DE3245854C2

DE3245854C2 - Aminofluorescein-Derivate und ihre Verwendung als Tracer zur Bestimmung von Liganden in biologischen Flüssigkeiten mittels einer Fluoreszenzpolarisationstechnik

Info

Publication number: DE3245854C2
Application number: DE3245854A
Authority: DE
Inventors: Chao-Huei Jeffrey Wang; Stephen Denham Stroupe; Michael Ernest Jolley
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1981-12-11
Filing date: 1982-12-10
Publication date: 1996-11-14
Anticipated expiration: 2002-12-11
Also published as: BE895300A; JPS58113189A; AU9088082A; CA1248086A; FR2518096B1; IT8224689A1; GB2111491B; GB2111491A; IT1155424B; DE3245854A1; FR2518096A1; AU558800B2; NZ202613A; IT8224689A0

Description

Die Erfindung betrifft Aminofluorescein-Derivate und ihre Verwendung als Tracer zur Bestimmung von Liganden in biologischen Fluids bzw. Flüssigkeiten, wie Serum, Plasma, Spinalflüssigkeit, Amnionflüssigkeit und Urin durch Fluoreszenzpolarisationstechnik. Die Fluoreszenzpolarisations- Immunassayverfahrensweise der Erfindung kombiniert die spezifische Natur eines Immunassays mit der Geschwindig keit und Zweckmäßigkeit der Fluoreszenz-Polarisations technik zur Bereitstellung eines mittels zur Bestimmung der Menge eines in einer Probe vorhandenen spezifischen Liganden.

Immunassays auf der Basis konkurrierender Bindungen (kompetitive Bindungs-Immunassays) zur Messung von Li ganden basieren auf der Konkurrenz zwischen einem Ligan den in einer Testprobe und einem markierten Reagens, das als ein Tracer bezeichnet wird, um eine begrenzte Anzahl von Rezeptor-Bindungsstellen auf Antikörpern, die für den Liganden und Tracer spezifisch sind. Die Konzentration des Liganden in der Probe bestimmt die Menge an Tracer, die spezifisch an einen Antikörper ge bunden wird. Die Menge an Tracer-Antikörper-Konjugat, die gebildet wird, kann quantitativ gemessen werden und ist umgekehrt proportional zu der Menge des Liganden in der Testprobe.

Im allgemeinen basieren Fluoreszenz-Polarisationstech niken auf dem Prinzip, daß eine fluoreszierende Mar kierungs-Verbindung bei der Anregung mit linear polari siertem Licht Fluoreszenz mit einem Polarisationsgrad emittiert, der in umgekehrter Beziehung zu ihrem Rotationsausmaß steht. Wird daher ein Molekül wie ein Tracer-Antikörper-Konjugat mit einer fluoreszierenden Markierung durch linear polarisiertes Licht angeregt, so verbleibt das emittierte Licht hochpolarisiert, da der Fluorophor gezwungen wird, zwischen der Zeit der Absorption von Licht und der Emission zu drehen. Wird eine "freie" Tracerverbindung (d. h. nicht an einen Antikörper gebunden) durch linear polarisiertes Licht angeregt, so erfolgt ihre Drehung wesentlich rascher als beim entsprechenden Tracer-Antikörper-Konjugat und die Moleküle werden zufallsweise orientiert, daher ist das emittierte Licht depolarisiert. Somit ergibt die Fluoreszenzpolarisation ein quantitatives Maß für die Messung der Menge des gebildeten Tracer-Antikörper- Konjugats bei einem konkurrierenden Bindungsimmunassay.
Dichlortriazinylaminofluorescein und seine Verwendung für Immunofluoroszenzassays mit Liganden mit einem Molekulargewicht von über 20 000 ist aus Chemical Abstracts Vol. 70, 79127y (1969), Vol. 88, 2669r (1978) und Vol. 86, 69872d (1977) bekannt. Die Kopplung niedermolekularer Liganden über eine SCN-Brücke an Fluorescein für Immunofluoreszenzassays ist in US-PS 3998943 beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind dort jedoch nicht beschrieben.

