JPS61227600A - プロカインアミド検定、トレーサー、免疫原および抗体 - Google Patents
プロカインアミド検定、トレーサー、免疫原および抗体Info
- Publication number
- JPS61227600A JPS61227600A JP61066132A JP6613286A JPS61227600A JP S61227600 A JPS61227600 A JP S61227600A JP 61066132 A JP61066132 A JP 61066132A JP 6613286 A JP6613286 A JP 6613286A JP S61227600 A JPS61227600 A JP S61227600A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorescein
- poly
- amino acid
- derivative
- tracer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9453—Cardioregulators, e.g. antihypotensives, antiarrhythmics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は液体、殊に生物学的液体例えば血清、血漿また
は尿中のプロカインアミドの量を測定する螢光偏光免疫
定量操作のための方法および試薬ならびに試薬の製法に
関する。更に詳しくは、本発明は(1)試料中のプロカ
インアミドの量を測定するための試薬(トレーサーおよ
び抗体)、(2)抗体を産生させる免疫原化合物、(3
)合成法(トレーサーおよび免疫原化合物を製造するた
め)、および(4)検定を実施するための分析方法に関
する。
は尿中のプロカインアミドの量を測定する螢光偏光免疫
定量操作のための方法および試薬ならびに試薬の製法に
関する。更に詳しくは、本発明は(1)試料中のプロカ
インアミドの量を測定するための試薬(トレーサーおよ
び抗体)、(2)抗体を産生させる免疫原化合物、(3
)合成法(トレーサーおよび免疫原化合物を製造するた
め)、および(4)検定を実施するための分析方法に関
する。
プロカインアミドは有効で広く処方されている抗不整脈
剤である。このものは狭い治療係数を有し、また重篤な
有毒な副作用例えば徐脈、血圧上昇、不整脈、見当識障
害、倦怠、はきけ、嘔吐および薬物誘起性全身性紅斑性
狼艙を生起し得る。投与されるこの薬物の投与量と得ら
れたプロカインアミドの血漿濃度との関係は患者によっ
て全く変化し得ることがわかった。この変化はいくつか
の因子に由来するものである。すなわち、1)個体間の
薬物代謝の差異:2)薬物代謝を改変する治療中の個々
の患者の症状の変化;および3)薬物素因に著しい効果
を有する病理学的条件、例えば腎臓損傷または心臓欠陥
である。従って、患者血清またはプラズマ中のプロ力イ
ンアミド濃度をモニターすることが安全かつ有効な療法
のために推奨される。
剤である。このものは狭い治療係数を有し、また重篤な
有毒な副作用例えば徐脈、血圧上昇、不整脈、見当識障
害、倦怠、はきけ、嘔吐および薬物誘起性全身性紅斑性
狼艙を生起し得る。投与されるこの薬物の投与量と得ら
れたプロカインアミドの血漿濃度との関係は患者によっ
て全く変化し得ることがわかった。この変化はいくつか
の因子に由来するものである。すなわち、1)個体間の
薬物代謝の差異:2)薬物代謝を改変する治療中の個々
の患者の症状の変化;および3)薬物素因に著しい効果
を有する病理学的条件、例えば腎臓損傷または心臓欠陥
である。従って、患者血清またはプラズマ中のプロ力イ
ンアミド濃度をモニターすることが安全かつ有効な療法
のために推奨される。
従来、患者の血清または血漿プロ力インアミド濃度は典
型的には高速液体クロマトグラフィーCHPLC入酵素
免疫定量法CEIA)および基質−結合螢光免疫定量法
CF;LFIA)によ!ll側足されていた。これらの
方法は薬物濃度を検定するのに相応に特異的であるが、
これらの方法に欠陥がない訳ではない。HPCL法は試
料抽出操作を必要とし、また検定時間が長い。EXAお
よび5LFIAは共に酵素反応を包含し、そして次のよ
うな不利な点を有している。すなわち、1)試薬が比較
的不安定であシ:2)EXAまたは5LEIAでの酵素
反応に影響を及ぼし得るし;そして3’)EXAおよび
5LFIAは吸光率または螢光を副足しそして吸光率ま
たは螢光に影響し得る生物学的試料中の任意の化合物(
例えば、脂質、ヘモグロビン、ビルビリンあるいは他の
発色団もしくは螢光団)がこれらの検定から得られる結
果の正確さに影響を及ぼす。
型的には高速液体クロマトグラフィーCHPLC入酵素
免疫定量法CEIA)および基質−結合螢光免疫定量法
CF;LFIA)によ!ll側足されていた。これらの
方法は薬物濃度を検定するのに相応に特異的であるが、
これらの方法に欠陥がない訳ではない。HPCL法は試
料抽出操作を必要とし、また検定時間が長い。EXAお
よび5LFIAは共に酵素反応を包含し、そして次のよ
うな不利な点を有している。すなわち、1)試薬が比較
的不安定であシ:2)EXAまたは5LEIAでの酵素
反応に影響を及ぼし得るし;そして3’)EXAおよび
5LFIAは吸光率または螢光を副足しそして吸光率ま
たは螢光に影響し得る生物学的試料中の任意の化合物(
例えば、脂質、ヘモグロビン、ビルビリンあるいは他の
発色団もしくは螢光団)がこれらの検定から得られる結
果の正確さに影響を及ぼす。
他の物質の検定において、拮抗結合免疫足音は更に好都
合な代替手段を提供していた。典型的には、拮抗結合免
疫定量法は供試試料中のリガンドを測定するのに用いら
れる。
合な代替手段を提供していた。典型的には、拮抗結合免
疫定量法は供試試料中のリガンドを測定するのに用いら
れる。
(この記述のために、「リガンド」とは拮抗結合免疫定
量技術により定量すべき生物学的関心のある物質である
)すガントは標識試薬または「リガンド・アナログJ(
J(j−asd analog)”または「トレーサー
J (taaar)とリガンドおよびリガンド・アナロ
グに河して特異的な抗体上の限られた数の受容体結合部
位について拮抗し;結合するリガンド・アナログの童は
試料中のリガンドの濃度と反比例する。その理由はリカ
ンドおよびリガンド・アナログは各々それぞれの濃度に
比例して抗体に結合しているからである。
量技術により定量すべき生物学的関心のある物質である
)すガントは標識試薬または「リガンド・アナログJ(
J(j−asd analog)”または「トレーサー
J (taaar)とリガンドおよびリガンド・アナロ
グに河して特異的な抗体上の限られた数の受容体結合部
位について拮抗し;結合するリガンド・アナログの童は
試料中のリガンドの濃度と反比例する。その理由はリカ
ンドおよびリガンド・アナログは各々それぞれの濃度に
比例して抗体に結合しているからである。
螢光偏光は拮抗結合免疫足型法で缶底されるトレーサー
・抗体複合物の量を測定する定量手段を提供する。螢光
偏光技術は、螢光標識化合物が平面偏光で励起されると
その(ロ)転単に対して逆の関係にある偏光度を有する
螢光を発する原理に基〈ものである。従って、螢光ラベ
ルを有するトレーサー・抗体複合物を平面偏光で励起す
ると、発する元は非常に偏光された11である。その理
由は螢光団は、元が吸収、放出される時間の間の回転を
むシにさせられるからである。これに対して、未結合の
トレーサーを平面偏光で励起すると、その回転は相当す
るトレーサー・抗体複合体よりも速くなシ、また分子が
更にランダム配列される。結果として、未結合トレーサ
ー分子から発する光は消偏光される。
・抗体複合物の量を測定する定量手段を提供する。螢光
偏光技術は、螢光標識化合物が平面偏光で励起されると
その(ロ)転単に対して逆の関係にある偏光度を有する
螢光を発する原理に基〈ものである。従って、螢光ラベ
ルを有するトレーサー・抗体複合物を平面偏光で励起す
ると、発する元は非常に偏光された11である。その理
由は螢光団は、元が吸収、放出される時間の間の回転を
むシにさせられるからである。これに対して、未結合の
トレーサーを平面偏光で励起すると、その回転は相当す
るトレーサー・抗体複合体よりも速くなシ、また分子が
更にランダム配列される。結果として、未結合トレーサ
ー分子から発する光は消偏光される。
このような螢光偏光技術はワングCWatす)等の米国
特許第4,420,568号で適用され、この技術は螢
光団としてトリアジニルアミノ−フルオレセイン部分の
使用に係る。
特許第4,420,568号で適用され、この技術は螢
光団としてトリアジニルアミノ−フルオレセイン部分の
使用に係る。
プロカインアミド抗原複合体および抗体はシンク(Sf
%−yh)等の米国特許第4,235,969号に開示
されている。
%−yh)等の米国特許第4,235,969号に開示
されている。
また、アニリン誘尋抗体はJ、ファルム・サイCJ、F
五G−rm、 5ai−) 、第69巻、第721−2
4頁、1980年およびジャーナル・オプ・イムノアッ
セイ(Josデ5aJof Itms*aaaaay)
、第3巻、第91−110頁、1982年に開示されて
いる。しかし、本発明は当該技術での進歩を提供するも
のであシ、新規な抗原、これらの抗原の製法、高度に感
受性を有するトレーサー、トレーサーの製法、およびト
レーサーを用−る検定が特にプロカインアミドの測定に
提供される点で進歩が提供される。本発明に従って行わ
れる検定は以下に説明するように特に正確である。
五G−rm、 5ai−) 、第69巻、第721−2
4頁、1980年およびジャーナル・オプ・イムノアッ
セイ(Josデ5aJof Itms*aaaaay)
、第3巻、第91−110頁、1982年に開示されて
いる。しかし、本発明は当該技術での進歩を提供するも
のであシ、新規な抗原、これらの抗原の製法、高度に感
受性を有するトレーサー、トレーサーの製法、およびト
レーサーを用−る検定が特にプロカインアミドの測定に
提供される点で進歩が提供される。本発明に従って行わ
れる検定は以下に説明するように特に正確である。
本発明は、プロカインアミドの螢光偏光検定;検定に使
用するためのトレーサー、免152鳳および抗体;なら
びにトレーサー、免疫原2よび抗体を製造する方法に係
る。
用するためのトレーサー、免152鳳および抗体;なら
びにトレーサー、免疫原2よび抗体を製造する方法に係
る。
本発明の第一の特徴は新規な構造を有する独特なトレー
サーおよび免疫原の発見に関する。本発明の第一の特徴
によると、トレーサーおよび免疫原共に式5に示す構造
式で示すことができる。
サーおよび免疫原の発見に関する。本発明の第一の特徴
によると、トレーサーおよび免疫原共に式5に示す構造
式で示すことができる。
式中、
Qはポリ(アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体または
別の免疫学的に活性な担体、あるいはフルオレセインま
たはフルオレセイン誘導体であシ;XはME%co、c
s%C=NH”またはSO,であ〕:偽は0、lまたは
2であり; Rは、Qがポリ(アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)@導体
または別の免疫学的に宿性な担体であるときは、6個ま
でのへテロ原子を包含し、また小計o−18個の炭素原
子およびヘテロ原子を有する8個までのへテロ原子を包
含する結合基でめり; R′は1−3個の炭素原子を有するアルキル基であシ;
Yは、Qがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
であるときは、0LNHt、CHl、F、01%Er、
CF、9たはHであシ、そしてYは、Qがポリ(アミノ
酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体または別の免役学的に活
性な担体であるときは、HlOLCHJ”筐たはCtで
あシ;そして 2は、Qがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
であるときは、HまたはFであプ、そして、Qがポリ(
アミノ酸〕、ポリ(アミノ酸)誘導体または別の免疫学
的に活性な担体であるときは、Hであル;そして ZがYまたはカルボキサミド基に結合しているベンゼン
環の炭素原子以外の該炭素原子のいずれかに結合してい
る。
別の免疫学的に活性な担体、あるいはフルオレセインま
たはフルオレセイン誘導体であシ;XはME%co、c
s%C=NH”またはSO,であ〕:偽は0、lまたは
2であり; Rは、Qがポリ(アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)@導体
または別の免疫学的に宿性な担体であるときは、6個ま
でのへテロ原子を包含し、また小計o−18個の炭素原
子およびヘテロ原子を有する8個までのへテロ原子を包
含する結合基でめり; R′は1−3個の炭素原子を有するアルキル基であシ;
Yは、Qがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
であるときは、0LNHt、CHl、F、01%Er、
CF、9たはHであシ、そしてYは、Qがポリ(アミノ
酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体または別の免役学的に活
性な担体であるときは、HlOLCHJ”筐たはCtで
あシ;そして 2は、Qがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
であるときは、HまたはFであプ、そして、Qがポリ(
アミノ酸〕、ポリ(アミノ酸)誘導体または別の免疫学
的に活性な担体であるときは、Hであル;そして ZがYまたはカルボキサミド基に結合しているベンゼン
環の炭素原子以外の該炭素原子のいずれかに結合してい
る。
Qがポリ(アミノ酸)またはその誘導体であるときは、
化合物は免疫原として使用することができる。Qがフル
オレセインまたはその誘導体であるときは、化合物はト
レーサーとして使用することができる。
化合物は免疫原として使用することができる。Qがフル
オレセインまたはその誘導体であるときは、化合物はト
レーサーとして使用することができる。
本発明の第二の特徴は新規な免疫原により産生される抗
体に関する。本発明の第二の特徴によると、抗体はQが
ポリ(アミノ酸)、そのts誘導体九は他の免疫学的に
活性な担体である特許請求の範囲第1項記載の化合物に
反応して製造される。
体に関する。本発明の第二の特徴によると、抗体はQが
ポリ(アミノ酸)、そのts誘導体九は他の免疫学的に
活性な担体である特許請求の範囲第1項記載の化合物に
反応して製造される。
本発明の第三の特徴によると、免疫原は式2に示す構造
式で示される化合物、 (式中、 Rは6個1でのへテロ原子を包含し、そして小計0−1
8個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であシ
: R′は1−3個の炭素原子を有するアルキル基であ屑X
はNH,、CC00LC,CHO,Be、ItたはOH
であり:そして YはH,10LCH,、FjたはCtであるンを有する
前駆体をポリ(アミノ酸)またはポリ(アミノ酸)の誘
導体とカップリングさせる工程からなる免疫原の製法に
よシ製造される。
式で示される化合物、 (式中、 Rは6個1でのへテロ原子を包含し、そして小計0−1
8個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であシ
: R′は1−3個の炭素原子を有するアルキル基であ屑X
はNH,、CC00LC,CHO,Be、ItたはOH
であり:そして YはH,10LCH,、FjたはCtであるンを有する
前駆体をポリ(アミノ酸)またはポリ(アミノ酸)の誘
導体とカップリングさせる工程からなる免疫原の製法に
よシ製造される。
本発明の第四の特徴によれば、式3に示される構造式で
示される化合物 (式中 Rは6個1でのへテロ原子を包含し、ま九小計〇−18
個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であシ; XはMB2、COH,CN、SO,HまたはOHであり
;YはO&NH,、CH3、F、 CIQEr、CF、
4たはHであシ;そして ZはHまたはFである) を有する前駆体をフルオレセインまたはフルオレセイン
誘導体とカップリングさせることからなるトレーサーの
製法が提供される。
示される化合物 (式中 Rは6個1でのへテロ原子を包含し、ま九小計〇−18
個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であシ; XはMB2、COH,CN、SO,HまたはOHであり
;YはO&NH,、CH3、F、 CIQEr、CF、
4たはHであシ;そして ZはHまたはFである) を有する前駆体をフルオレセインまたはフルオレセイン
誘導体とカップリングさせることからなるトレーサーの
製法が提供される。
本発明の第五の特徴によれば、プロカインアミドの濃度
を測定する方法が提供される。試料をプロカインアミド
抗血清およびプロカインアミド抗血清の存在に対して検
知可能な螢光偏光反応を生じ得るフルオレセイン含有プ
ロカインアミド誘導体と接触させる。次に、平面偏光8
溶液中を通して螢光偏光反応を得て、そしてこの反応を
試料中のプロカインアミドの量の尺度として検知する。
を測定する方法が提供される。試料をプロカインアミド
抗血清およびプロカインアミド抗血清の存在に対して検
知可能な螢光偏光反応を生じ得るフルオレセイン含有プ
ロカインアミド誘導体と接触させる。次に、平面偏光8
溶液中を通して螢光偏光反応を得て、そしてこの反応を
試料中のプロカインアミドの量の尺度として検知する。
本発明の更に他の特徴およびそれに伴う利点は、′##
造式と共に以下の詳細な説明を読むことによシ最も良く
理解される。
造式と共に以下の詳細な説明を読むことによシ最も良く
理解される。
式lは本発明に従って定量し得る薬物プロカインアミド
の構造を示す。
の構造を示す。
式2は本発明に従って免疫原を製造する方法のための一
群の試薬を示す。
群の試薬を示す。
式3は本発明に従ってトレーサー8製造する方法のため
の一群の試薬を示す。
の一群の試薬を示す。
式4は本発明のトレーサーに包含されるフルオレセイン
部分の代替の構造式および名称を示す。
部分の代替の構造式および名称を示す。
式5は本発明のトレーサーおよび免疫原の一般構造式を
示す・ 式6は本発明の免疫原の一般構造式を示す。
示す・ 式6は本発明の免疫原の一般構造式を示す。
式7は本発明のトレーサーの一般構造式を示す。
式8は本発明の好ましい免疫原の構造式を示す。
式9は本発明の好ましいトレーサーの構造式を示す。
式lOは式6および式8に示した免疫原および式7およ
び式9に示し九トレーサーの前駆体を示す。
び式9に示し九トレーサーの前駆体を示す。
式11は1式lOが式7および式9に示したトレーサー
の前駆体を示す場合、式10のX位置での前駆体に対し
てフルオレセイン部分がカップリングして−る種々の結
合を示すO 式12乃至式29は本発明によるトレーサーの構造の種
々の実例を示す。
の前駆体を示す場合、式10のX位置での前駆体に対し
てフルオレセイン部分がカップリングして−る種々の結
合を示すO 式12乃至式29は本発明によるトレーサーの構造の種
々の実例を示す。
式30乃至式35は本発明の免疫原を形成するのに使用
し得るハプテン反厄剤の構造の極々の実例を示す。
し得るハプテン反厄剤の構造の極々の実例を示す。
式において、記号rFtJはフルオレセイン部分を示し
、そして他の記号は本文に示したとおりである。式3.
