CN115197237B - 一种荧光素异构体的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荧光素异构体的纯化方法，通过用混合溶剂结晶的方法分离羧基荧光素的5,6异构体，先将羧基荧光素的异构体混合物溶于第一种有机溶剂A中，再加入一定比例的第二种极性有机溶剂B，低温放置24小时，过滤，收集固体得6‑羧基荧光素异构体，一次结晶就可以达到纯度95％以上，方法简单，易于规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于荧光染料合成技术领域，尤其涉及一种荧光素异构体的纯化方法。
背景技术
荧光探针就是以荧光物质为指示剂，在一定波长激发下使荧光物质产生荧光，通过检测所产生的荧光对被检测物质进行定量或定性分析。在生物医学检测方面，荧光探针相对于其他检测法，具有高灵敏度，高选择性，响应快，重复性好，操作简便，成本低等优点，因而在分子诊断，基因检测，抗体免疫分析等方面得到广泛的应用。荧光探针由识别基团、荧光基团和连接体三部分组成，识别基团决定探针的选择性特异性，荧光基团决定探针的灵敏度，连接体部分在探针中起到连接枢纽的作用。荧光染料在荧光探针中都以荧光基团的身份存在，它的光物理性质是探针性能的重要体现。
目前，用于标记或衍生的荧光探针主要有罗丹明类、荧光素类、邻苯二甲醛类等，其中荧光素类化合物在生物研究领域中占有及其重要的位置。荧光素类染料化学合成方法简单，一般是通过富电子的间苯二酚与邻苯二甲酸酐在酸性条件下缩合而成，但是在合成过程中会产生5,6-羧基异构体，如图1所示，这种异构体的混合物在用于定量时由于两个异构体的最大吸收和发射波长有不同，会导致谱带变宽，且混合物中两个异构体的比例难以控制，会导致定量的不准确，故5-和6-位羧基异构体混合物直接应用的限制性是显而易见的，有必要将5-和6-位羧基异构体分离出来，因此，荧光素染料异构体的拆分提纯是至关重要的。
从分子结构上讲，5,6-羧基荧光素（HEX）属于呫吨染料类，这类染料5,6-羧基荧光素异构体分离的传统方法如下：在异构混合物中加入乙醇溶解，加入二异丙胺与羧基成盐，零下20度放置24小时，有结晶固体析出，过滤收集固体得6-位异构体，纯度大于80%，然后用同样方法多次结晶，纯度提高到95%以上。根据目前报道（CN101451018A），我们在HEX的5,6-荧光素异构体分离中，也尝试过该方法，但效果不佳，需要经过反复多次结晶，6-羧基异构体也只能达到80％的纯度，分离提纯步骤繁琐，提纯度不高，不易于规模化生产。
发明内容
本申请的目的主要是提供一种荧光素染料异构体的纯化方法，且该方法操作简单，提纯度高，易于规模化生产。
为实现上述目的，本申请提供了一种荧光素异构体的纯化方法，包括如下步骤：S1、按比例将5,6-羧基荧光素异构体粗品溶解于有机溶剂A中，充分溶解后，得到第一混合溶液；S2、按比例向步骤S1所述的第一混合溶液中加入有机溶剂B，所述有机溶剂B与所述有机溶剂A不同，充分混合，得到第二混合溶液；S3、将步骤S2中的第二混合溶液冷却到0℃，再向所述第二混合溶液中滴加二异丙基胺，继续搅拌，低温静置，析出固体，过滤掉清液留取固体，得到滤饼，洗涤滤饼，收集固体；S4、将步骤S3收集的固体溶于乙酸乙酯中，加入盐酸，室温搅拌，萃取分层，收集有机相，减压浓缩后得到6-羧基荧光素异构体。
进一步的，所述5,6-羧基荧光素异构体为2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素异构体，所述6-羧基荧光素异构体为2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素异构体。
进一步的，步骤S1中，所述有机溶剂A为乙醇、甲醇、异丙醇、DMF、DMSO、丙酮中的任意一种。
进一步的，步骤S2中，所述有机溶剂B为乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯中的任意一种。
进一步的，所述有机溶剂A与所述有机溶剂B的体积比为1:1～5:1。
进一步的，所述有机溶剂A与所述有机溶剂B的体积比为4:1。
进一步的，步骤S3中，所述低温温度为0℃～-30℃，所述低温静置时间为24h。
作为本申请优选的实施方案，所述低温温度为-20℃。
进一步的，步骤S3中，洗涤滤饼的液体为冷乙醇。
进一步的，所述乙酸乙酯的量为1L，所述盐酸的浓度为1mol/L。
本申请的有益效果在于，提供了一种荧光素异构体的纯化方法，通过用混合溶剂结晶的方法分离羧基荧光素的5,6异构体，先将羧基荧光素的异构体混合物溶于第一种有机溶剂A中，再加入一定比例的另外一种极性有机溶剂B，低温放置24小时，过滤，收集固体得6-羧基荧光素异构体，一次结晶就可以达到纯度95%以上，方法简单，易于规模化生产。
附图说明
图1为5,6-羧基荧光素异构体的结构示意图；
图2为2’,4，4’,5’,7’，7-六氯-5,6-羧基荧光素化学反应过程示意图；
图3为实施例1中减压浓缩后得到的2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素和2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5-羧基特戊酸酯荧光素的混合物的HNMR图谱；
