CN107400070A - 双胍类探针及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了化合物、其制备方法及在制备试剂盒中的用途、筛选药物靶标的方法以及确定样本中是否存在药物靶标的方法。所述化合物具有：活性基团；以及潜在报告基团，其中，所述活性基团具有下式所示的结构，所述潜在报告基团为炔基。本发明的化合物能够特异性识别并结合双胍类药物的体内作用靶标，不影响细胞的通透性，且易于观察、分离、纯化靶蛋白。化合物同时兼具双胍类药物活性，对于双胍类药物的体内作用靶标以及药物与靶标的作用模式、活性位点等结构信息的研究具有重要意义。

Description

双胍类探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及双胍类探针及其制备方法。

背景技术

双胍类药物是一系列从山羊豆碱(galegine，异戊烯胍)衍生而来的，含有双胍结构的化合物，结构式如下所示：

曾有三种双胍化合物被开发成糖尿病药物：二甲双胍、苯乙双胍和丁双胍，其中苯乙双胍和丁双胍由于乳酸血症和心脏毒性的高风险，在上世纪70年代被撤出市场，而二甲双胍表现出了非常好的药物安全性和耐受性指标。多项研究(Gaochao Zhao et al.,2001；Shinichi Ota et al.,2009；Andre Madsen et al.,2015)显示，二甲双胍通过激活AMPKα、下调糖异生途径关键基因的表达，抑制小鼠肝原代细胞的糖异生来降低血糖。同时，研究表明二甲双胍在控制体重(Seifarth et al.,2013)、降低心血管病风险(UKPDS,1998)、降低肿瘤发病率(Evans et al.,2005)等方面都有积极的效果。尽管二甲双胍在临床上被证明是一种毒副作用非常小，且针对多个病种有治疗效果的安全的药物，但它在体内的作用靶标及其与靶蛋白的作用模式等信息尚未阐明，设计、制备双胍类药物探针，发现药物靶标对于抗糖尿病、抗肿瘤药物的研发具有积极的推动作用。

然而，目前双胍类药物检测探针仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了一种化合物、其制备方法及用途、筛选药物靶标的方法以及确定样本中是否存在药物靶标的方法。本发明的化合物能够特异性识别并结合双胍类药物的体内作用靶标，不影响细胞的通透性，且易于观察、分离、纯化靶蛋白。同时兼具双胍类药物活性，对于双胍类药物的体内作用靶标以及药物与靶标的作用模式、活性位点等结构信息的研究具有重要意义。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物具有：活性基团；以及潜在报告基团，其中，所述活性基团具有下式所示的结构，

所述潜在报告基团为炔基，

首先，发明人以双胍类药物基本结构作为活性基团，其能够特异性识别并结合药物靶标。

进一步，发明人发现，通常的报告基团(例如荧光素、生物素等)体积较大，若直接与上述活性基团相连，会影响活性基团与药物靶标的识别及结合，容易出现非特异性结合。进而，发明人经过大量实验发现，采用小分子的炔基作为潜在报告基团，利用炔基能够通过点击化学反应连接上含有叠氮基团的标签基团的特性，既可以实现富集、分离、提纯药物靶标的效果(例如与叠氮生物素相连)，也可以用于荧光标记(例如与叠氮荧光素相连)，也不影响细胞对该化合物的吸收以及活性基团对药物靶标的特异性识别及结合。

根据本发明的实施例，所述化合物还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述化合物进一步具有：光亲和标记基团。由此，能够使得活性基团与药物靶标共价结合，且便于观察。