5.7およびlOで、「Y」以外の基およびカルボキサ
ミド置換分はrYJおよびカルボキサミド置換分が占め
ていないベンゼン環の任意の位置に存在し得る。
、そして他の記号は本文に示したとおりである。式3.
5.7およびlOで、「Y」以外の基およびカルボキサ
ミド置換分はrYJおよびカルボキサミド置換分が占め
ていないベンゼン環の任意の位置に存在し得る。
式2
式3
式5
式6
式7
式8
式9
式lO
式11−1 式1l−2
NH−Ft 式11−4 式11−5式11
−3 −CNIP−NH−Ft −NFcO−NH−Ft
−NH−C3−NH−Ft式11−6
式11−7 式1l−8−O−CO−NH−P
L −0−C8−NH−Ft −8o、−NH−Ft式
11−9 式11−10 式1l−11−
0−CO−ATE−8o、−NH−Ft弐11−12 式19 式22 式30 式31 式32 式33 式34 本発明の種々の特徴に関して詳述する。
−3 −CNIP−NH−Ft −NFcO−NH−Ft
−NH−C3−NH−Ft式11−6
式11−7 式1l−8−O−CO−NH−P
L −0−C8−NH−Ft −8o、−NH−Ft式
11−9 式11−10 式1l−11−
0−CO−ATE−8o、−NH−Ft弐11−12 式19 式22 式30 式31 式32 式33 式34 本発明の種々の特徴に関して詳述する。
本発明はフルオレセインおよびフルオレセイン肪導体の
使用を包含する。特に、フルオレセインおよびその誘導
体の必要な特性(トレーサー化合物の有用性のための)
はフルオレセインの螢光である。フルオレセインは、環
境の酸濃度(jlH)に基いて、第4図に示す如く、2
@の互変異性体の形態で存在する。開環(識)形態では
、該形態のフルオレセイン(およびフルオレセイン部分
を含有する化合物)を約4ナノ秒の励起状態寿命の後青
色元を吸収しセして緑色の91に′yt、8発し得るよ
うにする多数の共役二重結合が存在する。開環および閉
環が共存しているときは、開環および閉環形態での分子
の相対濃度はpH濃度を調節することによって容易に変
更することができる。一般に、本発明のトレーサー化合
物は生物学的に許容し得る塩例えばナトIJウム、カリ
ウム、アンモニウム等として溶液中に存在し、これによ
り本発明の分析方法で使用する場合、化合物が一環、螢
光形態で存在することが可能となる。存在する特定の塩
はpH011度を調節するのに使用する緩衝剤によって
左右される。例えば、アルカリ性りん酸ナトリクム緩衝
液の存在下、本発明の化合物は一般にす) +7ウム塩
として開環形態で存在する。
使用を包含する。特に、フルオレセインおよびその誘導
体の必要な特性(トレーサー化合物の有用性のための)
はフルオレセインの螢光である。フルオレセインは、環
境の酸濃度(jlH)に基いて、第4図に示す如く、2
@の互変異性体の形態で存在する。開環(識)形態では
、該形態のフルオレセイン(およびフルオレセイン部分
を含有する化合物)を約4ナノ秒の励起状態寿命の後青
色元を吸収しセして緑色の91に′yt、8発し得るよ
うにする多数の共役二重結合が存在する。開環および閉
環が共存しているときは、開環および閉環形態での分子
の相対濃度はpH濃度を調節することによって容易に変
更することができる。一般に、本発明のトレーサー化合
物は生物学的に許容し得る塩例えばナトIJウム、カリ
ウム、アンモニウム等として溶液中に存在し、これによ
り本発明の分析方法で使用する場合、化合物が一環、螢
光形態で存在することが可能となる。存在する特定の塩
はpH011度を調節するのに使用する緩衝剤によって
左右される。例えば、アルカリ性りん酸ナトリクム緩衝
液の存在下、本発明の化合物は一般にす) +7ウム塩
として開環形態で存在する。
本文で使用する「フルオレセイン」なる用語は、個々の
化合物としてめるいはより大きい化合物の一成分として
、螢光の関連を除いて、特別な分子に刈して存在すると
きは開環2よび閉環両形態を包含することを意味してい
る。開環形態は螢光を生じさせるのに必要である。
化合物としてめるいはより大きい化合物の一成分として
、螢光の関連を除いて、特別な分子に刈して存在すると
きは開環2よび閉環両形態を包含することを意味してい
る。開環形態は螢光を生じさせるのに必要である。
フルオレセイン分子の炭素原子の番号付けは、分子の開
環形態か閉環形態ρ十考慮することに基いて、変化する
。
環形態か閉環形態ρ十考慮することに基いて、変化する
。
従って、フルオレセインおよびその化合物に関する文献
は炭素原子の番号付けに関しては統一されていない。閉
環形態では、フェニル環上のラクトンのカルボニルに対
するパラ−炭素を6と番号付けする。開環形態では、フ
ェニル環上のカルボン散基に対するバラ−炭素を5と番
号付けする(第4図参照)。本文の配達では開環形態の
番号付けを採用する。その理由は合成で使用する原料は
該システムで最も普及して番号付けされているからであ
る。従って、カルボキシ基に反対するフルオレセインお
よびその化合物の炭素原子を本文の記載の目的で6の番
号を付ける。
は炭素原子の番号付けに関しては統一されていない。閉
環形態では、フェニル環上のラクトンのカルボニルに対
するパラ−炭素を6と番号付けする。開環形態では、フ
ェニル環上のカルボン散基に対するバラ−炭素を5と番
号付けする(第4図参照)。本文の配達では開環形態の
番号付けを採用する。その理由は合成で使用する原料は
該システムで最も普及して番号付けされているからであ
る。従って、カルボキシ基に反対するフルオレセインお
よびその化合物の炭素原子を本文の記載の目的で6の番
号を付ける。
抗体と複合していない溶液中のトレーサーは、螢光の吸
収pよび再発光に必要な時間以下で自由に回転する。そ
の結果、再発光された光は比較的無作為な方向を有し、
その結果抗体に対して複合していないトレーサーの螢光
偏光が低く、Oに近い。特定の抗体と複合体を形成する
と、このようにして形成されたトレーサー−抗体複合体
抗体分子の回転が比較的小さいトレーサー分子の回転よ
りも遅いものと予測さ氏これによりl!察される偏光が
増加する。従って、リガンドが抗体部位に河してトレー
サーと競合したとき、遊離トレーサーとトレーサー・抗
体複合体との得られた混合物の螢光のiIM祭される偏
光がトレーチーとトレーサー・抗体複合体との中間の値
であると予想される。試料が高濃度のリガンドを含むと
きは、観察された偏光値は遊離リガンドの値に近くなる
、すなわ5低くなる。供試試料が低濃匿のリガンドを含
有しているときは、偏光値は結合リガンドの値により近
くなる、すなわち高くなる。免役定量法の反応混合物を
垂直次に水平の偏光で順次励起しセして発光した光の垂
直側光成分のみを解析することにより、反応混合物中の
螢光の偏光を正確に測定することができる。
収pよび再発光に必要な時間以下で自由に回転する。そ
の結果、再発光された光は比較的無作為な方向を有し、
その結果抗体に対して複合していないトレーサーの螢光
偏光が低く、Oに近い。特定の抗体と複合体を形成する
と、このようにして形成されたトレーサー−抗体複合体
抗体分子の回転が比較的小さいトレーサー分子の回転よ
りも遅いものと予測さ氏これによりl!察される偏光が
増加する。従って、リガンドが抗体部位に河してトレー
サーと競合したとき、遊離トレーサーとトレーサー・抗
体複合体との得られた混合物の螢光のiIM祭される偏
光がトレーチーとトレーサー・抗体複合体との中間の値
であると予想される。試料が高濃度のリガンドを含むと
きは、観察された偏光値は遊離リガンドの値に近くなる
、すなわ5低くなる。供試試料が低濃匿のリガンドを含
有しているときは、偏光値は結合リガンドの値により近
くなる、すなわち高くなる。免役定量法の反応混合物を
垂直次に水平の偏光で順次励起しセして発光した光の垂
直側光成分のみを解析することにより、反応混合物中の
螢光の偏光を正確に測定することができる。
偏光と画定すべきリガンドの濃度との間の正確な関係は
既知のa度を有する検量体の偏光値を測定することによ
って確立される。リガンドの濃度はこの方法で作製した
標準曲線から内挿することができる。
既知のa度を有する検量体の偏光値を測定することによ
って確立される。リガンドの濃度はこの方法で作製した
標準曲線から内挿することができる。
本発明に従って形成される特別な抗体2よびトレーサー
は上述の如く意外にも艮好な検定を生じることがわかっ
た。
は上述の如く意外にも艮好な検定を生じることがわかっ
た。
1、試薬
本発明の免疫原およびトレーサー共に式5で例示される
一般構造式で示すことができる(前文にも記載)。Qが
ポリ(アミノ酸〕である場合、構造は免疫原を示し;Q
はフルオレセイン部分である場合、構造はトレーサーを
示す。
一般構造式で示すことができる(前文にも記載)。Qが
ポリ(アミノ酸〕である場合、構造は免疫原を示し;Q
はフルオレセイン部分である場合、構造はトレーサーを
示す。
目的は、プロ力インアミドと抗体の認識部位のためのト
レーサーとの間の競合を有することである。ノ・ブテン
とトレーサーの構造上の大きな変化によシこのゴールを
達成することが可能である。本発明の目的のために、「
ノ・ブテン」(Aapta*)は免疫原の前駆体でちゃ
、一般に置換プロカインアミド類似体および免役学的に
活性な担体に対する結合基を包含している。
レーサーとの間の競合を有することである。ノ・ブテン
とトレーサーの構造上の大きな変化によシこのゴールを
達成することが可能である。本発明の目的のために、「
ノ・ブテン」(Aapta*)は免疫原の前駆体でちゃ
、一般に置換プロカインアミド類似体および免役学的に
活性な担体に対する結合基を包含している。
有用な抗体が種々のプロ力インアミド類似体から製造す
ることができる。プロカインアミドの−N&の代りにH
lOLCH,、FまたはCtを有する化合物から作った
免疫原は動物に抗体を主産し得る。かかる抗体は適当な
トレーサーと組合せると本発明によるプロカインアミド
検定に有用である。
ることができる。プロカインアミドの−N&の代りにH
lOLCH,、FまたはCtを有する化合物から作った
免疫原は動物に抗体を主産し得る。かかる抗体は適当な
トレーサーと組合せると本発明によるプロカインアミド
検定に有用である。
本発明の免疫原は式6に示す一般構造式を有し、そして
式6に示す好ましい式、弐6に示す好ましい式において
免疫原は式8に示す構造式を有している。免疫原は、式
2に示す群の化合物を合成方法および実施例に関連して
以下に論述する如くポリ(アミノ酸)、ポリ(アミノr
R)の誘導体または他の免疫学的に活性な担体物質とカ
ップリングすることにより製造することができる。
式6に示す好ましい式、弐6に示す好ましい式において
免疫原は式8に示す構造式を有している。免疫原は、式
2に示す群の化合物を合成方法および実施例に関連して
以下に論述する如くポリ(アミノ酸)、ポリ(アミノr
R)の誘導体または他の免疫学的に活性な担体物質とカ
ップリングすることにより製造することができる。
本発明の好ましい形態では、免疫原は式8に示す構造式
を有している。この構造が好ましい。その理由はプロカ
インアミドの最良の認識はハプテンが測定されるべき薬
物と同じ窒素置換分を担有する場合に生じる。牛血清ア
ルブミンがこの好ましい形態でポリ(アミノ酸)である
が、種々の蛋白質担体を使用し得る。これらの担体には
アルブミン、血清蛋白質例えばグロブリン、接眼レンズ
蛋白質、リボプロティン等が包含される。例示的な蛋白
担体には、牛血清アルブミン、キーホール・リムベット
(Keyhole litm−pat)・ヘモシアニ
ン、卵アルブミン、牛カンマグロブリン、チロキシン結
合グルプリン等が包含される。あるいはまた、利用可能
なアミノ基を十分な数を有する合成ポリ(アミノ酸)例
えばリジンを、他の合成または天然の反応性官能基を担
有する重合体性物質であるように、使用し得る。特に、
炭水化物、酵母あるいは多糖類をハプテンに共役させて
免疫原そ生成させる。
を有している。この構造が好ましい。その理由はプロカ
インアミドの最良の認識はハプテンが測定されるべき薬
物と同じ窒素置換分を担有する場合に生じる。牛血清ア
ルブミンがこの好ましい形態でポリ(アミノ酸)である
が、種々の蛋白質担体を使用し得る。これらの担体には
アルブミン、血清蛋白質例えばグロブリン、接眼レンズ
蛋白質、リボプロティン等が包含される。例示的な蛋白
担体には、牛血清アルブミン、キーホール・リムベット
(Keyhole litm−pat)・ヘモシアニ
ン、卵アルブミン、牛カンマグロブリン、チロキシン結
合グルプリン等が包含される。あるいはまた、利用可能
なアミノ基を十分な数を有する合成ポリ(アミノ酸)例
えばリジンを、他の合成または天然の反応性官能基を担
有する重合体性物質であるように、使用し得る。特に、
炭水化物、酵母あるいは多糖類をハプテンに共役させて
免疫原そ生成させる。
本発明のトレーサーの構造での可能な変化はハプテンの
構造での可能な変化よりも大きい。本発明のトレーサー
は式7に示す一般構造式を有し、ここでFtはフルオレ
セイン部分またはフルオレセイン誘導体である。本発明
の好ましい形態では、トレーサーは式9に示す構造式を
有する。
構造での可能な変化よりも大きい。本発明のトレーサー
は式7に示す一般構造式を有し、ここでFtはフルオレ
セイン部分またはフルオレセイン誘導体である。本発明
の好ましい形態では、トレーサーは式9に示す構造式を
有する。
トレーサは、式11に示す如く、例えばアミド、アミジ
ノ、トリアジニルアミノ、カルノイミド、テオカルノく
ミド、カルノくモイル、チオカル/(モイルlた&↓ス
ルホニルカルノくボイル基によシフルオレセイン訪導体
に結合されているプロ力インアミン類似体である。トレ
ーサーは、以下の合成法3よび実施例に関して記述する
如く、適当なフルオレセイン誘導体をアミノ、カルボン
酸、ヒドロキシ、イミデート、ヒドラジド、インシアネ
ート、チオインシアネート、クロロホルメート、クロロ
チオホルメート、クロロスルホ風ルカルバモイルまたは
同様な基に結合させることによシ製造される。
ノ、トリアジニルアミノ、カルノイミド、テオカルノく
ミド、カルノくモイル、チオカル/(モイルlた&↓ス
ルホニルカルノくボイル基によシフルオレセイン訪導体
に結合されているプロ力インアミン類似体である。トレ
ーサーは、以下の合成法3よび実施例に関して記述する
如く、適当なフルオレセイン誘導体をアミノ、カルボン
酸、ヒドロキシ、イミデート、ヒドラジド、インシアネ
ート、チオインシアネート、クロロホルメート、クロロ
チオホルメート、クロロスルホ風ルカルバモイルまたは
同様な基に結合させることによシ製造される。
例示のために、次のフルオレセイン誘導体のいスレも使
用し得る。
用し得る。
Ft−NH,フルオレセインアミン
Ft−Co、HカルボキシフルオレセインFt−NHC
OCH,I α−ヨードアセトアミドフルオレセ
イン PL−NHCOCHI Br α−プロモアセトア
ミドフルオレセイン ト 2、抗体 不発明の抗体は上述の免疫原に対して動物で反応を発現
させることにより生産される。プロカインアミド免疫原
に対する免役反応に河して現在好ましい宿主は兎である
が、本文に説明した免疫原構造に刈して抗体を生座し得
る任意の宿主を使用することができ、ならびに免疫感応
細胞を含有する任意の試験管内溶液も使用することがで
きる。免疫原を当業者に周知の方法で一連の接種により
動物にまたは免疫感応細胞培養物に投与する。
OCH,I α−ヨードアセトアミドフルオレセ
イン PL−NHCOCHI Br α−プロモアセトア
ミドフルオレセイン ト 2、抗体 不発明の抗体は上述の免疫原に対して動物で反応を発現
させることにより生産される。プロカインアミド免疫原
に対する免役反応に河して現在好ましい宿主は兎である
が、本文に説明した免疫原構造に刈して抗体を生座し得
る任意の宿主を使用することができ、ならびに免疫感応
細胞を含有する任意の試験管内溶液も使用することがで
きる。免疫原を当業者に周知の方法で一連の接種により
動物にまたは免疫感応細胞培養物に投与する。
3、合成方法
本発明の免疫原およびトレーサー共に式1oに示す一般
構造式を有する前駆体から製造することができる。式中
、トレーサーの製造に向けられているときは、YはHl
OHlNH,、CF、、F、 CムBデ、CF、 また
はHであ夛、そして、免疫原の製造に向けられていると
きは、YはH10H%CH,、FまたはCtであシ: 免疫原の製造に向けられているときは、XはNH,、C
00H1CHO,5o3H,CM%Bデ、IまたはOH
であシ、そして、トレーサーの製造に向けられていると
きは、XはNH,、C0OH%C7v%So、Hlたは
OHであシ:そしてトレーサーの製造に向けられている
ときは、ZはHlたはFであシ、そして、免疫原の製造
に向けられているときは、ZはHでl)、セしてZはy
−またはカルボキサミド基に結合されているベンゼン環
の炭素原子以外の任意の該炭素原子に結合されている。
構造式を有する前駆体から製造することができる。式中
、トレーサーの製造に向けられているときは、YはHl
OHlNH,、CF、、F、 CムBデ、CF、 また
はHであ夛、そして、免疫原の製造に向けられていると
きは、YはH10H%CH,、FまたはCtであシ: 免疫原の製造に向けられているときは、XはNH,、C
00H1CHO,5o3H,CM%Bデ、IまたはOH
であシ、そして、トレーサーの製造に向けられていると
きは、XはNH,、C0OH%C7v%So、Hlたは
OHであシ:そしてトレーサーの製造に向けられている
ときは、ZはHlたはFであシ、そして、免疫原の製造
に向けられているときは、ZはHでl)、セしてZはy
−またはカルボキサミド基に結合されているベンゼン環
の炭素原子以外の任意の該炭素原子に結合されている。
本発明の免疫原は、ハプテン、例えばXがNH,、C0
OH。
OH。
CM、So、LCHO,臭素、ヨウ素またはORである
式2の一般式で示されるハプテンをポリ(アミノ酸)ま
たはその他の免役学的に活性な担体にカップリングする
ことにより製造される。ポリ(アミノ酸)筐たはその他
の担体部分はアミド、アミジン、アルキル、尿素、チオ
尿素、スルホンアミド、カルバメートまたはチオカルバ
メート結合によりハプテンに結合することができる。好
