CN101451018A - 黄色荧光染料及其合成方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄色荧光染料及其合成方法与用途。该荧光染料具有通式(I)所示结构，其中R₁、R₂选自氯、氟、溴或氢，n为3至7的正整数。本发明提供的黄色荧光染料的荧光发射光谱位于可见光谱的黄色光区，具有很高的荧光量子产率和很好的荧光标记能力，可以用于蛋白标记。

Description

黄色荧光染料及其合成方法与用途

技术领域

本发明属于荧光染料合成领域，特别涉及具有黄光发射的荧光染料及其合成方法与用途。

背景技术

随着信息技术的迅速发展，人们对高密度和高清晰度的显示技术有了更高的要求。荧光现象早在16世纪就被发现，但对荧光的产生原理和条件直到19世纪中期才清楚。从1867年Goppetsroder采用桑色素为荧光试剂荧光法检测铝，到20世纪初，人们已经知道包括罗丹明、荧光素、稠环芳烃及曙红等在内的600余种化合物有荧光。随后Wawwillous进行了荧光产率的测定(1924年)，Gavila对荧光寿命进行了测定(1926年)。之后仪器的发展与荧光试剂相结合，出现了多种荧光分析方法，如时间分辨荧光测定、微分荧光测定、荧光偏振及同步荧光测定等。时至今日，由于荧光的高灵敏度、新型荧光试剂和仪器的优良性能，荧光分析及荧光检测已成为化学、生物学、环境科学的有力研究工具和重要的研究方法。

在有机荧光染料中，有些化合物可以作为荧光探针染料与生物大分子结合形成荧光探针，有些可以直接作为荧光探针对生物体内的相关物质、结构、生命过程进行识别、荧光标记和荧光显影。免疫荧光技术利用细胞骨架蛋白荧光探针对细胞骨架研究起到了极大地推动作用。用生化方法分别提纯细胞骨架的蛋白质，如微管主要成分微管蛋白，微丝的肌动蛋白，中间纤维的多种蛋白成分等，将这些蛋白提纯分别注射到实验动物，产生抗体，用荧光探针染料标记的抗体和细胞内的细胞骨架蛋白质发生免疫反应后，在荧光显微镜下就可以显示蛋白细丝在细胞内的分布。由于细胞骨架是最容易用荧光试剂标记的成分之一，应用荧光探针研究细胞骨架具有广泛的应用前景，同时具有很重要的理论研究价值。例如，使用荧光探针可以对γ-微管蛋白在细胞内的含量及定位进行研究(A.Liang，F.Ruiz，K.Heckmann，et al.，Europ.J.Cell Biol.，1996，70：331.V.Muresan，M.C.Joshi，J.C.Besharse，J.Cell Sci.，1993，104：1229).Rusan等用荧光探针标记的α-微管蛋白的LLCPK-1α细胞首次在哺乳动物细胞中定量分析了细胞间期和分裂期微管动力学参数(N.M.Rusan，C.J.Fagerstrom，A.M.Yvon，et al.，Mol.Biol.Cell，2001，12(4)：971.)。单克隆抗体免疫荧光技术在病原微生物的鉴定(纪巍，辛晓燕，陈必良，解放军医学杂志，2001，26(6)：470.刘军连，徐志凯等，第四军医大学学报，2004，25(8)：728.)、SARS诊断(车小燕，丘立文等，第一军医大学学报，2003，23(7)：640.K.Wen，Y.B.Mei，et al.，J.First Mil.Med.Univ.，2004，24(1)：1.)、禽流感的诊断(赵维波，陈美才等，中国实验动物学报，2004，12(4)：200.)等方面均有广泛的应用。

如何得到不同种类的标记试剂在蛋白质标记领域中非常困难。首先，很难找到不具有重叠的发射波长的荧光试剂，因为典型的有机荧光染料的半发射波长一般为40-80nm，而可见波长范围一般仅在350-400nm。其次，即使存在不具重叠发射光谱的荧光试剂，但因其荧光量子产率非常低也是无法应用于荧光标记，第三，当几种荧光同时应用时，激发波长的选择又非常困难，因为这几种荧光试剂的吸收波长波段会非常宽而无法分开。因此只有当能够达到每种荧光染料的相应最大吸收波长的光进行照射时许多有效荧光染料才能收到激发。第四，当不同单元片断的数目超过几百道尔顿时，染料生物化学性质以及它们与生物片断连接方式就会变得尤为重要。电荷，分子量以及染料的结构和连接链要求不能影响蛋白质片断的电泳淌度，使其还具有舒展的结构。最后，荧光染料必须与蛋白质片断的化学性质具有兼容性。