根据本发明的实施例，所述光亲和标记基团具有下式所示的结构。由此，能够使得活性基团与药物靶标共价结合，且便于观察。

根据本发明的实施例，所述化合物具有下式所示的结构，

根据本发明的实施例，所述化合物进一步具有：标签基团，所述标签基团为叠氮-聚乙二醇-生物素或叠氮-聚乙二醇-荧光素。由此，实现对药物靶标的富集、分离和纯化，或用于荧光标记。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将2-苯乙胺盐酸盐、三乙胺和乙酰氯进行反应，以便得到式I所示化合物；将所述式I所示化合物、三氯化铝、硝基苯、4-甲氧基苯甲酰氯进行反应，以便得到式II所示化合物；在溴化氢的作用下，使所述式II所示化合物还原，以便得到式III所示化合物；将所述式III所示化合物与炔丙基溴进行反应，以便得到式IV所示化合物；将所述式IV所示化合物与浓盐酸进行反应，以便得到式V所示化合物；以及将所述式V所示化合物与双氰胺在邻二氯苯中进行反应，以便得到前面所述化合物，其中，式I～V所示化合物的结果如下所示。发明人经过大量实验得到上述较佳的化合物合成方法，该方法操作简便，化合物得率较高，副产物较少。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述化合物在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于筛选药物靶标或确定样本中存在药物靶标。本发明的化合物能够特异性识别并结合双胍类药物的体内作用靶标，同时兼具双胍类药物活性。由此，能够准确、快速地筛选药物靶标或确定样本中存在药物靶标。

根据本发明的实施例，所述药物靶标为双胍类药物靶蛋白，所述化合物抑制G6pc基因的表达，激活Thr172蛋白磷酸化。发明人发现，该化合物能够抑制G6pc基因的表达，激活AMPKα蛋白Thr172磷酸化。由此，表明其具有双胍类药物的活性，能够特异性识别并结合双胍类药物的体内作用靶标—双胍类药物靶蛋白。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选药物靶标的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测样本与前面所述化合物接触，所述化合物能够特异性识别并结合所述待测样本中的药物靶标；以及分离与所述化合物结合的药物靶标。本发明的化合物中的活性基团能够特异性识别并结合药物靶标，并且在光亲和标记基团作用下实现共价结合。化合物中的潜在报告基团炔基可以通过点击化学反应连接上标签基团，从而富集、分离和纯化药物靶标，或用于荧光标记。由此，利用本发明实施例的方法能够准确地筛选出药物靶标，且操作简便。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种确定样本中是否存在药物靶标的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将样本与前面所述化合物接触；以及对可检测信号进行检测，其中，所述可检测信号产生是所述样本中存在药物靶标的指示。本发明的化合物能够进入细胞，活性基团能够特异性识别并结合药物靶标，活性基团连接的光亲和标记基团能够产生可检测信号。进而，若产生可检测信号，则表明样本中存在药物靶标。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的制备化合物的流程示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的对小鼠肝原代细胞的G6PC基因表达量分析；

图3显示了根据本发明一个实施例的western blot分析；以及

图4显示了根据本发明一个实施例的靶标识别荧光信号分析图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

本发明提出了化合物、其制备方法、其在制备试剂盒中的用途、筛选药物靶标的方法以及确定样本中是否存在药物靶标的方法。下面将分别对其进行详细描述。

化合物

在本发明的一个方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物具有：活性基团；以及潜在报告基团，其中，所述活性基团具有下式所示的结构，

所述潜在报告基团为炔基。

首先，发明人以双胍类药物基本结构作为活性基团，其能够特异性识别并结合药物靶标。

进一步，发明人发现，通常的报告基团(例如荧光素、生物素等)体积较大，若直接与上述活性基团相连，会影响活性基团与药物靶标的识别及结合。进而，发明人经过大量实验发现，采用小分子的炔基作为潜在报告基团，利用炔基能够通过点击化学反应连接上含有叠氮基团的标签基团的特性，既可以实现富集、分离、提纯药物靶标的效果(例如与叠氮生物素相连)，也可以用于荧光标记(与叠氮荧光素相连)，也不影响细胞对该化合物的吸收以及活性基团对药物靶标的特异性识别及结合。

根据本发明的实施例，化合物进一步具有：光亲和标记基团。光亲和标记基团的引入便于直观地展示活性基团与靶标蛋白的结合。另外，相比亲和纯化依赖于小分子和蛋白质的非共价相互作用，在激发光激活条件下，光亲和标记基团与靶蛋白可形成共价键，因此能够检测许多微弱的分子间相互作用。

根据本发明的实施例，光亲和标记基团具有下式所示的结构。发明人在众多光亲和标记基团中发现了上述较佳的光亲和标记基团，其既不影响化合物的活性，保证其具备双胍类药物的活性，也不影响活性基团与药物靶标的特异性识别和结合，又不影响细胞对于化合物的吸收。另外，二苯甲酮具有良好的化学稳定性和可见光稳定性，合成方法简单。