ましい態様では、ポリ(アミノ酸)が牛血清アルブミン
(ESA)でちゃ、そしてハプテンは式30〜35に示
した例示構造の一つから選択することができる。こわら
の反応剤は好1しくはアミド結合を形成するのに通常便
用されている条件下でカップリングされ、かかる条件は
当業者に周知である。水溶性カルボジイミド操作を使用
するのが最も好ましい。それは、これらの操作がこの関
連で所望のアミド結合を形成するのに最も有効だからで
ある。
式2の一般式で示されるハプテンをポリ(アミノ酸)ま
たはその他の免役学的に活性な担体にカップリングする
ことにより製造される。ポリ(アミノ酸)筐たはその他
の担体部分はアミド、アミジン、アルキル、尿素、チオ
尿素、スルホンアミド、カルバメートまたはチオカルバ
メート結合によりハプテンに結合することができる。好
ましい態様では、ポリ(アミノ酸)が牛血清アルブミン
(ESA)でちゃ、そしてハプテンは式30〜35に示
した例示構造の一つから選択することができる。こわら
の反応剤は好1しくはアミド結合を形成するのに通常便
用されている条件下でカップリングされ、かかる条件は
当業者に周知である。水溶性カルボジイミド操作を使用
するのが最も好ましい。それは、これらの操作がこの関
連で所望のアミド結合を形成するのに最も有効だからで
ある。
免疫原は−NH,、−Co、H%−〇〇NHNB、、−
CMORl−CHO,−Eデー、−1,−NCO,−N
C8A、−0COCム−ocscムーS Q、CL ま
たは−0CONH8O,C1基を含有するハゲテンをポ
リ(アミノ酸)にカップリングさせることによシ製造さ
れる。−NH,の事例は、−NH2基の存在下にポリア
ミノ酸のカルボン酸基を活性化することによシカツブリ
ングすることができる。ポリ(アミノ酸)のカルボン酸
の活性化は、ハプテンおよびポリ(アミノ酸)を1−エ
チル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイ
ミドCEDC)、N、N’−ジシクロへキシルカルボジ
イミド(DCC)、l−シクロへキシル−3−(2−モ
ルホリノエチル〕カルボジイミドメチル−p−トルエン
スルホネート等と混合することによって達成し得る。−
CO,Hの事例はまたトレーサー合成の部分で以下に述
べる如く系での活性化法(EDC)すなわち活性エステ
ル法によシカツブリングすることができる。−〇〇NH
NH,の事例はアミノの事例と同じ方法でカップリング
することができる。−〇HOの事例は還元アミノ化によ
りポリ(アミノ酸)にカップリングさせる。ポリ(アミ
ノ酸)を−〇HOハプテンと混合し、そして得られたイ
ミンをホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナ
トリウムで還元してポリ(アミノ酸)にアルキルアミン
を生成させる。−Bデおよび−Iの事例はまたポリ(ア
ミノ酸)にアルキル化アミンを生成させるが、ポリ(ア
ミノ酸)のアミンへのアルキルハライドの直接カップリ
ングによるものである。しかしながら、これらはフェノ
ールと反応してフェニルエーテルを生じ、1九メルカプ
ト基と反応してチオエーテルを生じる。イソシアネート
(−NGO)、インチオシアネート(−NCEI)、ク
ロロホルメートc−ococt>、クロロチオホルメー
ト(−Ocset)、スルホニルクロライ)”(−8O
,C1)おヨヒカルボニルスルホニルクロライド(−0
CONH8O2C1)の事例では尿素。
CMORl−CHO,−Eデー、−1,−NCO,−N
C8A、−0COCム−ocscムーS Q、CL ま
たは−0CONH8O,C1基を含有するハゲテンをポ
リ(アミノ酸)にカップリングさせることによシ製造さ
れる。−NH,の事例は、−NH2基の存在下にポリア
ミノ酸のカルボン酸基を活性化することによシカツブリ
ングすることができる。ポリ(アミノ酸)のカルボン酸
の活性化は、ハプテンおよびポリ(アミノ酸)を1−エ
チル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイ
ミドCEDC)、N、N’−ジシクロへキシルカルボジ
イミド(DCC)、l−シクロへキシル−3−(2−モ
ルホリノエチル〕カルボジイミドメチル−p−トルエン
スルホネート等と混合することによって達成し得る。−
CO,Hの事例はまたトレーサー合成の部分で以下に述
べる如く系での活性化法(EDC)すなわち活性エステ
ル法によシカツブリングすることができる。−〇〇NH
NH,の事例はアミノの事例と同じ方法でカップリング
することができる。−〇HOの事例は還元アミノ化によ
りポリ(アミノ酸)にカップリングさせる。ポリ(アミ
ノ酸)を−〇HOハプテンと混合し、そして得られたイ
ミンをホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナ
トリウムで還元してポリ(アミノ酸)にアルキルアミン
を生成させる。−Bデおよび−Iの事例はまたポリ(ア
ミノ酸)にアルキル化アミンを生成させるが、ポリ(ア
ミノ酸)のアミンへのアルキルハライドの直接カップリ
ングによるものである。しかしながら、これらはフェノ
ールと反応してフェニルエーテルを生じ、1九メルカプ
ト基と反応してチオエーテルを生じる。イソシアネート
(−NGO)、インチオシアネート(−NCEI)、ク
ロロホルメートc−ococt>、クロロチオホルメー
ト(−Ocset)、スルホニルクロライ)”(−8O
,C1)おヨヒカルボニルスルホニルクロライド(−0
CONH8O2C1)の事例では尿素。
チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、スルポン
アミド、およびカルバモイルスルホンアミド結合がそれ
ぞれ生成される。これはハプテンがポリアミノ酸への直
接カップリングにより達成される。
アミド、およびカルバモイルスルホンアミド結合がそれ
ぞれ生成される。これはハプテンがポリアミノ酸への直
接カップリングにより達成される。
上記ハプテンCY=H%0LCH,、FまたはCt で
ある免疫原前駆体)の合成は非常に似た方法で達成され
る。式2には本発明の方法の好ましい態様に従った免疫
原前駆体の群を示す。一般に、理想的な出発物質は適当
な置換安息香酸のメチルエステルまたは酸ハライド、例
えば4−トルオイルクロライドである。これらの活性化
された酸はN−エチルエチレンジアミンとカップリング
し、そして異った訪導体の製造を可能とする種々の試薬
でアルキル化することができる。適当なハライドまたは
スルホネートエステル〔例えば、エチル4−ブロモクロ
トネート〕との反応、次いで必要に応じて還元、そして
加水分解により同族のカルボン酸訪導体を製造すること
ができる。適当なりクロロ、ブロモーまたはスルホニル
オキシニトリルとの反応にヨシ接触還元後に同族のアミ
ンが得られる。適当なハロオレフィンによるアルキル化
次いでオゾン分解および多少激しい条件下での還元によ
ジアルコールおよびアルデヒドが得られる。アセタール
保護ハローアルデヒドはまたプロヵインアミドーアルデ
ヒドの前駆体としても有用でsb、そして同族のアルコ
ールはまたアルキル化剤としてクロロ−、ブロモ−また
はヨードアルコールの使用により直接得ることができる
。ブロモエタンスルホン酸またはその同種物の使用によ
シ同族のプロカインアミドスルホン酸が得られる。
ある免疫原前駆体)の合成は非常に似た方法で達成され
る。式2には本発明の方法の好ましい態様に従った免疫
原前駆体の群を示す。一般に、理想的な出発物質は適当
な置換安息香酸のメチルエステルまたは酸ハライド、例
えば4−トルオイルクロライドである。これらの活性化
された酸はN−エチルエチレンジアミンとカップリング
し、そして異った訪導体の製造を可能とする種々の試薬
でアルキル化することができる。適当なハライドまたは
スルホネートエステル〔例えば、エチル4−ブロモクロ
トネート〕との反応、次いで必要に応じて還元、そして
加水分解により同族のカルボン酸訪導体を製造すること
ができる。適当なりクロロ、ブロモーまたはスルホニル
オキシニトリルとの反応にヨシ接触還元後に同族のアミ
ンが得られる。適当なハロオレフィンによるアルキル化
次いでオゾン分解および多少激しい条件下での還元によ
ジアルコールおよびアルデヒドが得られる。アセタール
保護ハローアルデヒドはまたプロヵインアミドーアルデ
ヒドの前駆体としても有用でsb、そして同族のアルコ
ールはまたアルキル化剤としてクロロ−、ブロモ−また
はヨードアルコールの使用により直接得ることができる
。ブロモエタンスルホン酸またはその同種物の使用によ
シ同族のプロカインアミドスルホン酸が得られる。
置換安息香酸(例えばYがOHIたはNH2)で保護基
が必要なときは、これは通常アルキル化を実施した後の
合成順序のある個所で除去される。ヒドロキシ基の好ま
しい保護はベンジルエーテルであり;アミンに河して好
ましい方法はニトロ基として持ちこたえ、そして合成経
路の終り近くでアミシに還元することである。
が必要なときは、これは通常アルキル化を実施した後の
合成順序のある個所で除去される。ヒドロキシ基の好ま
しい保護はベンジルエーテルであり;アミンに河して好
ましい方法はニトロ基として持ちこたえ、そして合成経
路の終り近くでアミシに還元することである。
カルボン酸訪導体はカップリングして免疫原を生成する
のに適している。ニトリル訪導体を無水アルコールおよ
び塩化水素ガスで処理することによジアルコキシイミデ
ートに変換させる。これで、アルコキシイミデートはカ
ップリングに適したものとなる。ヒドラジド誘導体を、
ヒドラジンとの活性エステルカップリングによシあるい
はヒドラジンを相当するカルボン酸エステル誘導体と反
応させることによシ相当するカルボン酸誘導体から製造
する。アルデヒド騎導体もまたカップリングして免疫原
を生成するのに適している。これらはニトリルのごとく
相当するアミンに変換可能である。アルデヒドについて
は、これは還元アミノ化によりまたは好1しくは相当す
るオキシムへの変換次いで還元によシ達成される。便宜
上、オレフィン、ニトリルまたはオキシムそして、Y=
NO,について、ニトロ基の還元が同時に行われる。こ
れらのアミノ誘導体はこれでカップリングして免疫原を
製造するのに適したものとなる。Y基の適切な還元によ
り(必要に応じ)、アミンをホスゲン筐たはチオホスゲ
ンと反応させることによってアミンをインシアネートま
たはインチオシアネートに変換し得る。次に、インシア
ネートおよびチオイソシアネート誘導体をポリ(アミノ
酸)とカップリングさせ、次いで保護基を除去する。
のに適している。ニトリル訪導体を無水アルコールおよ
び塩化水素ガスで処理することによジアルコキシイミデ
ートに変換させる。これで、アルコキシイミデートはカ
ップリングに適したものとなる。ヒドラジド誘導体を、
ヒドラジンとの活性エステルカップリングによシあるい
はヒドラジンを相当するカルボン酸エステル誘導体と反
応させることによシ相当するカルボン酸誘導体から製造
する。アルデヒド騎導体もまたカップリングして免疫原
を生成するのに適している。これらはニトリルのごとく
相当するアミンに変換可能である。アルデヒドについて
は、これは還元アミノ化によりまたは好1しくは相当す
るオキシムへの変換次いで還元によシ達成される。便宜
上、オレフィン、ニトリルまたはオキシムそして、Y=
NO,について、ニトロ基の還元が同時に行われる。こ
れらのアミノ誘導体はこれでカップリングして免疫原を
製造するのに適したものとなる。Y基の適切な還元によ
り(必要に応じ)、アミンをホスゲン筐たはチオホスゲ
ンと反応させることによってアミンをインシアネートま
たはインチオシアネートに変換し得る。次に、インシア
ネートおよびチオイソシアネート誘導体をポリ(アミノ
酸)とカップリングさせ、次いで保護基を除去する。
アルデヒド誘導体はまた還元により相当するアルコール
に変換することができる。これはホウ水素化ナトリウム
、水素添加等により達成することができる。アルコール
は三臭化りん、三ヨウ化9ん等によりブロモまたはヨー
ド94体に変換することができる。また、ヨード肪導体
はヨウ化ナトリウム等圧よるハロゲン置換によりブロモ
誘導体から製造するができる。それで、ハロ誘導体はカ
ップリングに適した奄のとなる。ニトリル誘導体は1九
シアナイドとの反応によジハロ銹導体から製造すること
ができる。
に変換することができる。これはホウ水素化ナトリウム
、水素添加等により達成することができる。アルコール
は三臭化りん、三ヨウ化9ん等によりブロモまたはヨー
ド94体に変換することができる。また、ヨード肪導体
はヨウ化ナトリウム等圧よるハロゲン置換によりブロモ
誘導体から製造するができる。それで、ハロ誘導体はカ
ップリングに適した奄のとなる。ニトリル誘導体は1九
シアナイドとの反応によジハロ銹導体から製造すること
ができる。
アルデヒドは(アミノヒドロキシ)アルカンカルボン酸
例えばNHtOCH,Co、Hと縮合して置換オキシム
誇導体を生成させることができる。これらはポリ(アミ
ノ酸)とカップリングするのに適している。オキシムア
ルキルカルボン酸誘導体は部分的に還元して相当する(
アミノヒドロキシ)アルキルカルボン酸誘導体となすこ
とができ、これら誘導体はまたポリ(アミノ酸)とのカ
ップリングに適している。同じタイプの縮合および還元
はヒドラジンおよびヒドラジン誘導体くよシ達成するこ
とができる。
例えばNHtOCH,Co、Hと縮合して置換オキシム
誇導体を生成させることができる。これらはポリ(アミ
ノ酸)とカップリングするのに適している。オキシムア
ルキルカルボン酸誘導体は部分的に還元して相当する(
アミノヒドロキシ)アルキルカルボン酸誘導体となすこ
とができ、これら誘導体はまたポリ(アミノ酸)とのカ
ップリングに適している。同じタイプの縮合および還元
はヒドラジンおよびヒドラジン誘導体くよシ達成するこ
とができる。
アルコール誘導体はtfcクロロホルメート、クロロチ
オホルメートおよびクロロスルホニルカルバモイル誘導
体に変換することができる。これはY=OHまたはNH
,保護さし7’27 # :r −ルをホスゲン、チオ
ホスゲンまたはクロロスルホニルイソシアネートと反応
させることによシ達成される。得うれたクセロポルメー
ト、クロロチオホルメートまたはクロロスルホニルカル
バメートはポリ(アミノ酸)とカップリングさせ1次に
保護基を除去する。
オホルメートおよびクロロスルホニルカルバモイル誘導
体に変換することができる。これはY=OHまたはNH
,保護さし7’27 # :r −ルをホスゲン、チオ
ホスゲンまたはクロロスルホニルイソシアネートと反応
させることによシ達成される。得うれたクセロポルメー
ト、クロロチオホルメートまたはクロロスルホニルカル
バメートはポリ(アミノ酸)とカップリングさせ1次に
保護基を除去する。
スルホン酸は、五塩化シん等で処理することによシ相尚
するスルホン酸クロライドに変換させることによpポリ
(アミノ酸)と最も容易にカップリングされる。
するスルホン酸クロライドに変換させることによpポリ
(アミノ酸)と最も容易にカップリングされる。
本発明のトレーサー(1デaC−デ)はフルオレセイン
部分またはフルオレセインの誘導体をXがNH,、C0
OH。
部分またはフルオレセインの誘導体をXがNH,、C0
OH。
CNOR,5O8HjたはOHである式1oに示した一
般式にカップリングすることによV!!!遺される。フ
ルオレセイン部分は式11に示す如くアミド、アミジン
、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、
トリアジニルアミノ、スルホンアミドまたはスルホニル
カルバメート結合ニよジアミノ、カルボキシ、イミデー
ト、スルホニルまたはアルコキシ官能基に結合させるこ
とができる。本発明の好ましい態様において、フルオレ
セイン誘導体は6−7ミノフルオレセイ/〔アルドリッ
チ・ケミカル・力/パニーCAldrieh Chmt
p+4cal Cotpcpa*y)、 ミルウォ
ーキーから入手〕であり、そしてこれは式3に示す如く
前駆体とカップリングさせる。反応はジメチルホルムア
ミド中で実施される。プロカインアミド類似体は、イン
ブチルクロロホルメートで混合無水物を形成させること
によシ活性化される。他の溶媒例えばジメチルスルホキ
サイドおよび他の活性化反応剤例えばエチルクロロホル
メートを使用し得る。
般式にカップリングすることによV!!!遺される。フ
ルオレセイン部分は式11に示す如くアミド、アミジン
、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、
トリアジニルアミノ、スルホンアミドまたはスルホニル
カルバメート結合ニよジアミノ、カルボキシ、イミデー
ト、スルホニルまたはアルコキシ官能基に結合させるこ
とができる。本発明の好ましい態様において、フルオレ
セイン誘導体は6−7ミノフルオレセイ/〔アルドリッ
チ・ケミカル・力/パニーCAldrieh Chmt
p+4cal Cotpcpa*y)、 ミルウォ
ーキーから入手〕であり、そしてこれは式3に示す如く
前駆体とカップリングさせる。反応はジメチルホルムア
ミド中で実施される。プロカインアミド類似体は、イン
ブチルクロロホルメートで混合無水物を形成させること
によシ活性化される。他の溶媒例えばジメチルスルホキ
サイドおよび他の活性化反応剤例えばエチルクロロホル
メートを使用し得る。
種々の10力インアミド類似体から使用し得るトレーサ
ーを製造することができる。
ーを製造することができる。
末端アミノ基例えばアミノ、ヒドラジニル、ヒドラジノ
等を有するすべてのグロカインアミド類似体は活性エス
テル法または混合無水物法によジカルボキシフルオレセ
インとカップリングさせ、そして2.1iの物質を溶液
中で単に混合することによりフルオレセインインチオシ
アネート、α−ヨードアセトアミドフルオレセイン、α
−ブロモアセトアミドフルオレセイン、DTAF−また
はアルコキシDTAFとカップリングさせる。アミ7基
をホスゲン3よびチオホスゲンとの反応によりそれぞれ
インシアネートおよびチオインシアネート基に変換す°
ることができろ。仄に、これらの活性化され九化合物は
アミノフルオレセインと務合させてトレーサーを生成さ