在以上的影响因素下，很少有荧光染料能用于诊断及免疫分析技术领域。例如。Smith et al，Nucleic Acids Research，1985，13，2399；Prober et al，1987，238，336；Hood et al，European专利8500960；Connell et al，Biotechniques，1987，5，342。

综上所述，在诊断技术及免疫分析技术手段中还需要有新型结构的荧光探针染料。它必须具有以下特征：(1)所选的染料要不影响蛋白质片断的生物活性；(2)易用性，不需要分离固定、终止和脱色步骤；(3)高敏感性，激光扫描仪可以检测凝胶中毫克(纳克)量的染料染色的蛋白质；(4)线性定量范围宽；(5)均一的蛋白质染色；(6)光稳定性好，可以长时间拍照；(7)与多种仪器兼容；(8)化学稳定性好，染色凝胶的荧光可在数天保持稳定。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种黄色荧光染料，该荧光染料的荧光发射光谱位于可见光谱的黄色光区，并且具有很高的荧光量子产率。

本发明的再一目的是提供一种黄色荧光染料的合成方法，该方法具有反应步骤较少、操作简便、收率高、产物分离纯化容易等优点。

本发明的另一目的是提供一种黄色荧光染料的用途。

本发明提供一种全新的黄色荧光染料，该荧光染料具有以下结构：

R₁、R₂选自氯、氟、溴或氢，也就是说R₁、R₂可以同时为氯、氟、溴或氢，也可以分别为氯、氟、溴或氢，n为3至7的正整数。

本发明的黄色荧光染料的合成按如下反应式进行：

其中原料1为3，6-二氯苯甲三酸酐，其具有如下结构：

原料2为取代间苯二酚，其具有如下结构：

三氟乙酸琥珀酰亚胺碳酸酯结构如下：

直链氨基酸结构如下：

NH₂(CH₂)_nCOOH n为3至7的正整数。

中间产物3取代荧光素缩合化合物，其具有如下结构式：

中间产物4取代新戊酸酯荧光素化合物，其具有如下结构式：

中间产物5取代6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐，其具有如下结构式：

中间产物6取代6-羧基荧光素新戊酸酯，其具有如下结构式：

中间产物7取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯，其具有如下结构式：

黄色荧光染料8取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素具有如下结构式：

R₁、R₂选自氯、氟、溴或氢，n为3至7的正整数。

具体合成步骤如下：

(1)中间产物取代荧光素缩合化合物的合成

向浓硫酸溶液中加入取代的间苯二酚和3，6-二氯苯甲三酸酐，其中，浓硫酸的用量为每5mmol 3，6-二氯苯甲三酸酐需3ml，取代间苯二酚和3，6-二氯苯甲三酸酐的摩尔比为2-2.5:1，加热到170-190℃反应24-72小时，倒入冰水中，抽滤，干燥得中间产物取代荧光素缩合化合物。

(2)中间产物取代新戊酸酯荧光素的合成

向步骤(1)得到的取代荧光素缩合化合物中加入新戊酸酐，其中，新戊酸酐与荧光素缩合化合物的摩尔比是5-6:1，在210℃下加热回流2-3小时；冷却，分别加入与新戊酸酐体积比为2:1的四氢呋喃及水，搅拌2-4小时，加入与新戊酸酐体积比为5:1的乙醚，分出水层，有机层依次用缓冲溶液，盐酸，饱和氯化钠溶液洗涤，用干燥剂干燥。蒸除溶剂，得中间产物取代新戊酸酯荧光素。

(3)中间产物取代6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐的合成

向步骤(2)中加入绝对乙醇，再加入二异丙胺，其中，绝对乙醇与步骤(2)的新戊酸酐体积比为6:1，二异丙胺与步骤(2)中荧光素缩合化合物的摩尔比为5-6:1，摇匀，于-20℃放置24h，有沉淀析出，抽滤，干燥，得中间产物取代6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐；

(4)中间产物取代6-羧基荧光素新戊酸酯的合成

向步骤(3)得到的取代6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐中加入溶剂，用盐酸洗涤，干燥剂干燥，得中间产物取代6-羧基荧光素新戊酸酯；

