JPS61227600A - プロカインアミド検定、トレーサー、免疫原および抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体、殊に生物学的液体例えば血清、血漿また
は尿中のプロカインアミドの量を測定する螢光偏光免疫
定量操作のための方法および試薬ならびに試薬の製法に
関する。更に詳しくは、本発明は（１）試料中のプロカ
インアミドの量を測定するための試薬（トレーサーおよ
び抗体）、（２）抗体を産生させる免疫原化合物、（３
）合成法（トレーサーおよび免疫原化合物を製造するた
め）、および（４）検定を実施するための分析方法に関
する。

プロカインアミドは有効で広く処方されている抗不整脈
剤である。このものは狭い治療係数を有し、また重篤な
有毒な副作用例えば徐脈、血圧上昇、不整脈、見当識障
害、倦怠、はきけ、嘔吐および薬物誘起性全身性紅斑性
狼艙を生起し得る。投与されるこの薬物の投与量と得ら
れたプロカインアミドの血漿濃度との関係は患者によっ
て全く変化し得ることがわかった。この変化はいくつか
の因子に由来するものである。すなわち、１）個体間の
薬物代謝の差異：２）薬物代謝を改変する治療中の個々
の患者の症状の変化；および３）薬物素因に著しい効果
を有する病理学的条件、例えば腎臓損傷または心臓欠陥
である。従って、患者血清またはプラズマ中のプロ力イ
ンアミド濃度をモニターすることが安全かつ有効な療法
のために推奨される。

従来、患者の血清または血漿プロ力インアミド濃度は典
型的には高速液体クロマトグラフィーＣＨＰＬＣ入酵素
免疫定量法ＣＥＩＡ）および基質−結合螢光免疫定量法
ＣＦ；ＬＦＩＡ）によ！ｌｌ側足されていた。これらの
方法は薬物濃度を検定するのに相応に特異的であるが、
これらの方法に欠陥がない訳ではない。ＨＰＣＬ法は試
料抽出操作を必要とし、また検定時間が長い。ＥＸＡお
よび５ＬＦＩＡは共に酵素反応を包含し、そして次のよ
うな不利な点を有している。すなわち、１）試薬が比較
的不安定であシ：２）ＥＸＡまたは５ＬＥＩＡでの酵素
反応に影響を及ぼし得るし；そして３’）ＥＸＡおよび
５ＬＦＩＡは吸光率または螢光を副足しそして吸光率ま
たは螢光に影響し得る生物学的試料中の任意の化合物（
例えば、脂質、ヘモグロビン、ビルビリンあるいは他の
発色団もしくは螢光団）がこれらの検定から得られる結
果の正確さに影響を及ぼす。

他の物質の検定において、拮抗結合免疫足音は更に好都
合な代替手段を提供していた。典型的には、拮抗結合免
疫定量法は供試試料中のリガンドを測定するのに用いら
れる。

（この記述のために、「リガンド」とは拮抗結合免疫定
量技術により定量すべき生物学的関心のある物質である
）すガントは標識試薬または「リガンド・アナログＪ（
Ｊ（ｊ−ａｓｄ　ａｎａｌｏｇ）”または「トレーサー
Ｊ　（ｔａａａｒ）とリガンドおよびリガンド・アナロ
グに河して特異的な抗体上の限られた数の受容体結合部
位について拮抗し；結合するリガンド・アナログの童は
試料中のリガンドの濃度と反比例する。その理由はリカ
ンドおよびリガンド・アナログは各々それぞれの濃度に
比例して抗体に結合しているからである。

螢光偏光は拮抗結合免疫足型法で缶底されるトレーサー
・抗体複合物の量を測定する定量手段を提供する。螢光
偏光技術は、螢光標識化合物が平面偏光で励起されると
その（ロ）転単に対して逆の関係にある偏光度を有する
螢光を発する原理に基〈ものである。従って、螢光ラベ
ルを有するトレーサー・抗体複合物を平面偏光で励起す
ると、発する元は非常に偏光された１１である。その理
由は螢光団は、元が吸収、放出される時間の間の回転を
むシにさせられるからである。これに対して、未結合の
トレーサーを平面偏光で励起すると、その回転は相当す
るトレーサー・抗体複合体よりも速くなシ、また分子が
更にランダム配列される。結果として、未結合トレーサ
ー分子から発する光は消偏光される。

このような螢光偏光技術はワングＣＷａｔす）等の米国
特許第４，４２０，５６８号で適用され、この技術は螢
光団としてトリアジニルアミノ−フルオレセイン部分の
使用に係る。

プロカインアミド抗原複合体および抗体はシンク（Ｓｆ
％−ｙｈ）等の米国特許第４，２３５，９６９号に開示
されている。

また、アニリン誘尋抗体はＪ、ファルム・サイＣＪ、Ｆ
五Ｇ−ｒｍ、　５ａｉ−）　、第６９巻、第７２１−２
４頁、１９８０年およびジャーナル・オプ・イムノアッ
セイ（Ｊｏｓデ５ａＪｏｆ　Ｉｔｍｓ＊ａａａａａｙ）
、第３巻、第９１−１１０頁、１９８２年に開示されて
いる。しかし、本発明は当該技術での進歩を提供するも
のであシ、新規な抗原、これらの抗原の製法、高度に感
受性を有するトレーサー、トレーサーの製法、およびト
レーサーを用−る検定が特にプロカインアミドの測定に
提供される点で進歩が提供される。本発明に従って行わ
れる検定は以下に説明するように特に正確である。

本発明は、プロカインアミドの螢光偏光検定；検定に使
用するためのトレーサー、免１５２鳳および抗体；なら
びにトレーサー、免疫原２よび抗体を製造する方法に係
る。

本発明の第一の特徴は新規な構造を有する独特なトレー
サーおよび免疫原の発見に関する。本発明の第一の特徴
によると、トレーサーおよび免疫原共に式５に示す構造
式で示すことができる。

式中、 Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または
別の免疫学的に活性な担体、あるいはフルオレセインま
たはフルオレセイン誘導体であシ；ＸはＭＥ％ｃｏ、ｃ
ｓ％Ｃ＝ＮＨ”またはＳＯ，であ〕：偽は０、ｌまたは
２であり； Ｒは、Ｑがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）＠導体
または別の免疫学的に宿性な担体であるときは、６個ま
でのへテロ原子を包含し、また小計ｏ−１８個の炭素原
子およびヘテロ原子を有する８個までのへテロ原子を包
含する結合基でめり； Ｒ′は１−３個の炭素原子を有するアルキル基であシ；
Ｙは、Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
であるときは、０ＬＮＨｔ、ＣＨｌ、Ｆ、０１％Ｅｒ、
ＣＦ、９たはＨであシ、そしてＹは、Ｑがポリ（アミノ
酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または別の免役学的に活
性な担体であるときは、ＨｌＯＬＣＨＪ”筐たはＣｔで
あシ；そして ２は、Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
であるときは、ＨまたはＦであプ、そして、Ｑがポリ（
アミノ酸〕、ポリ（アミノ酸）誘導体または別の免疫学
的に活性な担体であるときは、Ｈであル；そして ＺがＹまたはカルボキサミド基に結合しているベンゼン
環の炭素原子以外の該炭素原子のいずれかに結合してい
る。

Ｑがポリ（アミノ酸）またはその誘導体であるときは、
化合物は免疫原として使用することができる。Ｑがフル
オレセインまたはその誘導体であるときは、化合物はト
レーサーとして使用することができる。

本発明の第二の特徴は新規な免疫原により産生される抗
体に関する。本発明の第二の特徴によると、抗体はＱが
ポリ（アミノ酸）、そのｔｓ誘導体九は他の免疫学的に
活性な担体である特許請求の範囲第１項記載の化合物に
反応して製造される。

本発明の第三の特徴によると、免疫原は式２に示す構造
式で示される化合物、 （式中、 Ｒは６個１でのへテロ原子を包含し、そして小計０−１
８個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であシ
： Ｒ′は１−３個の炭素原子を有するアルキル基であ屑Ｘ
はＮＨ，、ＣＣ００ＬＣ，ＣＨＯ，Ｂｅ、ＩｔたはＯＨ
であり：そして ＹはＨ，１０ＬＣＨ，、ＦｊたはＣｔであるンを有する
前駆体をポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）の誘
導体とカップリングさせる工程からなる免疫原の製法に
よシ製造される。

本発明の第四の特徴によれば、式３に示される構造式で
示される化合物 （式中 Ｒは６個１でのへテロ原子を包含し、ま九小計〇−１８
個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であシ； ＸはＭＢ２、ＣＯＨ，ＣＮ、ＳＯ，ＨまたはＯＨであり
；ＹはＯ＆ＮＨ，、ＣＨ３、Ｆ、　ＣＩＱＥｒ、ＣＦ、
４たはＨであシ；そして ＺはＨまたはＦである） を有する前駆体をフルオレセインまたはフルオレセイン
誘導体とカップリングさせることからなるトレーサーの
製法が提供される。

本発明の第五の特徴によれば、プロカインアミドの濃度
を測定する方法が提供される。試料をプロカインアミド
抗血清およびプロカインアミド抗血清の存在に対して検
知可能な螢光偏光反応を生じ得るフルオレセイン含有プ
ロカインアミド誘導体と接触させる。次に、平面偏光８
溶液中を通して螢光偏光反応を得て、そしてこの反応を
試料中のプロカインアミドの量の尺度として検知する。

本発明の更に他の特徴およびそれに伴う利点は、′＃＃
造式と共に以下の詳細な説明を読むことによシ最も良く
理解される。

式ｌは本発明に従って定量し得る薬物プロカインアミド
の構造を示す。

式２は本発明に従って免疫原を製造する方法のための一
群の試薬を示す。

式３は本発明に従ってトレーサー８製造する方法のため
の一群の試薬を示す。

式４は本発明のトレーサーに包含されるフルオレセイン
部分の代替の構造式および名称を示す。

式５は本発明のトレーサーおよび免疫原の一般構造式を
示す・ 式６は本発明の免疫原の一般構造式を示す。

式７は本発明のトレーサーの一般構造式を示す。

式８は本発明の好ましい免疫原の構造式を示す。

式９は本発明の好ましいトレーサーの構造式を示す。

式ｌＯは式６および式８に示した免疫原および式７およ
び式９に示し九トレーサーの前駆体を示す。

式１１は１式ｌＯが式７および式９に示したトレーサー
の前駆体を示す場合、式１０のＸ位置での前駆体に対し
てフルオレセイン部分がカップリングして−る種々の結
合を示すＯ 式１２乃至式２９は本発明によるトレーサーの構造の種
々の実例を示す。

