CN1600816A - 用于定量pcr的荧光染料的新的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法。该方法放弃原有的合成路线即衍生化后重结晶的方法，而采用直接合成，并用高效柱层析方法在引入6－羟基己基后直接进行异构体分离。本发明的方法可以大大缩短生产周期，降低人力投入，成倍地提高反应收率，从而大幅度地降低这类标记生物大分子用荧光染料的成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光染料的制备方法，尤其是一种用于定量PCR的荧光染料的制备方法。
背景技术
在二十世纪九十年代中期，荧光定量PCR方法逐渐发展成为一种可以方便地用于定量地检测各种病原体在组织内含量的方法，为很多重要的传染性疾病和遗传性疾病的临床诊断提供了一种新的更为有效、更具定量意义的方法。发展到现在，荧光定量PCR方法正在各级医院推广使用。然而，限制其更广泛使用的主要因素是该方法所需的耗材成本过高，其中最高的一块来自荧光染料本身。而目前能用于荧光定量PCR方法的各种标记寡核苷酸(Oligo)用荧光染料的制造工艺都很繁复，而且收率极低，造成了成本奇高，而价格也自然居高不下。
荧光染料用于标记生物分子可以取代以往的同位素标识，保持较高的灵敏度，同时又不对人体造成危害，废物的处理也变得容易得多。事实上，自从荧光染料标识开始得到使用以后，同位素标记的使用已经越来越少。但日前能用于生物大分子标识的荧光染料并不太多，主要原因是很多荧光染料或者荧光强度不够高，或者稳定性不够好。目前能用于定量PCR技术的荧光染料中以荧光素类染料最为常用。而这类染料又因连接臂在母环上的位置不同而导致产物以两种不同的形态出现，一种是5-和6-位异构体的混合物，一种是纯的6-位异构体。异构体的混合物在用于定量PCR时因两个异构体的最大吸收和发射波长略有偏差而会导致谱带变宽，且混合物中两异构体的比例难以控制，会导致定量PCR实验中批次与批次间的差异。故几乎没有人将5、6-位异构体混合物直接用于标记定量PCR探针。而为了制得纯的6-位异构体，目前使用的方法过程如图1，依次包括如下步骤：间苯二酚与偏苯三甲酸酐在较高温度(约200℃)下缩合，形成5(6)-羧基荧光素(III)；然后先进行乙酰化衍生化，得到二乙酰化-5(6)-羧基荧光素(IV)，在这一步重结晶往往能得到纯的二乙酰化-6-羧基荧光素(V)，如果不纯，则要进一步重结晶。这一步收率很低，只有10％左右。下一步，水解得到纯的6-羧基荧光素(VI)，然后是特戊丁基衍生化，N-羟基琥珀酰亚胺处理，再加入6-氨基己醇处理，顺序得到化合物二特戊酰基-6-羧基荧光素(VII)、二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素(VIII)、二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素(IX)。最后用磷酸化试剂磷酸化二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素。整个过程的特点是是在芳环缩合后先将其乙酰化衍生化，然后再进行重结晶，最后再脱保护回到原来状态。这样做，不单单使原本已很复杂的工艺变得更加复杂，同时在结晶这一步收率很低，通常只有10-15％的回收率，且有时第一次结晶达不到足够高的纯度，还需二次结晶，整个工艺流程的收率正常情况下是只有0.8％左右。这就使原来的方法生产出的产品的成本奇高，市场上的价格也降不下来，因而影响了定量PCR方法的进一步推广使用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提出一种用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法，极大地简化了工艺流程，提高了产品收率，并对大幅度降低荧光定量PCR方法的使用成本起到了根本保证作用，为荧光定量PCR方法在临床诊断上的更广泛应用起了推进作用。
本发明的上述目的是通过下述技术方案实现的：
所述的用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法，依次包括如下步骤：
A.间苯二酚与偏苯三甲酸酐在200℃左右的温度下缩合，形成5(6)-羧基荧光素(III)。
B.5(6)-羧基荧光素上的两个羟基用特戊酰基进行保护形成二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素(XI)。
C.二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素用N-羟基琥珀酰亚胺进行活化，形成二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯(XII)。
D.二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯与6-氨基己醇反应生成二特戊酰基-5(6)-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素(XIII)。
