明的技术方案如下:
第一方面,本发明提供一种用于脑部硫化氢检测的硅罗丹明衍生物,所述硅罗丹明衍生物的化学式如(式I)所示:
其中,R选自氢、羟基或甲氧基。
当R为氢时,所述衍生物命名为Indo-SiR;
当R为羟基时,所述衍生物命名为Hindo-SiR;
当R为甲氧基时,所述衍生物被命名为Mindo-SiR。
上述硅罗丹明衍生物分子本身在水相环境中处于荧光开启的状态;但当环境中存在H2S时,吲哚盐与HS-之间的加成反应会造成正电荷的消失。与硅罗丹明衍生物分子相比,反应产物的脂溶性会显著增加。基于SiR化合物的聚集会导致非荧光螺内酯的形成,反应产物呈现出比硅罗丹明衍生物分子更好的疏水性,并诱导荧光猝灭。
第二方面,本发明提供了前述硅罗丹明衍生物的制备方法。
当R为氢或甲氧基时,所述硅罗丹明衍生物的制备方法包括如下步骤:
(1)CHO-SiR的合成:将Br-SiR、4-甲酰基苯硼酸和四(三苯基膦)钯按照0.05~0.1:0.1~0.2:0.003~0.01的摩尔比混合溶解在THF中,使Br-SiR的摩尔浓度为5mM~10mM;
在搅拌下将饱和碳酸钾溶液加入到混合溶液中,所述饱和碳酸钾溶液的体积用量为THF体积用量的1/10;
在氮气氛下回流8~12h后,冷却至室温,去除溶剂,将残余物溶解在二氯甲烷中,并用饱和盐水洗涤2~3次,最后通过柱色谱法纯化得到黄色固体,即为CHO-SiR;
(2)indo-SiR/Mindo-SiR的合成:将步骤(1)所得的CHO-SiR分别和N-甲基-2,3,3-三甲基吲哚盐或N-甲基-5-甲氧基-2,3,3-三甲基吲哚盐按照1:2的摩尔比加入到无水乙醇中,在搅拌下加入哌啶,所述哌啶的体积用量为乙醇体积用量的1/100;并在氮气氛下回流8~12h;
反应完成后将混合物冷却到室温,去除溶剂,将残余物溶于二氯甲烷中,用盐水和水洗涤溶液,将有机层分离并干燥,通过柱色谱法纯化得到红褐色固体,即为R为氢或甲氧基的所述硅罗丹明衍生物。
进一步地,当R为羟基时,所述硅罗丹明衍生物的制备方法包括如下步骤:
(1)CHO-SiR的合成:将Br-SiR、4-甲酰基苯硼酸和四(三苯基膦)钯按照0.05~0.1:0.1~0.2:0.003~0.01的摩尔比混合溶解在THF中,使Br-SiR的摩尔浓度为5mM~10mM;
在搅拌下将饱和碳酸钾溶液加入到混合溶液中,所述饱和碳酸钾溶液的体积用量为THF体积用量的1/10;
在氮气氛下回流8~12h后,冷却至室温,去除溶剂,将残余物溶解在二氯甲烷中,并用饱和盐水洗涤2~3次,最后通过柱色谱法纯化得到黄色固体,即为CHO-SiR;
(2)Mindo-SiR的合成:将CHO-SiR和N-甲基-5-甲氧基-2,3,3-三甲基吲哚盐按照1:2的摩尔比加入到无水乙醇中,在搅拌下加入催化剂量哌啶;并在氮气氛下回流8~12h;
反应完成后将混合物冷却到室温,去除溶剂,将残余物溶于二氯甲烷中,用盐水和水洗涤溶液,将有机层分离并干燥,通过柱色谱法纯化得到红褐色固体;
(3)Hindo-SiR的合成:将Mindo-SiR溶解在二氯甲烷中,获得浓度为0.8~0.9mM的溶液,在冰水浴条件下,逐滴加入1M三溴化硼的二氯甲烷溶液,加入量为Mindo-SiR的5~15当量(mol/mol);
滴加完成后将反应缓慢升至室温,搅拌16~24h,用饱和碳酸氢钠水溶液猝灭剩余的三溴化硼,用二氯甲烷溶液对反应液进行萃取,再用无水硫酸镁干燥萃取液,去除溶剂,通过柱色谱纯化得到红褐色固体,即为R为羟基的所述硅罗丹明衍生物。
作为优选,步骤(1)中,Br-SiR、4-甲酰基苯硼酸和四(三苯基膦)钯的摩尔比为0.052:0.1:0.003。
作为优选,去除溶剂的方法可采用减压蒸馏或其他本领域常规的方法。
第三方面,本发明提供一种用于检测H2S的荧光探针或荧光成像试剂,该荧光探针或荧光成像试剂包括本发明前述硅罗丹明衍生物,或即为本发明前述硅罗丹明衍生物。
特别地,本发明所提供的荧光探针或荧光成像试剂可以穿透血脑屏障,实现脑内H2S的检测或监测。因此,可用于检测或监测动物脑内的H2S水平或水平的变化。