式３０乃至式３５は本発明の免疫原を形成するのに使用
し得るハプテン反厄剤の構造の極々の実例を示す。

式において、記号ｒＦｔＪはフルオレセイン部分を示し
、そして他の記号は本文に示したとおりである。式３．
５．７およびｌＯで、「Ｙ」以外の基およびカルボキサ
ミド置換分はｒＹＪおよびカルボキサミド置換分が占め
ていないベンゼン環の任意の位置に存在し得る。

式２ 式３ 式５ 式６ 式７ 式８ 式９ 式ｌＯ 式１１−１　　　　　　式１ｌ−２ ＮＨ−Ｆｔ　　　式１１−４　　　　式１１−５式１１
−３ −ＣＮＩＰ−ＮＨ−Ｆｔ　　　−ＮＦｃＯ−ＮＨ−Ｆｔ
　　　−ＮＨ−Ｃ３−ＮＨ−Ｆｔ式１１−６　　　　　
式１１−７　　　　　式１ｌ−８−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｐ
Ｌ　−０−Ｃ８−ＮＨ−Ｆｔ　−８ｏ、−ＮＨ−Ｆｔ式
１１−９　　　　式１１−１０　　　　式１ｌ−１１−
０−ＣＯ−ＡＴＥ−８ｏ、−ＮＨ−Ｆｔ弐１１−１２ 式１９ 式２２ 式３０ 式３１ 式３２ 式３３ 式３４ 本発明の種々の特徴に関して詳述する。

本発明はフルオレセインおよびフルオレセイン肪導体の
使用を包含する。特に、フルオレセインおよびその誘導
体の必要な特性（トレーサー化合物の有用性のための）
はフルオレセインの螢光である。フルオレセインは、環
境の酸濃度（ｊｌＨ）に基いて、第４図に示す如く、２
＠の互変異性体の形態で存在する。開環（識）形態では
、該形態のフルオレセイン（およびフルオレセイン部分
を含有する化合物）を約４ナノ秒の励起状態寿命の後青
色元を吸収しセして緑色の９１に′ｙｔ、８発し得るよ
うにする多数の共役二重結合が存在する。開環および閉
環が共存しているときは、開環および閉環形態での分子
の相対濃度はｐＨ濃度を調節することによって容易に変
更することができる。一般に、本発明のトレーサー化合
物は生物学的に許容し得る塩例えばナトＩＪウム、カリ
ウム、アンモニウム等として溶液中に存在し、これによ
り本発明の分析方法で使用する場合、化合物が一環、螢
光形態で存在することが可能となる。存在する特定の塩
はｐＨ０１１度を調節するのに使用する緩衝剤によって
左右される。例えば、アルカリ性りん酸ナトリクム緩衝
液の存在下、本発明の化合物は一般にす）　＋７ウム塩
として開環形態で存在する。

本文で使用する「フルオレセイン」なる用語は、個々の
化合物としてめるいはより大きい化合物の一成分として
、螢光の関連を除いて、特別な分子に刈して存在すると
きは開環２よび閉環両形態を包含することを意味してい
る。開環形態は螢光を生じさせるのに必要である。

フルオレセイン分子の炭素原子の番号付けは、分子の開
環形態か閉環形態ρ十考慮することに基いて、変化する
。

従って、フルオレセインおよびその化合物に関する文献
は炭素原子の番号付けに関しては統一されていない。閉
環形態では、フェニル環上のラクトンのカルボニルに対
するパラ−炭素を６と番号付けする。開環形態では、フ
ェニル環上のカルボン散基に対するバラ−炭素を５と番
号付けする（第４図参照）。本文の配達では開環形態の
番号付けを採用する。その理由は合成で使用する原料は
該システムで最も普及して番号付けされているからであ
る。従って、カルボキシ基に反対するフルオレセインお
よびその化合物の炭素原子を本文の記載の目的で６の番
号を付ける。

抗体と複合していない溶液中のトレーサーは、螢光の吸
収ｐよび再発光に必要な時間以下で自由に回転する。そ
の結果、再発光された光は比較的無作為な方向を有し、
その結果抗体に対して複合していないトレーサーの螢光
偏光が低く、Ｏに近い。特定の抗体と複合体を形成する
と、このようにして形成されたトレーサー−抗体複合体
抗体分子の回転が比較的小さいトレーサー分子の回転よ
りも遅いものと予測さ氏これによりｌ！察される偏光が
増加する。従って、リガンドが抗体部位に河してトレー
サーと競合したとき、遊離トレーサーとトレーサー・抗
体複合体との得られた混合物の螢光のｉＩＭ祭される偏
光がトレーチーとトレーサー・抗体複合体との中間の値
であると予想される。試料が高濃度のリガンドを含むと
きは、観察された偏光値は遊離リガンドの値に近くなる
、すなわ５低くなる。供試試料が低濃匿のリガンドを含
有しているときは、偏光値は結合リガンドの値により近
くなる、すなわち高くなる。免役定量法の反応混合物を
垂直次に水平の偏光で順次励起しセして発光した光の垂
直側光成分のみを解析することにより、反応混合物中の
螢光の偏光を正確に測定することができる。

偏光と画定すべきリガンドの濃度との間の正確な関係は
既知のａ度を有する検量体の偏光値を測定することによ
って確立される。リガンドの濃度はこの方法で作製した
標準曲線から内挿することができる。

本発明に従って形成される特別な抗体２よびトレーサー
は上述の如く意外にも艮好な検定を生じることがわかっ
た。

１、試薬 本発明の免疫原およびトレーサー共に式５で例示される
一般構造式で示すことができる（前文にも記載）。Ｑが
ポリ（アミノ酸〕である場合、構造は免疫原を示し；Ｑ
はフルオレセイン部分である場合、構造はトレーサーを
示す。

目的は、プロ力インアミドと抗体の認識部位のためのト
レーサーとの間の競合を有することである。ノ・ブテン
とトレーサーの構造上の大きな変化によシこのゴールを
達成することが可能である。本発明の目的のために、「
ノ・ブテン」（Ａａｐｔａ＊）は免疫原の前駆体でちゃ
、一般に置換プロカインアミド類似体および免役学的に
活性な担体に対する結合基を包含している。

有用な抗体が種々のプロ力インアミド類似体から製造す
ることができる。プロカインアミドの−Ｎ＆の代りにＨ
ｌＯＬＣＨ，、ＦまたはＣｔを有する化合物から作った
免疫原は動物に抗体を主産し得る。かかる抗体は適当な
トレーサーと組合せると本発明によるプロカインアミド
検定に有用である。

本発明の免疫原は式６に示す一般構造式を有し、そして
式６に示す好ましい式、弐６に示す好ましい式において
免疫原は式８に示す構造式を有している。免疫原は、式
２に示す群の化合物を合成方法および実施例に関連して
以下に論述する如くポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノｒ
Ｒ）の誘導体または他の免疫学的に活性な担体物質とカ
ップリングすることにより製造することができる。

本発明の好ましい形態では、免疫原は式８に示す構造式
を有している。この構造が好ましい。その理由はプロカ
インアミドの最良の認識はハプテンが測定されるべき薬
物と同じ窒素置換分を担有する場合に生じる。牛血清ア
ルブミンがこの好ましい形態でポリ（アミノ酸）である
が、種々の蛋白質担体を使用し得る。これらの担体には
アルブミン、血清蛋白質例えばグロブリン、接眼レンズ
蛋白質、リボプロティン等が包含される。例示的な蛋白
担体には、牛血清アルブミン、キーホール・リムベット
（Ｋｅｙｈｏｌｅ　　ｌｉｔｍ−ｐａｔ）・ヘモシアニ
ン、卵アルブミン、牛カンマグロブリン、チロキシン結
合グルプリン等が包含される。あるいはまた、利用可能
なアミノ基を十分な数を有する合成ポリ（アミノ酸）例
えばリジンを、他の合成または天然の反応性官能基を担
有する重合体性物質であるように、使用し得る。特に、
炭水化物、酵母あるいは多糖類をハプテンに共役させて
免疫原そ生成させる。

本発明のトレーサーの構造での可能な変化はハプテンの
構造での可能な変化よりも大きい。本発明のトレーサー
は式７に示す一般構造式を有し、ここでＦｔはフルオレ
セイン部分またはフルオレセイン誘導体である。本発明
の好ましい形態では、トレーサーは式９に示す構造式を
有する。

トレーサは、式１１に示す如く、例えばアミド、アミジ
ノ、トリアジニルアミノ、カルノイミド、テオカルノく
ミド、カルノくモイル、チオカル／（モイルｌた＆↓ス
ルホニルカルノくボイル基によシフルオレセイン訪導体
に結合されているプロ力インアミン類似体である。トレ
ーサーは、以下の合成法３よび実施例に関して記述する
如く、適当なフルオレセイン誘導体をアミノ、カルボン
酸、ヒドロキシ、イミデート、ヒドラジド、インシアネ
ート、チオインシアネート、クロロホルメート、クロロ
チオホルメート、クロロスルホ風ルカルバモイルまたは
同様な基に結合させることによシ製造される。

例示のために、次のフルオレセイン誘導体のいスレも使
用し得る。

Ｆｔ−ＮＨ，フルオレセインアミン Ｆｔ−Ｃｏ、ＨカルボキシフルオレセインＦｔ−ＮＨＣ
ＯＣＨ，Ｉ　　　　α−ヨードアセトアミドフルオレセ
イン ＰＬ−ＮＨＣＯＣＨＩ　Ｂｒ　　　α−プロモアセトア
ミドフルオレセイン ト ２、抗体 不発明の抗体は上述の免疫原に対して動物で反応を発現
させることにより生産される。プロカインアミド免疫原
に対する免役反応に河して現在好ましい宿主は兎である
が、本文に説明した免疫原構造に刈して抗体を生座し得
る任意の宿主を使用することができ、ならびに免疫感応
細胞を含有する任意の試験管内溶液も使用することがで
きる。免疫原を当業者に周知の方法で一連の接種により
動物にまたは免疫感応細胞培養物に投与する。

３、合成方法 本発明の免疫原およびトレーサー共に式１ｏに示す一般
構造式を有する前駆体から製造することができる。式中
、トレーサーの製造に向けられているときは、ＹはＨｌ
ＯＨｌＮＨ，、ＣＦ、、Ｆ、　ＣムＢデ、ＣＦ、　また
はＨであ夛、そして、免疫原の製造に向けられていると
きは、ＹはＨ１０Ｈ％ＣＨ，、ＦまたはＣｔであシ： 免疫原の製造に向けられているときは、ＸはＮＨ，、Ｃ
００Ｈ１ＣＨＯ，５ｏ３Ｈ，ＣＭ％Ｂデ、ＩまたはＯＨ
であシ、そして、トレーサーの製造に向けられていると
きは、ＸはＮＨ，、Ｃ０ＯＨ％Ｃ７ｖ％Ｓｏ、Ｈｌたは
ＯＨであシ：そしてトレーサーの製造に向けられている
ときは、ＺはＨｌたはＦであシ、そして、免疫原の製造
に向けられているときは、ＺはＨでｌ）、セしてＺはｙ
−またはカルボキサミド基に結合されているベンゼン環
の炭素原子以外の任意の該炭素原子に結合されている。