E.用高效柱层析方法在引入6-羟基己基后直接进行异构体分离，得到二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素(IX)。
F.用磷酸化试剂磷酸化二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素(IX)。
所述的用于定量PCR的荧光染料为6-FAM磷酸酰亚胺(6-FAMphosphoramidite)，化学结构式为X：
本发明的优选方案为：所述的用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法中，所述高效柱层析方法为使用中压柱层析系统。
本发明的更优选方案为：所述的用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法中，所述的高效柱层析方法为使用中压柱层析系统，并且所述的中压柱层析系统利用微球型硅胶作为固定相；利用乙醚-二氯甲烷系统作为洗脱液。
为了解决荧光素类生物大分子标记用染料的成本问题，放弃原有的合成路线即衍生化后重结晶的方法，而采用直接合成，获得两种异构体的混合物，直至接上C-6连接臂后，再通过中压制备柱层析进行分离。通过使用一种特殊的对于分离这类异构体有很好效果的洗脱系统，调整溶剂的极性，以达到彻底分离5-和6-位异构体的目的。本发明人发现，在该步的前面或后面做分离效果都不好，只有该步效果最佳，原因可能是：该步骤中两种异构体因为连接了C-6连接臂后，极性差异变得更为明显，从而使分离变得更容易。在该步分离的过程中，固定相的选择对分离效果也有很大影响。本发明人经过仔细的比较，发现微球型硅胶作为固定相效果最好。对洗脱液也进行过详细的比较，发现一般柱层析方法中很少用到的乙醚一二氯甲烷系统在分离用于定量PCR的荧光染料时效果很好。
和现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的方法可以大大缩短生产周期，降低人力投入，成倍地提高反应收率，从而大幅度地降低这类标记生物大分子用荧光染料的成本，进一步促进荧光定量PCR方法的推广使用。
附图说明
图1为6-FAM磷酸酰亚胺(6-FAM phosphoramidite)利用乙酰化衍生化再重结晶的方法的制备过程图；
图2为6-FAM磷酸酰亚胺(6-FAM phosphoramidite)利用高效柱层析方法的制备过程图；
I为间苯二酚；II为偏苯三甲酸酐；III为5(6)-羧基荧光素；IV为二乙酰化-5(6)-羧基荧光素；V为二乙酰化-6-羧基荧光素；VI为6-羧基荧光素；VII为二特戊酰基-6-羧基荧光素；VIII为二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素；IX为二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素；X为6-FAM磷酸酰亚胺；XI为二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素；XII为二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯；XIII为二特戊酰基-5(6)-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明作进一步的详细描述：
如图2，将间苯二酚(I)(55g)加热到135-145℃左右溶解，加入偏苯三甲酸酐(II)(19.2g)，在180-200℃反应两小时左右。TLC表明反应已完成，冷却后加入10MNaOH溶液(500ml)使之溶解，用2×500ml二氯甲烷萃取，弃去萃取液，水相用10MHCl溶液(700ml)中和至酸性(pH＝2)，形成的沉淀过滤并干燥后即得5(6)-羧基荧光素(III)(30g，纯度90％)。
将5(6)-羧基荧光素(III)(15g)溶于吡啶(100ml)，加入特戊丁酰氯(10ml)，三乙胺(10ml)，在室温下反应16小时，加入甲醇(20ml)终止反应，减压蒸除溶剂，加入二氯甲烷(150ml)，水(150ml)，分层后用二氯甲烷洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，蒸干，得到18g固体二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素(XI)。不经任何处理，进入下一步。
将上步所得二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素(XI)(18g)，N-羟基琥珀酰亚胺(4g)，DCC(7g)一起溶于乙酸乙酯(150ml)搅拌半小时，将生成的固体滤掉，滤液用水洗，并用无水硫酸钠干燥，蒸干后所得的产品用柱层析进行分离，将所得的适当的馏分合并后蒸干得到所要的产品二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯(XII)(4g，纯度95％)。