第四方面,本发明提供了前述硅罗丹明衍生物在制备用于脑部H2S检测试剂方面的应用。
进一步地,基于现有文献对精神分裂症与脑内的硫化氢水平增加存在高度相关性的报道,对H2S的检测可用于精神分裂的病理性研究,故本发明还提供了所述荧光探针在精神分裂小鼠治疗前后脑部荧光成像方面的应用,进一步表现为,本发明所述硅罗丹明衍生物在制备精神分裂症诊断试剂方面的用途。
本发明在具体实施方式中以Mindo-SiR作为示例性说明,展示了其可用于体外和体内环境中H2S的检测,Mindo-SiR在相同时间下更容易在脑部富集(图4(b))。同时本发明通过实验验证,Indo-SiR和Hindo-SiR由于同样具有的主体荧光团SiR以及H2S响应基团吲哚盐,也同样具有体内和体外硫化氢的检测能力以及穿过血脑屏障的能力。取代基的改变并不会影响吲哚盐和H2S的亲核加成反应。
因此,本发明所开发的硅罗丹明衍生物可对脑部通过外源注入H2S的模拟患病小鼠和实际患有精神分裂症的小鼠实现脑部H2S水平的检测。本发明所述硅罗丹明衍生物可有效穿透血脑屏障,实现对动物脑内H2S水平的实时荧光成像。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品,涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
本发明的有益效果在于:
本发明开发并合成了一种新型硅罗丹明衍生物,可作为近红外荧光探针有效地实现细胞内或体内H2S的检测与实时监测。不仅如此,其可高效穿透血脑屏障,实现对动物脑内H2S水平的实时荧光成像,可为精神分裂症的病理研究和早期检测提供一种有效解决方案。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分,示出了符合本发明的实施例,并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述硅罗丹明衍生物的合成路线。
图2为本发明所述硅罗丹明衍生物在水相环境中的光谱性质;其中,(a):三种探针的紫外吸收强度曲线,(b):三种探针的荧光强度曲线。
图3为本发明实施例中硅罗丹明衍生物的细胞内成像及线粒体共定位的应用。
图4为本发明实施例中硅罗丹明衍生物的脑部荧光成像和器官分布;其中,(a):三种探针在小鼠脑中的荧光成像,(b):三种探针在不同器官中的荧光强度。
图5为本发明实施例中硅罗丹明衍生物Mindo-SiR在溶液中与H2S的反应原理以及探针的紫外吸收强度和荧光强度的变化曲线曲线;其中,(a):Mindo-SiR在溶液中与H2S的反应原理,(b):Mindo-SiR随H2S浓度增加的紫外吸收强度曲线,(c):Mindo-SiR随H2S浓度增加的荧光强度曲线。
图6为本发明实施例中硅罗丹明衍生物Mindo-SiR和H2S反应产物的高分辨质谱。
图7为本发明实施例中Mindo-SiR检测bEnd.3细胞中外源性和内源性的H2S;其中,(a):Mindo-SiR检测bEnd.3细胞中外源性H2S的荧光成像,(b):Mindo-SiR检测半胱氨酸刺激bEnd.3细胞中产生的内源性H2S的荧光成像。
图8为本发明实施例中硅罗丹明衍生物Mindo-SiR检测活体小鼠脑中外源性的H2S。
图9为本发明实施例中硅罗丹明衍生物Mindo-SiR监测治疗前后SZ小鼠脑中内源性的H2S;其中,(a):随着时间变化,Mindo-SiR监测健康小鼠,SZ小鼠(MK-801刺激)和治疗组小鼠(MK-801+治疗药物利培酮)脑中硫化氢的水平变化,(b):(a)中小鼠脑部荧光强度随时间变化的线性关系,(c):(a)中小鼠解剖后大脑的荧光强度,(d):(c)中小鼠脑部荧光强度的柱状图,(e)和(f)分别为SZ小鼠和健康小鼠的照片。
图10为本发明实施例中硅罗丹明衍生物CHO-SiR的氢谱核磁图。
图11为本发明实施例中硅罗丹明衍生物Indo-SiR,Mindo-SiR和Hindo-SiR的氢谱核磁图。