せる。Y=OHおよびNH,基はX=NH,基をインシ
アネートおよびチオイソシアネート基に変換するのに保
護基を必要とする。この保護基はフルオレセインアミン
へのカップリングが完了した後除去される。
等を有するすべてのグロカインアミド類似体は活性エス
テル法または混合無水物法によジカルボキシフルオレセ
インとカップリングさせ、そして2.1iの物質を溶液
中で単に混合することによりフルオレセインインチオシ
アネート、α−ヨードアセトアミドフルオレセイン、α
−ブロモアセトアミドフルオレセイン、DTAF−また
はアルコキシDTAFとカップリングさせる。アミ7基
をホスゲン3よびチオホスゲンとの反応によりそれぞれ
インシアネートおよびチオインシアネート基に変換す°
ることができろ。仄に、これらの活性化され九化合物は
アミノフルオレセインと務合させてトレーサーを生成さ
せる。Y=OHおよびNH,基はX=NH,基をインシ
アネートおよびチオイソシアネート基に変換するのに保
護基を必要とする。この保護基はフルオレセインアミン
へのカップリングが完了した後除去される。
木端カルボン酸基例えばカルボン酸、(アミノヒドロキ
シ)アルキルカルボン酸等を有するすべてのグロヵイン
アミド類似体を活性エステル、カルボニルジイミダゾー
ル1次は混合無水物法によジアミノフルオレセインにカ
ップリングされる。
シ)アルキルカルボン酸等を有するすべてのグロヵイン
アミド類似体を活性エステル、カルボニルジイミダゾー
ル1次は混合無水物法によジアミノフルオレセインにカ
ップリングされる。
末端ヒドロキシ基を有するすべてのグロカインアミド類
似体は俗敷中DTAF、α−ヨードアセトアミドフルオ
レセイン、α−ブロモアセトアミドフルオレセインまた
はフルオレセインインチオシアネートとの反応によりフ
ルオレセインにカップリングさせる。ヒドロキシ基はク
ロロスルホニルインシアネート、ホスゲンおよびチオホ
スゲンと反応させることによジそれぞれクロロスルホニ
ルカルバモイル、クロロホルメートおよびクロロチオホ
ルメート基に変換することができる。これらの誘導体を
次に溶液中でアミノフルオレセインにカップリングさせ
てトレーサーを生Xさせる。Y=OHおよびNH,基は
ヒドロキシ基をクロロスルホニルカルバモイル、クロロ
ホルメートおよびクロロチオホルメート基に変換するの
に&謹基そ必峨とし、この基はフルオレセイン(flx
orasceix)アミンへのカップリング冗了後に除
云嘔れる。
似体は俗敷中DTAF、α−ヨードアセトアミドフルオ
レセイン、α−ブロモアセトアミドフルオレセインまた
はフルオレセインインチオシアネートとの反応によりフ
ルオレセインにカップリングさせる。ヒドロキシ基はク
ロロスルホニルインシアネート、ホスゲンおよびチオホ
スゲンと反応させることによジそれぞれクロロスルホニ
ルカルバモイル、クロロホルメートおよびクロロチオホ
ルメート基に変換することができる。これらの誘導体を
次に溶液中でアミノフルオレセインにカップリングさせ
てトレーサーを生Xさせる。Y=OHおよびNH,基は
ヒドロキシ基をクロロスルホニルカルバモイル、クロロ
ホルメートおよびクロロチオホルメート基に変換するの
に&謹基そ必峨とし、この基はフルオレセイン(flx
orasceix)アミンへのカップリング冗了後に除
云嘔れる。
床端ニトリル基を有するすべてのプロカインアミド類似
体は塩化水素ガスの存在下に無水アルコール中でイミデ
ートに変換きれる。次に、イミデートを#液中フルオレ
セインアミンにカップリングさせてトレーサー8製造す
る。
体は塩化水素ガスの存在下に無水アルコール中でイミデ
ートに変換きれる。次に、イミデートを#液中フルオレ
セインアミンにカップリングさせてトレーサー8製造す
る。
Y=Br&よびZ=Fの場合を除いて、安息香酸の徨々
のアミノ、カルボン酸、ヒドロキシおよびニトリル誘導
体の製造を免役原製造部分で上述した。Z=Fの誘導体
は相当するアミノ誘導体からバルズーシーマンCEal
z−3chi−amα10反応またはその変法にまり製
造される。アミノ誘導体は相当するニトロ誘導体の還元
によシ製造される。ニトロ誘導体は既知の方法により既
知のベンゼン訪導体から製造される。
のアミノ、カルボン酸、ヒドロキシおよびニトリル誘導
体の製造を免役原製造部分で上述した。Z=Fの誘導体
は相当するアミノ誘導体からバルズーシーマンCEal
z−3chi−amα10反応またはその変法にまり製
造される。アミノ誘導体は相当するニトロ誘導体の還元
によシ製造される。ニトロ誘導体は既知の方法により既
知のベンゼン訪導体から製造される。
4、検定
本発明の特別なトレーサーiよび抗体は意外にもプロカ
インアミドの螢光偏光検定で艮好な結果を生じることが
わかった。式1は本発明に従って定量し得る業物プロカ
インアミドのM造を示す。不発明の検定により、先行技
術の方法よりも更に簡便で、迅速なプロカインアミド検
定法が提供される。この方法は分析前に試料を処理する
必要がなく、試薬は化学的および熱的に安定であり、ヤ
して検定システムはブロカインアミド様化合物に対し最
小限の交差反応性を有しているからである。
インアミドの螢光偏光検定で艮好な結果を生じることが
わかった。式1は本発明に従って定量し得る業物プロカ
インアミドのM造を示す。不発明の検定により、先行技
術の方法よりも更に簡便で、迅速なプロカインアミド検
定法が提供される。この方法は分析前に試料を処理する
必要がなく、試薬は化学的および熱的に安定であり、ヤ
して検定システムはブロカインアミド様化合物に対し最
小限の交差反応性を有しているからである。
本発明の分析方法すなわち本発明のトレーサー化会物お
よび免疫魚を用いる螢光偏光免役足1法によるプロ力イ
ンアミドの(I11定法によって、プロカイ/アミドを
含有するかもしくはその疑いのある試料をトレーサーの
生物学的に許容し得る塩2よびプロカインアミド2よび
トレーサーに対して特異的な抗体と混合させる。抗体は
上述のとおり免疫原を用いて生産される。プロカインア
ミドおよびトレーサーは制限された抗体部位に対して受
容し、複合体を形成する。トレーサーおよび抗体の濃度
を一定に保つことにより、形成されるプロカインアミド
ー抗体複合体対トレーサー−抗体複合体の比が試料中の
プロカインアミドの童と正比例する。従って、混合物を
直線偏光で励起し、そしてトレーサーおよびトレーサー
−抗体複合体から発する螢光の偏光を測定すると、試料
中のブロカインアミドの量を定量的に側足することがで
きる。
よび免疫魚を用いる螢光偏光免役足1法によるプロ力イ
ンアミドの(I11定法によって、プロカイ/アミドを
含有するかもしくはその疑いのある試料をトレーサーの
生物学的に許容し得る塩2よびプロカインアミド2よび
トレーサーに対して特異的な抗体と混合させる。抗体は
上述のとおり免疫原を用いて生産される。プロカインア
ミドおよびトレーサーは制限された抗体部位に対して受
容し、複合体を形成する。トレーサーおよび抗体の濃度
を一定に保つことにより、形成されるプロカインアミド
ー抗体複合体対トレーサー−抗体複合体の比が試料中の
プロカインアミドの童と正比例する。従って、混合物を
直線偏光で励起し、そしてトレーサーおよびトレーサー
−抗体複合体から発する螢光の偏光を測定すると、試料
中のブロカインアミドの量を定量的に側足することがで
きる。
結果を正味のミリ偏光単位、スパン(spas)(ミ’
)偏光単位〕および相対強度によって足置することがで
きる。ミリ偏光単位の測定値は、トレーサーの最大量が
プロカインアミドの不存在下で抗体と結合されていると
きの最大偏光を指示している。正味もしくはネットミリ
偏光単位が高いほど、トレーサーが抗体に良く結合して
いる。スパンは抗体に結合されたトレーサーの最大量お
よび最小量の個所での正味のミリ偏光の差を示している
。スパンが大きいほど良いデータの数的解析が得られる
。強度はバックグラウンド上のシグナルの’M度の尺度
である。すなわち、強度が高いほど、測定値がより正確
となる。不発明の好適なトレーサーについて強度は約0
.5−2.0ナノモルで測定される(垂直偏光gi展+
2倍水平偏光強度の相として)。強度は、トレーサーの
濃度および他の検定の変化可能なものに基いて、バック
グラウンドノイズの約3倍乃至約30倍の信号の範囲に
あり得る。本発明の目的のために、バックグラウンドノ
イズCbackgros*d 5odas)の少くとも
8−10倍の強度が好ましい。
)偏光単位〕および相対強度によって足置することがで
きる。ミリ偏光単位の測定値は、トレーサーの最大量が
プロカインアミドの不存在下で抗体と結合されていると
きの最大偏光を指示している。正味もしくはネットミリ
偏光単位が高いほど、トレーサーが抗体に良く結合して
いる。スパンは抗体に結合されたトレーサーの最大量お
よび最小量の個所での正味のミリ偏光の差を示している
。スパンが大きいほど良いデータの数的解析が得られる
。強度はバックグラウンド上のシグナルの’M度の尺度
である。すなわち、強度が高いほど、測定値がより正確
となる。不発明の好適なトレーサーについて強度は約0
.5−2.0ナノモルで測定される(垂直偏光gi展+
2倍水平偏光強度の相として)。強度は、トレーサーの
濃度および他の検定の変化可能なものに基いて、バック
グラウンドノイズの約3倍乃至約30倍の信号の範囲に
あり得る。本発明の目的のために、バックグラウンドノ
イズCbackgros*d 5odas)の少くとも
8−10倍の強度が好ましい。
第1表−第m表は、スパン、ミリ偏光単位および強度に
関して本発明の種々の態様で得られた結果を示す。第1
表では、牛血清アルブミン(BSA)を蛋白担体として
用い、また兎を宿主の種として用いた。データから、広
範曲なフェニルi換分を担有し、また広い範囲の様々な
結合手を有するトレーサーはフッ素f!it:換免疫原
に河して生じる抗血清で有用なプロ力インアミド検定を
生じることが実証される。
関して本発明の種々の態様で得られた結果を示す。第1
表では、牛血清アルブミン(BSA)を蛋白担体として
用い、また兎を宿主の種として用いた。データから、広
範曲なフェニルi換分を担有し、また広い範囲の様々な
結合手を有するトレーサーはフッ素f!it:換免疫原
に河して生じる抗血清で有用なプロ力インアミド検定を
生じることが実証される。
第■表から、個の担体2よび他の動物宿主も!fCWf
容し得るプロ力インアミド検定を生じることが実証され
る。第■表から、本発明のトレーサーは先行技術を包含
する種々のフェニルfiL分を担有するハプテンに対し
て生じる抗血清で良好なグロ力インアミド検定を生じる
ことが実証される。
容し得るプロ力インアミド検定を生じることが実証され
る。第■表から、本発明のトレーサーは先行技術を包含
する種々のフェニルfiL分を担有するハプテンに対し
て生じる抗血清で良好なグロ力インアミド検定を生じる
ことが実証される。
第1、田および■表のデータから明らかな如く、式19
のトレーサーと組合せて用いた式32のハプテンからつ
くった免疫原から生じる検定がすぐれた結果を提供する
。従って、この組合せが本発明の最も好ましい形態であ
る。更に、多くの他のハプテン/トレーサーの組合せ、
特に式35と式24、式31と式24および式32と式
18の組合せで示されるものもまた許容し得る結果を生
じ、そして代替的な好ましい組合せである。
のトレーサーと組合せて用いた式32のハプテンからつ
くった免疫原から生じる検定がすぐれた結果を提供する
。従って、この組合せが本発明の最も好ましい形態であ
る。更に、多くの他のハプテン/トレーサーの組合せ、
特に式35と式24、式31と式24および式32と式
18の組合せで示されるものもまた許容し得る結果を生
じ、そして代替的な好ましい組合せである。
第 1 表
兎でのBSA担体でのフルオロ置換免疫原ハブテン
トレーサー ネット偏光0 スパン1 強度1式3
1 第14図 140 74 21%式% 軸 ネッ)%反対パックグラ9ンドノイズの比で表わし
た 第 ■ 表 抗体’&U生Tるのに用いた式3のハプテンESA
羊 式25 210 91 78式
% 骨 ミリ偏光単位 峠 ネット強度対バックグラウンドノイズの比で懺わし
た 第m表 兎でのハプテン置換分の変化 1321 #18 217 139
6 −1321 #20 16
6 113 81331 7F17
196 133 101331 #2
6 165 102 101331
JF22 136 96 17133
1 120 204 137 1?1
331 #18 194 104
6133j #13 125 70
341331 j19 160 1
00 16螢 ミリ偏光単位 峠 ネット強度対バックグラウンドノイズの比で表わし
た 1骨 先行技術の免疫原 本発明の方法を実施するpHは、トレーサーのフルオレ
セイン部分が開いた形態で存在させるのに十分なもので
なければならない。pHは約3−12、更に通常約5〜
10の範囲にあり、最も好ましくは約6〜9の範囲にあ
る。検定操作中pHを維持するのに種々の緩衝剤が使用
し得る。
トレーサー ネット偏光0 スパン1 強度1式3
1 第14図 140 74 21%式% 軸 ネッ)%反対パックグラ9ンドノイズの比で表わし
た 第 ■ 表 抗体’&U生Tるのに用いた式3のハプテンESA
羊 式25 210 91 78式
% 骨 ミリ偏光単位 峠 ネット強度対バックグラウンドノイズの比で懺わし
た 第m表 兎でのハプテン置換分の変化 1321 #18 217 139
6 −1321 #20 16
6 113 81331 7F17
196 133 101331 #2
6 165 102 101331
JF22 136 96 17133
1 120 204 137 1?1
331 #18 194 104
6133j #13 125 70
341331 j19 160 1
00 16螢 ミリ偏光単位 峠 ネット強度対バックグラウンドノイズの比で表わし
た 1骨 先行技術の免疫原 本発明の方法を実施するpHは、トレーサーのフルオレ
セイン部分が開いた形態で存在させるのに十分なもので
なければならない。pHは約3−12、更に通常約5〜
10の範囲にあり、最も好ましくは約6〜9の範囲にあ
る。検定操作中pHを維持するのに種々の緩衝剤が使用
し得る。
代表的な緩衝剤にはホウ酸塩、りん酸塩、炭酸塩、トリ
ス、パルビタール等が包含さnる。使用さnる特別なa
m剤は本発明に対して臨界的なものではないが、トリス
およびりん酸塩緩衝剤が好ましい。緩衝剤のカチオン部
分は一般に溶液中のトレーサー塩のカチオン部分′fr
1%足する。
ス、パルビタール等が包含さnる。使用さnる特別なa
m剤は本発明に対して臨界的なものではないが、トリス
およびりん酸塩緩衝剤が好ましい。緩衝剤のカチオン部
分は一般に溶液中のトレーサー塩のカチオン部分′fr
1%足する。
本発明の改良さnた検定の好ましい方法を以下に詳述す
る。検定は「均一検定」であり、これは結合されたトレ
ーサーが未結合のトレーサーから分離さtl、ない浴液
から終末偏光の示度t−読み取ることを意味する。この
ことは、不均一な免疫定量性操作例えば結合さnたトレ
ーサーを示度を読み取り得る前に未結合のトレーサーか
ら分離しなけnはならない操作に1さる明確な利点であ
る。
る。検定は「均一検定」であり、これは結合されたトレ
ーサーが未結合のトレーサーから分離さtl、ない浴液
から終末偏光の示度t−読み取ることを意味する。この
ことは、不均一な免疫定量性操作例えば結合さnたトレ
ーサーを示度を読み取り得る前に未結合のトレーサーか
ら分離しなけnはならない操作に1さる明確な利点であ
る。
本発明の螢光偏光検定のための試薬はブロヵインアミド
に特異的な抗体およびトレーサーを包含する。更に、ブ
ロカインアミド前処理浴′&を包含する王に通常の溶液
、希釈緩衝液、ブロカインアミド検量体およびプロヵイ
ンアミド比較対照全用意するのが望ましい。これらの試
薬(そのいくつ力檜以下に記載する〕の典型的な溶液は
アボット・ラボラトリーズCAbbott Labo
ratories)、 アホットパー久イリノイから検
定「キラ) J (ftt)で商業上入手可能である。
に特異的な抗体およびトレーサーを包含する。更に、ブ
ロカインアミド前処理浴′&を包含する王に通常の溶液
、希釈緩衝液、ブロカインアミド検量体およびプロヵイ
ンアミド比較対照全用意するのが望ましい。これらの試
薬(そのいくつ力檜以下に記載する〕の典型的な溶液は
アボット・ラボラトリーズCAbbott Labo
ratories)、 アホットパー久イリノイから検
定「キラ) J (ftt)で商業上入手可能である。
本文に示す%は他に指示のない限りすべて重量/容量で
ある。現存好ましいトレーサー処方は、0.1モルトリ
ス緩衝液pi 7.5 ; 0.1%ドデシル硫酸ナト
リウム;o、i%アジ化ナナトリウムおよび0.01%
牛ガンマグロブリン中の61.5ナノモル(%asom
・IGデ)トレーサーである。抗血清処方は、帆1モル
りん酸塩緩衝液pH7−5;アジ化ナトリウム帆1%:
(LO1%十ガンマグロブリン:および2比エチレン
グリコール(容量/容量)で希釈した先血清からなる。
ある。現存好ましいトレーサー処方は、0.1モルトリ
ス緩衝液pi 7.5 ; 0.1%ドデシル硫酸ナト
リウム;o、i%アジ化ナナトリウムおよび0.01%
牛ガンマグロブリン中の61.5ナノモル(%asom
・IGデ)トレーサーである。抗血清処方は、帆1モル
りん酸塩緩衝液pH7−5;アジ化ナトリウム帆1%:
(LO1%十ガンマグロブリン:および2比エチレン
グリコール(容量/容量)で希釈した先血清からなる。
希釈緩衝液は、0.1モルりん酸ナトIJウムpH7,
5;0.1zアジ化ナトリクム;および帆01′y、十
ガンマグロブリンを包含する。前処理溶液は、0.01
%牛ガンマグロブリン;0.1モルトリス緩衝液9H7
,5; 0.1%アジ化ナトリウム;01駕ドデシル硫
酸ナトリクムを包含する。ブロカインアミド検量体はブ
ロカインアミドおよび正常人血清、濃度0.0.1.0
.2.5.5.0、i o、oおよび20.011Q/
lを包含し、O,XSアジ化ナトリウム防腐剤を伴うの
が有用である。ブロカインアミド比収対照はブロカイン
アミドおよび正常人血清を包含し、2.0.7.Opよ
び150m9/lのmlで提供され、防腐剤として0.