(5)中间产物取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯的合成

向步骤(4)中得到的取代6-羧基荧光素新戊酸酯加入溶剂和弱碱及二琥珀酰亚胺碳酸酯，其中二琥珀酰亚胺碳酸酯和6-羧基荧光素新戊酸酯的摩尔比为8-10:1，弱碱与6-羧基荧光素新戊酸酯的摩尔比为8-10:1，TLC监测，停止反应，依次用缓冲溶液，盐酸及饱和食盐水洗涤，用干燥剂干燥，蒸除溶剂，得取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯；

(6)中间产物取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素的合成

向步骤(5)中得到取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯，加入溶剂，滴加直链氨基酸的二氯甲烷溶液，其中直链氨基酸的二氯甲烷溶液的摩尔浓度为0.2-0.4mol/L，直链氨基酸与取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯的摩尔比为1.2-1.5:1，TLC监测，待反应完，依次用盐酸，饱和食盐水洗涤，干燥剂干燥，过色谱柱收集中间取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素；

(7)黄色荧光染料的合成

向步骤(6)中得到取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素中加入浓氨水及溶剂，反应完，氨水层用盐酸酸化，其中浓氨水与溶剂体积比为1-2:1，抽滤，干燥得黄色荧光染料。

在上述合成方法中，合成过程中得到的取代荧光素缩合化合物可以不纯化而直接进行反应合成新戊酸酯荧光素。

在上述合成方法中，合成过程中得到的取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯可以不纯化而直接进行反应合成取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素。

在上述合成方法中，所述的溶剂为二氯甲烷，乙醚，乙醇。

在上述合成方法中，所述的弱碱包括三乙胺，吡啶。

在上述合成方法中，所述TLC监测所用溶剂为甲醇，三氯甲烷，乙酸乙酯或它们的混合溶剂。

在上述合成方法中，所述色谱柱所用流动相溶剂为三氯甲烷，乙酸乙酯混合溶剂。所用的固定相为53-75μm的柱层析硅胶。

在上述合成方法中，所述的干燥剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁。

在上述合成方法中，所述的缓冲溶液为pH＝7的磷酸钠盐缓冲溶液。

本发明的优点与积极效果：①本发明化合物引入了不同数目的氯，氟，溴取代基，其中不同数目氯原子的引入使该化合物具有更窄的发射光谱，增大了Stokes位移，其激发光谱和发射光谱的重叠减少，有利于提高其分辨率；②本发明提供了一种全新的黄色荧光染料，该荧光染料的荧光发射光谱位于可见光谱的黄色光区；③本发明荧光染料具有很高的荧光量子产率和很好的荧光标记能力，可以用在蛋白标记上；④连接链的长度控制在n＝3-7，这使荧光染料分子间不会发生重叠，从而不会发生荧光淬灭，其中当n＝5-6时效果最佳。

附图说明

图1为本发明合成得到的荧光标记试剂的激发光谱；

图2为本发明合成得到的荧光标记试剂的发射光谱；

图3为本发明荧光试剂着色显示的U2OS细胞图像；

图4为本发明为荧光试剂着色显示的Hela细胞图像；

具体实施方式

下面结合实例进一步描述发明的黄色荧光染料的合成方法。

实施例1：4，7，2`，7`-四氯-6-(6-羧基己酰胺基)-荧光素的合成

(1)化合物4，7，2`，7`-四氯-5(6)-羧基荧光素的合成，合成步骤如下：

在装有回流冷凝管，干燥管的50mL三口烧瓶中加入1.39g(5.33mmol)3，6-二氯苯甲三酸酐，1.70g(11.80mmol)4-氯间苯二酚和5.00ml浓硫酸，磁子搅拌，升温至190℃反应24h，冷却至室温，将反应液分批倒入冰水混合液中，并剧烈搅拌。抽滤得棕黄色滤饼，干燥得粗产品2.50g，产率91.20％。

MALDI-TOF MS，m/z：515.55(calcd.514.09)；

红外FT-IR(KBr)，υ/cm^-1：3421，1759，1608，1434，1212。

(2)化合物4，7，2`，7`-四氯-5(6)-羧基荧光素新戊酸酯的合成

在装有干燥管，回流冷凝管的100mL三口烧瓶中加入2.50g(4.86mmol)化合物4，7，2`，7`-四氯-5(6)-羧基荧光素和5.00ml新戊酸酐，回流2小时，冷却至室温，加入10.00ml四氢呋喃及10.00ml水，剧烈搅拌2小时。加入50.00ml乙醚，分出水层，有机层用50.00ml的1M盐酸，饱和氯化钠溶液洗涤，无水MgSO₄干燥过夜待用。得深褐色浆状液体。