本発明の免疫原は、ハプテン、例えばＸがＮＨ，、Ｃ０
ＯＨ。

ＣＭ、Ｓｏ、ＬＣＨＯ，臭素、ヨウ素またはＯＲである
式２の一般式で示されるハプテンをポリ（アミノ酸）ま
たはその他の免役学的に活性な担体にカップリングする
ことにより製造される。ポリ（アミノ酸）筐たはその他
の担体部分はアミド、アミジン、アルキル、尿素、チオ
尿素、スルホンアミド、カルバメートまたはチオカルバ
メート結合によりハプテンに結合することができる。好
ましい態様では、ポリ（アミノ酸）が牛血清アルブミン
（ＥＳＡ）でちゃ、そしてハプテンは式３０〜３５に示
した例示構造の一つから選択することができる。こわら
の反応剤は好１しくはアミド結合を形成するのに通常便
用されている条件下でカップリングされ、かかる条件は
当業者に周知である。水溶性カルボジイミド操作を使用
するのが最も好ましい。それは、これらの操作がこの関
連で所望のアミド結合を形成するのに最も有効だからで
ある。

免疫原は−ＮＨ，、−Ｃｏ、Ｈ％−〇〇ＮＨＮＢ、、−
ＣＭＯＲｌ−ＣＨＯ，−Ｅデー、−１，−ＮＣＯ，−Ｎ
Ｃ８Ａ、−０ＣＯＣム−ｏｃｓｃムーＳ　Ｑ、ＣＬ　ま
たは−０ＣＯＮＨ８Ｏ，Ｃ１基を含有するハゲテンをポ
リ（アミノ酸）にカップリングさせることによシ製造さ
れる。−ＮＨ，の事例は、−ＮＨ２基の存在下にポリア
ミノ酸のカルボン酸基を活性化することによシカツブリ
ングすることができる。ポリ（アミノ酸）のカルボン酸
の活性化は、ハプテンおよびポリ（アミノ酸）を１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミドＣＥＤＣ）、Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ）、ｌ−シクロへキシル−３−（２−モ
ルホリノエチル〕カルボジイミドメチル−ｐ−トルエン
スルホネート等と混合することによって達成し得る。−
ＣＯ，Ｈの事例はまたトレーサー合成の部分で以下に述
べる如く系での活性化法（ＥＤＣ）すなわち活性エステ
ル法によシカツブリングすることができる。−〇〇ＮＨ
ＮＨ，の事例はアミノの事例と同じ方法でカップリング
することができる。−〇ＨＯの事例は還元アミノ化によ
りポリ（アミノ酸）にカップリングさせる。ポリ（アミ
ノ酸）を−〇ＨＯハプテンと混合し、そして得られたイ
ミンをホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナ
トリウムで還元してポリ（アミノ酸）にアルキルアミン
を生成させる。−Ｂデおよび−Ｉの事例はまたポリ（ア
ミノ酸）にアルキル化アミンを生成させるが、ポリ（ア
ミノ酸）のアミンへのアルキルハライドの直接カップリ
ングによるものである。しかしながら、これらはフェノ
ールと反応してフェニルエーテルを生じ、１九メルカプ
ト基と反応してチオエーテルを生じる。イソシアネート
（−ＮＧＯ）、インチオシアネート（−ＮＣＥＩ）、ク
ロロホルメートｃ−ｏｃｏｃｔ＞、クロロチオホルメー
ト（−Ｏｃｓｅｔ）、スルホニルクロライ）”（−８Ｏ
，Ｃ１）おヨヒカルボニルスルホニルクロライド（−０
ＣＯＮＨ８Ｏ２Ｃ１）の事例では尿素。

チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、スルポン
アミド、およびカルバモイルスルホンアミド結合がそれ
ぞれ生成される。これはハプテンがポリアミノ酸への直
接カップリングにより達成される。

上記ハプテンＣＹ＝Ｈ％０ＬＣＨ，、ＦまたはＣｔ　で
ある免疫原前駆体）の合成は非常に似た方法で達成され
る。式２には本発明の方法の好ましい態様に従った免疫
原前駆体の群を示す。一般に、理想的な出発物質は適当
な置換安息香酸のメチルエステルまたは酸ハライド、例
えば４−トルオイルクロライドである。これらの活性化
された酸はＮ−エチルエチレンジアミンとカップリング
し、そして異った訪導体の製造を可能とする種々の試薬
でアルキル化することができる。適当なハライドまたは
スルホネートエステル〔例えば、エチル４−ブロモクロ
トネート〕との反応、次いで必要に応じて還元、そして
加水分解により同族のカルボン酸訪導体を製造すること
ができる。適当なりクロロ、ブロモーまたはスルホニル
オキシニトリルとの反応にヨシ接触還元後に同族のアミ
ンが得られる。適当なハロオレフィンによるアルキル化
次いでオゾン分解および多少激しい条件下での還元によ
ジアルコールおよびアルデヒドが得られる。アセタール
保護ハローアルデヒドはまたプロヵインアミドーアルデ
ヒドの前駆体としても有用でｓｂ、そして同族のアルコ
ールはまたアルキル化剤としてクロロ−、ブロモ−また
はヨードアルコールの使用により直接得ることができる
。ブロモエタンスルホン酸またはその同種物の使用によ
シ同族のプロカインアミドスルホン酸が得られる。

置換安息香酸（例えばＹがＯＨＩたはＮＨ２）で保護基
が必要なときは、これは通常アルキル化を実施した後の
合成順序のある個所で除去される。ヒドロキシ基の好ま
しい保護はベンジルエーテルであり；アミンに河して好
ましい方法はニトロ基として持ちこたえ、そして合成経
路の終り近くでアミシに還元することである。

カルボン酸訪導体はカップリングして免疫原を生成する
のに適している。ニトリル訪導体を無水アルコールおよ
び塩化水素ガスで処理することによジアルコキシイミデ
ートに変換させる。これで、アルコキシイミデートはカ
ップリングに適したものとなる。ヒドラジド誘導体を、
ヒドラジンとの活性エステルカップリングによシあるい
はヒドラジンを相当するカルボン酸エステル誘導体と反
応させることによシ相当するカルボン酸誘導体から製造
する。アルデヒド騎導体もまたカップリングして免疫原
を生成するのに適している。これらはニトリルのごとく
相当するアミンに変換可能である。アルデヒドについて
は、これは還元アミノ化によりまたは好１しくは相当す
るオキシムへの変換次いで還元によシ達成される。便宜
上、オレフィン、ニトリルまたはオキシムそして、Ｙ＝
ＮＯ，について、ニトロ基の還元が同時に行われる。こ
れらのアミノ誘導体はこれでカップリングして免疫原を
製造するのに適したものとなる。Ｙ基の適切な還元によ
り（必要に応じ）、アミンをホスゲン筐たはチオホスゲ
ンと反応させることによってアミンをインシアネートま
たはインチオシアネートに変換し得る。次に、インシア
ネートおよびチオイソシアネート誘導体をポリ（アミノ
酸）とカップリングさせ、次いで保護基を除去する。

アルデヒド誘導体はまた還元により相当するアルコール
に変換することができる。これはホウ水素化ナトリウム
、水素添加等により達成することができる。アルコール
は三臭化りん、三ヨウ化９ん等によりブロモまたはヨー
ド９４体に変換することができる。また、ヨード肪導体
はヨウ化ナトリウム等圧よるハロゲン置換によりブロモ
誘導体から製造するができる。それで、ハロ誘導体はカ
ップリングに適した奄のとなる。ニトリル誘導体は１九
シアナイドとの反応によジハロ銹導体から製造すること
ができる。

アルデヒドは（アミノヒドロキシ）アルカンカルボン酸
例えばＮＨｔＯＣＨ，Ｃｏ、Ｈと縮合して置換オキシム
誇導体を生成させることができる。これらはポリ（アミ
ノ酸）とカップリングするのに適している。オキシムア
ルキルカルボン酸誘導体は部分的に還元して相当する（
アミノヒドロキシ）アルキルカルボン酸誘導体となすこ
とができ、これら誘導体はまたポリ（アミノ酸）とのカ
ップリングに適している。同じタイプの縮合および還元
はヒドラジンおよびヒドラジン誘導体くよシ達成するこ
とができる。

アルコール誘導体はｔｆｃクロロホルメート、クロロチ
オホルメートおよびクロロスルホニルカルバモイル誘導
体に変換することができる。これはＹ＝ＯＨまたはＮＨ
，保護さし７’２７　＃　：ｒ　−ルをホスゲン、チオ
ホスゲンまたはクロロスルホニルイソシアネートと反応
させることによシ達成される。得うれたクセロポルメー
ト、クロロチオホルメートまたはクロロスルホニルカル
バメートはポリ（アミノ酸）とカップリングさせ１次に
保護基を除去する。

スルホン酸は、五塩化シん等で処理することによシ相尚
するスルホン酸クロライドに変換させることによｐポリ
（アミノ酸）と最も容易にカップリングされる。

本発明のトレーサー（１デａＣ−デ）はフルオレセイン
部分またはフルオレセインの誘導体をＸがＮＨ，、Ｃ０
ＯＨ。

ＣＮＯＲ，５Ｏ８ＨｊたはＯＨである式１ｏに示した一
般式にカップリングすることによＶ！！！遺される。フ
ルオレセイン部分は式１１に示す如くアミド、アミジン
、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、
トリアジニルアミノ、スルホンアミドまたはスルホニル
カルバメート結合ニよジアミノ、カルボキシ、イミデー
ト、スルホニルまたはアルコキシ官能基に結合させるこ
とができる。本発明の好ましい態様において、フルオレ
セイン誘導体は６−７ミノフルオレセイ／〔アルドリッ
チ・ケミカル・力／パニーＣＡｌｄｒｉｅｈ　Ｃｈｍｔ
ｐ＋４ｃａｌ　　Ｃｏｔｐｃｐａ＊ｙ）、　　ミルウォ
ーキーから入手〕であり、そしてこれは式３に示す如く
前駆体とカップリングさせる。反応はジメチルホルムア
ミド中で実施される。プロカインアミド類似体は、イン
ブチルクロロホルメートで混合無水物を形成させること
によシ活性化される。他の溶媒例えばジメチルスルホキ
サイドおよび他の活性化反応剤例えばエチルクロロホル
メートを使用し得る。

