CN113354612B

CN113354612B - 基于吡罗红的线粒体和核仁rna近红外荧光探针、制备及应用

Info

Publication number: CN113354612B
Application number: CN202110659481.7A
Authority: CN
Inventors: 孙远强; 宋琰; 李朝辉
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2041-06-15
Also published as: CN113354612A

Abstract

本发明提供了一种基于吡罗红的线粒体和核仁RNA近红外荧光探针、制备及应用，结构式如下：

，探针由于苯乙烯基团的引入，导致共轭结构增大，可以有效地避免生物自发荧光的干扰。基于探针在低粘度体系中不具有荧光，在高粘度体系中具有红色荧光的现象，探针在和RNA相互结合后，苯乙烯键的旋转受到抑制，发出荧光，实现了对RNA的检测。

Description

基于吡罗红的线粒体和核仁RNA近红外荧光探针、制备及应用

技术领域

本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种基于吡罗红的线粒体和核仁RNA近红外荧光探针、制备及应用。

背景技术

核糖核酸（RNA）作为遗传信息的载体，在蛋白质合成、传递遗传信息、基因调控中起着重要的作用。RNA的种类包括：核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）和信使RNA（mRNA），其中核糖体RNA主要存在于核仁中，且含量最高，约占82%。核仁作为真核细胞细胞核中的一部分，是核糖体RNA生产、加工和组装的场所。核仁的大小及数量在生理和病理情况下会发生变化，可作为癌症等疾病的重要指标。线粒体中也含有丰富的RNA，在蛋白质表达，调控RNA稳定性、修饰和讲解中行使重要的功能。目前商业化的RNA染料只有“SYTO RNA-Select”一种，发绿色荧光，且该染料存在着成本较高、只能染色固定的细胞（不能染色活细胞），不能染色线粒体RNA等问题。具有近红外发射的荧光探针可避免生物自发荧光等干扰，在组织成像中展现出独特的优势。因此开发一种合成简单、对线粒体和核仁中RNA实时成像的近红外探针具有重要意义。

发明内容

本发明提出了一种基于吡罗红的RNA荧光探针、制备及应用，探针由于苯乙烯基团的引入，导致共轭结构增大，可以有效地避免生物自发荧光的干扰。

实现本发明的技术方案是：

一种基于吡罗红的RNA荧光探针，结构式如下：

。

所述的RNA荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）在0 °C、氮气环境中，将氧杂蒽酮溶于无水四氢呋喃中，向上述反应液中缓慢加入甲基溴化镁的THF溶液，室温下搅拌过夜，反应结束后用水猝灭、DCM萃取、减压去除溶剂，得到的产物重新溶解在乙腈和高氯酸的水溶液中，搅拌10分钟后再次用DCM萃取，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤蒸发得到粗产品，柱色谱纯化得到中间体；

其中，氧杂蒽酮的结构式如下：

；

中间体的结构式如下：

；

（2）将中间体与对甲基苯甲醛在乙醇回流体系中搅拌反应，TLC检测反应完全后，等反应体系冷却至室温后，减压旋蒸，除去反应体系中的溶剂，最后用硅胶柱层析色谱分离得到探针。

制备的RNA荧光探针在识别核仁和线粒体RNA中的应用。

所述荧光探针与RNA作用后在650 nm处产生较强荧光。

所述荧光探针在区分癌细胞/组织和正常细胞/组织试剂中的应用。

合成路线如下：

本发明的有益效果是：本发明制备得到的荧光探针，由于苯乙烯基的引入，探针的共轭结构变大，能够有效地避免生物自发荧光的干扰。实验表明探针在低粘度体系中由于苯乙烯基的旋转而具有较弱的荧光，在高粘度体系中苯乙烯基的旋转受抑制，显示出较强的荧光。基于上述性质，探针在和RNA相互作用后，苯乙烯基的旋转受到抑制，在650 nm处产生较强的荧光。根据正常细胞和癌细胞的线粒体和核仁RNA的含量存在差异的性质，探针能够区分癌细胞和正常细胞，正常器官和肿瘤。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明探针¹H NMR图。

图2为本发明探针¹³C NMR图。

图3为探针与不同极性溶剂作用的荧光强度变化图，（A）探针（4 μM）在不同溶液中的紫外吸收谱图；（B）探针（4 μM）在不同溶液中的荧光发射谱图。激发波长：580 nm，狭缝：5/5 nm，电压：700 V。

图4为探针的荧光强度随RNA浓度的变化，（A）探针（4 μM）在存在不同浓度RNA（0-500 μg/mL）时的荧光发射光谱；（B）不同浓度RNA与相对应的650 nm处的荧光强度之间的线性关系图。激发波长：580 nm，狭缝：5/5 nm，电压：700 V。

图5为探针的细胞毒性实验，不同浓度的探针溶液（0、2、3、4、5、6 μM）和HeLa细胞共同孵育24小时后，HeLa细胞的存活率。

图6为探针的共定位成像图，（a1-c1）探针（4 μM）和Hoechst 33342在HeLa细胞内的共染图；（a2-c2）探针（4 μM）和溶酶体商业染料在HeLa细胞内的共染图；（a3-c3）探针（4μM）和线粒体商业染料在HeLa细胞内的共染图；（d1,d2,d3）各自对应的叠加图片中的白线标记区域的荧光强度趋势统计图。（a1,b1,c1）激发波长为580nm，收集波长为600-680 nm，（b1）激发波长：405 nm，收集波长为425-470 nm；（b2）激发波长为638 nm，收集波长为695-780 nm ；（b3）激发波长为638 nm，收集波长：695-780 nm，比例尺：20 μm。