图12为本发明实施例中硅罗丹明衍生物CHO-SiR和Indo-SiR的高分辨质谱。
图13为本发明实施例中硅罗丹明衍生物Mindo-SiR和Hindo-SiR的高分辨质谱。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施;显然,说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
其中,下述实施例中所述的Br-SiR为参考文献(Chem.Commun.2014,50,14374–14377.)记载的化合物,可参考文献中的合成方法合成。
实施例1硅罗丹明衍生物的制备方法与产物验证
1、CHO-SiR的合成
在100mL圆底双颈烧瓶中,Br-SiR(29.4mg,0.052mmol)、4-甲酰基苯硼酸(15mg,0.1mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(3.4mg,3μmol)溶解在10mL脱气的THF中。随后,在搅拌下将1mL饱和碳酸钾溶液加入到混合物中。氮气氛下回流12h后,冷却至室温,过滤,减压除去溶剂。将残余物溶解在二氯甲烷中,并用饱和盐水洗涤3次。使用石油醚:乙酸乙酯=5:1作为洗脱剂,最后通过柱层析得到黄色固体。
CHO-SiR的表征:1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.08(s,1H),8.08(d,J=7.4Hz,1H),7.97(s,2H),7.84(d,J=5.4Hz,1H),7.77(d,J=8.1Hz,2H),7.58(s,1H),6.95(s,2H),6.82(d,J=8.8Hz,2H),6.53(d,J=9.9Hz,2H),3.38(d,J=7.0Hz,8H),1.18(t,J=6.9Hz,12H),0.64(d,J=10.6Hz,6H).HR-MS(ESI,positive)calcd for C37H40N2O3Si[M+H]+588.28,found 588.28。
氢谱核磁图和高分辨质谱见图10和图12。
2、硅罗丹明衍生物的合成
2.1Indo-SiR的合成
向100mL圆底双口烧瓶中加入CHO-SiR(20mg,0.034mmol),N-甲基-2,3,3-三甲基吲哚盐(11.83mg,0.068mmol),溶于20mL无水乙醇,然后在搅拌下加入0.2ml哌啶,在氮气氛下回流12h后,将混合物冷却到室温,减压除去溶剂,将残余物溶于DCM,用盐水和水洗涤溶液,将有机层分离,并用硫酸镁干燥。蒸干溶剂后,用柱色谱法纯化,使用二氯甲烷:甲醇=30:1,作为洗脱剂,用柱色谱法纯化,最终得到红褐色固体。
Indo-SiR的表征:1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.29–8.23(m,3H),8.04(d,J=8.0Hz,1H),7.91(d,J=16.2Hz,1H),7.81(d,J=6.7Hz,1H),7.75(d,J=8.4Hz,2H),7.66(d,J=5.6Hz,1H),7.55(d,J=12.3Hz,4H),6.95(d,J=2.8Hz,2H),6.80(d,J=9.0Hz,2H),6.56–6.51(m,2H),4.49(s,3H),3.37(q,J=7.0Hz,8H),1.86(s,6H),1.16(t,J=7.0Hz,12H),0.64(d,J=22.0Hz,6H).HR-MS(ESI,positive)calcd for C49H54N3O2Si+[M-I]+744.40,found 744.40。
氢谱核磁图和高分辨质谱见图11和图12。
2.2Mindo-SiR的合成
向100mL圆底双口烧瓶中加入CHO-SiR(20mg,0.034mmol),N-甲基-5-甲氧基-2,3,3-三甲基吲哚盐(13.87mg,0.068mmol),溶于20mL无水乙醇,然后在搅拌下加入0.2ml哌啶,在氮气氛下回流12h后,将混合物冷却到室温,减压除去溶剂,将残余物溶于DCM,用盐水和水洗涤溶液,将有机层分离,并用硫酸镁干燥。蒸干溶剂后,用柱色谱法纯化,使用二氯甲烷:甲醇=30:1,作为洗脱剂,用柱色谱法纯化,最终得到红褐色固体。