種々の１０力インアミド類似体から使用し得るトレーサ
ーを製造することができる。

末端アミノ基例えばアミノ、ヒドラジニル、ヒドラジノ
等を有するすべてのグロカインアミド類似体は活性エス
テル法または混合無水物法によジカルボキシフルオレセ
インとカップリングさせ、そして２．１ｉの物質を溶液
中で単に混合することによりフルオレセインインチオシ
アネート、α−ヨードアセトアミドフルオレセイン、α
−ブロモアセトアミドフルオレセイン、ＤＴＡＦ−また
はアルコキシＤＴＡＦとカップリングさせる。アミ７基
をホスゲン３よびチオホスゲンとの反応によりそれぞれ
インシアネートおよびチオインシアネート基に変換す°
ることができろ。仄に、これらの活性化され九化合物は
アミノフルオレセインと務合させてトレーサーを生成さ
せる。Ｙ＝ＯＨおよびＮＨ，基はＸ＝ＮＨ，基をインシ
アネートおよびチオイソシアネート基に変換するのに保
護基を必要とする。この保護基はフルオレセインアミン
へのカップリングが完了した後除去される。

木端カルボン酸基例えばカルボン酸、（アミノヒドロキ
シ）アルキルカルボン酸等を有するすべてのグロヵイン
アミド類似体を活性エステル、カルボニルジイミダゾー
ル１次は混合無水物法によジアミノフルオレセインにカ
ップリングされる。

末端ヒドロキシ基を有するすべてのグロカインアミド類
似体は俗敷中ＤＴＡＦ、α−ヨードアセトアミドフルオ
レセイン、α−ブロモアセトアミドフルオレセインまた
はフルオレセインインチオシアネートとの反応によりフ
ルオレセインにカップリングさせる。ヒドロキシ基はク
ロロスルホニルインシアネート、ホスゲンおよびチオホ
スゲンと反応させることによジそれぞれクロロスルホニ
ルカルバモイル、クロロホルメートおよびクロロチオホ
ルメート基に変換することができる。これらの誘導体を
次に溶液中でアミノフルオレセインにカップリングさせ
てトレーサーを生Ｘさせる。Ｙ＝ＯＨおよびＮＨ，基は
ヒドロキシ基をクロロスルホニルカルバモイル、クロロ
ホルメートおよびクロロチオホルメート基に変換するの
に＆謹基そ必峨とし、この基はフルオレセイン（ｆｌｘ
ｏｒａｓｃｅｉｘ）アミンへのカップリング冗了後に除
云嘔れる。

床端ニトリル基を有するすべてのプロカインアミド類似
体は塩化水素ガスの存在下に無水アルコール中でイミデ
ートに変換きれる。次に、イミデートを＃液中フルオレ
セインアミンにカップリングさせてトレーサー８製造す
る。

Ｙ＝Ｂｒ＆よびＺ＝Ｆの場合を除いて、安息香酸の徨々
のアミノ、カルボン酸、ヒドロキシおよびニトリル誘導
体の製造を免役原製造部分で上述した。Ｚ＝Ｆの誘導体
は相当するアミノ誘導体からバルズーシーマンＣＥａｌ
ｚ−３ｃｈｉ−ａｍα１０反応またはその変法にまり製
造される。アミノ誘導体は相当するニトロ誘導体の還元
によシ製造される。ニトロ誘導体は既知の方法により既
知のベンゼン訪導体から製造される。

４、検定 本発明の特別なトレーサーｉよび抗体は意外にもプロカ
インアミドの螢光偏光検定で艮好な結果を生じることが
わかった。式１は本発明に従って定量し得る業物プロカ
インアミドのＭ造を示す。不発明の検定により、先行技
術の方法よりも更に簡便で、迅速なプロカインアミド検
定法が提供される。この方法は分析前に試料を処理する
必要がなく、試薬は化学的および熱的に安定であり、ヤ
して検定システムはブロカインアミド様化合物に対し最
小限の交差反応性を有しているからである。

本発明の分析方法すなわち本発明のトレーサー化会物お
よび免疫魚を用いる螢光偏光免役足１法によるプロ力イ
ンアミドの（Ｉ１１定法によって、プロカイ／アミドを
含有するかもしくはその疑いのある試料をトレーサーの
生物学的に許容し得る塩２よびプロカインアミド２よび
トレーサーに対して特異的な抗体と混合させる。抗体は
上述のとおり免疫原を用いて生産される。プロカインア
ミドおよびトレーサーは制限された抗体部位に対して受
容し、複合体を形成する。トレーサーおよび抗体の濃度
を一定に保つことにより、形成されるプロカインアミド
ー抗体複合体対トレーサー−抗体複合体の比が試料中の
プロカインアミドの童と正比例する。従って、混合物を
直線偏光で励起し、そしてトレーサーおよびトレーサー
−抗体複合体から発する螢光の偏光を測定すると、試料
中のブロカインアミドの量を定量的に側足することがで
きる。

結果を正味のミリ偏光単位、スパン（ｓｐａｓ）（ミ’
）偏光単位〕および相対強度によって足置することがで
きる。ミリ偏光単位の測定値は、トレーサーの最大量が
プロカインアミドの不存在下で抗体と結合されていると
きの最大偏光を指示している。正味もしくはネットミリ
偏光単位が高いほど、トレーサーが抗体に良く結合して
いる。スパンは抗体に結合されたトレーサーの最大量お
よび最小量の個所での正味のミリ偏光の差を示している
。スパンが大きいほど良いデータの数的解析が得られる
。強度はバックグラウンド上のシグナルの’Ｍ度の尺度
である。すなわち、強度が高いほど、測定値がより正確
となる。不発明の好適なトレーサーについて強度は約０
．５−２．０ナノモルで測定される（垂直偏光ｇｉ展＋
２倍水平偏光強度の相として）。強度は、トレーサーの
濃度および他の検定の変化可能なものに基いて、バック
グラウンドノイズの約３倍乃至約３０倍の信号の範囲に
あり得る。本発明の目的のために、バックグラウンドノ
イズＣｂａｃｋｇｒｏｓ＊ｄ　５ｏｄａｓ）の少くとも
８−１０倍の強度が好ましい。

第１表−第ｍ表は、スパン、ミリ偏光単位および強度に
関して本発明の種々の態様で得られた結果を示す。第１
表では、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を蛋白担体として
用い、また兎を宿主の種として用いた。データから、広
範曲なフェニルｉ換分を担有し、また広い範囲の様々な
結合手を有するトレーサーはフッ素ｆ！ｉｔ：換免疫原
に河して生じる抗血清で有用なプロ力インアミド検定を
生じることが実証される。

第■表から、個の担体２よび他の動物宿主も！ｆＣＷｆ
容し得るプロ力インアミド検定を生じることが実証され
る。第■表から、本発明のトレーサーは先行技術を包含
する種々のフェニルｆｉＬ分を担有するハプテンに対し
て生じる抗血清で良好なグロ力インアミド検定を生じる
ことが実証される。

第１、田および■表のデータから明らかな如く、式１９
のトレーサーと組合せて用いた式３２のハプテンからつ
くった免疫原から生じる検定がすぐれた結果を提供する
。従って、この組合せが本発明の最も好ましい形態であ
る。更に、多くの他のハプテン／トレーサーの組合せ、
特に式３５と式２４、式３１と式２４および式３２と式
１８の組合せで示されるものもまた許容し得る結果を生
じ、そして代替的な好ましい組合せである。

第　　１　　表 兎でのＢＳＡ担体でのフルオロ置換免疫原ハブテン　　
トレーサー　　ネット偏光０　　スパン１　強度１式３
１　第１４図　　　１４０　　　７４　２１％式％ 軸　ネッ）％反対パックグラ９ンドノイズの比で表わし
た 第　　■　　表 抗体’＆Ｕ生Ｔるのに用いた式３のハプテンＥＳＡ　　
　　羊　　式２５　　２１０　　　９１　　　　７８式
％ 骨　ミリ偏光単位 峠　ネット強度対バックグラウンドノイズの比で懺わし
た 第ｍ表 兎でのハプテン置換分の変化 １３２１　　　　＃１８　　　２１７　　　１３９　　
　　６　　　　　−１３２１　　　　＃２０　　　１６
６　　　１１３　　　　８１３３１　　　７Ｆ１７　　
　１９６　　　１３３　　　１０１３３１　　　　＃２
６　　　１６５　　　１０２　　　１０１３３１　　　
　ＪＦ２２　　　１３６　　　　９６　　　１７１３３
１　　　１２０　　　２０４　　　１３７　　　１？１
３３１　　　　＃１８　　　１９４　　　１０４　　　
　６１３３ｊ　　　＃１３　　　１２５　　　　７０　
　　３４１３３１　　　　ｊ１９　　　１６０　　　１
００　　　１６螢　ミリ偏光単位 峠　ネット強度対バックグラウンドノイズの比で表わし
た １骨　先行技術の免疫原 本発明の方法を実施するｐＨは、トレーサーのフルオレ
セイン部分が開いた形態で存在させるのに十分なもので
なければならない。ｐＨは約３−１２、更に通常約５〜
１０の範囲にあり、最も好ましくは約６〜９の範囲にあ
る。検定操作中ｐＨを維持するのに種々の緩衝剤が使用
し得る。

代表的な緩衝剤にはホウ酸塩、りん酸塩、炭酸塩、トリ
ス、パルビタール等が包含さｎる。使用さｎる特別なａ
ｍ剤は本発明に対して臨界的なものではないが、トリス
およびりん酸塩緩衝剤が好ましい。緩衝剤のカチオン部
分は一般に溶液中のトレーサー塩のカチオン部分′ｆｒ
１％足する。

本発明の改良さｎた検定の好ましい方法を以下に詳述す
る。検定は「均一検定」であり、これは結合されたトレ
ーサーが未結合のトレーサーから分離さｔｌ、ない浴液
から終末偏光の示度ｔ−読み取ることを意味する。この
ことは、不均一な免疫定量性操作例えば結合さｎたトレ
ーサーを示度を読み取り得る前に未結合のトレーサーか
ら分離しなけｎはならない操作に１さる明確な利点であ
る。

本発明の螢光偏光検定のための試薬はブロヵインアミド
に特異的な抗体およびトレーサーを包含する。更に、ブ
ロカインアミド前処理浴′＆を包含する王に通常の溶液
、希釈緩衝液、ブロカインアミド検量体およびプロヵイ
ンアミド比較対照全用意するのが望ましい。これらの試
薬（そのいくつ力檜以下に記載する〕の典型的な溶液は
アボット・ラボラトリーズＣＡｂｂｏｔｔ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）、　アホットパー久イリノイから検
定「キラ）　Ｊ　（ｆｔｔ）で商業上入手可能である。