Gegenstand der Erfindung ist eine Verbindung der Formel

worin X eine Gruppe darstellt, ausgewählt aus der Klasse einer Oxalylgruppe mit der Formel

einer Sulfonylgruppe mit der Formel

und einer Carboamidosulfonylgruppe mit der Formel

und worin R ein Ligandenanaloges ist, das ausgewählt ist aus, falls

ist

-Lidocain der Formel einschließlich der Isomerengemische,
- Phenytoin der Formel
-Primidon der Formel worin R′ Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist, und falls ist,
- Nortriptylin der Formel
- Desipramin der Formel
- Carbamazepin der Formel
- Thyroxin der Formel und und, falls ist,
- Carbamazepin der Formel über Hydroxysauerstoff oder reaktives Amin gebundenes Thyroxin,
- Propranolol der Formel
- Procainamid der Formel und und biologisch brauchbare Salze davon.

Bevorzugt ist eine Verbindung der Formel

oder

wobei R und X die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben und biologisch brauchbare Salze davon.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung von Liganden in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man mit der Probe ein biologisch brauchbares Salz einer Tracer- Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 und einen Antikörper, der zur spezifischen Erkennung des Liganden und des Tracers geeignet ist, ver mischt und anschließend die Menge an Tracer, die an den Antikörper gebunden ist, durch Fluoreszenz- Polarisationstechniken als Maß für die Menge des Liganden in der Probe, bestimmt.

Die Methoden und Tracer der Erfindung sind besonders brauchbar bei der quantitativen Überwachung therapeutischer Arzneimittelkonzentrationen in Serum und Plasma.

Die erfindungsgemäßen Tracer liegen im allgemeinen in einem Gleichgewicht zwischen ihren Säurezuständen und ionisierten Zuständen vor und sind im ionisierten Zu stand beim erfindungsgemäßen Verfahren wirksam. Daher umfaßt die Erfindung die Tracer sowohl in der sauren Form als auch in der ionisierten Form und aus Zweck mäßigkeitsgründen werden die erfindungsgemäßen Tracer strukturell in ihrer sauren Form dargestellt. Wenn die erfindungsgemäßen Tracer im ionisierten Zustand vor liegen, liegen die Tracer in der Form biologisch brauch barer Salze vor. Der hier verwendete Ausdruck "biologisch brauchbare Salze" bezieht sich auf Salze, wie von Natrium, Kalium, oder Ammonium, die es den erfindungsgemäßen Tracern ermöglichen im ionisierten Zustand bei der An wendung beim erfindungsgemäßen Verfahren vorzuliegen. Im allgemeinen liegen die erfindungsgemäßen Tracer in Lösungen als Salze vor, wobei das spezielle Salz von dem verwendeten Puffer resultiert, z. B. liegen in Anwesen heit eines Natriumphosphatpuffers die erfindungsgemäßen Tracer im allgemeinen im ionisierten Zustand als Natrium salz vor.

Der hier verwendete. Ausdruck "Liganden-Analogon" be zieht sich auf einen ein- oder mehrwertigen Rest wie oben definiert, von dem ein wesentlicher Anteil die gleiche räumliche oder polare Organisation wie der Ligand aufweist, zur Definition ein oder mehrerer Determinanten oder epitoper Stellen, die zur Konkurrenz mit dem Liganden für die bindenden Stellen eines Rezeptors geeignet sind. Ein Charakteristikum für ein derartiges Liganden-Analogon liegt darin, daß es eine ausreichende Strukturähnlich keit mit dem interessanten Liganden aufweist, so daß es durch den Antikörper für den Liganden erkannt werden kann. Zum größten Teil weist das Liganden-Analogon die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Struktur und Ladungsverteilung (räumliche und polare Organisation) wie der interessante Ligand für einen beträchtlichen Teil der Moleküloberfläche auf. Da häufig die bindende Stelle für ein Hapten die gleiche ist wie bei der Her stellung des Antigens zur Erzeugung von Antikörpern, wie die zur Bindung des Liganden verwendete, wird der gleiche Teil des Liganden-Analogons, der die Schablone für den Antikörper bereitstellt, durch das Liganden- Analogon in dem Tracer exponiert.

Wenn X eine Sulfonylgruppe

ist, leitet sich die Klasse der Liganden-Analoga, die durch R (gemäß der oben angegebenen Definition) dargestellt wird, von dem entsprechenden Ligan den ab durch Entfernen eines aromatischen Wasserstoffs, d. h. eines Wasserstoffs, der an einen aromatischen Kohlenstoff, vorzugsweise einen Phenylkohlenstoff, gebunden ist, oder durch Bildung eines Phenyl- oder substituierten Phenylderivats des Liganden. Außerdem kann ein Ligand strukturell modifiziert werden durch Zusatz oder Wahl einer oder mehrerer funktioneller Gruppen, unter Bildung eines Liganden-Analogons, unter Beibehaltung der not wendigen Epitop-Stellen für die Bindung an einen Anti körper. Es ist jedoch bevorzugt, daß derartige modifi zierte Liganden-Analoga an den Sulfonylaminofluoreszein rest durch einen aromatischen Kohlenstoff gebunden ist.