(3)化合物4，7，4`，5`-四氯-6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐的合成

将上步浆状液体溶解在30.00ml绝对乙醇中，再加入3.00ml二异丙胺，摇匀，于-20℃放置24h，有沉淀析出，抽滤，用无水乙醇洗涤，干燥，得1.50g，产率39.50％。

MALDI-TOF MS，m/z：682.54(calcd.682.69)；

红外FT-IR(KBr)，υ/cm^-1：3440，2979，1767，1640，1094；

核磁¹HNMR(DMSO)δ (ppm)1.19(d，12H)，1.34(S，18H)，3.44(a quintet，2H)，7.49(S，2H)，7.52(S，2H)，8.40(S，1H)。

(4)化合物4，7，4`，5`-四氯-6-羧基荧光素新戊酸酯的合成

将上步所得二异丙铵盐1.50g(1.92mmol)溶解在二氯甲烷中，用1M盐酸洗涤(2*25ml)，有机层用无水MgSO₄干燥，蒸除溶剂，得4，7，4`，5`-四氯-6-羧基荧光素新戊酸酯1.18g，产率90.80％。

MALDI-TOF MS，m/z：682.89(calcd.682.33)；

红外FT-IR(KBr)，υ/cm^-1：2976，1765，1478，1408，1093；

核磁¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)1.40(s，18H)，6.91(s，2H)，7.13(s，2H)，8.18(s，1H)。

(5)化合物4，7，2`，7`-四氯-二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯的合成

在100mL三口瓶中加入1.18g(0.352mmol)化合物4，7，4`，5`-四氯-6-羧基荧光素新戊酸酯，30.00ml二氯甲烷，搅拌溶解，再加入1.00ml吡啶和DSC(0.90g，3.52mmol)剧烈搅拌，TLC监测反应进度。待反应完全依次用1M盐酸(3*25ml)和饱和氯化钠溶液(2*25ml)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，蒸干溶剂得黄色固体1.10g，产率81.50％。

(6)化合物4，7，2`，7`-四氯-6-(6-羧基己酰胺基)-二叔戊酰基荧光素的合成

在100ml三口烧瓶中加入化合物4，7，2`，7`-四氯-二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯(1.10g，0.35mmol)和30ml二氯甲烷，滴加6-氨基己酸的二氯甲烷溶液(0.22g溶于20.00mlCH₂Cl₂)搅拌反应，并用TLC监控反应进度，待反应完全依次用1M盐酸(3*25ml)和饱和氯化钠溶液(2*25ml)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，蒸干溶剂，过色谱柱收集纯产物得白色晶体0.53g，产率48.20％。

MALDI-TOF MS，m/z：795.39(calcd.795.49)；

红外FT-IR(KBr)，υ/cm^-1：3384，2974，1768，1477，1408，1093；

核磁¹HNMR(DMSO)δ(ppm)1.25(m，2H)，1.39(s，18H)，1.59(m，4H)，2.31(m，2H)，3.42(m，2H)，6.22(b，1H)，6.93(s，2H)，7.11(s，2H)，7.81(s，1H)。

(7)化合物4，7，2`，7`-四氯-6-(6-羧基己酰胺基)-荧光素的合成

将0.53g(0.67mmol)4，7，2`，7`-四氯-6-(6-羧基己酰胺基)-二叔戊酰基荧光素溶解在50.00ml二氯甲烷中，加入50.00ml浓氨水，搅拌1小时，分去有机层，收集氨水层，用1MHCl调解pH值至1，抽滤，得黄色固体0.36g，产率87.70％。

MALDI-TOF MS，m/z：628.46(calcd.627.25)；

红外FT-IR(KBr)，υ/cm^-1：3352，2937，1769，1632，1435，1228；

核磁¹HNMR(DMSO)δ(ppm)1.42(m，2H)，1.51(m，4H)，2.19(m，2H)，3.17(m，2H)，6.93(s，2H)，7.17(s，2H)，11.99(s，1H)，7.82(s，1H)，8.70(s，1H)，11.20(s，2H)。

通过上述方法合成得到的荧光标记试剂的最大激发光谱波长为525nm(图1)，最大发射波长为545nm(图2)。

该荧光标记试剂应用于蛋白标记，图3为U2OS细胞中用甲醛定影，上述的荧光试剂着色，共聚焦激光扫描显微镜采集的图像。图4为Hela细胞用100ul 4％甲醛溶液定影，上述的荧光试剂着色，共聚焦激光扫描显微镜采集的图像。