本文に示す％は他に指示のない限りすべて重量／容量で
ある。現存好ましいトレーサー処方は、０．１モルトリ
ス緩衝液ｐｉ　７．５　；　０．１％ドデシル硫酸ナト
リウム；ｏ、ｉ％アジ化ナナトリウムおよび０．０１％
牛ガンマグロブリン中の６１．５ナノモル（％ａｓｏｍ
・ＩＧデ）トレーサーである。抗血清処方は、帆１モル
りん酸塩緩衝液ｐＨ７−５；アジ化ナトリウム帆１％：
　（ＬＯ１％十ガンマグロブリン：および２比エチレン
グリコール（容量／容量）で希釈した先血清からなる。

希釈緩衝液は、０．１モルりん酸ナトＩＪウムｐＨ７，
５；０．１ｚアジ化ナトリクム；および帆０１′ｙ、十
ガンマグロブリンを包含する。前処理溶液は、０．０１
％牛ガンマグロブリン；０．１モルトリス緩衝液９Ｈ７
，５；　０．１％アジ化ナトリウム；０１駕ドデシル硫
酸ナトリクムを包含する。ブロカインアミド検量体はブ
ロカインアミドおよび正常人血清、濃度０．０．１．０
．２．５．５．０、ｉ　ｏ、ｏおよび２０．０１１Ｑ／
ｌを包含し、Ｏ，ＸＳアジ化ナトリウム防腐剤を伴うの
が有用である。ブロカインアミド比収対照はブロカイン
アミドおよび正常人血清を包含し、２．０．７．Ｏｐよ
び１５０ｍ９／ｌのｍｌで提供され、防腐剤として０．
１％アジ化ナナトリ９ム伴うのが有用である。

好適な操作は特にアボット・ラボラトリーズ、アーグイ
ング、テキサスから入手し得るアボット（Ａｈｂｏｔｔ
）・ＴＤｚ＠　ボーラリゼーション・アナライザーＣＰ
ｏ１αデ（−ｒａｔｉｏ％Ａｎαｌνロデ）と−線番こ
使用するように企図式れている。血清または血）Ｒ５μ
ｔを必要とする。検量体、比較対照すなわちコントロー
ルまたは未仰の試料をＴＤｚ＠試料カートリッジの試料
壁中に直接ピペットで入れる。この操作の利点の一つは
試料が特別な調製を何ら必要としないことである。ＴＤ
ｚ＠ブロヵインアミド検定キットをＴ　Ｄ　ｚ　＠アナ
ライザーと共に使用しているときは、キット中の３種の
試薬容器の各々からキャップを外し、セしてＴＤｚ＠）
アナライザー内の企図した壁中に入ｎ、そしてこのとこ
ろから検定操作は完全に自動化される。

手動による検定が達成されるときは、試料を希釈緩衝液
中の前処理溶液と混相し、そしてバックグラウンド示度
を読＾とる。次に、トレーサーを検定と混合する。次に
、抗体を供試溶液中に最後に混入する。培養後、螢光偏
光示度を読み取る。

各検量体、コントロールまたは試料の螢光偏光値を測定
し、そして例えばアボット・ＴＤｍ＠偏光アナライザー
のような装置の出力テープにプリントする。非線状回帰
分析を用いて、各検量体の偏光対その濃度をプロットす
る装置において、標準的ｍを作製する。各コントロール
または試料の濃度を保存検量線から読み、そして出力テ
ープにプリントする。

上述の好ましい操作に関し、トレーサー、抗体、前処理
溶成、検量体および比較対照は約２−８℃で保存し、一
方希釈緩衝液は周囲の温度で保存しなければならないこ
とを注目すべきである。標準曲線およびコントロールは
２週間毎に操作しなけれはならず、また各検量体２よび
コントロールは重複して操作さｎる。コントロールは各
バッチで操作しなけれはならない。すべての試料は重複
して操作することができる。

前述の詳細な説明および以下の実施例は例示を企図して
いるものであり、本発明の範囲に関して限定をしている
ものではないことが明らかである。当業者にとって種々
の変化をなし得るものであり、これらの変化は本発明の
範囲を定めるものではない。

実施例 実施例１−ＬＸ■は本発明の着想に従って打われた実験
全記載している。実施例１−ｖｌは抗体生産ｌこ有用な
免疫原の装造を記載しまた実施例鴇−ＸＬ■は免疫原お
よびトレーサーの前駆体の合成に係り、そして実施例Ｘ
Ｌｒ１．−ＬＸ■はトレーサーの製造に係る。

Ｎ−〔Ｎ′−エチル−Ｎζ（３−カルボキシ−１−プロ
ピル〕−２−アミノエチル〕−ｐ−ヒドロキシベンズア
ミド（５，４ｒＩＪｇ）ｊ？よびＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（２，７Ｎｉ）をジメチルホルムアミドＬＯ−
に浴屏し、そしてジシクロへキシルカルボジイミド（４
，９Ｉｎ９）’を加えた。浴ｇｔ室温で一夜かくはんし
、セして得られた混合物を濾過し、セして炭酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ９゜８）３（ｌｄ中のサイログロブリン
ｔ１．２８　Ｓ’の浴水に加えた。０−５℃で一夜かく
はんを松け、次１こ免疫原を透析および体結乾燥で単離
した。

実　施　例　ＩＩ：式３１のハブテンおよび牛血清アル
プミＮ−〔Ｎ’−エチル−Ｎ’−（３−カルボキシ−１
−プロピル）−２−アミノエチル〕−ｐ−フルオロベン
ズアミド（２０ＩＲ９，０，０７憔モル〕をＤＭＦ２０
０−にとり、セしてＮ−ヒドロキシスクシンイミド９Ｉ
Ｒ９（０，０８ｓモル）およびジシクロへキシルカルボ
ジイミド１７ＩＱ（０，０８ｍモル）を加えた。混合ｖ
ｌＪを０−４℃で一夜力）り扛んし、ジシクロヘキシル
尿素全戸去し、セしてＦｇｋＯ℃で炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９，８）３−中の牛血清アルブミン１１３ＩＲ
９（ｔｌ、００１７鴨モル）に加えた。混合物を０−４
℃で一夜かくはんし、次に緩衝液を毎日交換しながら６
日間希水醗化アンモニウム（ｐＨ９，４）　１　ｔに対
して透析した。

ｌ：ｌジオキサン−ジメチルホルムアミド２．〇−中の
Ｎ−〔Ｎ’−エテル−Ｎ’−（３−カルボキシ−１−プ
ロピル）−２−アミノエチル〕−ｐ−フルオロベンズア
ミド（５０■〕にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２５
ＩＩ９）およびジシクロへキシル−カルボジイミド（４
５９）を加えた。溶液を室温で一夜かくはんし、そして
ｐＨ８，２のりん酸塩緩＠ｇ２５ｗｄ中のサイログロブ
リン（３００ダ〕の溶液に濾過して入れた。室温で一夜
かくはんした後、３日間蒸留水に対して透析しそして凍
結乾燥すると生成物が得られた。

Ｎ−〔Ｎ’−エテル−ｙ−（３−カルボキシ−１−プロ
ピル）−２−アミノエチル〕−ｐ−クロロベンズアミド
（４５Ｍ９）ｊ？よび牛血清アルブミン３ＵＩＩ９を蒸
留水４ｔｄ４こ溶解し、ｐＨを５．０に調節しそしてｌ
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド〔ＥＤｃ〕４５９全力）くはんしながら混合物
に加えた。１時間後、ＥＤＣを更に４５１ｎ９を加えた
。室温で更に４時間後に、混合物全蒸留水２ｔで水を５
回変えながら３日間透析した。

実施例ｍの方法により＃−（Ａ／ζエチル−Ｎ’−（３
’−カルボキシ−１−プロピル）−２−アミノエチル〕
ベンズアミド５３ダおよび牛血清アルブミン２６１１９
から本免疫原を製造した。

実施例ｍの方法によりＮ−〔Ｎ′−エチル−Ｎ′−（３
−カルボキシ−１−プロピル）−２−アミノエチル〕−
ｐ−トルアミド４８〜および牛血清アルブミン４０．９
から本免疫原を！ｌｌｉ！遺した。

実　施　例　ｖｕ：ｐ−ベンジルオキシ安息香酸メチル
エステル ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（１，Ｏｆ　）
　’ｉ乾燥ＴＨＦＣ６ｔｄ）４ことり、セしてこのむ欣
を６ｍ１ＴＨＦζこ懸濁した水素化ナトリウム（α２６
））に滴加した。１０分後ＤＭＦを浴叡が透明となる１
で滴加し、そしてベンジルブロマイド（０７８ｆ）を滴
加した。ｆｆｌ温で一夜かくはんを続けた。溶媒を除云
し、残渣をＨ，Ｏに俗解し、そしてＣＢ、ＣＩ４で抽出
した。Ｍ後層ｆＮａＨｃＯ３浴液で洗い、セして硫酸マ
グネシウムで乾燥した。溶媒全回転蒸発で除云すると純
粋な生成物が得らｎた。収量２．７９　ｒ　　融点９２
−９４℃ ｐ−ベンジルオキシ安息香酸メチルエステルに９ｔＪＭ
ｅＯＨおよび１ＮＮａＯＨの９ｄにとった。溶ａｔ−ａ
時間還流し、冷却しそして過剰のＨ，Ｏに注入した。ｐ
Ｈが酸性となる１で塩酸ヲ加え、そして浴ｇをジクロロ
メタンで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し
そして溶媒を除去すると白色針状晶として生成物が得ら
れた。収量２．１　ｔｏ ｐ−ベンジルオキシｆ息査１！ｆｆｌ　（３，４２ｒ　
）　’ｉジクロロメタンＩＯ＋ｄにとり、そしてＤＭＦ
を全ての物質が溶液となる１で滴加した。Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（１，７２ｔ〕およびジシクロへキシ
ルカルボジイミド（３，０９ｒ　）を加えた。反応混合
物を室温で１時間かくはんし、濾過し、セしてＮ−エチ
ルエチレンジアミン（１，３２？　）　ｔ−２７０えた
。