Mindo-SiR的表征:1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.20(d,J=8.3Hz,2H),8.13(d,J=16.3Hz,1H),8.05(d,J=8.0Hz,1H),7.86–7.80(m,2H),7.76(d,J=8.3Hz,2H),7.65–7.56(m,2H),7.10–7.05(m,2H),6.95(d,J=2.8Hz,2H),6.81(d,J=8.9Hz,2H),6.54(dd,J=9.0,2.9Hz,2H),4.47(s,3H),3.92(s,3H),3.38(q,J=7.0Hz,8H),1.86(s,6H),1.17(t,J=7.0Hz,12H),0.64(d,J=19.1Hz,6H).HR-MS(ESI,positive)calcd forC50H56N3O3Si+[M-I]+774.41,found 774.41。
氢谱核磁图和高分辨质谱见图11和图13。
2.3Hindo-SiR的合成
向100mL圆底双口烧瓶中加入Mindo-SiR((14.79mg,0.017mmol)),20mL二氯甲烷,在冰水浴下,逐滴加入三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液)0.2mL,缓慢升至室温,常温下搅拌24h。用饱和碳酸氢钠水溶液猝灭剩余的三溴化硼,用二氯甲烷溶液萃取三次后,用无水硫酸镁干燥,蒸干溶剂,使用二氯甲烷:甲醇=20:1,作为洗脱剂,利用柱色谱纯化,最终得到红褐色固体。
Hindo-SiR的表征:1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.88(s,1H),8.12–8.03(m,3H),7.99(d,J=7.8Hz,2H),7.81(s,1H),7.74(d,J=7.8Hz,2H),7.60–7.57(m,1H),7.22(d,J=9.4Hz,2H),7.05(d,J=7.9Hz,2H),6.97(s,1H),6.83(d,J=8.7Hz,2H),6.56(s,2H),4.27(s,3H),3.42–3.34(m,8H),1.73(s,6H),1.17(t,J=7.0Hz,12H),0.65(d,J=16.4Hz,6H).HR-MS(ESI,positive)calcd for C49H54N3O3Si+[M-I]+760.39,found 760.39。
氢谱核磁图和高分辨质谱见图11和图13。
实施例2三种硅罗丹明衍生物的光谱性质
将三种探针溶解在二甲基亚砜(DMSO)中制成储备溶液(1mM),然后分别溶解在Tris缓冲液(PH=7.4,包含0.1%SDS助溶剂)中形成工作溶液(10μM)。随后,测试了它们的紫外-可见光谱和荧光光谱。根据紫外光谱分析表明三种硅罗丹明衍生物比未经修饰的SiR在400-550nm范围内增加了吸收峰,而650nm左右SiR的吸收峰没有受到明显的影响(图2a)。荧光依然处在近红外光区,最大发射为680nm处(图2b)。
实施例3三种硅罗丹明衍生物的细胞成像以及线粒体共定位
将浓度为10μM的三种探针(Mindo-SiR、Hindo-SiR和Indo-SiR)与MCF-7细胞孵育30分钟,去除培养基并与商业探针Rhod 123(2μM)孵育20分钟。最后,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞用于细胞成像。三种SiR衍生探针和Rhod 123的激发波长分别为638nm和488nm。
合并后的图像显示,Indo-SiR与Mindo-SiR这两个探针的皮尔逊相关系数分别为86.7%与85.5%,显示了非常优秀的细胞内线粒体靶向性(图3a和图3b)。而Hindo-SiR的皮尔逊相关系数为62.7%,显示细胞内线粒体靶向性较差(图3c)。