根据本发明的实施例，化合物具有下式所示的结构。发明人经过大量实验得到上述较佳的化合物，其能够特异性识别并结合双胍类药物的体内作用靶标，且易于观察、分离、纯化靶蛋白。兼具双胍类药物活性，对于双胍类药物的体内作用靶标以及药物与靶标的作用模式、活性位点等结构信息的研究具有重要意义。

根据本发明的实施例，化合物进一步具有：标签基团，标签基团为叠氮-聚乙二醇-生物素或叠氮-聚乙二醇-荧光素。发明人发现，该标签基团中的叠氮基团能够通过点击化学反应连接上潜在报告基团炔基，从而实现对药物靶标的富集、分离和纯化，或者荧光标记。具体地，具有活性基团、光亲和标记基团和潜在报告基团的化合物进入细胞后，活性基团特异性识别并结合药物靶标，在紫外光照射下进行光激活，然后裂解细胞，并利用点击化学反应将炔基连接上标签基团，反应完成后，使用链霉亲和素磁珠进行亲和纯化，在避光处直接进行SDS-PAGE，电泳结束后将PAGE胶固定，使用荧光成像系统观察荧光，并将疑似靶蛋白切胶回收进行LC/MS鉴定，从而实现药物靶标的富集、分离和鉴定。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将2-苯乙胺盐酸盐、三乙胺和乙酰氯进行反应，以便得到式I所示化合物；将式I所示化合物、三氯化铝、硝基苯、4-甲氧基苯甲酰氯进行反应，以便得到式II所示化合物；在溴化氢的作用下，使式II所示化合物还原，以便得到式III所示化合物；将式III所示化合物与炔丙基溴进行反应，以便得到式IV所示化合物；将式IV所示化合物与浓盐酸进行反应，以便得到式V所示化合物；以及将式V所示化合物与双氰胺在邻二氯苯中进行反应，以便得到前面化合物，其中，式I～V所示化合物的结果如下所示。发明人经过大量实验得到上述较佳的化合物合成方法，该方法操作简便，化合物得率较高，副产物较少。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对化合物所描述的特征和优点，同样适用于该制备化合物的方法，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述化合物在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，该试剂盒用于筛选药物靶标或确定样本中存在药物靶标。本发明的化合物能够特异性识别并结合双胍类药物的体内作用靶标，同时兼具双胍类药物活性。由此，能够准确、快速地筛选药物靶标或确定样本中存在药物靶标。

根据本发明的实施例，药物靶标为双胍类药物靶蛋白，化合物抑制G6pc基因的表达，激活AMPKα蛋白Thr172磷酸化。发明人发现，该化合物能够抑制G6pc基因的表达，激活AMPKα蛋白Thr172磷酸化。由此，表明其具有双胍类药物的活性，能够特异性识别并结合双胍类药物的体内作用靶标—双胍类药物靶蛋白。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对化合物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选药物靶标的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将待测样本与前面所述化合物接触，该化合物能够特异性识别并结合待测样本中的药物靶标；以及分离与化合物结合的药物靶标。本发明的化合物中的活性基团能够特异性识别并结合药物靶标，并且在光亲和标记基团作用下实现共价结合。化合物中的潜在报告基团炔基可以通过点击化学反应连接上标签基团，从而富集、分离和鉴定药物靶标。由此，利用本发明实施例的方法能够准确地筛选出药物靶标，且操作简便。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对化合物所描述的特征和优点，同样适用于该筛选药物靶标的方法，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种确定样本中是否存在药物靶标的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将样本与前面所述化合物接触；以及对可检测信号进行检测，其中，可检测信号产生是样本中存在药物靶标的指示。本发明的化合物能够进入细胞，活性基团能够特异性识别并结合药物靶标，活性基团连接的光亲和标记基团能够产生可检测信号。进而，若产生可检测信号，则表明样本中存在与化合物的活性基团特异性结合的药物靶标。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对化合物所描述的特征和优点，同样适用于该确定样本中是否存在药物靶标的方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在该实施例中，按照图1合成式Ⅵ所示化合物：