1%アジ化ナナトリ9ム伴うのが有用である。
5;0.1zアジ化ナトリクム;および帆01′y、十
ガンマグロブリンを包含する。前処理溶液は、0.01
%牛ガンマグロブリン;0.1モルトリス緩衝液9H7
,5; 0.1%アジ化ナトリウム;01駕ドデシル硫
酸ナトリクムを包含する。ブロカインアミド検量体はブ
ロカインアミドおよび正常人血清、濃度0.0.1.0
.2.5.5.0、i o、oおよび20.011Q/
lを包含し、O,XSアジ化ナトリウム防腐剤を伴うの
が有用である。ブロカインアミド比収対照はブロカイン
アミドおよび正常人血清を包含し、2.0.7.Opよ
び150m9/lのmlで提供され、防腐剤として0.
1%アジ化ナナトリ9ム伴うのが有用である。
好適な操作は特にアボット・ラボラトリーズ、アーグイ
ング、テキサスから入手し得るアボット(Ahbott
)・TDz@ ボーラリゼーション・アナライザーCP
o1αデ(−ratio%Anαlνロデ)と−線番こ
使用するように企図式れている。血清または血)R5μ
tを必要とする。検量体、比較対照すなわちコントロー
ルまたは未仰の試料をTDz@試料カートリッジの試料
壁中に直接ピペットで入れる。この操作の利点の一つは
試料が特別な調製を何ら必要としないことである。TD
z@ブロヵインアミド検定キットをT D z @アナ
ライザーと共に使用しているときは、キット中の3種の
試薬容器の各々からキャップを外し、セしてTDz@)
アナライザー内の企図した壁中に入n、そしてこのとこ
ろから検定操作は完全に自動化される。
ング、テキサスから入手し得るアボット(Ahbott
)・TDz@ ボーラリゼーション・アナライザーCP
o1αデ(−ratio%Anαlνロデ)と−線番こ
使用するように企図式れている。血清または血)R5μ
tを必要とする。検量体、比較対照すなわちコントロー
ルまたは未仰の試料をTDz@試料カートリッジの試料
壁中に直接ピペットで入れる。この操作の利点の一つは
試料が特別な調製を何ら必要としないことである。TD
z@ブロヵインアミド検定キットをT D z @アナ
ライザーと共に使用しているときは、キット中の3種の
試薬容器の各々からキャップを外し、セしてTDz@)
アナライザー内の企図した壁中に入n、そしてこのとこ
ろから検定操作は完全に自動化される。
手動による検定が達成されるときは、試料を希釈緩衝液
中の前処理溶液と混相し、そしてバックグラウンド示度
を読^とる。次に、トレーサーを検定と混合する。次に
、抗体を供試溶液中に最後に混入する。培養後、螢光偏
光示度を読み取る。
中の前処理溶液と混相し、そしてバックグラウンド示度
を読^とる。次に、トレーサーを検定と混合する。次に
、抗体を供試溶液中に最後に混入する。培養後、螢光偏
光示度を読み取る。
各検量体、コントロールまたは試料の螢光偏光値を測定
し、そして例えばアボット・TDm@偏光アナライザー
のような装置の出力テープにプリントする。非線状回帰
分析を用いて、各検量体の偏光対その濃度をプロットす
る装置において、標準的mを作製する。各コントロール
または試料の濃度を保存検量線から読み、そして出力テ
ープにプリントする。
し、そして例えばアボット・TDm@偏光アナライザー
のような装置の出力テープにプリントする。非線状回帰
分析を用いて、各検量体の偏光対その濃度をプロットす
る装置において、標準的mを作製する。各コントロール
または試料の濃度を保存検量線から読み、そして出力テ
ープにプリントする。
上述の好ましい操作に関し、トレーサー、抗体、前処理
溶成、検量体および比較対照は約2−8℃で保存し、一
方希釈緩衝液は周囲の温度で保存しなければならないこ
とを注目すべきである。標準曲線およびコントロールは
2週間毎に操作しなけれはならず、また各検量体2よび
コントロールは重複して操作さnる。コントロールは各
バッチで操作しなけれはならない。すべての試料は重複
して操作することができる。
溶成、検量体および比較対照は約2−8℃で保存し、一
方希釈緩衝液は周囲の温度で保存しなければならないこ
とを注目すべきである。標準曲線およびコントロールは
2週間毎に操作しなけれはならず、また各検量体2よび
コントロールは重複して操作さnる。コントロールは各
バッチで操作しなけれはならない。すべての試料は重複
して操作することができる。
前述の詳細な説明および以下の実施例は例示を企図して
いるものであり、本発明の範囲に関して限定をしている
ものではないことが明らかである。当業者にとって種々
の変化をなし得るものであり、これらの変化は本発明の
範囲を定めるものではない。
いるものであり、本発明の範囲に関して限定をしている
ものではないことが明らかである。当業者にとって種々
の変化をなし得るものであり、これらの変化は本発明の
範囲を定めるものではない。
実施例
実施例1−LX■は本発明の着想に従って打われた実験
全記載している。実施例1−vlは抗体生産lこ有用な
免疫原の装造を記載しまた実施例鴇−XL■は免疫原お
よびトレーサーの前駆体の合成に係り、そして実施例X
Lr1.−LX■はトレーサーの製造に係る。
全記載している。実施例1−vlは抗体生産lこ有用な
免疫原の装造を記載しまた実施例鴇−XL■は免疫原お
よびトレーサーの前駆体の合成に係り、そして実施例X
Lr1.−LX■はトレーサーの製造に係る。
N−〔N′−エチル−Nζ(3−カルボキシ−1−プロ
ピル〕−2−アミノエチル〕−p−ヒドロキシベンズア
ミド(5,4rIJg)j?よびN−ヒドロキシスクシ
ンイミド(2,7Ni)をジメチルホルムアミドLO−
に浴屏し、そしてジシクロへキシルカルボジイミド(4
,9In9)’を加えた。浴gt室温で一夜かくはんし
、セして得られた混合物を濾過し、セして炭酸ナトリウ
ム緩衝液(pH9゜8)3(ld中のサイログロブリン
t1.28 S’の浴水に加えた。0−5℃で一夜かく
はんを松け、次1こ免疫原を透析および体結乾燥で単離
した。
ピル〕−2−アミノエチル〕−p−ヒドロキシベンズア
ミド(5,4rIJg)j?よびN−ヒドロキシスクシ
ンイミド(2,7Ni)をジメチルホルムアミドLO−
に浴屏し、そしてジシクロへキシルカルボジイミド(4
,9In9)’を加えた。浴gt室温で一夜かくはんし
、セして得られた混合物を濾過し、セして炭酸ナトリウ
ム緩衝液(pH9゜8)3(ld中のサイログロブリン
t1.28 S’の浴水に加えた。0−5℃で一夜かく
はんを松け、次1こ免疫原を透析および体結乾燥で単離
した。
実 施 例 II:式31のハブテンおよび牛血清アル
プミN−〔N’−エチル−N’−(3−カルボキシ−1
−プロピル)−2−アミノエチル〕−p−フルオロベン
ズアミド(20IR9,0,07憔モル〕をDMF20
0−にとり、セしてN−ヒドロキシスクシンイミド9I
R9(0,08sモル)およびジシクロへキシルカルボ
ジイミド17IQ(0,08mモル)を加えた。混合v
lJを0−4℃で一夜力)り扛んし、ジシクロヘキシル
尿素全戸去し、セしてFgkO℃で炭酸ナトリウム緩衝
液(pH9,8)3−中の牛血清アルブミン113IR
9(tl、0017鴨モル)に加えた。混合物を0−4
℃で一夜かくはんし、次に緩衝液を毎日交換しながら6
日間希水醗化アンモニウム(pH9,4) 1 tに対
して透析した。
プミN−〔N’−エチル−N’−(3−カルボキシ−1
−プロピル)−2−アミノエチル〕−p−フルオロベン
ズアミド(20IR9,0,07憔モル〕をDMF20
0−にとり、セしてN−ヒドロキシスクシンイミド9I
R9(0,08sモル)およびジシクロへキシルカルボ
ジイミド17IQ(0,08mモル)を加えた。混合v
lJを0−4℃で一夜力)り扛んし、ジシクロヘキシル
尿素全戸去し、セしてFgkO℃で炭酸ナトリウム緩衝
液(pH9,8)3−中の牛血清アルブミン113IR
9(tl、0017鴨モル)に加えた。混合物を0−4
℃で一夜かくはんし、次に緩衝液を毎日交換しながら6
日間希水醗化アンモニウム(pH9,4) 1 tに対
して透析した。
l:lジオキサン−ジメチルホルムアミド2.〇−中の
N−〔N’−エテル−N’−(3−カルボキシ−1−プ
ロピル)−2−アミノエチル〕−p−フルオロベンズア
ミド(50■〕にN−ヒドロキシスクシンイミド(25
II9)およびジシクロへキシル−カルボジイミド(4
59)を加えた。溶液を室温で一夜かくはんし、そして
pH8,2のりん酸塩緩@g25wd中のサイログロブ
リン(300ダ〕の溶液に濾過して入れた。室温で一夜
かくはんした後、3日間蒸留水に対して透析しそして凍
結乾燥すると生成物が得られた。
N−〔N’−エテル−N’−(3−カルボキシ−1−プ
ロピル)−2−アミノエチル〕−p−フルオロベンズア
ミド(50■〕にN−ヒドロキシスクシンイミド(25
II9)およびジシクロへキシル−カルボジイミド(4
59)を加えた。溶液を室温で一夜かくはんし、そして
pH8,2のりん酸塩緩@g25wd中のサイログロブ
リン(300ダ〕の溶液に濾過して入れた。室温で一夜
かくはんした後、3日間蒸留水に対して透析しそして凍
結乾燥すると生成物が得られた。
N−〔N’−エテル−y−(3−カルボキシ−1−プロ
ピル)−2−アミノエチル〕−p−クロロベンズアミド
(45M9)j?よび牛血清アルブミン3UII9を蒸
留水4td4こ溶解し、pHを5.0に調節しそしてl
−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド〔EDc〕459全力)くはんしながら混合物
に加えた。1時間後、EDCを更に451n9を加えた
。室温で更に4時間後に、混合物全蒸留水2tで水を5
回変えながら3日間透析した。
ピル)−2−アミノエチル〕−p−クロロベンズアミド
(45M9)j?よび牛血清アルブミン3UII9を蒸
留水4td4こ溶解し、pHを5.0に調節しそしてl
−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド〔EDc〕459全力)くはんしながら混合物
に加えた。1時間後、EDCを更に451n9を加えた
。室温で更に4時間後に、混合物全蒸留水2tで水を5
回変えながら3日間透析した。
実施例mの方法により#−(A/ζエチル−N’−(3
’−カルボキシ−1−プロピル)−2−アミノエチル〕
ベンズアミド53ダおよび牛血清アルブミン26119
から本免疫原を製造した。
’−カルボキシ−1−プロピル)−2−アミノエチル〕
ベンズアミド53ダおよび牛血清アルブミン26119
から本免疫原を製造した。
実施例mの方法によりN−〔N′−エチル−N′−(3
−カルボキシ−1−プロピル)−2−アミノエチル〕−
p−トルアミド48〜および牛血清アルブミン40.9
から本免疫原を!lli!遺した。
−カルボキシ−1−プロピル)−2−アミノエチル〕−
p−トルアミド48〜および牛血清アルブミン40.9
から本免疫原を!lli!遺した。
実 施 例 vu:p−ベンジルオキシ安息香酸メチル
エステル p−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル(1,Of )
’i乾燥THFC6td)4ことり、セしてこのむ欣
を6m1THFζこ懸濁した水素化ナトリウム(α26
))に滴加した。10分後DMFを浴叡が透明となる1
で滴加し、そしてベンジルブロマイド(078f)を滴
加した。ffl温で一夜かくはんを続けた。溶媒を除云
し、残渣をH,Oに俗解し、そしてCB、CI4で抽出
した。M後層fNaHcO3浴液で洗い、セして硫酸マ
グネシウムで乾燥した。溶媒全回転蒸発で除云すると純
粋な生成物が得らnた。収量2.79 r 融点92
−94℃ p−ベンジルオキシ安息香酸メチルエステルに9tJM
eOHおよび1NNaOHの9dにとった。溶at−a
時間還流し、冷却しそして過剰のH,Oに注入した。p
Hが酸性となる1で塩酸ヲ加え、そして浴gをジクロロ
メタンで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し
そして溶媒を除去すると白色針状晶として生成物が得ら
れた。収量2.1 to p−ベンジルオキシf息査1!ffl (3,42r
) ’iジクロロメタンIO+dにとり、そしてDMF
を全ての物質が溶液となる1で滴加した。N−ヒドロキ
シスクシンイミド(1,72t〕およびジシクロへキシ
ルカルボジイミド(3,09r )を加えた。反応混合
物を室温で1時間かくはんし、濾過し、セしてN−エチ
ルエチレンジアミン(1,32? ) t−270えた
。
エステル p−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル(1,Of )
’i乾燥THFC6td)4ことり、セしてこのむ欣
を6m1THFζこ懸濁した水素化ナトリウム(α26
))に滴加した。10分後DMFを浴叡が透明となる1
で滴加し、そしてベンジルブロマイド(078f)を滴
加した。ffl温で一夜かくはんを続けた。溶媒を除云
し、残渣をH,Oに俗解し、そしてCB、CI4で抽出
した。M後層fNaHcO3浴液で洗い、セして硫酸マ
グネシウムで乾燥した。溶媒全回転蒸発で除云すると純
粋な生成物が得らnた。収量2.79 r 融点92
−94℃ p−ベンジルオキシ安息香酸メチルエステルに9tJM
eOHおよび1NNaOHの9dにとった。溶at−a
時間還流し、冷却しそして過剰のH,Oに注入した。p
Hが酸性となる1で塩酸ヲ加え、そして浴gをジクロロ
メタンで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し
そして溶媒を除去すると白色針状晶として生成物が得ら
れた。収量2.1 to p−ベンジルオキシf息査1!ffl (3,42r
) ’iジクロロメタンIO+dにとり、そしてDMF
を全ての物質が溶液となる1で滴加した。N−ヒドロキ
シスクシンイミド(1,72t〕およびジシクロへキシ
ルカルボジイミド(3,09r )を加えた。反応混合
物を室温で1時間かくはんし、濾過し、セしてN−エチ
ルエチレンジアミン(1,32? ) t−270えた
。
室温で30分間かくはん後、溶媒全除去し、セして残渣
を−夜高具仝下においた。
を−夜高具仝下においた。
N−r−Nζエチル−2−アミノエチル〕−p−ベンジ
ルオキシベンズアミドfDMF4−にとった。エチルブ
ロモクロトネート(OJ6P)?加え、そして反応を室
温で30分間力)くけんした。溶媒を回転蒸発で除去し
、セして残渣をジクロロメタンlO−に溶解した。有機
層を10sd塩水で3IP!J洗滌し、硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、そして溶媒′f−除去すると粗生成物が侍
らnた。このものをシリカゲルでのカラムクロマトグラ
フィーで精製し、ジクロロメタン−メタノールで溶離し
て精製した。収量0.42 fドロキシベンズアミド N−〔N′−エチル−N′−(3−カルボエトキシ−1
−プロピル))−2−アミノエテル−p−ベンジルオキ
シベンズアミド(x40m9)′fr:95%F:tO
H5,0−にと9、セして1o′Apt付きカーボン2
0〜を加えた。251(で1時間低圧水素添加器で水素
添加を実施した。浴aを濾過し、そしてF液を濃細し、
真空で乾燥すると生成物が得られた。収量271!g ジベンズアミド N−〔Nζエテル−Nζ(3−カルボキシ−1−プロピ
ル)−2−アミノエテル〕−p−ヒドロキシベンズアミ
ド(17I1g)を0.5−のエタノールにとり、セし
て1.0 M水酸化ナトリウム1.0−を加えた。室温
で1時間かくはんした後、塩酸を添加して酸apHとし
た。溶媒t−h転蒸発で除去し、そして生成物を逆相プ