室温で３０分間かくはん後、溶媒全除去し、セして残渣
を−夜高具仝下においた。

Ｎ−ｒ−Ｎζエチル−２−アミノエチル〕−ｐ−ベンジ
ルオキシベンズアミドｆＤＭＦ４−にとった。エチルブ
ロモクロトネート（ＯＪ６Ｐ）？加え、そして反応を室
温で３０分間力）くけんした。溶媒を回転蒸発で除去し
、セして残渣をジクロロメタンｌＯ−に溶解した。有機
層を１０ｓｄ塩水で３ＩＰ！Ｊ洗滌し、硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、そして溶媒′ｆ−除去すると粗生成物が侍
らｎた。このものをシリカゲルでのカラムクロマトグラ
フィーで精製し、ジクロロメタン−メタノールで溶離し
て精製した。収量０．４２　ｆドロキシベンズアミド Ｎ−〔Ｎ′−エチル−Ｎ′−（３−カルボエトキシ−１
−プロピル））−２−アミノエテル−ｐ−ベンジルオキ
シベンズアミド（ｘ４０ｍ９）′ｆｒ：９５％Ｆ：ｔＯ
Ｈ５，０−にと９、セして１ｏ′Ａｐｔ付きカーボン２
０〜を加えた。２５１（で１時間低圧水素添加器で水素
添加を実施した。浴ａを濾過し、そしてＦ液を濃細し、
真空で乾燥すると生成物が得られた。収量２７１！ｇ ジベンズアミド Ｎ−〔Ｎζエテル−Ｎζ（３−カルボキシ−１−プロピ
ル）−２−アミノエテル〕−ｐ−ヒドロキシベンズアミ
ド（１７Ｉ１ｇ）を０．５−のエタノールにとり、セし
て１．０　Ｍ水酸化ナトリウム１．０−を加えた。室温
で１時間かくはんした後、塩酸を添加して酸ａｐＨとし
た。溶媒ｔ−ｈ転蒸発で除去し、そして生成物を逆相プ
レプ（ｐｒ−ｐ）プレートで０．５％酢酸を含む５０１
５０水−メタノールで溶離して精製した。収量１２．４
■ ベンズアミド 安息香酸メチル（６８０ｒ）およびＮ−エチルエチレン
ジアミン（６，６０ｔ　）　ｉ　）ルエン２０９−に俗
屏し、セして２３Ａ日間加熱還流した。溶媒を除云し、
セして残渣を希塩酸とジクロロメタンとの間で分配した
。水層を固体水酸化カリウムで塩基性化し、ヤしてジク
ロロメタンで２回抽出した。炭酸カリウムで乾燥した後
、溶媒を除云すると油として生成物８−７２　ｆが残っ
た。

エチル〕ベンズアミド Ｎ−ＣＮζエチル）−２−アミノエテルベンズアミド（
２，６９ｆ　）およびエチルブロモクロトネート（２，
９７？　）をジメチルホルムアミド２５−中室温で２時
間放置した。

炭酸カリ９ム（３，８６ｒ　）を加え、セして混合物ｔ
−Ｕ温で一夜放置した。溶媒を除去し、残渣をジクロロ
メタンにと９、濾過して無機塩を除去し、塩水で洗い、
そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除云すると油
４８６？が残り。

このものを中性アルミナ５（ｌで、ジクロロメタンで溶
離して、クロマトグラフィーを行うことによって精製す
ると透明な油として生成物３．０２ｔが得らｎた。

ズアミド Ｎ−〔Ｎ’−エチル、Ｎ’−（３−エトキシ力ルポニル
ープロブ−２−エン−１−イル）−２−アミノエチル〕
ベンズアミド（１，０１ｔ−５０−のエタノールに溶解
し、セして室温、３気圧の初圧でラネーニッケル〔アル
ドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｇｈ　Ｃ
ｈｍｔｈ４ｃａｌ　Ｃｏｔｎｐａ−ηυ〕で水素添加し
た。生成物ｔ−濾過して単離し、そして溶媒を除去する
と油０．９７９が得られた。

Ｎ−（Ｊ／ζエチル、　Ｎ′−（３−エトキシカルボニ
ル−１−プロピル）−２−アミノエテル〕ベンズアミド
（４９２ダ、１．６愼モル）をメタノール５ｍに溶解し
、そして１．０ＭＮａＯＨ浴ｖｌｉ、３．２−で処理し
た。室温で５時間放置した後、３ＭＭＣ１５３０ｄ（１
，６ｍモル）ｔ−加え、そして溶媒を除去した。アセト
ニトリルで数回ストリッピングして残留する水を除去し
た後、残渣をメタノールにとり、そして塩化す１．　リ
ウムから濾過した。溶媒を除去すると無色のコ９ム状物
として生成物が得られた。

Ｎ−エチルエチレンジアミンＣ１，７６ｔ）ｔジクロロ
メタン２０ｍに浴所し、そして氷塩浴で冷却した。ジク
ロロメタン２〇−中のｐ−フルオロベンジルクロライド
（１，５９ｆ）の同じく冷却した溶液を３０分間かけて
よくかくはんしながら部用した。混合物を１０分間で室
温で加温びせ、そして溶媒を除去した。残渣を希塩酸に
とり、ジクロロメタンで抽出し、固体水酸化ナトリウム
で塩基性化し、ジクロロメタンに抽出し、炭酸カリクム
で乾燥し、戸適しセして凝縮すると無色の油として標記
化合物１．（Ｊ　１　ｔが残った。

Ｎ−ＣＮζエチル−２−アミノエチル）−ｐ−フルオロ
ベンズアミド（６５４〜）、トリエチルアミン（６５０
ｗｔ）およびブロモアセトニトリル（５５，９１Ｒ９）
ｔメタノール２−に溶解し、セして室温で２時間放置し
た。溶媒を除去し、残渣を希塩酸に溶解した。エーテル
で抽出した後、水層を固体水酸化カリ９ムで塩基性とし
、そしてジクロロメタンで抽出した。溶媒を除去した後
、残渣をジクロロメタン−メタノールでシリカゲル４０
９でクロマトグラフィーで精製すると透明な油６２６Ｉ
ｎ９が得らｎた。

ド Ｎ−ＣＮ′−エチル−２−アミノエチル）ｐ−フルオロ
ベンズアミドＣ０３４ｔ）ｆ３気圧の初圧下で９０：１
０メタノール−アンモニア１０〇−中す３０ラネ一ニツ
ケル４００１１ｋｇで一夜水素添加した。触媒を除去し
、そして溶媒を除去すると殆んど無色の油０．３５９が
残った。

ベンゾイルクロライド（２，１１ｆ）を２．２．２−）
リフルオロエタノール５．５−に溶解し、ふたをし、室
温で一夜放置し、次に手短かに加熱還流した。揮発性物
質を除去し、セして残渣をトリフルオロエタノール２−
に再びとり、そして手短かに加熱還流した。全ての揮発
性物質を再び除去した。残渣をジクロロメタン１〇−瘉
こｆ６解し、水浴で冷却し、セしてＮ−イソプロピルエ
チレンジアミン１．８４９を５分間かけて加えた。混合
？！Ｉを２ｈ日間冷蔵庫に放置した。揮発性物質を除去
し、セして残渣を希塩酸とエーテルとの間で分配した。

固体水酸化カリウムで水層を塩基性にし、エーテルで抽
出し、乾燥しセして溶媒を除去すると無色の油として生
成物２．２５　ｆが得られた。

実施例ＸＸＩの方法に従って、ｐ−トルオイルクロライ
ド３．０９　ｆおよびＮ−エチルエチレンジアミン１．
９４　ｆから過剰の２　＋　２　＋　２−　）　リフル
オロエタノールを用いてこの化合物を製造した。収ｉ１
３．Ｕ（１ 実施例ＸＶＵの方法に従って、ｐ−クロロベンゾイルク
ロライド８．７５９９よひＮ−エチルエチレンジアミン
５．５１２からこの化合物を製造した。収量５．０９　
ｆ生成物を反応混合物から晶出させ、ｐ過着こよって単
離する以外は実施例ＸｖＩｌの方法に従って、ｐ〜ニト
ロベンゾイルクロラ・「ド１．８５６　ｒ＆よびＮ−イ
ソプロピルエチレンジアミン１．０２２　Ｆからこの化
合物′（ｉ−製造した。収量塩酸塩として２．４６９ この化付物は実施例ＸＩＶの方法により製造した。Ｎ−
［Ｎ−（２−７０ビル）−２−アミノエチル〕ベンズア
ミド２．１８？およびエチル４−プロモクロトネー）　
２．２５　ｒから淡黄色部として′Ｓ記化曾物２．０７
　？が侍られた。

実施例ＸＩＶの方法に従ってＮ−（Ｎζエチル−２−ア
ミノエチル〕ｐ−フルオロベンズアミド８．１２および
エテル４−ブロモクロトネート？、４４　ｔからこの化
合物を製造した。精製した生成物の収量は４．０２でお
った。

実施例Ｘ１ｖの操作に従ってＮ−〔Ｎζエチル−２−ア
ミノエチルコアートルアミド３．４３　ｔおよびエテル
４−ブロモクロトネート３．５３９からこの化合物？＃
造した。精製した生成物の重量は３．６４　ｆであった
。

実施例ＸＩｖの操作に従ってＮ−〔Ｎ′−エチル−２−
アミノエチル〕ｐ−クロロベンズアミド３．３８　ｆお
よびエチル４−ブロモクロトネート３．１８　ｒから精
製した標記生成物３．４７　ｔが得らｎた。

Ｎ−Ｎ’−Ｃ２−プロピル）、Ｎ’−Ｃ３−エトキシ−
カルボニルプロ７’−２−エン−１−イル）−２−アミ
ノエチル〕ベンズアミド２・０２ｆｔを用いて実施例Ｘ
ｖの操作ｔ−実施すると、標記化合物１．９３　ｒがほ
とんど無色の油として得られた。

Ｎ−（＃ζエチル、　Ｎ′−（３−エトキシカルボニル
プロブ−２−エン−１−イル）−２−アミノエチル〕ｐ
−フルォロベンズアミド（４，Ｏｆ　）　ｆｆ１３ｆｉ
圧でエタノール中１０％パラジウム付き木炭４ＵＯＩｎ
９で水素添加した。触媒を濾過し、浴媒を除去するとＭ
３．８９　ｆが残った。

−トルアミド この化合物は実施例Ｘ■の方法により製造された。Ｎ−
〔Ｎζエテル、Ｎ’Ｃ３−エトキシカルボニルプロプ−
２−エン−１−イル）−２−アミノエチル〕ｐ−トルア
ミド（３，５５ｆ　）から殆んど無色の油として標記化
合物３．２９Ｖが侍らｎ、た。

粗生成物が小量の不純分で汚染され、クロマトグラフィ
ーによる精製を必要とする以外は実施例Ｘ■の方法によ
りＮ−Ｎ′−エテル、Ｎζ（３−エトキシカルボニル−
プロプ−２−エン−１−イル）−２−アミノエチル〕ｐ
−クロロベンズアミド１．４（ｌからこの化合物が製造
された。最終収量は６６３１ｎ９であった。

ベンズアミド この化合物は実施例Ｘｖ１の操作に従ってＮ−〔Ｎ’−
Ｃ２−フロビル〕、Ｎ′−（３−エトキシカルボニル−
１−プロピ＃）−２−７ミノエチル〕ベンズアミド１．
８　Ｏｆから製造さｎた。