Wenn X eine Oxalylgruppe

ist, leitet sich die Klasse der Liganden-Analoga, die durch R (gemäß der oben angegebenen Definition) dargestellt wird, von dem entsprechenden Liganden ab durch Entfernen eines Wasserstoffatoms, das an ein reaktives Amin gebunden ist, d. h. eines Wasserstoffatoms, gebunden an ein primäres oder sekundäres Amin, oder durch Bildung eines Aminderivats des Liganden, in dem eine Iminogruppe

ein oder mehrere Atome, die ursprünglich in dem Liganden vorhanden waren, an der Stelle der Bindung an einen Oxalylaminoflureszeinrest ersetzt. Beispiele für Ligan den, die bei Entfernung eines Wasserstoffs an ein reak tives Amin von einem durch R dargestellten Liganden- Analogon binden, umfassen beispielsweise Procainamid und Thyroxin. Zusätzlich kann ein Ligand strukturell durch Addition oder Entfernung einer oder mehrerer funk tioneller Gruppen unter Bildung eines Liganden-Analogons modifiziert werden, wobei die notwendigen Epitop-Stellen zur Bindung an einen Antikörper beibehalten werden. Es ist jedoch bevorzugt, daß derartig modifizierte Liganden- Analoga an den Oxalylaminofluoreszeinrest durch eine Iminogruppe gebunden sind.

Wenn X eine Carboamidosulfonylaminogruppe

darstellt, leitet sich die Klasse von Liganden-Analoga, die durch R (gemäß der oben angegebenen Definition) dargestellt wird, von dem entsprechenden Liganden ab durch Entfernen eines reaktiven Wasser stoffatoms, d. h. eines Wasserstoffatoms, das an einen Hydroxysauerstoff oder ein reaktives Amin (primär oder sekundär) gebunden ist, oder durch Bildung eines Amin derivats des Liganden, worin eine Iminogruppe

ein oder mehrere Atome, die ursprünglich in dem Liganden vorhanden waren, an der Stelle der Bildung an einen Carbo amidosulfonylaminofluoreszeinrest ersetzt. Beispiele für Liganden, die bei Entfernung eines reaktiven Wasser stoffs ein Liganden-Analogon bilden können, das durch R dargestellt wird, umfassen beispielsweise Procainamid, Thyroxin und Chinidin. Zusätzlich kann ein Ligand strukturell modifiziert werden durch Zusatz oder Entfernung einer oder mehrerer funktioneller Gruppen unter Bildung eines Liganden-Analogons, wobei die notwendigen Epitop-Stellen zur Bindung an einen Antikörper beibehalten werden. Es ist jedoch bevorzugt, solche modifizierten Liganden- Analoga an einen Carboamidosulfonylaminofluoreszeinrest durch eine Imino- oder Oxygruppe zu binden.

Die erfindungsgemäßen Tracer werden nach bekannten bzw. üblichen Techniken hergestellt. Wenn X eine Sulfonyl gruppe

ist, werden die erfindungsgemäßen Tracer hergestellt durch Reaktion einer Verbindung der Formel

R-Y (II)

worin R wie vor stehend definiert ist und Y ein aroma tischer Wasserstoff, vorzugsweise an einen Phenylring gebunden, ist, mit Chlorsulfonsäure, unter Bildung eines Chlorsulfonyl-Liganden-Analogons der Formel

Das Chlorsulfonyl-Liganden-Analogon wird mit einem Aminofluoreszein der Formel

worin die Aminogruppe an die 4- oder 5-Stellung des Benzoesäurerings gebunden ist, umgesetzt, in Anwesenheit eines inerten Lösungsmittels, unter Bildung eines Tracers gemäß der Erfindung mit der Formel

Wenn X eine Oxalylgruppe

R-Z (VI)

worin R wie vorstehend definiert ist und Z ein Wasser stoff, gebunden an einen reaktiven Stickstoff (primäres oder sekundäres Amin) ist, mit Methyloxalylchlorid unter Bildung eines Methoxyoxalyl-Liganden-Analogons, das hydrolysiert wird in Anwesenheit einer Base, unter Bildung eines Hydroxyoxalyl-Liganden-Analogons der Formel