レプ(pr−p)プレートで0.5%酢酸を含む501
50水−メタノールで溶離して精製した。収量12.4
■ ベンズアミド 安息香酸メチル(680r)およびN−エチルエチレン
ジアミン(6,60t ) i )ルエン209−に俗
屏し、セして23A日間加熱還流した。溶媒を除云し、
セして残渣を希塩酸とジクロロメタンとの間で分配した
。水層を固体水酸化カリウムで塩基性化し、ヤしてジク
ロロメタンで2回抽出した。炭酸カリウムで乾燥した後
、溶媒を除云すると油として生成物8−72 fが残っ
た。
ルオキシベンズアミドfDMF4−にとった。エチルブ
ロモクロトネート(OJ6P)?加え、そして反応を室
温で30分間力)くけんした。溶媒を回転蒸発で除去し
、セして残渣をジクロロメタンlO−に溶解した。有機
層を10sd塩水で3IP!J洗滌し、硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、そして溶媒′f−除去すると粗生成物が侍
らnた。このものをシリカゲルでのカラムクロマトグラ
フィーで精製し、ジクロロメタン−メタノールで溶離し
て精製した。収量0.42 fドロキシベンズアミド N−〔N′−エチル−N′−(3−カルボエトキシ−1
−プロピル))−2−アミノエテル−p−ベンジルオキ
シベンズアミド(x40m9)′fr:95%F:tO
H5,0−にと9、セして1o′Apt付きカーボン2
0〜を加えた。251(で1時間低圧水素添加器で水素
添加を実施した。浴aを濾過し、そしてF液を濃細し、
真空で乾燥すると生成物が得られた。収量271!g ジベンズアミド N−〔Nζエテル−Nζ(3−カルボキシ−1−プロピ
ル)−2−アミノエテル〕−p−ヒドロキシベンズアミ
ド(17I1g)を0.5−のエタノールにとり、セし
て1.0 M水酸化ナトリウム1.0−を加えた。室温
で1時間かくはんした後、塩酸を添加して酸apHとし
た。溶媒t−h転蒸発で除去し、そして生成物を逆相プ
レプ(pr−p)プレートで0.5%酢酸を含む501
50水−メタノールで溶離して精製した。収量12.4
■ ベンズアミド 安息香酸メチル(680r)およびN−エチルエチレン
ジアミン(6,60t ) i )ルエン209−に俗
屏し、セして23A日間加熱還流した。溶媒を除云し、
セして残渣を希塩酸とジクロロメタンとの間で分配した
。水層を固体水酸化カリウムで塩基性化し、ヤしてジク
ロロメタンで2回抽出した。炭酸カリウムで乾燥した後
、溶媒を除云すると油として生成物8−72 fが残っ
た。
エチル〕ベンズアミド
N−CNζエチル)−2−アミノエテルベンズアミド(
2,69f )およびエチルブロモクロトネート(2,
97? )をジメチルホルムアミド25−中室温で2時
間放置した。
2,69f )およびエチルブロモクロトネート(2,
97? )をジメチルホルムアミド25−中室温で2時
間放置した。
炭酸カリ9ム(3,86r )を加え、セして混合物t
−U温で一夜放置した。溶媒を除去し、残渣をジクロロ
メタンにと9、濾過して無機塩を除去し、塩水で洗い、
そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除云すると油
486?が残り。
−U温で一夜放置した。溶媒を除去し、残渣をジクロロ
メタンにと9、濾過して無機塩を除去し、塩水で洗い、
そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除云すると油
486?が残り。
このものを中性アルミナ5(lで、ジクロロメタンで溶
離して、クロマトグラフィーを行うことによって精製す
ると透明な油として生成物3.02tが得らnた。
離して、クロマトグラフィーを行うことによって精製す
ると透明な油として生成物3.02tが得らnた。
ズアミド
N−〔N’−エチル、N’−(3−エトキシ力ルポニル
ープロブ−2−エン−1−イル)−2−アミノエチル〕
ベンズアミド(1,01t−50−のエタノールに溶解
し、セして室温、3気圧の初圧でラネーニッケル〔アル
ドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrigh C
hmth4cal Cotnpa−ηυ〕で水素添加し
た。生成物t−濾過して単離し、そして溶媒を除去する
と油0.979が得られた。
ープロブ−2−エン−1−イル)−2−アミノエチル〕
ベンズアミド(1,01t−50−のエタノールに溶解
し、セして室温、3気圧の初圧でラネーニッケル〔アル
ドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrigh C
hmth4cal Cotnpa−ηυ〕で水素添加し
た。生成物t−濾過して単離し、そして溶媒を除去する
と油0.979が得られた。
N−(J/ζエチル、 N′−(3−エトキシカルボニ
ル−1−プロピル)−2−アミノエテル〕ベンズアミド
(492ダ、1.6愼モル)をメタノール5mに溶解し
、そして1.0MNaOH浴vli、3.2−で処理し
た。室温で5時間放置した後、3MMC1530d(1
,6mモル)t−加え、そして溶媒を除去した。アセト
ニトリルで数回ストリッピングして残留する水を除去し
た後、残渣をメタノールにとり、そして塩化す1. リ
ウムから濾過した。溶媒を除去すると無色のコ9ム状物
として生成物が得られた。
ル−1−プロピル)−2−アミノエテル〕ベンズアミド
(492ダ、1.6愼モル)をメタノール5mに溶解し
、そして1.0MNaOH浴vli、3.2−で処理し
た。室温で5時間放置した後、3MMC1530d(1
,6mモル)t−加え、そして溶媒を除去した。アセト
ニトリルで数回ストリッピングして残留する水を除去し
た後、残渣をメタノールにとり、そして塩化す1. リ
ウムから濾過した。溶媒を除去すると無色のコ9ム状物
として生成物が得られた。
N−エチルエチレンジアミンC1,76t)tジクロロ
メタン20mに浴所し、そして氷塩浴で冷却した。ジク
ロロメタン2〇−中のp−フルオロベンジルクロライド
(1,59f)の同じく冷却した溶液を30分間かけて
よくかくはんしながら部用した。混合物を10分間で室
温で加温びせ、そして溶媒を除去した。残渣を希塩酸に
とり、ジクロロメタンで抽出し、固体水酸化ナトリウム
で塩基性化し、ジクロロメタンに抽出し、炭酸カリクム
で乾燥し、戸適しセして凝縮すると無色の油として標記
化合物1.(J 1 tが残った。
メタン20mに浴所し、そして氷塩浴で冷却した。ジク
ロロメタン2〇−中のp−フルオロベンジルクロライド
(1,59f)の同じく冷却した溶液を30分間かけて
よくかくはんしながら部用した。混合物を10分間で室
温で加温びせ、そして溶媒を除去した。残渣を希塩酸に
とり、ジクロロメタンで抽出し、固体水酸化ナトリウム
で塩基性化し、ジクロロメタンに抽出し、炭酸カリクム
で乾燥し、戸適しセして凝縮すると無色の油として標記
化合物1.(J 1 tが残った。
N−CNζエチル−2−アミノエチル)−p−フルオロ
ベンズアミド(654〜)、トリエチルアミン(650
wt)およびブロモアセトニトリル(55,91R9)
tメタノール2−に溶解し、セして室温で2時間放置し
た。溶媒を除去し、残渣を希塩酸に溶解した。エーテル
で抽出した後、水層を固体水酸化カリ9ムで塩基性とし
、そしてジクロロメタンで抽出した。溶媒を除去した後
、残渣をジクロロメタン−メタノールでシリカゲル40
9でクロマトグラフィーで精製すると透明な油626I
n9が得らnた。
ベンズアミド(654〜)、トリエチルアミン(650
wt)およびブロモアセトニトリル(55,91R9)
tメタノール2−に溶解し、セして室温で2時間放置し
た。溶媒を除去し、残渣を希塩酸に溶解した。エーテル
で抽出した後、水層を固体水酸化カリ9ムで塩基性とし
、そしてジクロロメタンで抽出した。溶媒を除去した後
、残渣をジクロロメタン−メタノールでシリカゲル40
9でクロマトグラフィーで精製すると透明な油626I
n9が得らnた。
ド
N−CN′−エチル−2−アミノエチル)p−フルオロ
ベンズアミドC034t)f3気圧の初圧下で90:1
0メタノール−アンモニア10〇−中す30ラネ一ニツ
ケル40011kgで一夜水素添加した。触媒を除去し
、そして溶媒を除去すると殆んど無色の油0.359が
残った。
ベンズアミドC034t)f3気圧の初圧下で90:1
0メタノール−アンモニア10〇−中す30ラネ一ニツ
ケル40011kgで一夜水素添加した。触媒を除去し
、そして溶媒を除去すると殆んど無色の油0.359が
残った。
ベンゾイルクロライド(2,11f)を2.2.2−)
リフルオロエタノール5.5−に溶解し、ふたをし、室
温で一夜放置し、次に手短かに加熱還流した。揮発性物
質を除去し、セして残渣をトリフルオロエタノール2−
に再びとり、そして手短かに加熱還流した。全ての揮発
性物質を再び除去した。残渣をジクロロメタン1〇−瘉
こf6解し、水浴で冷却し、セしてN−イソプロピルエ
チレンジアミン1.849を5分間かけて加えた。混合
?!Iを2h日間冷蔵庫に放置した。揮発性物質を除去
し、セして残渣を希塩酸とエーテルとの間で分配した。
リフルオロエタノール5.5−に溶解し、ふたをし、室
温で一夜放置し、次に手短かに加熱還流した。揮発性物
質を除去し、セして残渣をトリフルオロエタノール2−
に再びとり、そして手短かに加熱還流した。全ての揮発
性物質を再び除去した。残渣をジクロロメタン1〇−瘉
こf6解し、水浴で冷却し、セしてN−イソプロピルエ
チレンジアミン1.849を5分間かけて加えた。混合
?!Iを2h日間冷蔵庫に放置した。揮発性物質を除去
し、セして残渣を希塩酸とエーテルとの間で分配した。
固体水酸化カリウムで水層を塩基性にし、エーテルで抽
出し、乾燥しセして溶媒を除去すると無色の油として生
成物2.25 fが得られた。
出し、乾燥しセして溶媒を除去すると無色の油として生
成物2.25 fが得られた。
実施例XXIの方法に従って、p−トルオイルクロライ
ド3.09 fおよびN−エチルエチレンジアミン1.
94 fから過剰の2 + 2 + 2− ) リフル
オロエタノールを用いてこの化合物を製造した。収i1
3.U(1 実施例XVUの方法に従って、p−クロロベンゾイルク
ロライド8.7599よひN−エチルエチレンジアミン
5.512からこの化合物を製造した。収量5.09
f生成物を反応混合物から晶出させ、p過着こよって単
離する以外は実施例XvIlの方法に従って、p〜ニト
ロベンゾイルクロラ・「ド1.856 r&よびN−イ
ソプロピルエチレンジアミン1.022 Fからこの化
合物′(i−製造した。収量塩酸塩として2.469 この化付物は実施例XIVの方法により製造した。N−
[N−(2−70ビル)−2−アミノエチル〕ベンズア
ミド2.18?およびエチル4−プロモクロトネー)
2.25 rから淡黄色部として′S記化曾物2.07
?が侍られた。
ド3.09 fおよびN−エチルエチレンジアミン1.
94 fから過剰の2 + 2 + 2− ) リフル
オロエタノールを用いてこの化合物を製造した。収i1
3.U(1 実施例XVUの方法に従って、p−クロロベンゾイルク
ロライド8.7599よひN−エチルエチレンジアミン
5.512からこの化合物を製造した。収量5.09
f生成物を反応混合物から晶出させ、p過着こよって単
離する以外は実施例XvIlの方法に従って、p〜ニト
ロベンゾイルクロラ・「ド1.856 r&よびN−イ
ソプロピルエチレンジアミン1.022 Fからこの化
合物′(i−製造した。収量塩酸塩として2.469 この化付物は実施例XIVの方法により製造した。N−
[N−(2−70ビル)−2−アミノエチル〕ベンズア
ミド2.18?およびエチル4−プロモクロトネー)
2.25 rから淡黄色部として′S記化曾物2.07
?が侍られた。
実施例XIVの方法に従ってN−(Nζエチル−2−ア
ミノエチル〕p−フルオロベンズアミド8.12および
エテル4−ブロモクロトネート?、44 tからこの化
合物を製造した。精製した生成物の収量は4.02でお
った。
ミノエチル〕p−フルオロベンズアミド8.12および
エテル4−ブロモクロトネート?、44 tからこの化
合物を製造した。精製した生成物の収量は4.02でお
った。
実施例X1vの操作に従ってN−〔Nζエチル−2−ア
ミノエチルコアートルアミド3.43 tおよびエテル
4−ブロモクロトネート3.539からこの化合物?#
造した。精製した生成物の重量は3.64 fであった
。
ミノエチルコアートルアミド3.43 tおよびエテル
4−ブロモクロトネート3.539からこの化合物?#
造した。精製した生成物の重量は3.64 fであった
。
実施例XIvの操作に従ってN−〔N′−エチル−2−
アミノエチル〕p−クロロベンズアミド3.38 fお
よびエチル4−ブロモクロトネート3.18 rから精
製した標記生成物3.47 tが得らnた。
アミノエチル〕p−クロロベンズアミド3.38 fお
よびエチル4−ブロモクロトネート3.18 rから精
製した標記生成物3.47 tが得らnた。
N−N’−C2−プロピル)、N’−C3−エトキシ−
カルボニルプロ7’−2−エン−1−イル)−2−アミ
ノエチル〕ベンズアミド2・02ftを用いて実施例X
vの操作t−実施すると、標記化合物1.93 rがほ
とんど無色の油として得られた。
カルボニルプロ7’−2−エン−1−イル)−2−アミ
ノエチル〕ベンズアミド2・02ftを用いて実施例X
vの操作t−実施すると、標記化合物1.93 rがほ
とんど無色の油として得られた。
N−(#ζエチル、 N′−(3−エトキシカルボニル
プロブ−2−エン−1−イル)−2−アミノエチル〕p
−フルォロベンズアミド(4,Of ) ff13fi
圧でエタノール中10%パラジウム付き木炭4UOIn
9で水素添加した。触媒を濾過し、浴媒を除去するとM
3.89 fが残った。
プロブ−2−エン−1−イル)−2−アミノエチル〕p
−フルォロベンズアミド(4,Of ) ff13fi
圧でエタノール中10%パラジウム付き木炭4UOIn
9で水素添加した。触媒を濾過し、浴媒を除去するとM
3.89 fが残った。
−トルアミド
この化合物は実施例X■の方法により製造された。N−
〔Nζエテル、N’C3−エトキシカルボニルプロプ−
2−エン−1−イル)−2−アミノエチル〕p−トルア
ミド(3,55f )から殆んど無色の油として標記化
合物3.29Vが侍らn、た。
〔Nζエテル、N’C3−エトキシカルボニルプロプ−
2−エン−1−イル)−2−アミノエチル〕p−トルア
ミド(3,55f )から殆んど無色の油として標記化
合物3.29Vが侍らn、た。
粗生成物が小量の不純分で汚染され、クロマトグラフィ
ーによる精製を必要とする以外は実施例X■の方法によ
りN−N′−エテル、Nζ(3−エトキシカルボニル−
プロプ−2−エン−1−イル)−2−アミノエチル〕p
−クロロベンズアミド1.4(lからこの化合物が製造
された。最終収量は6631n9であった。
ーによる精製を必要とする以外は実施例X■の方法によ
りN−N′−エテル、Nζ(3−エトキシカルボニル−
プロプ−2−エン−1−イル)−2−アミノエチル〕p
−クロロベンズアミド1.4(lからこの化合物が製造
された。最終収量は6631n9であった。
ベンズアミド
この化合物は実施例Xv1の操作に従ってN−〔N’−
C2−フロビル〕、N′−(3−エトキシカルボニル−
1−プロピ#)−2−7ミノエチル〕ベンズアミド1.
8 Ofから製造さnた。
C2−フロビル〕、N′−(3−エトキシカルボニル−
1−プロピ#)−2−7ミノエチル〕ベンズアミド1.
8 Ofから製造さnた。
ロベンズアミド
この化合物はN−〔Nζエチル、Nζ(3−エトキシカ
ルボニル−1−−fロビル)−2−アミノエテル〕p−
フルオロベンズアミド3.89 fおよびエタノール−
水中の水酸化ナトリウム0.48 Fから製造した。室
温で3時間後、溶液を希塩酸で酸性となし、生成物をジ
クロロメタンで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥しセし
て浴媒を除去すると2、Ofが得られた。
ルボニル−1−−fロビル)−2−アミノエテル〕p−
フルオロベンズアミド3.89 fおよびエタノール−
水中の水酸化ナトリウム0.48 Fから製造した。室
温で3時間後、溶液を希塩酸で酸性となし、生成物をジ
クロロメタンで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥しセし
て浴媒を除去すると2、Ofが得られた。
この化合物は実施例Xvlの方法によりN−〔N’−エ
チル。
チル。
y−C3−エトキシカルボニル−1−プロピル〕−2−
アミノエチル〕p−トルアミド3.02 fから製造さ
れた。免疫原の製造に使用する物質の部分を厚層プレー
トでのクロマトグラフィーにより精製した。
アミノエチル〕p−トルアミド3.02 fから製造さ
れた。免疫原の製造に使用する物質の部分を厚層プレー
トでのクロマトグラフィーにより精製した。
ホキシーl−プロピル)−2−アミノエチル〕p−クロ
ロベンズアミド この化合物は実施例XVIの方法番こよりN−〔N′−
エチル。
ロベンズアミド この化合物は実施例XVIの方法番こよりN−〔N′−
エチル。
f−(3−エトキシカルボニル−1−プロピル)−2−
7ミノエテル〕p−クロロベンズアミド999から製造
した。
7ミノエテル〕p−クロロベンズアミド999から製造
した。
殆んど無色のゴム状物の収量は87〜であった。
この化合物は実施例XIXの操作に従ってN−(N′−
エチル−2−アミノエテル)ベンズアミド1.92 t
およびブロモアセトニトリル2.4fから製造された。
エチル−2−アミノエテル)ベンズアミド1.92 t
およびブロモアセトニトリル2.4fから製造された。
クロマトグラフィー後の収量は1.29 fであった。
この化合物は、塩基としてトリエチルアミンの代りにジ
イソプロピルエチルアミンを使用し、反応時間を24時
間に増加させる以外は、実施例XIの操作番こ従ってN
−(A+’−エチル−2−アミノエチルクーp−ニトロ
ベンズアミド237I!I9およびブロモアセトニトリ
ル240Ingから製造さnた。淡黄色結晶性生成物は
融点115−116℃を肩していた。
イソプロピルエチルアミンを使用し、反応時間を24時
間に増加させる以外は、実施例XIの操作番こ従ってN
−(A+’−エチル−2−アミノエチルクーp−ニトロ
ベンズアミド237I!I9およびブロモアセトニトリ
ル240Ingから製造さnた。淡黄色結晶性生成物は
融点115−116℃を肩していた。
この化合物は、@基としてトリエチルアミンの代9擾こ
ジイソプロピルエチルアミンを使用する以外は実施例X
Iの操作によりN−(Nζエチル−2−アミノエチル)
ベンズアミド960■訃よび3−ブロモプロピオニトリ
k1.79tから製造された。若干の機械的損失後の収
量は265II9でおった。
ジイソプロピルエチルアミンを使用する以外は実施例X
Iの操作によりN−(Nζエチル−2−アミノエチル)
ベンズアミド960■訃よび3−ブロモプロピオニトリ
k1.79tから製造された。若干の機械的損失後の収
量は265II9でおった。
ル) −2−’yミノエチル〕−p−ニトロベンズアミ
ドジメチルホルムアミド6−中のN−CNζエテル−2
−アミノエチル)−p−二トロベンズアミド(1,37
F )、3−ブロモプロピオニトリル(1,00? )
および炭酸カリウム(1,389)を室温で一夜かくは
んした。3−ブロモプロピオニトリルを更に0.349
を加え、そして混合物を7時間50−60℃の油浴中で
加熱した。混合物をジクロロメタンで希釈し、セして濾
過して無機塩を除去しセして俗媒を除去した。残渣をシ
リカゲル30fでジクロロメタン−メタノールで溶離し
てクロマトグラフィー処理をすると生成物1.38rが
得られた。
ドジメチルホルムアミド6−中のN−CNζエテル−2
−アミノエチル)−p−二トロベンズアミド(1,37
F )、3−ブロモプロピオニトリル(1,00? )
および炭酸カリウム(1,389)を室温で一夜かくは
んした。3−ブロモプロピオニトリルを更に0.349
を加え、そして混合物を7時間50−60℃の油浴中で
加熱した。混合物をジクロロメタンで希釈し、セして濾
過して無機塩を除去しセして俗媒を除去した。残渣をシ
リカゲル30fでジクロロメタン−メタノールで溶離し
てクロマトグラフィー処理をすると生成物1.38rが
得られた。
ト
テトラヒドロフラン2−中のN−〔N′−エテル−2−
アミノエチル〕−p−フルオロベンズアミド(210〜
)をアクリロニトリル64jI2および2M水酸化ナト
リクム0.025−で処理し、室温で一夜かくはんした
。温!t−55℃に上げ、そして追加のアクリロニトリ
ル(127II#9童)を4時間および20時間後に加
えた。55−60℃での全時間は24時間であった。粗
生成物をシリカゲル2.5tt通し、クロロホルム−メ
タノールで溶離することによって生成物を単離すると透
明な油265〜が得らnた。
アミノエチル〕−p−フルオロベンズアミド(210〜
)をアクリロニトリル64jI2および2M水酸化ナト
リクム0.025−で処理し、室温で一夜かくはんした
。温!t−55℃に上げ、そして追加のアクリロニトリ
ル(127II#9童)を4時間および20時間後に加
えた。55−60℃での全時間は24時間であった。粗
生成物をシリカゲル2.5tt通し、クロロホルム−メ
タノールで溶離することによって生成物を単離すると透
明な油265〜が得らnた。
ンズアミド
この化合物は、トリエチルアミン塩基を加えない以外は
実施例xrLの操作をこよr)y−<n′−エテル−2
−アミノエチル)−p−フルオロベンズアミド210〜
および4−ブロモブチロニトリル163〜から製造さn
た。生成物の収率は理論量より4若干大きかった。この
理由は若干のニッケル塩が含’Enていたからでろる。
実施例xrLの操作をこよr)y−<n′−エテル−2
−アミノエチル)−p−フルオロベンズアミド210〜
および4−ブロモブチロニトリル163〜から製造さn
た。生成物の収率は理論量より4若干大きかった。この
理由は若干のニッケル塩が含’Enていたからでろる。
こnらの塩は次の反応を阻害しなかった。
ラネーニッケルの代りに触媒として5%ロジウム付きカ
ーボンを使用する以外は実施例xxの操作に従ってN−
〔Nζエチル、Nζ(シアノメチル)−2−アミノエチ
ルクーp−ニトロベンズアミド92■からこの化合物が
表迫石れた。重量62〜の生成物はラネーニッケル還元
で生産された生成物はど清浄ではなかった。
ーボンを使用する以外は実施例xxの操作に従ってN−
〔Nζエチル、Nζ(シアノメチル)−2−アミノエチ
ルクーp−ニトロベンズアミド92■からこの化合物が
表迫石れた。重量62〜の生成物はラネーニッケル還元
で生産された生成物はど清浄ではなかった。
この化付物は実施例xXの操作に便ってN−(Nζエチ
ル、Nζ(2−シアノエチル]−2−アミノエチル〕ベ
ンズアミド239II#9から製造された。収量205
III9、淡緑色前 ンズアミド この化合物は実施例Xxの操作に従ってN−(#−エチ
ル、71/’−(2−シアノエチル)−2−アミノエチ
ル)−p−フルオロペンズアミド200I#gから製造
した。
ル、Nζ(2−シアノエチル]−2−アミノエチル〕ベ
ンズアミド239II#9から製造された。収量205
III9、淡緑色前 ンズアミド この化合物は実施例Xxの操作に従ってN−(#−エチ
ル、71/’−(2−シアノエチル)−2−アミノエチ
ル)−p−フルオロペンズアミド200I#gから製造
した。
ズアミド
この化合物は実施例xxの操作番こ従ってN−〔N’−
エチル、N’−(3−シアノ−1−プロピル)−2−ア
ミノ−エテルlp−フルオロベンズアミド100mgか
ら製造した。
エチル、N’−(3−シアノ−1−プロピル)−2−ア
ミノ−エテルlp−フルオロベンズアミド100mgか
ら製造した。
キシ)フルオレセイン
5−カルボキシフルオレセイン N−ヒドロキシスクシ
ンイミジルエステル(500Iv)をジメチルホルムア
ミド2−にとり、そしてジメチルホルムアミド2−中の
エチレンジアミン635〜の′#rWILに加えた。混
合物を室温で30分間かくはんし、そして大量のエチル
エーテルで希釈し、モして沈殿t−戸果した。
ンイミジルエステル(500Iv)をジメチルホルムア
ミド2−にとり、そしてジメチルホルムアミド2−中の
エチレンジアミン635〜の′#rWILに加えた。混
合物を室温で30分間かくはんし、そして大量のエチル
エーテルで希釈し、モして沈殿t−戸果した。
N −(N’−エテル−2−アミノエチル)ベンズアミ
ド(251#g、0.1sモル)%5−ブロモアセトア
ミドフルオレセイン(239,0,05sモル)および
トリエチルアミン(17,7m9.0−175sモル〕
をメタノール0.25−に浴解し、そして定温で一夜か
くはんした。生成物をシリカゲル厚層プレートで3:l
クロロホルム−メタノールで展開してクロマトグラフィ
ーで単離した。
ド(251#g、0.1sモル)%5−ブロモアセトア
ミドフルオレセイン(239,0,05sモル)および
トリエチルアミン(17,7m9.0−175sモル〕
をメタノール0.25−に浴解し、そして定温で一夜か
くはんした。生成物をシリカゲル厚層プレートで3:l
クロロホルム−メタノールで展開してクロマトグラフィ
ーで単離した。
N−CN’−エチル−2−アミノエチル>−p−フルオ
ロベンズアミド塩酸塩(25#、 0.1嘱モル)、5
−ブロモアセトアミドフルオレセイン(23#、t)、
05 vnモル)およびトリエチルアミン((J、02
611It、 0.15%モル]をメタノール0.25
111tiこ浴解しそして室温で64時間かくはんした
。生成物t−3: 1クロロホルム−メタノールで展開
シてシリカゲル厚層プレートでのクロマトグラフィーに
より単離した。
ロベンズアミド塩酸塩(25#、 0.1嘱モル)、5
−ブロモアセトアミドフルオレセイン(23#、t)、
05 vnモル)およびトリエチルアミン((J、02
611It、 0.15%モル]をメタノール0.25
111tiこ浴解しそして室温で64時間かくはんした
。生成物t−3: 1クロロホルム−メタノールで展開
シてシリカゲル厚層プレートでのクロマトグラフィーに
より単離した。
チル〕4−トルアミド
N−CN’−エチル−2−アミノエテル)4−トルアミ
ド(12II9.0.05惰モル)、5−ブロモアセト
アミドフルオレセインC234,0,05mモル)2よ
びトリエチルアミン(12,5II#9、U、l 25
惰モル)をメタノール0.25sdに浴解し、そして室
温で36時間放置しt’:、 2 : 1クロ′iホル
ム−メタノールで厚層シリカゲルプレートでのクロマト
グラフィーにより純粋な生成物か得らnた=N−〔N’
−エチル−2−アミノエチル]−p−クロロベンズアミ
ド(201F9%o、o 88惧モル)、5−プロモア
jドアミドフルオレセイン(23Iv%U、05 tn
モル)およびトリエチルアミン((J、01[)5mg
、0.07 ’5%モル)1!−メ′タノール0.25
−に溶解しそして室温で24時間放置した。
ド(12II9.0.05惰モル)、5−ブロモアセト
アミドフルオレセインC234,0,05mモル)2よ
びトリエチルアミン(12,5II#9、U、l 25
惰モル)をメタノール0.25sdに浴解し、そして室
温で36時間放置しt’:、 2 : 1クロ′iホル
ム−メタノールで厚層シリカゲルプレートでのクロマト
グラフィーにより純粋な生成物か得らnた=N−〔N’
−エチル−2−アミノエチル]−p−クロロベンズアミ
ド(201F9%o、o 88惧モル)、5−プロモア
jドアミドフルオレセイン(23Iv%U、05 tn
モル)およびトリエチルアミン((J、01[)5mg
、0.07 ’5%モル)1!−メ′タノール0.25
−に溶解しそして室温で24時間放置した。
生成物を3=1クロロホルム−メタノールで展開してシ
リカゲル厚層プレートでのクロマトグラフィーにより単
離した。
リカゲル厚層プレートでのクロマトグラフィーにより単
離した。
N−〔N’−C2−プロピル)−2−アミノエチル)−
p−ニトロペンズアミド(29〜)および5−ブロモア
セトアミドフルオレセイン(23II9)t−メタノー
ル0.5m4Cとり、そして室温で36時間かくはんし
た。生成物をクロロホルム−メタノールでの溶離によシ
リカゲル厚層プレートでのクロマトグラフィーによ)単
離した。このものをメタノール7w5tj?よび15%
水酸化カリウム水爵歌2−にとシ、そして硫ll第一鉄
7水和物のlO%水浴液1mを加えて還元した。得られ
た沈殿を遠心分離で除去し、pHを6.74こal11
1節しそして温媒を除去した。クロロホルム−メタノー
ルでのシリカゲルプレートでの第二のクロマトグラフィ
ーにまって純粋な生成物が得られた。
p−ニトロペンズアミド(29〜)および5−ブロモア
セトアミドフルオレセイン(23II9)t−メタノー
ル0.5m4Cとり、そして室温で36時間かくはんし
た。生成物をクロロホルム−メタノールでの溶離によシ
リカゲル厚層プレートでのクロマトグラフィーによ)単
離した。このものをメタノール7w5tj?よび15%
水酸化カリウム水爵歌2−にとシ、そして硫ll第一鉄
7水和物のlO%水浴液1mを加えて還元した。得られ
た沈殿を遠心分離で除去し、pHを6.74こal11
1節しそして温媒を除去した。クロロホルム−メタノー
ルでのシリカゲルプレートでの第二のクロマトグラフィ
ーにまって純粋な生成物が得られた。
この化合物は、N−〔N′−エテル−2−アミノエチル
〕−シーニトロベンズアミド40IIkg&’よび5−
ブロモアセトアミドフルオレセイン949から出発して
実施例Lmの方法に従って製造された。
〕−シーニトロベンズアミド40IIkg&’よび5−
ブロモアセトアミドフルオレセイン949から出発して
実施例Lmの方法に従って製造された。
N−〔N′−エテル、N’−(3−カルボキシ−1−プ
ロピル)−2−7ミノエチル〕ベンズアミド(17JI
p、0.064偽モル)tfli、燥ジメチルホルムア
ミド0.10−に溶解し、水浴で冷却しそしてインブチ
ルクロロホルメート13.2ダ(0,l溝モル)を加え
た。溶液を氷が静けるにつれて3f1#間かくはんし、
モして室温に加、温した。仁の混会物の半分を6−アミ
ツフルオレセイ711η(0−032y+aモル)に加
え、そしてピリジン0.05−を加えた。室温で一夜か
ぐはんした後、生成物を3:1クロロホルム−メタノー
ルで展開してシリカゲル厚層プレートでの夕、ロマトグ
ラフイーにより単離した。
ロピル)−2−7ミノエチル〕ベンズアミド(17JI
p、0.064偽モル)tfli、燥ジメチルホルムア
ミド0.10−に溶解し、水浴で冷却しそしてインブチ
ルクロロホルメート13.2ダ(0,l溝モル)を加え
た。溶液を氷が静けるにつれて3f1#間かくはんし、
モして室温に加、温した。仁の混会物の半分を6−アミ
ツフルオレセイ711η(0−032y+aモル)に加
え、そしてピリジン0.05−を加えた。室温で一夜か
ぐはんした後、生成物を3:1クロロホルム−メタノー
ルで展開してシリカゲル厚層プレートでの夕、ロマトグ
ラフイーにより単離した。
実施例Z、Xの方法によシ、N−〔N’−C2−プロピ
ル〕。
ル〕。
A/’−(3−カルボキシ−1−プロピル)−2、−ア
ミノエチル〕ヘンズアミド63It9、インブチルクロ
ロホルメート41Mgおよび5−7ミノフルオレセイ7
28〜からこの化合物を製造した。クロロホルム−メタ
ノール(2:1)iクロマトグラフィー精製に使用した
。
ミノエチル〕ヘンズアミド63It9、インブチルクロ
ロホルメート41Mgおよび5−7ミノフルオレセイ7
28〜からこの化合物を製造した。クロロホルム−メタ
ノール(2:1)iクロマトグラフィー精製に使用した
。
N−r−N’−エチル、N’ (3−カルボキシ−1−
プロピk)−2−7ミ/エチル〕−p−クロロベンズア
ミ)−CB’Dy)s−よぴカルボニルジイミダゾール
40.5jlpをアセトニトリル2mにとった。室温で
1%時間かくはんした後、0.40−アリコートをとり
、回転蒸発器で濃縮し、ジメチルホルムアミド帆10d
4こ貴溶膚し、そして43A時間室温で6″−7ミノフ
ルオレセイン17.41+19と反応させた。
プロピk)−2−7ミ/エチル〕−p−クロロベンズア
ミ)−CB’Dy)s−よぴカルボニルジイミダゾール
40.5jlpをアセトニトリル2mにとった。室温で
1%時間かくはんした後、0.40−アリコートをとり
、回転蒸発器で濃縮し、ジメチルホルムアミド帆10d
4こ貴溶膚し、そして43A時間室温で6″−7ミノフ
ルオレセイン17.41+19と反応させた。
生成物Th3 : lクロロホルム−メタノールで薄層
、プレートで2回クロマトグラフィー処理することによ
り精製した。
、プレートで2回クロマトグラフィー処理することによ
り精製した。
N−r、N’−エチル、 N’−(3−カルボキシ−1
−プロピル))−2−アミノエチル−2−ヒドロキシベ
ンズアミド(80IIg)t−ジメチルホルムアミド2
−にとり、N−ヒドロキシスクシンイミド(411Ig
)j!?よびジシクロヘキシルカルボジイミド(73I
Ni)を加えた。溶液を室温で一夜かくはんし、モして
ジメチルホルムアミド1−中の5−(2−アミノエチル
アミノカルボキシ)フルオレセイン(114mg)およ
びトリエチルアミン(28jlIg)の溶液番こF遇し
て入れた。混合物を再び室温で一夜かくはんし、そして
溶媒を除いた。生成物を逆相クロマトグラフィープレー
トでのクロマトグラフィーによりm製した。
−プロピル))−2−アミノエチル−2−ヒドロキシベ
ンズアミド(80IIg)t−ジメチルホルムアミド2
−にとり、N−ヒドロキシスクシンイミド(411Ig
)j!?よびジシクロヘキシルカルボジイミド(73I
Ni)を加えた。溶液を室温で一夜かくはんし、モして
ジメチルホルムアミド1−中の5−(2−アミノエチル
アミノカルボキシ)フルオレセイン(114mg)およ
びトリエチルアミン(28jlIg)の溶液番こF遇し
て入れた。混合物を再び室温で一夜かくはんし、そして
溶媒を除いた。生成物を逆相クロマトグラフィープレー
トでのクロマトグラフィーによりm製した。
N−〔Nζエチル、N’−(2−アミノ−1−エテル)
−2−7ミノエチル〕ベンズアミド(309)t、予め
2時間ピリジン帆25sdでかくはんしておいた6−カ
ルボキシフルオレセイン、1−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール水相物13.94およびジシクロへキシルカルボ
ジイミド48.2〜から形成され7’Cff1性化6−
カルボキシフルオレセインの浴猷と反応させた。最終混
合物を一夜かくはんし、そして生成物を1すクロロホル
ム−メタノールでシリカゲル厚層プレート、次にメタノ
ール−酢酸アンモニクム緩衝液で逆相プレートでクロマ
トグラフィーにまり単離した。
−2−7ミノエチル〕ベンズアミド(309)t、予め
2時間ピリジン帆25sdでかくはんしておいた6−カ
ルボキシフルオレセイン、1−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール水相物13.94およびジシクロへキシルカルボ
ジイミド48.2〜から形成され7’Cff1性化6−
カルボキシフルオレセインの浴猷と反応させた。最終混
合物を一夜かくはんし、そして生成物を1すクロロホル
ム−メタノールでシリカゲル厚層プレート、次にメタノ
ール−酢酸アンモニクム緩衝液で逆相プレートでクロマ
トグラフィーにまり単離した。
(フルオレセイン−6−イルアミノ)−6−クロロ−1
゜ベンズアミド N−〔N′−エチル、Nζ(2−7ミノエチル)−2−
アミノエチル〕ベンズアミド(8mg)および6−((
4,6−ジクロロ−1,3,5−)リアジン−2−イル
)アミノコフルオレセイン(17,5J19)全メタノ
ール0コーに溶解した。トリエチルアミン((J、01
5d) ’に加え、そして混合物を室温で3時間〃為<
はんした。生成物をクロロホルムーメタノールで展開し
て分取薄層クロマトグラフィーによシ精製した。
゜ベンズアミド N−〔N′−エチル、Nζ(2−7ミノエチル)−2−
アミノエチル〕ベンズアミド(8mg)および6−((
4,6−ジクロロ−1,3,5−)リアジン−2−イル
)アミノコフルオレセイン(17,5J19)全メタノ
ール0コーに溶解した。トリエチルアミン((J、01
5d) ’に加え、そして混合物を室温で3時間〃為<
はんした。生成物をクロロホルムーメタノールで展開し
て分取薄層クロマトグラフィーによシ精製した。
ベンズアミド
この化合物は実施例LXの方法に従ってN−〔N′−エ
チに、N’−C2−7ミノエテ゛ル〕−2−アミノエ゛
チル〕ベンズアミド13m9j?よび5−((4,6−