ロベンズアミド この化合物はＮ−〔Ｎζエチル、Ｎζ（３−エトキシカ
ルボニル−１−−ｆロビル）−２−アミノエテル〕ｐ−
フルオロベンズアミド３．８９　ｆおよびエタノール−
水中の水酸化ナトリウム０．４８　Ｆから製造した。室
温で３時間後、溶液を希塩酸で酸性となし、生成物をジ
クロロメタンで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥しセし
て浴媒を除去すると２、Ｏｆが得られた。

この化合物は実施例Ｘｖｌの方法によりＮ−〔Ｎ’−エ
チル。

ｙ−Ｃ３−エトキシカルボニル−１−プロピル〕−２−
アミノエチル〕ｐ−トルアミド３．０２　ｆから製造さ
れた。免疫原の製造に使用する物質の部分を厚層プレー
トでのクロマトグラフィーにより精製した。

ホキシーｌ−プロピル）−２−アミノエチル〕ｐ−クロ
ロベンズアミド この化合物は実施例ＸＶＩの方法番こよりＮ−〔Ｎ′−
エチル。

ｆ−（３−エトキシカルボニル−１−プロピル）−２−
７ミノエテル〕ｐ−クロロベンズアミド９９９から製造
した。

殆んど無色のゴム状物の収量は８７〜であった。

この化合物は実施例ＸＩＸの操作に従ってＮ−（Ｎ′−
エチル−２−アミノエテル）ベンズアミド１．９２　ｔ
およびブロモアセトニトリル２．４ｆから製造された。

クロマトグラフィー後の収量は１．２９　ｆであった。

この化合物は、塩基としてトリエチルアミンの代りにジ
イソプロピルエチルアミンを使用し、反応時間を２４時
間に増加させる以外は、実施例ＸＩの操作番こ従ってＮ
−（Ａ＋’−エチル−２−アミノエチルクーｐ−ニトロ
ベンズアミド２３７Ｉ！Ｉ９およびブロモアセトニトリ
ル２４０Ｉｎｇから製造さｎた。淡黄色結晶性生成物は
融点１１５−１１６℃を肩していた。

この化合物は、＠基としてトリエチルアミンの代９擾こ
ジイソプロピルエチルアミンを使用する以外は実施例Ｘ
Ｉの操作によりＮ−（Ｎζエチル−２−アミノエチル）
ベンズアミド９６０■訃よび３−ブロモプロピオニトリ
ｋ１．７９ｔから製造された。若干の機械的損失後の収
量は２６５ＩＩ９でおった。

ル）　−２−’ｙミノエチル〕−ｐ−ニトロベンズアミ
ドジメチルホルムアミド６−中のＮ−ＣＮζエテル−２
−アミノエチル）−ｐ−二トロベンズアミド（１，３７
Ｆ　）、３−ブロモプロピオニトリル（１，００？　）
および炭酸カリウム（１，３８９）を室温で一夜かくは
んした。３−ブロモプロピオニトリルを更に０．３４９
を加え、そして混合物を７時間５０−６０℃の油浴中で
加熱した。混合物をジクロロメタンで希釈し、セして濾
過して無機塩を除去しセして俗媒を除去した。残渣をシ
リカゲル３０ｆでジクロロメタン−メタノールで溶離し
てクロマトグラフィー処理をすると生成物１．３８ｒが
得られた。

ト テトラヒドロフラン２−中のＮ−〔Ｎ′−エテル−２−
アミノエチル〕−ｐ−フルオロベンズアミド（２１０〜
）をアクリロニトリル６４ｊＩ２および２Ｍ水酸化ナト
リクム０．０２５−で処理し、室温で一夜かくはんした
。温！ｔ−５５℃に上げ、そして追加のアクリロニトリ
ル（１２７ＩＩ＃９童）を４時間および２０時間後に加
えた。５５−６０℃での全時間は２４時間であった。粗
生成物をシリカゲル２．５ｔｔ通し、クロロホルム−メ
タノールで溶離することによって生成物を単離すると透
明な油２６５〜が得らｎた。

ンズアミド この化合物は、トリエチルアミン塩基を加えない以外は
実施例ｘｒＬの操作をこよｒ）ｙ−＜ｎ′−エテル−２
−アミノエチル）−ｐ−フルオロベンズアミド２１０〜
および４−ブロモブチロニトリル１６３〜から製造さｎ
た。生成物の収率は理論量より４若干大きかった。この
理由は若干のニッケル塩が含’Ｅｎていたからでろる。

こｎらの塩は次の反応を阻害しなかった。

ラネーニッケルの代りに触媒として５％ロジウム付きカ
ーボンを使用する以外は実施例ｘｘの操作に従ってＮ−
〔Ｎζエチル、Ｎζ（シアノメチル）−２−アミノエチ
ルクーｐ−ニトロベンズアミド９２■からこの化合物が
表迫石れた。重量６２〜の生成物はラネーニッケル還元
で生産された生成物はど清浄ではなかった。

この化付物は実施例ｘＸの操作に便ってＮ−（Ｎζエチ
ル、Ｎζ（２−シアノエチル］−２−アミノエチル〕ベ
ンズアミド２３９ＩＩ＃９から製造された。収量２０５
ＩＩＩ９、淡緑色前 ンズアミド この化合物は実施例Ｘｘの操作に従ってＮ−（＃−エチ
ル、７１／’−（２−シアノエチル）−２−アミノエチ
ル）−ｐ−フルオロペンズアミド２００Ｉ＃ｇから製造
した。

ズアミド この化合物は実施例ｘｘの操作番こ従ってＮ−〔Ｎ’−
エチル、Ｎ’−（３−シアノ−１−プロピル）−２−ア
ミノ−エテルｌｐ−フルオロベンズアミド１００ｍｇか
ら製造した。

キシ）フルオレセイン ５−カルボキシフルオレセイン　Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミジルエステル（５００Ｉｖ）をジメチルホルムア
ミド２−にとり、そしてジメチルホルムアミド２−中の
エチレンジアミン６３５〜の′＃ｒＷＩＬに加えた。混
合物を室温で３０分間かくはんし、そして大量のエチル
エーテルで希釈し、モして沈殿ｔ−戸果した。

Ｎ　−（Ｎ’−エテル−２−アミノエチル）ベンズアミ
ド（２５１＃ｇ、０．１ｓモル）％５−ブロモアセトア
ミドフルオレセイン（２３９，０，０５ｓモル）および
トリエチルアミン（１７，７ｍ９．０−１７５ｓモル〕
をメタノール０．２５−に浴解し、そして定温で一夜か
くはんした。生成物をシリカゲル厚層プレートで３：ｌ
クロロホルム−メタノールで展開してクロマトグラフィ
ーで単離した。

Ｎ−ＣＮ’−エチル−２−アミノエチル＞−ｐ−フルオ
ロベンズアミド塩酸塩（２５＃、　０．１嘱モル）、５
−ブロモアセトアミドフルオレセイン（２３＃、ｔ）、
０５　ｖｎモル）およびトリエチルアミン（（Ｊ、０２
６１１Ｉｔ、　０．１５％モル］をメタノール０．２５
１１１ｔｉこ浴解しそして室温で６４時間かくはんした
。生成物ｔ−３：　１クロロホルム−メタノールで展開
シてシリカゲル厚層プレートでのクロマトグラフィーに
より単離した。

チル〕４−トルアミド Ｎ−ＣＮ’−エチル−２−アミノエテル）４−トルアミ
ド（１２ＩＩ９．０．０５惰モル）、５−ブロモアセト
アミドフルオレセインＣ２３４，０，０５ｍモル）２よ
びトリエチルアミン（１２，５ＩＩ＃９、Ｕ、ｌ　２５
惰モル）をメタノール０．２５ｓｄに浴解し、そして室
温で３６時間放置しｔ’：、　２　：　１クロ′ｉホル
ム−メタノールで厚層シリカゲルプレートでのクロマト
グラフィーにより純粋な生成物か得らｎた＝Ｎ−〔Ｎ’
−エチル−２−アミノエチル］−ｐ−クロロベンズアミ
ド（２０１Ｆ９％ｏ、ｏ　８８惧モル）、５−プロモア
ｊドアミドフルオレセイン（２３Ｉｖ％Ｕ、０５　ｔｎ
モル）およびトリエチルアミン（（Ｊ、０１［）５ｍｇ
、０．０７　’５％モル）１！−メ′タノール０．２５
−に溶解しそして室温で２４時間放置した。

生成物を３＝１クロロホルム−メタノールで展開してシ
リカゲル厚層プレートでのクロマトグラフィーにより単
離した。

Ｎ−〔Ｎ’−Ｃ２−プロピル）−２−アミノエチル）−
ｐ−ニトロペンズアミド（２９〜）および５−ブロモア
セトアミドフルオレセイン（２３ＩＩ９）ｔ−メタノー
ル０．５ｍ４Ｃとり、そして室温で３６時間かくはんし
た。生成物をクロロホルム−メタノールでの溶離によシ
リカゲル厚層プレートでのクロマトグラフィーによ）単
離した。このものをメタノール７ｗ５ｔｊ？よび１５％
水酸化カリウム水爵歌２−にとシ、そして硫ｌｌ第一鉄
７水和物のｌＯ％水浴液１ｍを加えて還元した。得られ
た沈殿を遠心分離で除去し、ｐＨを６．７４こａｌ１１
１節しそして温媒を除去した。クロロホルム−メタノー
ルでのシリカゲルプレートでの第二のクロマトグラフィ
ーにまって純粋な生成物が得られた。

この化合物は、Ｎ−〔Ｎ′−エテル−２−アミノエチル
〕−シーニトロベンズアミド４０ＩＩｋｇ＆’よび５−
ブロモアセトアミドフルオレセイン９４９から出発して
実施例Ｌｍの方法に従って製造された。

Ｎ−〔Ｎ′−エテル、Ｎ’−（３−カルボキシ−１−プ
ロピル）−２−７ミノエチル〕ベンズアミド（１７ＪＩ
ｐ、０．０６４偽モル）ｔｆｌｉ、燥ジメチルホルムア
ミド０．１０−に溶解し、水浴で冷却しそしてインブチ
ルクロロホルメート１３．２ダ（０，ｌ溝モル）を加え
た。溶液を氷が静けるにつれて３ｆ１＃間かくはんし、
モして室温に加、温した。仁の混会物の半分を６−アミ
ツフルオレセイ７１１η（０−０３２ｙ＋ａモル）に加
え、そしてピリジン０．０５−を加えた。室温で一夜か
ぐはんした後、生成物を３：１クロロホルム−メタノー
ルで展開してシリカゲル厚層プレートでの夕、ロマトグ
ラフイーにより単離した。