第一步：化合物I的制备：

将15.0g 2-苯乙胺盐酸盐加入到500mL DCM中，在冰上加入24.5g三乙胺和9.0g乙酰氯，在冰上搅拌反应5小时。使反应液恢复至室温，使用水和卤水清洗。有机相使用无水硫酸钠干燥，浓缩后的到粗品，经色谱纯化后得到白色固体化合物I 13.9g，纯度90％。

第二步：化合物II的制备：

将14.7g三氯化铝加入300mL硝基苯，置于冰上，缓慢滴入18.8g 4-甲氧基苯甲酰氯。冰上搅拌30分钟后，加入12.0g化合物I，加热至100℃，搅拌反应过夜。反应液自然冷却至室温后，倒入冰水，搅拌1小时。加入乙酸乙酯萃取，用水和卤水清洗后，将有机相使用无水硫酸钠干燥、减压浓缩，色谱纯化后得到白色固体化合物II 11.3g，纯度52％。

第三步：化合物III的制备：

将10.0g化合物II溶于100mL乙醇，加入200mL溴化氢(33％乙酸溶液)，密封后，于100℃搅拌反应12小时。冷却至室温后，将反应液倒入500mL水中，使用200mL乙酸乙酯萃取，重复3次。将萃取液混合，使用卤水清洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，色谱柱纯化后得到白色固体化合物III 7.2g，纯度76％。

第四步：化合物IV的制备

将5.0g化合物III溶于300mL甲醇，加入3.15g炔丙基溴和2.2g碳酸氢钠，回流反应6小时。减压去除溶剂，色谱柱纯化后得到白色固体化合物IV 5.1g，纯度90％。

第五步：化合物V的制备

将1.1g化合物IV溶于20mL乙醇，加入20mL浓盐酸，回流反应过夜。使用乙酸乙酯20mL萃取三次，将萃取液合并后，使用无水硫酸钠干燥浓缩，色谱柱纯化得到白色固体化合物V 425mg，纯度44％。

第六步：基于双胍类药物的光亲和标记小分子探针VI的制备

将279mg化合物V溶于5mL二氧六环，加入5mL 4M盐酸(溶于二氧六环)，室温搅拌反应1小时。滤纸过滤收集沉淀，用5mL乙醚洗两次，得到化合物V的盐酸盐，为白色固体。将化合物V的盐酸盐与84mg双氰胺混合加入20mL邻二氯苯，150℃搅拌反应5小时。冷却至室温后，去除溶剂，将1mL甲醇和50mL乙醚加入沉淀，过滤收集沉淀，得到基于双胍类药物的光亲和标记小分子探针VI 350mg，纯度88％，为白色固体。

实施例2

提取小鼠肝原代细胞并种入6孔板，实验前约80％汇合度。分别加入不含(阴性对照组)、含有不同浓度二甲双胍、苯乙双胍(阳性对照组)或含有不同浓度化合物VI(实验组)的培养基，37℃孵育30分钟，之后去除培养基并用冰冷PBS洗细胞3次，收集细胞，提取RNA，反转录为cDNA后，利用qPCR法检测G6PC的基因表达变化。结果如图2所示。

提取小鼠肝原代细胞并种入6孔板，实验前约80％汇合度。分别加入不含(阴性对照组)、含有不同浓度二甲双胍、苯乙双胍(阳性对照组)或含有不同浓度化合物VI(实验组)的培养基，37℃孵育30分钟，之后去除培养基并用冰冷PBS洗细胞3次，收集细胞并提取蛋白进行Western Blo分析，结果如图3所示。

从该结果可以看出，化合物VI具备双胍类药物可以抑制G6PC基因表达、促进AMPKα蛋白Thr172磷酸化的特性，甚至该化合物抑制G6PC基因表达、促进AMPKα蛋白Thr172磷酸化的活性明显优于二甲双胍、苯乙双胍，表明该化合物具备作为双胍类药物靶标蛋白识别探针的可行性。