由图3-4可以看出此荧光蛋白标记试剂具有很好的荧光特性。

实施例2：2`，4，4`，5`，7，7`-六氯-6-(酰氨己酰胺基)荧光素

(1)化合物2`，4，4`，5`，7，7`-六氯-5(6)-羧基荧光素的合成

取41.10g(0.23mol)2，4-二氯间苯二酚和26.10g(0.01mol)3，6-二氯-4-羧基邻苯二甲酸酐加入500mL三口瓶中，加入200mL浓硫酸，氮气保护下170℃反应36小时，反应完毕后将反应混合物倾入冰水中，有大量砖红色沉淀析出。抽滤，得粉红色固体，产率75.00％。

MALDI-TOF MS，m/z：581.90(Calcd：582.99)；

红外FT-IR(KBr)，υ/cm^-1：3480，1768，1709，1478，1433。

(2)2`，4，4`，5`，7，7`-六氯-5(6)-羧基荧光素新戊酸酯的合成化合物

取9.00g(15.00mmol)2`，4，4`，5`，7，7`-六氯-5(6)-羧基-荧光素，加入18mL三甲基乙酸酐，回流2h，冷至室温。加入20mLTHF和120mL水，剧烈搅拌2h后用乙醚萃取，有机层用pH＝7的磷酸盐缓冲溶液洗涤(40mL*3)，再依次用50mL1mol/L盐酸，50mL饱和氯化钠溶液洗涤，无水MgSO₄干燥。蒸除溶剂，得浆状褐色液体。

(3)2`，4，4`，5`，7，7`-六氯-6-羧基荧光素新戊酸酯的二异丙基胺盐的合成

将上述浆状液体用80mL无水乙醇溶解，加入10mL二异丙基胺后在-20℃下冷冻过夜。得白色沉淀，抽滤得到粗品胺盐，用无水乙醇洗涤，白色粉末状固体，产率40.00％。

MALDI-TOF MS，m/z：852.52(Calcd：852.41)；

红外FT-IR(KBr)，υ/cm^-1：2979，2874，1775，1642，1425，1214，1075，682；

核磁¹HNMR(DMSO)δ(ppm)1.24(s，12H)，1.44(s，18H)，3.25(s，2H)，6.87(s，2H)，7.81(s，1H)。

(4)2`，4，4`，5`，7，7`-六氯-6-羧基荧光素特戊酸酯的合成

取上步所得化合物7.00g(8.20mmol)，溶于30mL二氯甲烷中，用1mol/L盐酸洗涤(30mL*3)，有机层用无水MgSO₄干燥。蒸除溶剂得到白色粉末状固体，产率95.00％。

MALDI-TOF MS，m/z：751.30(Calcd：751.22)；

红外FT-IR(KBr)，υ/cm^-1：2977，1778，1589，1454，1425，1369，1212，1078；

核磁¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)1.44(s，18H)，6.87(s，2H)，8.20(s，1H)。

(5)2`，4，4`，5`，7，7`-六氯-二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯

将上步所得化合物4.80g(6.50mmol)溶于150ml二氯甲烷中，加入16mL吡啶和DSC(16.00g，61.00mmol)，剧烈搅拌30～60min，TLC监测至反应完全。反应混合物依次用4％盐酸(100M1*3)、饱和氯化钠溶液(100mL*2)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，蒸除溶剂，干燥得白色固体，产率85.00％。

(6)2`，4，4`，5`，7，7`-六氯-6-酰氨己酰胺基荧光素特戊酸酯的合成

将5.50g(6.50mmol)化合物D溶解在50mL二氯甲烷中，搅拌下滴加20mL6-氨基己酸(7.70mmol，0.90g)的二氯甲烷溶液，滴加完毕后继续搅拌1～2h，TLC监测至反应完全。蒸除溶剂得粉红色固体，柱色谱分离得白色纯品，产率83.00％。

MALDI-TOF MS，m/z：861.11，(Calcd：861.02)；

红外FT-IR(KBr)，υ/cm^-1：3378，2975，1778，1657，1551，1454，1424，1372，1211，1079，1026，754；

核磁¹HNMR(DMSO)δ(ppm)1.44(s，18H，)1.47～1.51(m，2H)，1.67～1.72(m，2H)，2.39(t，2H)，3.52(t，2H)，6.89(s，2H)，7.86(s，1H)。