实施例4三种硅罗丹明衍生物在小鼠脑部荧光成像和器官分布
通过尾静脉向三只健康的昆明小鼠(7周龄)注射三种探针(5mL/kg,在1:20DMSO/PBS中,v/v)。随后,所有三只小鼠都用异氟醚麻醉,并在大约30分钟内用于小动物活体成像。成像完成后处死动物,解剖取出脑、心、肝、脾、肺、肾等脏器,PBS洗去残留血液,进行荧光成像。
结果显示三种探针均具有一定的血脑屏障渗透性,都可以用于脑部荧光成像(图4a)。然而,如图4b所示,它们的器官分布有着明显的区别。Indo-SiR探针的荧光信号主要集中在脑,肝以及脾三种器官。而Hindo-SiR由于羟基的存在具有较好的亲水性以及形成氢键的能力,该探针的荧光信号主要集中在肾脏以及肺部。而Mindo-SiR的荧光信号则主要集中在肝脏以及脑中。
实施例5硅罗丹明衍生物Mindo-SiR与H2S的光谱学变化
探针MIndo-SiR在H2S存在下,紫外-可见光或荧光光谱的变化。两个探针都在610nm处激发。在室温下从630到800nm扫描荧光发射光谱。向Mindo-SiR(20μM)溶液中添加NaHS(从0到40μM),可以发现440nm以及650nm处的紫外吸收峰,680nm处的荧光发射峰都在逐渐降低直到最后消失(图5)。反应产物HS-Mindo-SiR进一步通过高分辨质谱表征,m/z为806.3973(图6)。
实施例6 Mindo-SiR检测bEnd.3细胞中外源性和内源性的H2S
将10μM探针与活细胞一起孵育45min,然后进行成像,可以从图像看到细胞中明亮的荧光,随后将细胞与(40μM)的NaSH共孵育,每15min记录一次图像。激发波长为638nm。结果如图7a所示,可以发现荧光强度随着时间在快速减弱,到1h左右荧光已经基本消失。结果表明该探针可用于细胞中外源性H2S的检测。
随后我们探究了Mindo-SiR用于细胞内源性H2S检测的能力。将(10μM)探针与活细胞一起孵育45min,然后进行成像,可以从图像看到细胞中明亮的荧光,随后将细胞与(200μM)的半胱氨酸(Cys)共孵育,每15min记录一次图像。激发波长为638nm。结果如图7b所示,到1h左右荧光强度与孵育之前相比有了一定程度的降低。结果表明该探针可用于细胞中内源性H2S的检测。
实施例7硅罗丹明衍生物Mindo-SiR监测活体小鼠脑中外源性的H2S水平变化
为排除颅内注射以及溶剂的影响,我们选取了三只8周龄的健康C57/BL6小鼠进行实验。两只小鼠分别颅内注射10微升的PBS与NaSH(50μM)。半个小时后对三只小鼠同时进行尾部静脉注射Mindo-SiR(0.5mg/kg,5mL/kg in 1:20DMSO/PBS,v/v)。最后,将三只小鼠用于小动物活体成像,观察它们的脑部荧光强度的变化。结果如图8所示,与前两只对照组小鼠相比,实验组小鼠脑部荧光强度明显降低。这个结果表明使用额外的NaHS,可以猝灭Mindo-SiR在脑中的荧光。
实施例8硅罗丹明衍生物Mindo-SiR监测治疗前后SZ小鼠脑中内源性的H2S水平变化
地佐环平马来酸盐地唑西平(MK-801)作为一种有效、选择性的非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)拮抗剂,被广泛用于诱导精神分裂症的药理动物模型(Schizophr.Res.2007,97,254-263.)。利培酮(Risperidone)是一种治疗急性和慢性精神分裂症的药物。
实验小鼠均被尾部静脉注射Mindo-SiR(0.5mg/Kg),并在不同时间进行脑荧光成像。如图9a和图9b所示,对照组小鼠脑部显示出明亮的荧光,其强度几乎是其他组的1.5倍。与对照组相比,SZ组小鼠脑内荧光强度显著降低,表明SZ组小鼠脑内H2S水平呈显著上调从而淬灭了Mindo-SiR的荧光。用利培酮(1mg/Kg)治疗3天后,SZ小鼠的脑区荧光有一定程度的恢复。如图9c和图9d所示,三只小鼠的解剖脑组织也显示MK-801(+)组的荧光显著降低,而治疗组的荧光略有恢复。这些结果表明Mindo-SiR可用于实时成像SZ小鼠药物治疗前后大脑中H2S水平的变化。