将上步所得二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯(XII)(4g)溶于60ml干燥过的二氯甲烷中，在半小时内滴加入6-氨基己醇(4ml)溶于二氯甲烷(15ml)的溶液，然后反应液在水(100ml)和二氯甲烷(100ml)中分配，将有机相分离出来后，干燥，蒸去溶剂，残余物使用中压柱层析系统(Biotage75m)在硅胶上用乙醚一二氯甲烷系统进行高效柱层析分离，将适当的馏分收集到一起，蒸干溶剂后即得纯的6-位异构体二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素(IX)(1.5g，纯度98.5％，无5-位异构体)。
将上步所得二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素(IX)(1.5g)溶于15ml干燥过的二氯甲烷中，加入二异丙胺四唑盐(0.15g)，N，N，N’N’-四异丙基-氰乙基磷酸酰亚胺(1.2g)，在室温下反应过夜，加入5％NaHCO3，分离后水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥，蒸干后，用硅胶柱层析进行分离。将适当的组分合并，蒸干后，再溶于15ml无水乙腈，用0.2微米的聚四氟乙烯膜过滤，蒸干后，冷冻干燥过夜，即得最终产品6-FAM磷酸酰亚胺(6-FAM phosphoramidite)(X)1.2g，纯度96％。
整个工艺流程以偏苯三甲酸酐为基础计算收率为3％，并且制备出的产品与标准产品的P31核磁共振和HPLC比较，完全一致。
上面实施例显示利用高效柱层析方法的制备6-FAM磷酸酰亚胺(6-FAMphosphoramidite)只需6个主要反应步骤(图2)，而利用原来的乙酰化衍生化后重结晶的办法制备6-FAM磷酸酰亚胺则必须经过8个必要的反应步骤(图1)，并且前者的收率3％远高于相同量原料使用后者方法的收率0.8％。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明所述用于定量PCR的荧光染料包括但不限于6-FAM磷酸酰亚胺(6-FAM phosphoramidite)，即6-FAM标记单体，而各种类似标记单体如6-HEX、6-TET等与6-FAM标记单体有基本相同的制备方法，即本发明所述制备方法也适用于除6-FAM标记单体外的用于定量PCR的荧光染料。因此本发明不局限于上述实施例的各个细节，而且本发明还可体现在不背离本发明基本特征的其他特定形式中，所以希望本实施例在各个方面都视为阐述性的而非限制性的。
Claims (6)
1、一种用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法，依次包括如下步骤：
A.间苯二酚与偏苯三甲酸酐在200℃左右的温度下缩合，形成5(6)-羧基荧光素；
B.5(6)-羧基荧光素上的两个羟基用特戊酰基进行保护形成二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素；
C.二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素用N-羟基琥珀酰亚胺进行活化，形成二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯；
D.二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯与6-氨基己醇反应生成二特戊酰基-5(6)-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素；
E.用高效柱层析方法在引入6-羟基己基后直接进行异构体分离，得到二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素；
F.用磷酸化试剂磷酸化二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素。
2、根据权利要求1所述的用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法，其特征在于：所述的用于定量PCR的荧光染料是6-FAM磷酸酰亚胺(6-FAM phosphoramidite)。
3、根据权利要求1所述的用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法，其特征在于：所述的用于定量PCR的荧光染料化学式为X：
4、根据权利要求1所述的用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法，其特征在于：所述步骤E中高效柱层析方法为使用中压柱层析系统。
5、根据权利要求4所述的用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法，其特征在于：所述的中压柱层析系统利用微球型硅胶作为固定相；
6、根据权利要求4所述的用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法，其特征在于：所述的中压柱层析系统利用乙醚-二氯甲烷系统作为洗脱液。
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |