DE3786037T2

DE3786037T2 - Tracer zur Benutzung in immunologischen Fluoreszenz-Polarisationsverfahren zum Nachweis von Flecainid.

Info

Publication number: DE3786037T2
Application number: DE19873786037
Authority: DE
Inventors: Daniel Feulner Heiman
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1986-04-25
Filing date: 1987-04-21
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2007-04-22
Also published as: CA1321998C; EP0242847A2; EP0242847A3; EP0242847B1; JPS62267289A; DE3786037D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Reagentien für ein Fluoreszenz-polarisations-Immuntestverfahren (FPIA) zur Bestimmung der Menge an Flecainid in Flüssigkeiten, insbesondere biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Plasma oder Harn.
Insbesondere betrifft die Erfindung (1) Reagentien zur Bestimmung der Menge an Flecainid in einer Probe, z. B. Tracer- und Pufferlösungen und (2) analytische Verfahren zur Durchführung des Tests.

Technischer Hintergrund

Flecainidacetat oder N-(2-Piperidylmethyl)-2,5-bis(2,2,2- trifluorethoxy)-benzamidacetat ist ein Arzneimittel, das verwendet wird zur Behandlung von ventrikulären Arrhythmien und Tachykardie. Obwohl Flecainidacetat sich als klinisch wirksam erwies, kann es unerwünschte Nebenwirkungen verursachen, wenn die optimalen Dosierungskonzentrationen überschritten werden. Es wurde gefunden, daß die therapeutischen Flecaninid-Konzentrationen im Blut im Bereich von 0,2 bis 1,0 ug pro ml liegen, wobei 0,5 ug pro ml als durchschnittliche wirksame Konzentration angesehen wird. Die Überwachung der Flecaninid-Konzentrationen im Serum in Verbindung mit den klinischen Daten kann dem Arzt nützliche Information liefern, als Hilfe für die Einstellung der Dosis für den Patienten, die Erzielung der optimalen therapeutischen Wirkungen, während nutzlose subtherapeutische oder schädliche toxische Dosierungskonzentrationen vermieden werden.
In der Vergangenheit wurden die Flecainid-Konzentrationen eines Patienten im Serum oder Plasma typischerweise mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Gaschromatographie (GC) gemessen. Obwohl diese Verfahren recht spezifisch sind zur Ermittlung von Arzneimittelkonzentrationen, sind sie nicht ohne Nachteile. Sie schließen ein eine umfassende Probenpräparation, eine zeitraubende Instrument-Einstellung und einen Bedarf an hochqualifiziertem Personal.
In Tests für andere Substanzen lieferten die kompetitiven Bindungs-Immuntests eine zufriedenstellendere Alternative. Typischerweise werden die kompetitiven Bindungstests verwendet zu Messung von Liganden in einer Testprobe (für die Zwecke dieser Beschreibung bedeutet "Ligand" eine Substanz von biologischem Interesse, die quantitativ durch ein kompetitives Bindungs-Immuntestverfahren bestimmt werden soll). Die Liganden konkurrieren mit einem markierten Reagens oder "Liganden-Analogon" oder "Tracer" um eine begrenzte Anzahl von Rezeptorbindungsstellen auf den Antikörpern, die spezifisch sind für den Liganden und das Liganden-Analogon. Die Konzentration des Liganden in der Probe bestimmt die Menge des Liganden-Analogon, das an den Antikörper bindet: die Menge des Liganden-Analogon, das eine Bindung eingeht, ist umgekehrt proportional zu der Konzentration des Liganden in der Probe, da der Ligand und das Liganden-Analogon jeweils in dem Verhältnis ihrer entsprechenden Konzentrationen an den Antikörper binden.
Die Fluoreszenz-Polarisation liefert ein quantitatives Mittel zur Messung der Menge des in einem kompetitiven Bindungs-Immuntest produzierten Tracer-Antikörper- Konjugats. Den Fluoreszenz-Polarisationstechniken liegt das Prinzip zugrunde, daß eine fluoreszierende markierte Verbindung bei Anregung mit linear polarisiertem Licht eine Fluoreszenz emittiert, die zu deren Rotationsgeschwindigkeit in umgekehrter Beziehung steht. Demgemäß bleibt, wenn ein Tracer-Antikörper-Konjugat, das einen fluoreszierenden Markierung aufweist, mit linear polarisiertem Licht angeregt wird, das emittierte Licht hochgradig polarisiert, da das Fluorophore in der Zeit, in der das Licht absorbiert und emittiert wird, an der Rotation gehindert wird. Im Gegensatz dazu ist, wenn ein ungebundener Tracer durch linear polarisiertes Licht angeregt wird, seine Rotation viel schneller als die des entsprechenden Tracer-Antikörper- Konjugats. Als Ergebnis wird das von den ungebundenen Tracermolekülen emittierte Licht depolarisiert.
Als wichtiger Stand der Technik kann die US-A-3 900 481 erwähnt werden, die Flecainid-Derivate beschreibt. Ferner betrifft die EP-A-199 042, die unter den Bezeichnungen Artikel 54(3) und (4) EPC als Stand der Technik betrachtet wird, Fluorescein-Derivate, die als Tracer für Procainamid geeignet sind. Die EP-A-218 010, die unter den Bezeichnungen Artikel 54(3) und (4) EPC ebenfalls als Stand der der Technik betrachtet wird, beschreibt Tracer zur Detektion antiarrhythmischer Arzneimittel, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Molekül des Arzneimittels mit der Fluorescein-Gruppierung kombiniert wird, jedoch beschreibt die EP-A-218 010 nicht Flecainid als eines der antiarrythmischen Arzneimittel.
Fluoreszenz-Polarisations-Immuntestverfahren sind in der Technik gut bekannt. Bisher jedoch ist die Verwendung solcher Techniken zur Bestimmung von Flecainid-Konzentrationen nicht erfolgreich versucht worden. Somit bietet die vorliegende Erfindung einen Fortschritt in der Technik dadurch, daß hochempfindliche Tracer und ein Test, bei dem die Tracer verwendet werden, speziell zur Bestimmung von Flecainid bereitgestellt werden. Der erfindungsgemäß durchgeführte Test ist besonders genau, was infra erklärt wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft einen FPIA für Flecainid, einen Tracer zur Verwendung in dem Test und Verfahren zur Herstellung solcher Tracer.
Ein erster Gesichtspunkt der Erfindung betrifft die Entdeckung von einzigartigen Tracern, die neue Strukturen aufweisen. Gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung können die Tracer dargestellt werden durch die in Fig. 2 der Zeichnungen gezeigte Strukturformel, worin:
Q für Fluoresceinyl steht; und
RZ eine Gruppe darstellt, ausgewählt aus
Wenn Q Wasserstoff, Hydroxyl oder eine Abgangsgruppe bedeutet, stellt die in Fig. 2 der Zeichnungen gezeigte Strukturformel eine Vorstufe dar, die zur Herstellung eines Tracers verwendet wird. Für die Zwecke dieser Beschreibung bedeutet "Abgangsgruppe" ein Halogen, eine Acyloxygruppe (einschließlich einem Carbonatester), eine Succinimidyloxy- oder Phthalimidyloxygruppe, eine Alkoxy- oder Phenoxy- oder substituierte Phenoxygruppe, eine Imidazolygruppe, eine Benzotriazolyloxygruppe oder irgendeine der anderen ähnlichen Aktivierungsgruppen, die den Fachleuten gut bekannt sind.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Messung der Flecainid-Konzentration bereitgestellt. Eine Probe wird in Kontakt gebracht mit Flecainid- Antiserum und einem Fluorescein-haltigen Flecainid-Derivat, das in der Lage ist, eine detektierbare Fluoreszenzpolarisationsantwort auf das Vorliegen des Flecainid- Antiserums zu erzeugen. Es wird dann linear polarisiertes Licht durch die Lösung geschickt, um eine Fluoreszenzpolarisationsantwort zu erhalten. Diese Antwort wird als Maß für die Menge an Flecainid in der Probe detektiert.
Weitere Aufgaben und die damit verbunden Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden ausführlichen Beschreibung zusammen mit den Figuren und Beispielen hervor.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

In den folgenden Figuren bedeutet das Symbol "F1" eine Fluorescein-Gruppierung. Die verschiedenen anderen Symbole werden in der ausführlichen Beschreibung erklärt.
Fig. 1 zeigt die allgemeine Struktur des Arzneimittels Flecainidacetat, welches erfindungsgemäß quantitativ bestimmt werden soll.
Fig. 2 zeigt eine allgemeine Strukturformel für die erfindungsgemäßen Tracer sowie die Klasse von Reagentien, die bei deren Herstellung verwendet wurden.
Fig. 3 zeigt die alternativen Strukturformeln und Namen der Fluorescein-Gruppierung, die in den erfindungsgemäßen Tracern eingeschlossen ist.
Fig. 4 zeigt verschiedene Bindungen, über die die Fluorescein-Gruppierung mit der Vorstufe in Fig. 2 gekuppelt ist, wenn Fig. 2 eine Vorstufe für die Tracer darstellt.
Fig. 5 bis 24 zeigen verschiedene Beispiele für die Strukturen der erfindungsgemäßen Tracer.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die verschiedenen Gesichtspunkte der Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die Figuren ausführlich erläutert.

Definitionen und erklärendes Material

Die vorliegende Erfindung schließt die Verwendung von Fluorescein und Derivaten des Fluorescein ein. Insbesondere ist die Fluoreszenz von Fluorescein eine notwendige Eigenschaft von Fluorescein und seinen Derivaten für eine Brauchbarkeit als Tracerverbindungen. Fluorescein liegt, in Abhängigkeit von der Säurekonzentration (pH) der Umgebung, in zwei tautomeren Formen vor, die in Fig. 3 dargestellt sind. In der offenen (Säure)-Form existiert eine Anzahl konjugierter Doppelbindungen, die diese Form von Fluorescein (und die Verbindungen, die eine Fluorescein- Gruppierung enthalten) in die Lage versetzen, blaues Licht zu absorbieren und nach einer Lebensdauer des angeregten Zustands von etwa 4 ns eine grüne Fluoreszenz zu emittieren. Wenn die offene und die geschlossene Form nebeneinander existieren, wird die relative Konzentration der Moleküle in der offenen und geschlossenen Form leicht verändert, indem der pH-Wert eingestellt wird. Im allgemeinen existieren die erfindungsgemäßen Tracerverbindungen in Lösung als biologisch verträgliche Salze, wie Natrium, Kalium oder Ammonium, was es den Verbindungen ermöglicht, in ihrer offenen fluoreszierenden Form vorzukommen, wenn sie bei den analytischen erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Das vorhandene spezielle Salz hängt ab von dem Puffer, der verwendet wird, um den pH-Wert einzustellen. Beispielsweise liegen die erfindungsgemäßen Verbindungen in Gegenwart von Natriumphosphatpuffer im allgemeinen in der offenen Form als Natriumsalz vor.
Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "Fluorescein", entweder als eine einzelne Verbindung oder als Komponente einer größeren Verbindung, daß sowohl die offene als auch die geschlossene Form eingeschlossen ist, wenn sie für ein bestimmtes Molekül existieren, außer im Zusammenhang mit der Fluoreszenz. Eine offene Form ist notwendig, damit die Fluoreszenz auftreten kann.
Die Numerierung der Kohlenstoffatome des Fluoreszein- Moleküls variiert je nach dem, ob die offene oder geschlossene Form des Moleküls betrachtet wird. Demgemäß ist die Literatur, die Fluorescein und seine Verbindungen betrifft, im Hinblick auf die Kohlenstoffatom-Numerierung nicht einheitlich. In der geschlossenen Form wird der para- Kohlenstoff im Carbonyl des Lacton an dem Phenylring mit der Nummer 6 bezeichnet. In der offenen Form wird der para- Kohlenstoff in der Carbonsäuregruppe an den Phenylring mit der Nummer 5 bezeichnet, (siehe Fig. 3). Für diese Beschreibung wird die Numerierung der geschlossenen Form übernommen, da die bei den Synthesen verwendeten Rohmaterialien meistens üblicherweise mit diesem System numeriert werden. Das Kohlenstoffatom von Fluorescein und seinen Verbindungen, welches sich gegenüber der Carboxylgruppe befindet, wird darum für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung mit der Nummer "6" bezeichnet.
Ein Tracer in Lösung, der nicht mit einem Antikörper komplexiert wird, rotiert frei, in weniger als der Zeit, die erforderlich ist, zur Absorption und Reemission von fluoreszentem Licht. Als Ergebnis ist das reemittierte Licht relativ zufällig orientiert, so daß die Fluoreszenz- Polarisation eines Tracers, der nicht mit einem Antikörper komplexiert ist, gering ist, gegen 0 geht. Durch Komplexierung mit einem spezifischen Antikörper nimmt der so gebildete Tracer-Antikörper-Komplex die Rotation des Antikörpermoleküls an, die langsamer ist als die des relativ kleinen Tracermoleküls, wodurch die beobachtete Polarisation zunimmt. Darum nimmt, wenn ein Ligand mit dem Tracer um Antikörper-Bindungsstellen konkurriert, die beobachtete Polarisation der Fluoreszenz des resultierenden Gemisches aus freien Tracer und Tracer-Antikörper-Komplex einen Wert an, der zwischen dem des Tracers und dem des Tracer-Antikörper-Komplexes liegt. Wenn eine Probe eine hohe Konzentration des Liganden enthält, liegt der beobachtete Polarisationswert näher an dem des freien Liganden, d. h. er ist niedrig. Wenn die Testprobe eine geringe Konzentration des Liganden enthält, liegt der Polarisationswert näher an dem des gebundenen Liganden, d. h. er ist hoch. Durch eine stufenweise Anregung des Reaktionsgemisches eines Immuntests mit vertikal und dann mit horizontal polarisiertem Licht und dadurch, daß nur die vertikal polarisierte Komponenten des emittierten Lichtes analysiert wird, kann die Polarisation der Fluoreszenz in dem Reaktionsgemisch genau bestimmt werden. Die genaue Beziehung zwischen Polarisation und zu bestimme-der Konzentration des Liganden kann zweckmäßigerweise bestimmt werden durch Messen der Polarisationswerte von Eichsubstanzen mit bekannten Konzentrationen. Die Konzentration des Liganden kann interpoliert werden aus einer auf diese Weise hergestellten Standardkurve.
Es wurde gefunden, daß die bestimmten erfindungsgemäß gebildeten Tracer sehr gute Tests produzieren, wie infra beschrieben.

Reagentien

Aufgabe bei der Konzipierung eines kompetitiven Bindungs- Immuntests für Flecainid ist es, eine ziemlich ausgeglichene Kompetition zwischen dem Arzneimittel Flecainid und dem Tracer um die Erkennungsstellen im Antikörper zu erstellen. Strukturen, die für Haptene und Tracer stark variieren, können zum Erreichen dieses Ziels nützlich sein. Für die Zwecke der Erfindung stellen "Haptene" Vorstufen für Immunogene dar, die im allgemeinen ein substituiertes Flecainid-Derivat umfassen, welches eine Gruppe trägt, die zur Bindung an einen immunologisch aktiven Carrier geeignet ist.

Antikörper

Die erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper werden hergestellt, indem in Kaninchen oder Schafen eine Reaktion gegenüber geeigneten Immunogenen hervorgerufen wird. Das Immunogen wird an die Tiere oder an in vitro-Kulturen aus immunkompetenten Zellen durch eine Reihe von Impfungen in einer den Fachleuten bekannten Weise verabreicht. selbstverständlich kann, obwohl Schafe die bevorzugten Immun-Wirte für die Flecainid-Immunogene darstellten, bei den hier beschriebenen Experimenten irgendein in vivo- oder in vitro-Wirt, der in der Lage ist, Antikörper zu produzieren, eingesetzt werden.

Struktur der Tracer

Die erfindungsgemäßen Tracer können durch die in Fig. 2 gezeigte allgemeine Strukturformel dargestellt werden.
Gemäß einer bevorzugten Form der Erfindung weist der Tracer die in Fig. 5 gezeigte Strukturformel auf.
Der Tracer ist ein Flecainid-Derivat, das mit einem Fluorescein-Derivat verbunden ist, beispielsweise einer Amido-, Aimidino-, Triazinylamino-, Carbamido-, Thiocarbamido-, Carbamoyl-, Sulfonamido- oder Sulfonylcarbamoylgruppe, wie in Fig. 4 gezeigt. Die Tracer werden hergestellt durch Verknüpfen des geeigneten Fluorescein-Derivats mit einem Flecainid-Derivat, das eine Amino-, Carbonsäure-, Sulfonsäure-, Hydroxy-, Imidat-, Hydrazid-, Isocyanat-, Chloroformat- oder Chlorsulfonylcarbamoylgruppe enthält, wie es im Zusammenhang mit dem Syntheseverfahren und den unten angeführten Beispielen erläutert wird.
Beispielsweise kann irgendeines der folgenden Fluorescein- Derivate verwendet werden:
F1-NH&sub2; Fluoreszeinamin
F1-CO&sub2;H Carboxyfluorescein
F1-NHCOCH&sub2;I α-Iodacetamidofluorescein
F1-NHCOCH&sub2;Br α-Bromacetamidofluorescein
2,4-Dichlor-1,3,5-triazin-2- ylamino-Fluorescein (DTAF)
4-Chlor-6-methoxy-1,3,5-triazin-2- ylamino-Fluorescein

Synthese von Tracern

Die erfindungsgemäßen Tracer werden hergestellt durch Kuppeln einer Fluorescein-Gruppierung oder eines Fluorescein-Derivats an die in Fig. 2 gezeigte allgemeine Struktur, worin Q Wasserstoff, Hydroxyl oder eine Abgangsgruppe bedeutet.
Die Fluorescein-Gruppierung kann über eine Amid-, Amidin-, Harnstoff-, Carbamat-, Sulfonamid-, Triazinylamino- oder Sulfonylcarbamatbindung, wie in Fig. 4 gezeigt, mit der Amino-, Carboxyl-, Imidat- oder Alkoxy-funktionellen Gruppe verknüpft werden. Gemäß der derzeit bevorzugten Ausführungsform ist das Fluorescein-Derivat Dichlortriazinylaminofluorescein (DTAF) (Isomeres I), erhältlich von Research Organics, Cleveland, Ohio. Dieses wird mit einer in Fig. 2 gezeigten Vorstufe gekuppelt (worin R=(CH&sub2;)&sub3;, Z=NH und Q=H).
DTAF wird mit dem Aminoalkylderivat von Flecainid gekuppelt, indem die zwei Verbindungen in Methanol bei einer Temperatur zwischen etwa 0ºC und dem Siedepunkt des Lösungsmittels gerührt werden. Die basischen Verbindungen, wie Triethylamin, können gegebenenfalls zugegeben werden und insbesondere, wenn ein Salz (wie das Hydrochlorid oder Acetat) der Aminvorstufe bei der Reaktion eingesetzt wird. Weitere Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, können verwendet werden. Geeignete Tracer können aus einer Reihe von Flecainid-Derivaten hergestellt werden.
Alle Flecainid-Derivate, die eine endständige Aminogruppe aufweisen, wie Amino, Hydrazinyl oder Hydrazido, werden mit Carboxyfluorescein gemäß dem aktiven Esterverfahren oder dem gemischten Anhydridverfahren gekuppelt und an DTAF oder Alkoxychlortriazinylaminofluorescein gekuppelt, indem die beiden Materialien einfach in Lösung vermischen werden. Die Aminogruppe kann durch Umsetzen mit Phosgen in die Isocyanatgruppe umgewandelt werden. Diese wird dann mit Aminofluorescein kondensiert, um den Tracer herzustellen.
Flecainid-Derivate mit einer endständigen Mercaptogruppe werden in einem inerten Lösungsmittel mit α- Bromacetamidofluorescein oder α-Iodacetamidofluorescein gekuppelt.
Alle Flecainid-Derivate, die endständige Carbonsäuregruppe aufweisen, wie eine Carbonsäure oder (Aminohydroxy)alkylcarbonsäure, werden gemäß dem aktiven Esterverfahren oder den gemischten Anhydridverfahren gekuppelt.
Alle Flecainid-Derivate, die eine endständige Hydroxygruppe aufweisen, können mit Fluorescein in Lösung gekuppelt werden durch Umsetzen mit DTAF, α-Iodacetamidofluorescein oder α-Bromacetamidofluorescein. Die Hydroxygruppe kann durch Umsetzen mit Chlorsulfonylisocyanat bzw. Phosgen in die Chlorsulfonylcarbamoyl- oder Chlorformiatgruppe umgewandelt werden. Diese Derivate werden dann in Lösung mit Aminofluorescein gekuppelt, um den Tracer herzustellen.
Sulfonsäurederivate von Flecainid werden in die entsprechenden Sulfonylchloride umgewandelt durch Umsetzen mit einem Chlorierungsmittel, wie Thionylfluorid, Phosphorylchlorid oder Phosphorpentachlorid.
Die Sulfonylhalogenide werden dann mit Aminofluoresceinen oder anderen Fluorescein-Derivaten, die reaktive Aminogruppen tragen umgesetzt, im allgemeinen in Gegenwart einer zugegebenen basischen Verbindung, um die Tracer zu ergeben.
Flecainid-Derivate, die eine endständige Nitrilgruppe aufweisen, werden in wasserfreiem Alkohol in Gegenwart von Chlorwasserstoffgas in die Imidate übergeführt. Das Imidat wird dann in Lösung mit Fluoreszeinamin gekuppelt, um den Tracer herzustellen.

Test

Es wurde gefunden, daß die bestimmten erfindungsgemäßen Tracer die Flecainidkonzentrationen im Serum und Plasma genau und spezifisch messen. Fig. 1 zeigt die Struktur des Arzneimittels Flecainid, welches erfindungsgemäß quantitativ bestimmt werden kann. Der erfindungsgemäße Test liefert ein schnelleres und zweckmäßigeres Flecainid-Testverfahren als die Verfahren der herkömmlichen Technik, da es vor der Analyse keine Behandlung der Probe erfordert, die Reagentien chemisch und thermisch stabil sind, das Testsystem eine minimale Kreuzreaktivität gegenüber Flecainid-artigen Verbindungen aufweist und da es wegen seiner Einfachheit schnell mit einer hochautomatisierten Vorrichtung durchgeführt werden kann.
Gemäß den analytischen erfindungsgemäßen Verfahren, d. h. den Verfahren zur Bestimmung von Flecainid durch ein Fluoreszenz-Immuntestverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Tracerverbindungen, wird eine Probe, die Flecainid enthält oder von der vermutet wird, daß sie Flecainid enthält, mit einem biologisch verträglichen Salz eines Tracers und eines Antikörpers vermischt, der auf Flecainid und den Tracer spezifisch ist. Flecainid und der Tracer konkurrieren um eine begrenzte Anzahl von Antikörper-Bindungsstellen, was zur Bildung der Komplexe führt. Da die Konzentration von Tracer und Antikörper konstant gehalten wird, ist das Verhältnis des Flecainid- Antikörper-Komplexes zu dem gebildeten Tracer-Antikörper- Komplex direkt proportional zu der Menge an Flecainid in der Probe. Darum ist es möglich, durch Anregung des Gemisches mit linear polarisiertem Licht und Messen der Polarisation der von einem Tracer und einem Tracer- Antikörper-Komplex emittierten Fluoreszenz die Menge an Flecainid in der Probe quantitativ zu bestimmen.
Die Ergebnisse können quantitativ angegeben werden durch die Netto-Millipolarisationseinheiten, die Polarisationsspanne (in Millipolarisationseinheiten) und die relative Intensität. Die Bestimmung der Millipolarisationseinheiten zeigt die maximale Polarisation an, wenn eine maximale Menge des Tracers an den Antikörper in Abwesenheit irgendeines Flecainid gebundenen wird. Je größer die Netto-Millipolarisationseinheiten, desto besser ist die Bindung des Tracers an den Antikörper. Die Polarisationsspanne ist eine Angabe für den Unterschied zwischen der Netto-Millipolarisation an den Punkten der maximalen und minimalen Menge des an den Antikörper gebundenen Tracers. Eine große Polarisationsspanne sorgt für eine bessere numerische Analyse der Daten. Die Intensität ist ein Maß für die Stärke des Signals über dem Hintergrund. Somit wird für die bevorzugten erfindungsgemäßen Tracer eine höhere Intensität bei etwa 0,5 bis 2,5 nmol als Summe der vertikal polarisierten Intensität plus zweimal der horizontal polarisierten Intensität gemessen. Die Intensität des Tracersignals kann im Bereich von etwa dreimal bis etwa dreißig mal des Signals des Hintergrundrauschens liegen, je nach Konzentration des Tracers und der weiteren Testvariablen. Für die Zwecke der Erfindung wird eine Intensität bevorzugt, die mindestens fünfmal über der des Hintergrundrauschens liegt, je nach Konzentration des Tracers und der weiteren Testvariablen. Für die Zwecke der Erfindung wird eine Intensität von mindestens fünfmal der des Hintergrundrauschens bevorzugt.
Tabelle I zeigt die gemäß den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung erhaltenen Ergebnisse, in bezug auf Polarisationsspanne, Millipolarisationseinheiten und Intensität. In allen Fällen wurde das verwendete Antiserum in Schafen produziert. Wie aus diesen Daten ersichtlich ist, liefert ein Test, welcher durchgeführt wird unter Verwendung des Tracers aus Fig. 5, ausgezeichnete Ergebnisse und wird derzeit am meisten bevorzugt. Darüber hinaus lieferten die in den Fig. 16 und 21 dargestellten Tracer ebenfalls annehmbare Ergebnisse und sind so als Alternative bevorzugte Tracer. TABELLE I Tracer Netto-Polarisation* Polarisationsspanne* Intensität* * in Millipolarisationseinheiten ** ausgedrückt als Verhältnis von Nettointensität zu Hintergrundrauschen
Der pH-Wert, bei dem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, muß ausreichen, um es der Fluoreszein- Gruppierung der Tracer zu ermögliche, in der offenen Form vorzuliegen. Der pH-Wert kann im Bereich von 3 bis 12 liegen, mehr bevorzugt im Bereich von 5 bis 10 und am meisten bevorzugt im Bereich von 6 bis 9. Verschiedene Puff er können verwendet werden, um den pH-Wert zu erzielen und während des Testverfahrens beizubehalten. Beispielhafte Puffer schließen ein Borat, Citrat, Acetat, Phosphat, Carbonat, Tris und Barbital.
Der bestimmte Puffer, der verwendet wird, ist für die Erfindung nicht kritisch, jedoch werden Tris- und Phopshatpuffer bevorzugt. Der Kationenteil des Puffers bestimmt im allgemeinen den Kationenteil des Tracersalzes in Lösung.
Das bevorzugte Verfahren des verbesserten, erfindungsgemäßes Tests wird nun ausführlich erläutert. Der Test ist ein "homogener Test", was bedeutet, daß die abgelesenen Endpolarisationswerte aus einer Lösung genommen wurden, in der der gebundene Tracer nicht von dem ungebundenen Tracer getrennt wird. Dies stellt einen deutlichen Vorteil dar im Vergleich zu den heterogenen Immuntestverfahren, bei denen der gebundene Tracer von dem ungebundenen Tracer abgetrennt werden muß, bevor abgelesen werden kann.
Die Reagentien für den erfindungsgemäßen Fluoreszenz- Polarisationstest umfassen Antikörper, die spezifisch sind für Flecainid und den Tracer. Zusätzlich werden zweckmäßigerweise weitgehend herkömmliche Lösungen hergestellt, die einschließen eine Flecainid-Vorbehandlungslösung, einen Verdünnungspuffer, Flecainid-Eichsubstanzen und Flecainid- Kontrollsubstanzen. Typische Lösungen dieser Reagentien, von denen einige hier beschrieben werden, sind käuflich erhältlich als Test-"Kits" bei Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois.
Alle hier angegebenen Prozentangaben sind, wenn-nicht anders angegeben, in Gewicht/Volumen angegeben. Die Tracerformulierung, die derzeit bevorzugt wird, ist 82 nmol Tracer in 0,1 M Tris-Puffer bei pH 5,5, 5 % 5-Sulfosalicylat und 0,1 % Natriumazid. Die Antiserumformulierung umfaßt Schaf-Antiserum, verdünnt mit 1 % normalem Schaf- Antiserum (Volumen/Volumen) und 0,1 % Natriumazid. Der Verdünnungspuffer umfaßt 0,1 M Natriumphosphat bei pH 7,5, 0,1 % Natriumazid und 0,01 % Rinder-gamma-Globulin. Die Vorbehandlungsformulierung umfaßt 0,1 M Tris-Puffer bei pH 5,5, 5 % 5-Sulfosalicylat und 0,1 % Natriumazid. Eichsubstanzen, die Flecainid in einem normalen Human-Serum in Konzentrationen von 0,0, 0,1, 0,25, 0,50, 1,0 und 1,5 mg pro Liter mit 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel enthalten, sind geeignet. Kontrollen, die Flecainid in einem normalen Human-Serum enthalten, werden bereitgestellt in Konzentrationen von 0,15, 0,60 und 1,20 mg pro Liter mit 0,1 % Natriumazid als Konservierungsstoff.
Das bevorzugte Verfahren ist besonders zur Verwendung in Verbindung mit dem TDx®-Polarisationsanalysator von Abbott konzipiert, der erhältlich ist von Abbott Laboratories, Irving, Texas. 50 ul Serum oder Plasma sind erforderlich. Die Eichsubstanzen, Kontrollen oder die unbekannten Proben werden direkt in die Probenvertiefung der TDx®-Probenpatrone pipettiert. Einer der Vorteile dieses Verfahrens ist, daß die Probe keine spezielle Präparation erfordert. Wird ein TDx®-Flecainid-Testkit mit dem TDx®-Analysator verwendet, so werden die Proben direkt in ein Probenkarussell gegeben, die Deckel von jedem der drei Reagensbehälter in dem Kit werden entfernt und in die dafür bestimmten Vertiefungen in dem TDx®-Analysator gegeben. Von diesem Punkt an ist das Testverfahren vollautomatisch.
Wird ein manueller Test durchgeführt, so wird die Probe mit der Vorbehandlungslösung in Verdünnungspuffer vermischt und ein Hintergrundwert wird abgelesen. Der Tracer wird dann mit dem Testgemisch vermischt. Der Antikörper wird schließlich zu der Testlösung zugemischt. Nach dem Inkubieren wird der Wert der Fluoreszenz-Polarisation abgelesen.
Der Fluoreszenz-Polarisationswert jeder Eichsubstanz, Kontrolle oder Probe wird bestimmt und kann auf den Ausgabestreifen eines Instruments, wie eines TDx®-Polarisationsanalysators von Abbott, gedruckt werden. Es wird mit dem Instrument eine Standardkurve hergestellt, indem die Polarisation einer jeden Eichsubstanz gegen ihre Konzentration unter Verwendung der nicht linearen Regressionsanalyse ausgedruckt wird. Die Konzentration jeder Kontrolle oder der Probe wird aus der gespeicherten Eichkurve abgelesen und auf den Ausgabestreifen gedruckt.
Unter Berücksichtigung der zuvor genannten bevorzugten Verfahrensweise sollte angemerkt werden, daß Tracer, Antikörper, Vorbehandlungslösung, Eichsubstanzen und Kontrollen zwischen 2 und 8ºC aufbewahrt werden sollten, während der Verdünnungspuffer bei Umgebungstemperatur aufbewahrt werden sollte. Eine Standardkurve und die Kontrollen sollten alle zwei Wochen hergestellt werden, wobei jede Eichsubstanz und Kontrolle in doppelter Ausführung hergestellt wird. Die Kontrollen sollten täglich gemessen werden. Alle Proben können in wiederholter Ausführung gemessen werden, wenn es gewünscht wird.

BEISPIELE

Die Beispiele 1 bis 19 beschreiben Experimente, die gemäß den Konzepten der Erfindung durchgeführt worden sind.

Beispiel 1

Herstellung des Tracers aus Fig. 6

Flecainidacetat (9,5 mg) und 2-(Fluorescein-5-yl)-amino- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin (8,5 mg) wurden in 0,15 ml Methanol aufgelöst und bei Umgebungstemperatur 3 1/2 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde direkt auf eine Dünnschichtplatte aus Silicagel aufgestrichen und mit Chloroform-Methanol chromatographiert, um den Tracer zu ergeben.

Beispiel 2

Herstellung des Tracers aus Fig. 7

Flecainidacetat (9,5 mg) und 2-(Fluorescein-6-yl)amino-4,6- dichlor-1,3,5-triazin (8,0 mg) wurden in 0,15 ml Methanol aufgenommen und bei Umgebungstemperatur 16 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Dünnschichtplatte aus Silicagel aufgestrichen und mit Chloroform-Methanol chromatographiert, um den Tracer zu ergeben.

Beispiel 3

Herstellung des Tracers aus Fig. 8

Flecainidacetat (23,7 mg), 5-Bromacetamidofluorescein (15,6 mg) und Triethylamin (0,0116 ml) wurden in 0,25 ml Methanol aufgelöst und bei Umgebungstemperatur 48 Stunden lang gerührt. Das Produkt wurde isoliert durch Chromatographie auf einer Dünnschicht-Silicagelplatte, die mit Chloroform- Methanol entwickelt wurde.

Beispiel 4

Herstellung des Tracers aus Fig. 9

Flecainidhemisuccinamid (25,7 mg), Triethylamin (0,0066 ml) und Isobutylchloroformat (6,8 mg) wurden in 0,4 ml Diemethylformamid, welches in einem Eisbad gekühlt wurde, aufgelöst und 1 Stunde lang gerührt. Die Lösung der aktivierten Vorstufe wurde in zwei Teile aufgeteilt. 5-Aminofluorescein (8,7 mg) wurde zu einem Teil hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur aufgewärmt. Das Rühren wurde 14 Stunden lang fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde auf Dünnschicht-Silicagelplatten mit Chloroform-Methanol und nochmals mit Benzol-Ethylacetat-Aceton chromatographiert, um den reinen Tracer zu ergeben.

Beispiel 5

Herstellung des Tracers aus Fig. 10

Eine Hälfte der Lösung der in Beispiel 4 hergestellten aktivierten Vorstufe wurde bei Umgebungstemperatur mit 8,7 mg 6-Aminofluorescein 15 Stunden lang gerührt. Dimethylformamid wurde in vacuo entfernt. Der Rückstand wurde auf Dünnschicht-Silicagelplatten mit Chloroform- Methanol und nochmals mit Benzol-Ethylacetat-Aceton chromatographiert, um den Tracer zu ergeben.

Beispiel 6

Herstellung des Tracers aus Fig. 11

Die Flecainid-haltige Vorstufe (0,02 mmol) und 6-(N- Succinimidyloxycarbonyl)-Fluorescein (11,8 mg) wurden in 0,35 ml Diemthylformamid 4 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde auf Dünnschicht-Silicagelplatten mit Chloroform-Methanol und nochmals mit Benzol- Ethylacetat-Aceton chromatographiert, um den Tracer zu ergeben.

Beispiel 7

Herstellung des Tracers aus Fig. 12

Diese Verbindung wurde hergestellt gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 aus 0,02 mmol der geeigneten Flecainid-haltigen Vorstufe und 11,8 mg 5-(N-Succinimidyloxycarbonyl)- Fluorescein, wobei zuerst eine Chromatographie mit Benzol- Ethylacetat-Hexan und dann mit chloroform-Methanol durchgeführt wurde.

Beispiel 8

Herstellung des Tracers aus Fig. 13

Die Flecainid-haltige Vorstufe (0,02 mmol) und 2- (Fluorescein-6-yl-amino)-4,6-dichlor-1,3,5-triazin wurden in 0,40 ml Methanol aufgenommen und bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Dünnschicht-Silicagel gereinigt, wobei mit Chloroform- Methanol und Benzol-Ethylacetat-Aceton entwickelt wurde.

Beispiel 9

Herstellung des Tracers aus Fig. 14

Die Verbindung wurde hergestellt gemäß dem Verfahren aus Beispiel 8 aus 0,02 mmol der geeigneten Flecainid-haltigen Vorstufe und 13,3 mg 2-(Fluorescein-5-yl-amino-4,6-dichlor- 1,3,5-triazin in 0,20 ml Methanol. Die chromatographische Reinigung erfolgte mit Chloroform-Methanol.

Beispiel 10

Herstellung des Tracers aus Fig. 15

Diese Verbindung wurde hergestellt gemäß dem Verfahren aus Beispiel 6 aus 0,02 mmol der geeigneten Flecainid-haltigen Vorstufe und 11,8 mg 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)- Fluorescein in 0,25 ml Dimethylformamid.

Beispiel 11

Herstellung des Tracers aus Fig. 16

Diese Verbindung wurde hergestellt gemäß dem Verfahren aus Beispiel 8 aus 0,02 mmol der geeigneten Flecainid-haltigen Vorstufe und 13,3 mg 2-(Fluorescein-6-yl-amino)-4,6- dichlor-1,3,5-triazin in 0,20 ml Methanol.

Beispiel 12

Herstellung des Tracers aus Fig. 17

Diese Verbindung wurde hergestellt gemäß dem Verfahren aus Beispiel 6 aus 0,02 mmol der geeigneten Flecainid-haltigen Vorstufe und 11,8 mg 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)- Fluorescein in 0,20 ml Dimethylformamid. Die Chromatographie wurde mit Chloroform-Methanol durchgeführt.

Beispiel 13

Herstellung des Tracers aus Fig. 184

Die Verbindung wurde hergestellt gemäß dem Verfahren aus Beispiel 6 aus 0,02 mmol der geeigneten Flecainid-haltigen Vorstufe und 11,8 mg 6-(N-Succinimidyl-oxycarbonyl)- Fluorescein in 0,20 ml Diemethylformamid. Die Chromatographie erfolgte mit Chloroform-Methanol.

Beispiel 14

Herstellung des Tracers aus Fig. 19

Ein Gemisch aus 0,02 mmol der Flecainid-haltigen Vorstufe und 13,2 mg 2-(Fluorescein-5-yl-amino)-4-methoxy-6-chlor- 1,3,5-triazin in 0,50 ml Methanol wurde gerührt und in einem 50ºC warmen Ölbad 6 1/2 Stunden lang erwärmt. Das rohe Reaktionsgemisch wurde auf eine Dünnschicht-Silicagelplatte aufgestrichen und mit Chloroform-Methanol entwickelt, um den reinen Tracer zu ergeben.

Beispiel 15

Herstellung des Tracers aus Fig. 20

Diese Verbindung wurde hergestellt gemäß dem Verfahren aus Beispiel 14 aus 0,02 mmol der Flecainid-haltigen Vorstufe und 13,2 mg 2-(Fluorescein-5-yl-amino)-4-methoxy-6-chlor- 1,3,5-triazin. Die Chromatographie erfolgte mit Chloroform- Methanol und Benzol-Ethylacetat-Aceton.

Beispiel 16

Herstellung des Tracers aus Fig. 21

Ein Gemisch aus N-(3-Aminopropyl)-flecainid und 5,3 mg 2- (Fluorescein-6-yl-amino-4,6-dichlor-1,3,5-triazin wurde bei Umgebungstemperatur in 0,20 ml Methanol 24 Stunden lang gerührt. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silicagel-Dünnschichtplatten mit Chloroform-Methanol und Benzol-Ethylacetat-Aceton gereinigt.

Beispiel 17

Herstellung des Tracers aus Fig. 5

Diese Verbindung wurde hergestellt gemäß dem Verfahren aus Beispiel 16, außer daß das 5-Isomere anstelle des 6-Isomeren des fluoreszierenden Markierungsreagens eingesetzt wurde.

Beispiel 18

Herstellung des Tracers aus Fig. 22

N-(3-Aminopropyl)-flecainid (4,7 mg) und 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)-Fluorescein (4,7 mg) wurden in 0,20 ml Diemethylformamid 24 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde auf einer Dünnschicht-Silicagelplatte mit Chloroform- Methanol chromatographiert, worauf sich eine zweite Chromatographie auf einer C&sub1;&sub8;-Reversed-Phase-Platte anschloß, die mit Wasser-Methanol, enthaltend 0,5 % Essigsäure, entwickelt wurde.

Beispiel 19

Herstellung des Tracers aus Fig. 23

Diese Verbindung wurde hergestellt gemäß dem Verfahren von Beispiel 18, außer daß das 5-Isomere von aktiviertem Carboxyfluorescein anstelle des 6-Isomeren eingesetzt wurde. Die Reinigung erfolgte durch zweimalige Chromatographie auf Silicagelplatten mit Chloroform- Methanol.

CHARAKTERISIERUNG DER FLECAINID TRACER

Tracer aus Fig. 5

Ultraviolett-Absorptionsspektrum λ max = 494 nm Massenspektrum (FAB-Verfahren): (M+H)+ = 930 amu NMR-Spektrum (300 MHz in CD&sub3;OD): δ 1,4 bis 1,8 ppm, m, 8H; 2,3, m, 1H; 2,6, m, 2H; 3,05, m, 4H; 4,4 bis 4,7, m, 4H; 6,6, m, 4H; 7,05 bis 7,2, m, 6H; 7,35, m, 1H; 7,45, d, 1H; 7,9, t, 1H.

Tracer aus Fig. 10

Ultraviolett-Absorptionspektrum: λ max = 494 nm

Tracer aus Fig. 11

Ultraviolett-Absorptionspektrum λ max = 498,7 nm

Tracer aus Fig. 15

Ultraviolett-Absorptionspektrum λ max = 499,7 nm

Tracer aus Fig. 16

Ultraviolett-Absorptionspektrum λ max = 495,5 nm

Tracer aus Fig. 21

Massenspektrum (FAB-Verfahren): (M+H)+ = 930 amu, (M+Na)+ = 952 amu, (M+2Na)+ = 974 amu. NMR-Spektrum (300 MHz in CD&sub3;OD): δ 1,4 ppm, m, 4H; 1,65, m, 4H; 2,05, m, 1H; 2,25, m, 2H; 2,7, m, 2H; 3,05, m, 4H; 4,4 bis 4,6, m, 4H; 6,55, m, 4H; 6,55, m, 4H; 7,05 bis 7,15, m, 6H; 7,4, d, 1H.

Claims

1. Verbindung, die der folgenden Struktur entspricht:

worin Z für NH oder CO steht und zusammen mit R eine Gruppe RZ bildet, die ausgewählt ist aus

Q Fluoresceinyl bedeutet.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin Q-Z (Fluorescein-5-yl)amino bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin Q-Z (Fluorescein-6-yl)amino bedeutet.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin Q-Z (Fluorescein-5-yl)carbonyl bedeutet.

5. Verbindung nach Anspruch 1, worin Q-Z (Fluorescein-6-yl)carbonyl bedeutet.

6. Verbindung nach Anspruch 1, worin -R-Z-Q die folgende Struktur aufweist:

7. Verbindung nach Anspruch 1, worin -R-Z-Q die folgende Struktur aufweist:

8. Verfahren zur Messung der Konzentration von Flecainid in einer wäßrigen Lösung, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) Kontakt in einer wäßrigen, gepufferten Lösung einer Probe mit einem Flecainid-Antiserum und einer Verbindung nach Anspruch 1, die in der Lage ist, bei Vorliegen des Flecainid-Antiserums eine detektierbare Fluoreszenz-Polarisationsantwort zu produzieren;

b) Hindurchschicken von linear polarisiertem Licht durch die in Stufe 1 erhaltene Lösung um a) eine Fluoreszenz-Polarisationsantwort zu erhalten; und

c) Detektieren der Fluoreszenz-Polarisationsantwort der Lösung aus Stufe b) als Maß für die Menge an Flecainid in der Probe.