图4为实施例2中减压浓缩后得到的2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素和2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5-羧基特戊酸酯荧光素的混合物的HPLC图谱。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，不用来限制本发明的范围。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
不管荧光素染料修饰DNA探针的任何位置，必须要用单一的异构体去衍生化，用单一的异构体去修饰，因为混合异构会对DNA探针的纯化造成干扰。因此，本申请提供了一种荧光素异构体的纯化方法，包括如下步骤：S1、按比例将5,6-羧基荧光素异构体粗品溶解于有机溶剂A中，充分溶解后，得到第一混合溶液；S2、按比例向步骤S1所述的第一混合溶液中加入有机溶剂B，所述有机溶剂B与所述有机溶剂A不同，充分混合，得到第二混合溶液；S3、将步骤S2中的第二混合溶液冷却到0℃，再向所述第二混合溶液中滴加二异丙基胺，继续搅拌，低温静置，析出固体，过滤掉清液留取固体，得到滤饼，洗涤滤饼，收集固体；S4、将步骤S3收集的固体溶于乙酸乙酯中，加入盐酸，室温搅拌，萃取分层，收集有机相，减压浓缩后得到6-羧基荧光素异构体。本方案主要针对5,6-羧基荧光素异构体的分离的改进方法，用混合溶剂结晶的方法分离羧基荧光素的5,6异构体，先将羧基荧光素的异构体混合物溶于乙醇中，再加入一定比例的另外一种极性有机溶剂，低温放置24小时，过滤，收集固体得6-羧基荧光素异构体，一次结晶就可以达到纯度95%以上，方法简单，易于规模化生产。
本申请中，作为优选的实施方案，所述的荧光素异构体的纯化方法不仅仅限于应用于5,6-羧基荧光素异构体，还可应用于其它荧光素异构体，如与5,6-羧基荧光素异构体具有相同特性的荧光素异构体等。所述的所述5,6-羧基荧光素异构体可以为但不仅仅限于2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素异构体，当所述的5,6-羧基荧光素异构体为2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素异构体时，所述6-羧基荧光素异构体为2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素异构体。
本申请中，作为优选的实施方案，步骤S1中，所述有机溶剂A为乙醇、甲醇、异丙醇、DMF、DMSO、丙酮中的任意一种，进一步优选的，所述有机溶剂A最佳为乙醇。步骤S2中，所述有机溶剂B为乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯中的任意一种，进一步优选的，所述有机溶剂B最佳为甲醇。所述有机溶剂A与所述有机溶剂B的体积比为1:1～5:1，优选的，所述有机溶剂A与所述有机溶剂B的最佳体积比为4:1。步骤S3中，所述低温温度为0℃～-30℃，所述低温静置时间为24h，优选的，所述低温温度最佳为-20℃。步骤S3中，洗涤滤饼的液体为冷乙醇。所述乙酸乙酯的量为1L，所述盐酸的浓度为1mol/L。
2’,4，4’,5’,7’，7-六氯-5,6-羧基荧光素的激发波长为535nm，发射波长为556nm。衍生后的羧基荧光素的亚磷酰胺单体可以直接用于DNA自动合成仪上，用于修饰DNA探针的5’端，同时HEX也可以衍生化后负载于CPG或PS上，直接标记DNA探针的3’端。因此，常作为荧光探针的一种常用的荧光素染料，为佐证本申请的技术方案具有较佳的技术效果，下面以2’,4，4’,5’,7’，7-六氯-5,6-羧基荧光素为例进行了验证。
实施例1
称取2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素粗品500g加入一个干燥的烧瓶中，加入3600mL乙醇溶解，然后按4:1的比例再加入900mL甲醇，冷却到0℃滴加250ml二异丙基胺，继续搅拌1小时后在-20℃放置24小时，有固体析出，过滤，滤饼冷乙醇洗涤，收集固体溶于1L乙酸乙酯中，加入浓度为1mol/L的盐酸1L，搅拌10分钟后萃取分层，收集有机相，减压浓缩后得2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素和2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5-羧基特戊酸酯荧光素的混合物，其中2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素反应的过程如图2所示。对混合物的核磁检测HNMR为（CDCl3）δ1.44(s,18H),6.87(s,2H),8.19(s,1H)，如图3所示，2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素的纯度为95.2%。
实施例2