以上所述仅是本发明的具体实施方式,使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
2.权利要求1所述硅罗丹明衍生物的制备方法,其特征在于,R为氢或甲氧基,所述硅罗丹明衍生物的制备方法包括如下步骤:
(1)将Br-SiR、4-甲酰基苯硼酸和四(三苯基膦)钯按照0.05~0.1:0.1~0.2:0.003~0.01的摩尔比混合溶解在THF中,使Br-SiR的摩尔浓度为5mM~10mM;
在搅拌下将饱和碳酸钾溶液加入到混合溶液中,所述饱和碳酸钾溶液的体积用量为THF体积用量的1/10;
在氮气氛下回流8~12h后,冷却至室温,去除溶剂,将残余物溶解在二氯甲烷中,并用饱和盐水洗涤2~3次,最后通过柱色谱法纯化得到黄色固体;
其中,Br-SiR的结构式如下所示:
(2)将步骤(1)所得分别和N-甲基-2,3,3-三甲基吲哚盐或N-甲基-5-甲氧基-2,3,3-三甲基吲哚盐按照1:2的摩尔比加入到无水乙醇中,在搅拌下加入哌啶,所述哌啶的体积用量为乙醇体积用量的1/100;并在氮气氛下回流8~12h;
反应完成后将混合物冷却到室温,去除溶剂,将残余物溶于二氯甲烷中,用盐水和水洗涤溶液,将有机层分离并干燥,通过柱色谱法纯化得到红褐色固体,即为R为氢或甲氧基的所述硅罗丹明衍生物。
3.权利要求1所述硅罗丹明衍生物的制备方法,其特征在于,R为羟基,所述硅罗丹明衍生物的制备方法包括如下步骤:
(1)将Br-SiR、4-甲酰基苯硼酸和四(三苯基膦)钯按照0.05~0.1:0.1~0.2:0.003~0.01的摩尔比混合溶解在THF中,使Br-SiR的摩尔浓度为5mM~10mM;
在搅拌下将饱和碳酸钾溶液加入到混合溶液中,所述饱和碳酸钾溶液的体积用量为THF体积用量的1/10;
在氮气氛下回流8~12h后,冷却至室温,去除溶剂,将残余物溶解在二氯甲烷中,并用饱和盐水洗涤2~3次,最后通过柱色谱法纯化得到黄色固体;
(2)将步骤(1)所得和N-甲基-5-甲氧基-2,3,3-三甲基吲哚盐按照1:2的摩尔比加入到无水乙醇中,在搅拌下加入催化剂量哌啶;并在氮气氛下回流8~12h;
反应完成后将混合物冷却到室温,去除溶剂,将残余物溶于二氯甲烷中,用盐水和水洗涤溶液,将有机层分离并干燥,通过柱色谱法纯化得到红褐色固体;
(3)将步骤(2)所得溶解在二氯甲烷中,制备浓度为0.8~0.9mM的溶液,在冰水浴条件下,逐滴加入1M三溴化硼的二氯甲烷溶液,加入量为步骤(2)所得的5~15当量;
滴加完成后反应缓慢升至室温,搅拌16~24h,用饱和碳酸氢钠水溶液猝灭剩余的三溴化硼,用二氯甲烷溶液对反应液进行萃取,再用无水硫酸镁干燥萃取液,去除溶剂,通过柱色谱纯化得到红褐色固体,即为R为羟基的所述硅罗丹明衍生物。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法,其特征在于,Br-SiR、4-甲酰基苯硼酸和四(三苯基膦)钯的摩尔比为0.052:0.1:0.003。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法,其特征在于,采用减压蒸馏的方法去除溶剂。
6.一种用于检测H2S的荧光探针或荧光成像试剂,其特征在于,包括权利要求1所述的硅罗丹明衍生物,或为权利要求1所述的硅罗丹明衍生物。
7.根据权利要求6所述的荧光探针或荧光成像试剂,其特征在于,所述荧光探针或荧光成像试剂可以穿透血脑屏障。
8.根据权利要求6或7所述的荧光探针或荧光成像试剂,其特征在于,用于检测或监测动物脑内的H2S水平或水平的变化。
9.权利要求1所述的硅罗丹明衍生物在制备用于脑部H2S检测试剂方面的应用。
10.权利要求1所述的硅罗丹明衍生物在制备精神分裂症诊断试剂方面的应用。
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