图7为正常细胞和癌细胞孵育探针后的荧光成像图，(A)为探针(4 μM)在不同细胞中的荧光成像图，(B)为和(A)相对应的荧光强度统计柱状图。激发波长：580 nm，收集波长：600-700 nm，比例尺：20 μm。

图8为器官成像图，探针与不同的组织（心、肝、脾、肺、肾、肿瘤）共同孵育不同时间的成像图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

RNA荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）中间体3的合成

在0℃和氮气保护下，向含有1.1 g氧杂蒽酮和20 mL超干四氢呋喃的100 mL反应瓶中缓慢加入3.75 mmol甲基溴化镁的四氢呋喃溶液（1.0 mol/L），室温搅拌12小时。反应完全后，加40 mL水淬灭反应，用40 mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相，减压蒸馏除去二氯甲烷。剩余的固体残余物溶解在乙腈中，加入高氯酸水溶液后继续搅拌15分钟，用50 mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相，然后用无水硫酸钠干燥2 h，过滤，滤液减压蒸馏除去二氯甲烷，最后用硅胶柱层析色谱分离（二氯甲烷：甲醇 = 100：1），得到红色固体1.1 g。

（2）探针的合成

在含有乙醇的反应瓶中加入中间体3和对甲基苯甲醛，搅拌回流12 h，TLC检测反应完全，反应液冷却至室温后减压旋蒸除去乙醇溶剂，最后用硅胶柱层析色谱分离（二氯甲烷：甲醇= 20：1）得到固体0.82 g。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.99 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.62 – 7.53 (m,3H), 7.27 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 9.6,2.4 Hz, 2H), 6.76 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 3.62 (q, J = 7.2 Hz, 8H), 2.41 (s,3H), 1.33 (t, J = 7.2 Hz, 12H).

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 157.64, 155.28, 153.89, 144.99, 141.10,132.39, 130.72, 129.94, 128.05, 117.53, 113.88, 112.17, 96.57, 45.96, 21.57,12.67.

HR-MS: m/z calcd for [C30H35N2O]+ =439.2744，Found:439.2747.

实施例制备的探针的应用：

1. 探针在不同极性溶剂中的荧光发射光谱

配制pH =7.4的PBS (10 mM)缓冲溶液；称取探针，用DMSO溶解，准确配制2 mM的探针储存液；分别向比色皿中加入1,4-二氧六环、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、乙二醇、丙三醇、乙醇、乙腈、甲醇和PBS缓冲溶液后，加入4 μM的探针储存液，进行荧光光谱测试。

如图3所示，探针在低粘度溶剂中显示非常弱的荧光，在高粘度的丙三醇中具有较高的荧光强度，说明在高粘度体系中探针的苯乙烯键在激发态的的转动受到抑制，发出很强的荧光。

2. 探针在与RNA的响应光谱

向含有4 μM探针的PBS溶液中逐渐加入不同浓度RNA（0-500 μg/mL），进行荧光光谱测试。

如图4所示，探针的荧光强度随RNA的浓度增大而逐渐升高，说明与RNA结合后探针的苯乙烯键在激发态的的转动受到抑制，发出很强的荧光，从而实现对RNA的识别传感。

3. 探针的细胞毒性实验

用探针不同浓度（0、2、3、4、5、6 μM）处理HeLa细胞后细胞的存活率（如图5），说明此探针细胞毒性较小。

4. 探针的细胞器共定位

将HeLa细胞用探针（4 μM）孵育20min，之后利用用磷酸缓冲液（PBS）洗涤细胞2-3次，用商业溶酶体染料(100 nM, 20 min)、Mito-Tracker Deep Red (50 nM, 20 min)、Hoechst 33342 (one drop/1 mL, 15 min)在37℃、DMEM中孵育，PBS洗三遍，用共聚焦显微镜成像。

如图6所示，探针的荧光不仅出现在核仁，还出现在细胞之中，并且探针在细胞质中的荧光能够和商业化线粒体探针的荧光重叠，说明探针能够靶向线粒体和核仁的RNA。

5. 正常细胞和癌细胞成像

用探针(4 μM)对正常细胞(3T3和HL-7702)和癌细胞(HepG-2、HeLa、A549和SMMC-7721)共孵育后进行共聚焦成像，如图7所示，探针在癌细胞中的荧光强度明显高于正常细胞，说明探针具有根据癌细胞和正常细胞中RNA含量的差异来区分癌细胞和正常细胞的能力。

6. 器官成像

如图8所示，将组织浸入含探针(50 μM)的PBS缓冲液(pH=7.4 10 mM)中，在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏中未见明显荧光，而肿瘤器官中荧光强度随时间的增加逐渐增加，说明该探针能够区分肿瘤和正常组织。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于吡罗红的线粒体和核仁RNA近红外荧光探针在制备识别线粒体和核仁RNA试剂中的应用，所述基于吡罗红的线粒体和核仁RNA近红外荧光探针的结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的基于吡罗红的线粒体和核仁RNA近红外荧光探针在制备识别线粒体和核仁RNA试剂中的应用，其特征在于：所述荧光探针与RNA作用后在发射波长为650nm处产生较强荧光。

3.根据权利要求1所述的基于吡罗红的线粒体和核仁RNA近红外荧光探针在制备识别线粒体和核仁RNA试剂中的应用，其特征在于：所述荧光探针在区分癌细胞/组织和正常细胞/组织试剂中的应用。