ジクoロー1.3w5−トリアジン−2−イル)アミノ
コフルオレセイン29ダから製造された。
チに、N’−C2−7ミノエテ゛ル〕−2−アミノエ゛
チル〕ベンズアミド13m9j?よび5−((4,6−
ジクoロー1.3w5−トリアジン−2−イル)アミノ
コフルオレセイン29ダから製造された。
この化合物は実施例LXの方法蛋こ従ってN−r−N’
−エチルr A’ −(2−y ミノエチル)−2−ア
ミノエテル〕ベンズアミド9■2よび5−[(4,6−
ジクロロ−1,3゜5−トリアジン−2−イル)アミノ
コフルオレセイン19.11n9から製造された。
−エチルr A’ −(2−y ミノエチル)−2−ア
ミノエテル〕ベンズアミド9■2よび5−[(4,6−
ジクロロ−1,3゜5−トリアジン−2−イル)アミノ
コフルオレセイン19.11n9から製造された。
(フルオレセイン−5−イルアミノ)−6−クロロ−1
゜この化合物は、反応を水浴で開始しモして33A時間
番こわたって徐々に室温に加温した以外は、実施例Lx
の方法に従って製勇された。出発物質/I′iN−〔N
′−エチル、N′−(2−アミノエチル)−2−7ミノ
工チル〕ベンズアミド15mgj?よび5−[(4,6
−ジクC’0−1.3.5−)リアジン−2−イル)ア
ミノコフルオレセイン22.7M9であった。クロマト
グラフィー溶媒は酢酸エチル−メタノールおよび次にク
ロロホルム−メタノールであった。
゜この化合物は、反応を水浴で開始しモして33A時間
番こわたって徐々に室温に加温した以外は、実施例Lx
の方法に従って製勇された。出発物質/I′iN−〔N
′−エチル、N′−(2−アミノエチル)−2−7ミノ
工チル〕ベンズアミド15mgj?よび5−[(4,6
−ジクC’0−1.3.5−)リアジン−2−イル)ア
ミノコフルオレセイン22.7M9であった。クロマト
グラフィー溶媒は酢酸エチル−メタノールおよび次にク
ロロホルム−メタノールであった。
ベンズアミド
この化合物は実施例LXの方法に従ってN−〔Nζエチ
ル、Nζ(3−アミノ−1−プロピル)−2−アミノエ
テル〕ベンズアミド7In9j?よび5−((4,6−
ジクロロ−1,3,5−)リアジン−1−イル)アミノ
コフルオレセイン14.91kgから製造さnた。
ル、Nζ(3−アミノ−1−プロピル)−2−アミノエ
テル〕ベンズアミド7In9j?よび5−((4,6−
ジクロロ−1,3,5−)リアジン−1−イル)アミノ
コフルオレセイン14.91kgから製造さnた。
ベンズイミド
この化合物は実施例LXの方法に従ってN−(N′−エ
チル、N’−(3−アミノ−1−プロピル)−2−アミ
ノエテルツーp−フルオロベンズアミド6.2mgおよ
び5− ((4゜6−ジクロロ−1,3,5−)リアジ
ン−2−イル)アミノコフルオレセイン12.6mgか
ら製造された。
チル、N’−(3−アミノ−1−プロピル)−2−アミ
ノエテルツーp−フルオロベンズアミド6.2mgおよ
び5− ((4゜6−ジクロロ−1,3,5−)リアジ
ン−2−イル)アミノコフルオレセイン12.6mgか
ら製造された。
この化合物は実施例LXの方法に従って製造された。但
し、反応時間は4℃で16時間次に室温で1時間でめっ
た。
し、反応時間は4℃で16時間次に室温で1時間でめっ
た。
出発物質はN−[Nζエチル、 y’−(4−アミノ−
1−ブチル)−2−アミノエテルツーp−フルオロベン
ズアミド511g2よび5−((4,6−ジクロO−1
,3,5−)リアジン−2−イル)アミノコフルオレセ
イン9.54であった。
1−ブチル)−2−アミノエテルツーp−フルオロベン
ズアミド511g2よび5−((4,6−ジクロO−1
,3,5−)リアジン−2−イル)アミノコフルオレセ
イン9.54であった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物。 上記構造において、 Qはポリ(アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体または
別の免疫学的に活性な担体、あるいはフルオレセインま
たはフルオレセイン誘導体であり; XはNH、CO、CS、C=NHまたはSO_2であり
;nは0、1または2であり; Rは、Qがポリ(アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体
または別の免疫学的に活性な担体であるときは、6個ま
でのヘテロ原子を包含し、また小計0−18個の炭素原
子およびヘテロ原子を有する8個までのヘテロ原子を包
含する結合基であり; R′は1−3個の炭素原子を有するアルキル基であり;
Yは、Qがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
であるときは、OH、NH_2、CH_3、F、Cl、
Br、CF_3またはHであり、そしてYは、Qがポリ
(アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体または別の免疫
学的に活性な担体であるときは、H、OH、CH_3、
FまたはClであり;そして Zは、Qがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
であるときは、HまたはFであり、そして、Qがポリ(
アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体または別の免疫学
的に活性な担体であるときは、Hであり;そして ZがYまたはカルボキサミド基に結合しているベンゼン
環の炭素原子以外の該炭素原子のいずれかに結合してい
る。 2、Qが牛血清アルブミンである特許請求の範囲第1項
記載の化合物。 8、Qがアミノ、アミド、アミジノ、尿素、チオ尿素、
カルバメート、チオカルバメート、トリアジニルアミノ
またはフルオレセインの(カルボキシアミノ)−スルホ
ンアミド誘導体である特許請求の範囲第1項記載の化合
物。 4、Qが4−クロロ−6−(フルオレセイン−5−イル
アミノ)−1,3,5−トリアジン−2−イルである特
許請求の範囲第1項記載の化合物。 5、Qが4−クロロ−6−(フルオレセイン−6−イル
アミノ)−1,3,5−トリアジン−2−イルである特
許請求の範囲第1項記載の化合物。 6、Qが4−メトキシ−6−(フルオレセイン−5−イ
ルアミノ)−1,3,5−トリアジン−2−イルである
特許請求の範囲第1項記載の化合物。 7、Qが4−メトキシ−6−(フルオレセイン−6−イ
ルアミノ)−1,3,5−トリアジン−2−イルである
特許請求の範囲第1項記載の化合物。 8、Qが(フルオレセイン−5−イル)アミノである特
許請求の範囲第1項記載の化合物。 9、Qが(フルオレセイン−6−イル)アミノである特
許請求の範囲第1項記載の化合物。 10、Qがポリ(アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体
または別の免疫学的に活性な担体である特許請求の範囲
第1項記載の化合物に対する抗体。 11、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、 Rは6個までのヘテロ原子を包含し、そして小計0−1
8個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であり
; R′は1−3個の炭素原子を有するアルキル基であり;
XはNH_2、COOH、CN、CHO、Br、Iまた
はOHであり;そして YはH、OH、CH_3、FまたはClである)を有す
る前駆体をポリ(アミノ酸)またはポリ(アミノ酸)の
誘導体とカップリングさせる工程からなる免疫原の製法
。 12、ポリ(アミノ酸)がサイログロブリンである特許
請求の範囲第11項記載の方法。 13、ポリ(アミノ酸)が牛血清アルブミンである特許
請求の範囲第11項記載の方法。 14、反応を活性エステルカップリングにより実施する
特許請求の範囲第11項記載の方法。 15、15 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中 Rは6個までのヘテロ原子を包含し、また小計0−18
個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であり; XはNH_2、COH、CN、SO_3HまたはOHで
あり;YはOH、NH_2、CH_3、F、Cl、Br
、CF_3またはHであり;そして ZはHまたはFである) を有する前駆体をフルオレセインまたはフルオレセイン
誘導体とカップリングさせることからなるトレーサーの
製法。 16、プロカインアミドの濃度測定方法において、(a
)プロカインアミド抗血清を伴う生物学的試料を、プロ
カインアミド抗血清の存在に対して検知可能な螢光偏光
反応を生じ得る特許請求の範囲第1項の化合物と接触さ
せ、 (b)工程(a)から得られる溶液中を平面偏光を通過
させて螢光偏光反応を得て、そして (c)工程(b)からの溶液の螢光偏光反応を試料中の
プロカインアミドの量の尺度として検出する ことからなる上記方法。 17、プロカインアミド抗血清が特許請求の範囲第10
項の抗体により生産される特許請求の範囲第16項記載
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US71601585A | 1985-03-26 | 1985-03-26 | |
US716015 | 1985-03-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61227600A true JPS61227600A (ja) | 1986-10-09 |
Family
ID=24876379
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61066132A Pending JPS61227600A (ja) | 1985-03-26 | 1986-03-26 | プロカインアミド検定、トレーサー、免疫原および抗体 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0199042A1 (ja) |
JP (1) | JPS61227600A (ja) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3786037T2 (de) * | 1986-04-25 | 1993-11-25 | Abbott Lab | Tracer zur Benutzung in immunologischen Fluoreszenz-Polarisationsverfahren zum Nachweis von Flecainid. |
EP0252405A3 (en) * | 1986-07-09 | 1989-11-08 | Abbott Laboratories | 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol fluorescence polarization immunoassay |
US4939264A (en) * | 1986-07-14 | 1990-07-03 | Abbott Laboratories | Immunoassay for opiate alkaloids and their metabolites; tracers, immunogens and antibodies |
US4868132A (en) * | 1987-02-03 | 1989-09-19 | Abbott Laboratories | Fluorescence polarization immunoassay for amphetamine/methamphetamine |
US4894348A (en) * | 1987-07-01 | 1990-01-16 | Ronald Robert C | Fluorescein-conjugated proteins with enhanced fluorescence |
US5262333A (en) * | 1988-10-28 | 1993-11-16 | Abbott Laboratories | Method and reagents for detecting amphetamine and/or D-methamphetamine in biological samples |
US5073629A (en) * | 1989-01-23 | 1991-12-17 | Abbott Laboratories | Methadone fluorescence polarization immunoassay |
FR2642972B1 (fr) * | 1989-02-14 | 1994-08-05 | Inst Nat Sante Rech Med | Agents pour le diagnostic et le traitement des melanomes, derives halogenes aromatiques utilisables comme de tels agents et leur preparation |
ATE154135T1 (de) * | 1989-03-10 | 1997-06-15 | Hoffmann La Roche | Reagenzien zum nachweis von drogen |
US5248791A (en) * | 1989-04-10 | 1993-09-28 | Abbott Laboratories | Reagents, methods and kits for an amphetamine-class fluorescence polarization immunoassay |
US5101015A (en) * | 1989-04-10 | 1992-03-31 | Abbott Laboratories | Reagents for an amphetamine-class fluorescence polarization immunoassay |
US5439798A (en) * | 1993-12-17 | 1995-08-08 | Boehringer Mannheim Corporation | Maleimide adduct conjugates of procainamide and NAPA |
US5525474A (en) * | 1994-01-31 | 1996-06-11 | Boehringer Mannheim Corporation | Piperidine analogs and conjugates of procainamide and NAPA |
US7279340B2 (en) * | 2004-04-07 | 2007-10-09 | Dade Behring Inc. | Synthesis and application of procainamide analogs for use in an immunoassay |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4235969A (en) * | 1978-05-08 | 1980-11-25 | Syva Company | Procainamide antigen conjugates and antibodies |
US4318846A (en) * | 1979-09-07 | 1982-03-09 | Syva Company | Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers |
CA1160626A (en) * | 1980-07-30 | 1984-01-17 | Stephen D. Stroupe | Biologically interesting compounds labeled with dichlorotriazinyl-aminofluorescein |
AU555213B2 (en) * | 1981-02-17 | 1986-09-18 | Abbott Laboratories | N-substituted-amido-fluoresein derivatives |
CA1248086A (en) * | 1981-12-11 | 1989-01-03 | Stephen D. Stroupe | Fluorescence polarization immunoassay |
-
1986
- 1986-03-10 EP EP86103161A patent/EP0199042A1/en not_active Withdrawn
- 1986-03-26 JP JP61066132A patent/JPS61227600A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0199042A1 (en) | 1986-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9644099B2 (en) | Violet laser excitable dyes and their method of use | |
JP2726793B2 (ja) | 免疫アッセイ | |
JP3009170B2 (ja) | 薬物の検出用試剤 | |
EP0279213B1 (en) | Fluorescence polarization immunoassay for amphetamine/methamphetamine | |
JPS61227600A (ja) | プロカインアミド検定、トレーサー、免疫原および抗体 | |
CA2288275A1 (en) | Glycoconjugated fluorescent labeling reagents | |
US4760142A (en) | Divalent hapten derivatives | |
JPS6236368A (ja) | レゾルフイン−誘導体並びにその製法 | |
JPS6323882A (ja) | アヘンアルカロイドおよびそれらの代謝物のための免疫検定法、トレ−サ−、免疫原および抗体 | |
US4952336A (en) | Fluorescence polymerization immunoassay for amphetamine/methamphetamine | |
EP0264797B1 (en) | Benzodiazepines assay, tracers, immunogens and antibodies | |
EP0371253A2 (en) | Method and reagents for detecting amphetamine and/or d-methamphetamine in biological samples | |
US5463027A (en) | Fluorescence polarazation immunoassay for tetrahydrocannabinoids | |
US5202270A (en) | Cocaine and cocaine metabolites assay tracers, immunogens and antibodies | |
EP0380019B1 (en) | Methadone fluorescence polarization immunoassay | |
US20100029017A1 (en) | Mono-chlorinated hydroxycoumarin conjugates | |
EP0457213B1 (en) | Barbiturate assay, tracers, immunogens, antibodies and kit | |
EP0199963B1 (en) | Ethosuximide assay tracers, immunogens and antibodies | |
EP0242847B1 (en) | Tracers for use in flecainide fluorescence polarization immunoassay | |
JPS61165400A (ja) | アセトアミノフエン分折、トレーサ、免疫源および抗体 | |
US5099000A (en) | Derivatives and analogues of monoethylglycinexylidide and their production and use | |
JP3022942B2 (ja) | 新規標識カルバマゼピン類似体 | |
EP0373508A2 (en) | Barbiturate assay, tracers, immunogens and antibodies | |
US5336622A (en) | Tracers for use in flecainide fluorescence polarization immunoassay | |
EP0184120A2 (en) | Tracers for disopyramide assay and immunogens to raise antibody |