称取2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素粗品500g加入一个干燥的烧瓶中，加入1800ml乙醇溶解，然后按1:1的比例再加入1800ml甲醇，冷却到0℃滴加250ml二异丙基胺，继续搅拌1小时后在-20℃放置24小时，有固体析出，过滤，滤饼冷乙醇洗涤，收集固体溶于1L乙酸乙酯中，加入浓度为1mol/L的盐酸1L，搅拌10分钟后萃取分层，收集有机相，减压浓缩后得2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素和2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5-羧基特戊酸酯荧光素的混合物。经HPLC分析，6位异构体（2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素）与5位异构体（2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5-羧基特戊酸酯荧光素）比例约61：39，对混合物的HPLC图谱如图4所示。
实施例3
称取2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素粗品500g加入一个干燥的烧瓶中，加入3000ml乙醇溶解，然后按5:1的比例再加入600mL甲醇，冷却到0℃滴加250ml二异丙基胺，继续搅拌1小时后在-20℃放置24小时，有固体析出，过滤，滤饼冷乙醇洗涤，收集固体溶于1L乙酸乙酯中，加入浓度为1mol/L的盐酸1L，搅拌10分钟后萃取分层，收集有机相，减压浓缩后得2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素和2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5-羧基特戊酸酯荧光素的混合物。经HPLC分析，6位异构体与5位异构体约为65：35，异构体未能得到有效分离。
实施例4
称取2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素粗品500g加入一个干燥的烧瓶中，加入3600mL乙醇溶解，然后按4:1的比例再加入900mL甲醇，冷却到0℃滴加250ml二异丙基胺，继续搅拌1小时后在0℃放置24小时，有固体析出，过滤，滤饼冷乙醇洗涤，收集固体溶于1L乙酸乙酯中，加入浓度为1mol/L的盐酸1L，搅拌10分钟后萃取分层，收集有机相，减压浓缩后得2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素和2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5-羧基特戊酸酯荧光素的混合物。经HPLC分析，6位异构体与5位异构体约为60：40，异构体未能得到有效分离。
实施例5
称取2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素粗品500g加入一个干燥的烧瓶中，加入3600mL乙醇溶解，然后按4:1的比例再加入900mL甲醇，冷却到0℃滴加250ml二异丙基胺，继续搅拌1小时后在-30℃放置24小时，有固体析出，过滤，滤饼冷乙醇洗涤，收集固体溶于1L乙酸乙酯中，加入浓度为1mol/L的盐酸1L，搅拌10分钟后萃取分层，收集有机相，减压浓缩后得2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素和2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5-羧基特戊酸酯荧光素的混合物。经HPLC分析，6位异构体与5位异构体约为70：30，异构体未能得到有效分离。
综上所述，本申请中提供了一种荧光素异构体的纯化方法，该方法主要针对但不仅仅限于5,6-羧基荧光素异构体的分离，通过用混合溶剂结晶的方法分离羧基荧光素的5,6异构体，先将羧基荧光素的异构体混合物溶于第一种有机溶剂A中，再加入一定比例的另外一种极性有机溶剂B，低温放置24小时，过滤，收集固体得6-羧基荧光素异构体，一次结晶就可以达到纯度95%以上，方法简单，易于规模化生产。
虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种荧光素异构体的纯化方法，其特征在于，
称取2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素粗品500g加入一个干燥的烧瓶中，加入3600mL乙醇溶解，然后按4:1的比例再加入900mL甲醇，冷却到0℃滴加250ml二异丙基胺，继续搅拌1小时后在-20℃放置24小时，有固体析出，过滤，滤饼冷乙醇洗涤，收集固体溶于1L乙酸乙酯中，加入浓度为1mol/L的盐酸1L，搅拌10分钟后萃取分层，收集有机相，减压浓缩后得2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素和2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5-羧基特戊酸酯荧光素的混合物，2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素的纯度为95.2%，所述2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯荧光素的结构式如下：所述2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯荧光素的结构式如下：/>所述2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5-羧基特戊酸酯荧光素的结构式如下：/>。
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