(7)2`，4，4`，5`，7，7`-六氯-6-酰氨己酰胺基荧光素的合成

将5.20g(6.00mmol)化合物E溶解在三氯甲烷中，滴加浓氨水，搅拌2h，分出水层，用浓盐酸调pH＝2得粉红色沉淀，抽滤干燥得化合物，产率75.00％。

MALDI-TOF MS，m/z：696.44，(Calcd：696.14)；

红外FT-IR(KBr)，υ/cm^-1：3395，2958，1782，1658，1548，1430，1216，1090，746；

核磁¹HNMR(DMSO)δ(ppm)1.63～1.70(m，2H)，1.85～1.86(m，2H)，2.34(t，2H)，3.41(t，2H)，6.87(s，2H)，7.82(s，1H)。

实施例3：化合物4，7-二氯-2`，7`-二氟-6-(6-羧基己酰胺基)-荧光素的合成

(1)化合物4，7-二氯-2`，7`-二氟-5(6)-羧基荧光素的合成与实施例1步骤(1)类似，不同的是2-氟间苯二酚代替2-氯间苯二酚，产率70.00％。

(2)化合物4，7-二氯-2`，7`-二氟-5(6)-羧基荧光素新戊酸酯的合成与实施例1步骤(2)类似。

(3)化合物4，7-二氯-2`，7`-二氟-四氯-6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐的合成与实施例1步骤(3)类似，产率35.50％。

(4)化合物4，7-二氯-2`，7`-二氟-6-羧基荧光素新戊酸酯的合成与实施例1步骤(4)类似，产率90.00％。

(5)化合物4，7-二氯-2`，7`-二氟-二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯的合成与实施例1步骤(5)类似，产率82.60％。

(6)化合物4，7-二氯-2`，7`-二氟-6-(6-羧基己酰胺基)-二叔戊酰基荧光素的合成与实施例1步骤(6)类似，产率80.30％。

(7)化合物4，7-二氯-2`，7`-二氟-6-(6-羧基己酰胺基)-荧光素的合成与实施例1步骤(7)类似，产率71.00％。

Claims (10)

1、具有如下结构通式(I)的黄色荧光染料：

R₁、R₂选自氯、氟、溴或氢，n为3至7的正整数。

2、根据权利要求1所述黄色荧光染料，其特征在于：R₁或/和R₂为氯，n是4至6的正整数。

3、权利要求1所述的黄色荧光染料的合成方法，其特征是合成步骤如下：

(1)中间产物取代荧光素缩合化合物的合成

取代间苯二酚与3，6-二氯苯甲三酸酐在酸性条件下缩合得到取代荧光素缩合产物；

(2)中间产物取代新戊酸酯荧光素的合成

取代荧光素缩合产物与新戊酸酐酯化得到取代新戊酸酯荧光素；

(3)中间产物取代6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐的合成

取代新戊酸酯荧光素与二异丙胺合成得到取代6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐；

(4)中间产物取代6-羧基荧光素新戊酸酯的合成

取代6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐酸化得到取代6-羧基荧光素新戊酸酯；

(5)中间产物取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯的合成

取代6-羧基荧光素新戊酸酯与二琥珀酰亚胺碳酸酯酯化得到取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯；

(6)中间产物取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素的合成

取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯与C₃-C₇的直链氨基酸取代合成得到取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素；

(7)黄色荧光染料的合成。

4、如权利要求3所述的合成方法，其特征是：所述的取代间苯二酚具有如下结构：

R₁、R₂选自氯、氟、溴或氢。

5、如权利要求3所述的合成方法，其特征是：步骤(1)中得到的取代荧光素缩合化合物不纯化直接进行步骤(2)反应合成取代新戊酸酯荧光素。

6、如权利要求3所述的合成方法，其特征是：步骤(5)中得到的取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯不纯化而直接进行步骤(6)反应合成取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素。

7、如权利要求3中所述的合成方法，其特征是，步骤(5)在三乙胺或吡啶的弱碱性条件下进行。

8、如权利要求3中所述的合成方法，其特征是，步骤(5)中，产物取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯依次使用pH＝7的磷酸钠盐缓冲溶液、盐酸溶液及饱和食盐水溶液进行洗涤。

9、如权利要求3中所述的合成方法，其特征是，步骤(6)中，取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素通过色谱柱进一步纯化，色谱柱所用流动相溶剂为三氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂，固定相为53-75μm的柱层析硅胶。

10、权利要求1所述黄色荧光染料在蛋白质标记中的应用。

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