提取小鼠肝原代细胞并种入6孔板，实验前约80％汇合度。加入不含(对照组)或含有10μM化合物VI(实验组)的培养基，37℃孵育30分钟进行光亲和标记，然后在紫外光照射下进行光激活，之后去除培养基并用冰冷PBS洗细胞3次，收集细胞、裂解，细胞裂解液与叠氮-聚乙二醇-生物素进行点击化学反应；反应完成后，使用链霉亲和素磁珠进行亲和纯化，在避光处直接进行SDS-PAGE，电泳结束后将PAGE胶固定，使用荧光成像系统观察荧光，有荧光的条带即为化合物VI的靶蛋白(图4)。

对比例1

发明人设计了化合物2，其与化合物VI的区别在于化合物2的标记基团为芳基。由于化合物2并不能够产生荧光信号，故采用磁珠亲和纯化方式确认双胍类药物靶标蛋白的方法，具体步骤如下：

提取小鼠肝原代细胞并种入6孔板，实验前约80％汇合度。分别加入不含(阴性对照组)、含有不同浓度二甲双胍、苯乙双胍(阳性对照组)或含有不同浓度化合物2(实验组)的培养基，37℃孵育30分钟。结果发现化合物2也具有双胍类药物可以抑制G6PC基因表达、促进AMPKα蛋白Thr172磷酸化的特性，具备作为双胍类药物靶标蛋白识别探针的可行性。

提取小鼠肝原代细胞并种入6孔板，实验前约80％汇合度。加入不含(对照组)或含有10μM化合物2(实验组)的培养基，37℃孵育30分钟进行光亲和标记，之后去除培养基并用冰冷PBS洗细胞3次，收集细胞、裂解，将化合物2通过点击化学反应直接连接到链霉亲和素磁珠上，对磁珠进行洗脱，对洗脱样品进行SDS-PAGE银染色分析，发现低标记量的磁珠没有获得目标条带，而高标记量的磁珠非特异性静电吸附现象严重。

发明人推测，很可能是因为化合物2与二甲双胍类似，在中性pH值附近，每个化合物2分子都带有一个正电荷，因此磁珠表面固定的化合物2越多，带电量越大，导致磁珠表面的正电非特异性地富集带有负电的蛋白质。后期尝试使用化合物2先与叠氮-生物素反应，再连接到链霉亲和素磁珠上，发现高浓度化合物2固定时，同样有严重的非特异性静电吸附现象。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种化合物，其特征在于，具有：

活性基团；以及

潜在报告基团，

其中，所述活性基团具有下式所示的结构：

所述潜在报告基团为炔基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，进一步具有：光亲和标记基团。

3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述光亲和标记基团具有下式所示的结构：

4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，具有下式所示的结构：

5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，进一步具有：标签基团，

所述标签基团为叠氮-聚乙二醇-生物素或叠氮-聚乙二醇-荧光素。

6.一种制备权利要求1～5任一项所述化合物的方法，其特征在于，包括：

将2-苯乙胺盐酸盐、三乙胺和乙酰氯进行反应，以便得到式I所示化合物；

将所述式I所示化合物、三氯化铝、硝基苯、4-甲氧基苯甲酰氯进行反应，以便得到式II所示化合物；

在溴化氢的作用下，使所述式II所示化合物还原，以便得到式III所示化合物；

将所述式III所示化合物与炔丙基溴进行反应，以便得到式IV所示化合物；

将所述式IV所示化合物与浓盐酸进行反应，以便得到式V所示化合物；以及

将所述式V所示化合物与双氰胺在邻二氯苯中进行反应，以便得到权利要求1～5任一项所述化合物，

其中，式I～V所示化合物的结果如下所示：

7.权利要求1～5任一项所述化合物在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于筛选药物靶标或确定样本中存在药物靶标。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物靶标为双胍类药物靶蛋白，

所述化合物抑制G6pc基因的表达，激活AMPKα蛋白Thr172磷酸化。

9.一种筛选药物靶标的方法，其特征在于，包括：

将待测样本与权利要求1～5任一项所述化合物接触，所述化合物能够特异性识别并结合所述待测样本中的药物靶标；以及

分离与所述化合物结合的药物靶标。

10.一种确定样本中是否存在药物靶标的方法，其特征在于，包括：

将样本与权利要求1～5任一项所述化合物接触；以及

对可检测信号进行检测，

其中，所述可检测信号产生是所述样本中存在药物靶标的指示。