実施例Ｚ、Ｘの方法によシ、Ｎ−〔Ｎ’−Ｃ２−プロピ
ル〕。

Ａ／’−（３−カルボキシ−１−プロピル）−２、−ア
ミノエチル〕ヘンズアミド６３Ｉｔ９、インブチルクロ
ロホルメート４１Ｍｇおよび５−７ミノフルオレセイ７
２８〜からこの化合物を製造した。クロロホルム−メタ
ノール（２：１）ｉクロマトグラフィー精製に使用した
。

Ｎ−ｒ−Ｎ’−エチル、Ｎ’　（３−カルボキシ−１−
プロピｋ）−２−７ミ／エチル〕−ｐ−クロロベンズア
ミ）−ＣＢ’Ｄｙ）ｓ−よぴカルボニルジイミダゾール
４０．５ｊｌｐをアセトニトリル２ｍにとった。室温で
１％時間かくはんした後、０．４０−アリコートをとり
、回転蒸発器で濃縮し、ジメチルホルムアミド帆１０ｄ
４こ貴溶膚し、そして４３Ａ時間室温で６″−７ミノフ
ルオレセイン１７．４１＋１９と反応させた。

生成物Ｔｈ３　：　ｌクロロホルム−メタノールで薄層
、プレートで２回クロマトグラフィー処理することによ
り精製した。

Ｎ−ｒ、Ｎ’−エチル、　Ｎ’−（３−カルボキシ−１
−プロピル））−２−アミノエチル−２−ヒドロキシベ
ンズアミド（８０ＩＩｇ）ｔ−ジメチルホルムアミド２
−にとり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４１１Ｉｇ
）ｊ！？よびジシクロヘキシルカルボジイミド（７３Ｉ
Ｎｉ）を加えた。溶液を室温で一夜かくはんし、モして
ジメチルホルムアミド１−中の５−（２−アミノエチル
アミノカルボキシ）フルオレセイン（１１４ｍｇ）およ
びトリエチルアミン（２８ｊｌＩｇ）の溶液番こＦ遇し
て入れた。混合物を再び室温で一夜かくはんし、そして
溶媒を除いた。生成物を逆相クロマトグラフィープレー
トでのクロマトグラフィーによりｍ製した。

Ｎ−〔Ｎζエチル、Ｎ’−（２−アミノ−１−エテル）
−２−７ミノエチル〕ベンズアミド（３０９）ｔ、予め
２時間ピリジン帆２５ｓｄでかくはんしておいた６−カ
ルボキシフルオレセイン、１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール水相物１３．９４およびジシクロへキシルカルボ
ジイミド４８．２〜から形成され７’Ｃｆｆ１性化６−
カルボキシフルオレセインの浴猷と反応させた。最終混
合物を一夜かくはんし、そして生成物を１すクロロホル
ム−メタノールでシリカゲル厚層プレート、次にメタノ
ール−酢酸アンモニクム緩衝液で逆相プレートでクロマ
トグラフィーにまり単離した。

（フルオレセイン−６−イルアミノ）−６−クロロ−１
゜ベンズアミド Ｎ−〔Ｎ′−エチル、Ｎζ（２−７ミノエチル）−２−
アミノエチル〕ベンズアミド（８ｍｇ）および６−（（
４，６−ジクロロ−１，３，５−）リアジン−２−イル
）アミノコフルオレセイン（１７，５Ｊ１９）全メタノ
ール０コーに溶解した。トリエチルアミン（（Ｊ、０１
５ｄ）　’に加え、そして混合物を室温で３時間〃為＜
はんした。生成物をクロロホルムーメタノールで展開し
て分取薄層クロマトグラフィーによシ精製した。

ベンズアミド この化合物は実施例ＬＸの方法に従ってＮ−〔Ｎ′−エ
チに、Ｎ’−Ｃ２−７ミノエテ゛ル〕−２−アミノエ゛
チル〕ベンズアミド１３ｍ９ｊ？よび５−（（４，６−
ジクｏロー１．３ｗ５−トリアジン−２−イル）アミノ
コフルオレセイン２９ダから製造された。

この化合物は実施例ＬＸの方法蛋こ従ってＮ−ｒ−Ｎ’
−エチルｒ　Ａ’　−（２−ｙ　ミノエチル）−２−ア
ミノエテル〕ベンズアミド９■２よび５−［（４，６−
ジクロロ−１，３゜５−トリアジン−２−イル）アミノ
コフルオレセイン１９．１１ｎ９から製造された。

（フルオレセイン−５−イルアミノ）−６−クロロ−１
゜この化合物は、反応を水浴で開始しモして３３Ａ時間
番こわたって徐々に室温に加温した以外は、実施例Ｌｘ
の方法に従って製勇された。出発物質／Ｉ′ｉＮ−〔Ｎ
′−エチル、Ｎ′−（２−アミノエチル）−２−７ミノ
工チル〕ベンズアミド１５ｍｇｊ？よび５−［（４，６
−ジクＣ’０−１．３．５−）リアジン−２−イル）ア
ミノコフルオレセイン２２．７Ｍ９であった。クロマト
グラフィー溶媒は酢酸エチル−メタノールおよび次にク
ロロホルム−メタノールであった。

ベンズアミド この化合物は実施例ＬＸの方法に従ってＮ−〔Ｎζエチ
ル、Ｎζ（３−アミノ−１−プロピル）−２−アミノエ
テル〕ベンズアミド７Ｉｎ９ｊ？よび５−（（４，６−
ジクロロ−１，３，５−）リアジン−１−イル）アミノ
コフルオレセイン１４．９１ｋｇから製造さｎた。

ベンズイミド この化合物は実施例ＬＸの方法に従ってＮ−（Ｎ′−エ
チル、Ｎ’−（３−アミノ−１−プロピル）−２−アミ
ノエテルツーｐ−フルオロベンズアミド６．２ｍｇおよ
び５−　（（４゜６−ジクロロ−１，３，５−）リアジ
ン−２−イル）アミノコフルオレセイン１２．６ｍｇか
ら製造された。

この化合物は実施例ＬＸの方法に従って製造された。但
し、反応時間は４℃で１６時間次に室温で１時間でめっ
た。

出発物質はＮ−［Ｎζエチル、　ｙ’−（４−アミノ−
１−ブチル）−２−アミノエテルツーｐ−フルオロベン
ズアミド５１１ｇ２よび５−（（４，６−ジクロＯ−１
，３，５−）リアジン−２−イル）アミノコフルオレセ
イン９．５４であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物。 上記構造において、 Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または
   別の免疫学的に活性な担体、あるいはフルオレセインま
   たはフルオレセイン誘導体であり； ＸはＮＨ、ＣＯ、ＣＳ、Ｃ＝ＮＨまたはＳＯ＿２であり
   ；ｎは０、１または２であり； Ｒは、Ｑがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体
   または別の免疫学的に活性な担体であるときは、６個ま
   でのヘテロ原子を包含し、また小計０−１８個の炭素原
   子およびヘテロ原子を有する８個までのヘテロ原子を包
   含する結合基であり； Ｒ′は１−３個の炭素原子を有するアルキル基であり；
   Ｙは、Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
   であるときは、ＯＨ、ＮＨ＿２、ＣＨ＿３、Ｆ、Ｃｌ、
   Ｂｒ、ＣＦ＿３またはＨであり、そしてＹは、Ｑがポリ
   （アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または別の免疫
   学的に活性な担体であるときは、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ＿３、
   ＦまたはＣｌであり；そして Ｚは、Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
   であるときは、ＨまたはＦであり、そして、Ｑがポリ（
   アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または別の免疫学
   的に活性な担体であるときは、Ｈであり；そして ＺがＹまたはカルボキサミド基に結合しているベンゼン
   環の炭素原子以外の該炭素原子のいずれかに結合してい
   る。 ２、Ｑが牛血清アルブミンである特許請求の範囲第１項
   記載の化合物。 ８、Ｑがアミノ、アミド、アミジノ、尿素、チオ尿素、
   カルバメート、チオカルバメート、トリアジニルアミノ
   またはフルオレセインの（カルボキシアミノ）−スルホ
   ンアミド誘導体である特許請求の範囲第１項記載の化合
   物。 ４、Ｑが４−クロロ−６−（フルオレセイン−５−イル
   アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イルである特
   許請求の範囲第１項記載の化合物。 ５、Ｑが４−クロロ−６−（フルオレセイン−６−イル
   アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イルである特
   許請求の範囲第１項記載の化合物。 ６、Ｑが４−メトキシ−６−（フルオレセイン−５−イ
   ルアミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イルである
   特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ７、Ｑが４−メトキシ−６−（フルオレセイン−６−イ
   ルアミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イルである
   特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ８、Ｑが（フルオレセイン−５−イル）アミノである特
   許請求の範囲第１項記載の化合物。 ９、Ｑが（フルオレセイン−６−イル）アミノである特
   許請求の範囲第１項記載の化合物。 １０、Ｑがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体
   または別の免疫学的に活性な担体である特許請求の範囲
   第１項記載の化合物に対する抗体。 １１、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｒは６個までのヘテロ原子を包含し、そして小計０−１
   ８個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であり
   ； Ｒ′は１−３個の炭素原子を有するアルキル基であり；
   ＸはＮＨ＿２、ＣＯＯＨ、ＣＮ、ＣＨＯ、Ｂｒ、Ｉまた
   はＯＨであり；そして ＹはＨ、ＯＨ、ＣＨ＿３、ＦまたはＣｌである）を有す
   る前駆体をポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）の
   誘導体とカップリングさせる工程からなる免疫原の製法
   。 １２、ポリ（アミノ酸）がサイログロブリンである特許
   請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、ポリ（アミノ酸）が牛血清アルブミンである特許
   請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、反応を活性エステルカップリングにより実施する
   特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １５、１５ ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中 Ｒは６個までのヘテロ原子を包含し、また小計０−１８
   個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であり； ＸはＮＨ＿２、ＣＯＨ、ＣＮ、ＳＯ＿３ＨまたはＯＨで
   あり；ＹはＯＨ、ＮＨ＿２、ＣＨ＿３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ
   、ＣＦ＿３またはＨであり；そして ＺはＨまたはＦである） を有する前駆体をフルオレセインまたはフルオレセイン
   誘導体とカップリングさせることからなるトレーサーの
   製法。 １６、プロカインアミドの濃度測定方法において、（ａ
   ）プロカインアミド抗血清を伴う生物学的試料を、プロ
   カインアミド抗血清の存在に対して検知可能な螢光偏光
   反応を生じ得る特許請求の範囲第１項の化合物と接触さ
   せ、 （ｂ）工程（ａ）から得られる溶液中を平面偏光を通過
   させて螢光偏光反応を得て、そして （ｃ）工程（ｂ）からの溶液の螢光偏光反応を試料中の
   プロカインアミドの量の尺度として検出する ことからなる上記方法。 １７、プロカインアミド抗血清が特許請求の範囲第１０
   項の抗体により生産される特許請求の範囲第１６項記載
   の方法。