Das Hydroxyoxalyl-Liganden-Analogon wird mit einem Aminofluoreszein der Formel IV in Anwesenheit eines Kupplungsmittels, wie 1-Äthyl-3-(3′-dimethylamino propyl)-carbodiimid-hydrochlorid und eines inerten Lösungsmittels umgesetzt, unter Bildung eines Tracers gemäß der Erfindung mit der Formel

Wenn X Carboamidosulfonyl

R-W (IX)

worin R wie vorstehend definiert ist und W ein Wasser stoff, gebunden an einen reaktiven Stickstoff (primäres oder sekundäres Amin) oder an einen Hydroxysauerstoff ist, mit Chlorsulfonylisocyanat, unter Bildung eines Chlorsulfonamidocarbonyl-Liganden-Analogon-Derivats der Formel

Das Chlorsulfonamidocarbonyl-Liganden-Analogon-Derivat wird mit einem Aminofluoreszein der Formel (IV) umge setzt, unter Bildung der erfindungsgemäßen Tracer der Formel

Die Temperatur, bei der die Reaktion zur Herstellung der erfindungsgemäßen Tracer durchgeführt wird, ist nicht kritisch. Die Temperatur sollte ausreichend sein, um die Reaktion zu initiieren und zu erhalten. Im all gemeinen ist aus Wirtschaftlichkeitsgründen die Raum temperatur ausreichend. Bei der Herstellung der erfin dungsgemäßen Tracer ist das Verhältnis der Reaktions komponenten nicht in besonderer Weise kritisch. Bei spielsweise sollte man für jedes Mol einer Verbindung der Formel II 2 Mol Chlorsulfonsäure verwenden, um eine vernünftige Ausbeute zu erzielen. Vorzugsweise verwendet man einen Überschuß an Chlorsulfonsäure zur Erleich terung der Reaktion und der Gewinnung der Reaktionspro dukte.

Die als Ausgangsmaterialien bei der Herstellung der er findungsgemäßen Tracer verwendeten Verbindungen der Formel IV sind entweder handelsüblich oder werden nach bekannten bzw. üblichen Techniken hergestellt.

Zur erleichterten Handhabung und Gewinnung des Produkts wird das Verfahren zur Herstellung der erfindungs gemäßen Tracer in Anwesenheit eines inerten Lösungs mittels durchgeführt. Geeignete inerte Lösungsmittel umfassen Lösungsmittel, die nicht wesentlich mit den Ausgangsmaterialien reagieren und ausreichen, die Aus gangsmaterialien zu lösen und schließen beispielsweise Aceton, Chloroform und Pyridin ein. Um maximale Produktausbeuten zu erzielen, verläuft die Reaktion vorzugsweise unter neutralen oder basischen Bedingungen. Geeignete Basen umfassen beispielsweise Triäthylamin und Pyridin. Die Reaktionsprodukte werden im allge meinen gereinigt, entweder unter Verwendung der Dünn schichtchromatographie oder der Säulenchromatographie vor Anwendung der erfindungsgemäßen Methoden.

Nach der erfindungsgemäßen Verfahrensweise wird eine Probe, die den zu bestimmenden Liganden enthält, mit einem biologisch brauchbaren Salz eines Tracers der Formel I und einem Antikörper, der für den Liganden und Tracer spezifisch ist, vermischt. Der in der Probe vorhandene Ligand und der Tracer konkurrieren, um die begrenzten Antikörperstellen, die aus der Bildung von Ligand-Antikörper- und Tracer-Antikörper-Komplexen resultieren. Durch Konstanthalten der Konzentration von Tracer und Antikörper ist das Verhältnis des Ligan den-Antikörper-Komplexes zum Tracer-Antikörper-Komplex, der gebildet wird, direkt proportional zu der Menge des in der Probe vorhandenen Liganden. Daher ist es beim Anregen des Gemischs mit fluoreszierendem Licht und Messen der Polarisation der durch einen Tracer und einen Tracer-Antikörper-Komplex emittierten Fluoreszenz mög lich, die Menge des Liganden in der Probe quantitativ zu bestimmen.

In der Theorie ist die Fluoreszenz-Polarisation eines nicht komplex an einen Antikörper gebundenen Tracers gering und nähert sich Null. Bei der Komplexbildung mit einem spezifischen Antikörper nimmt der Tracer-Antikörper- Komplex, der so gebildet wurde, die Drehung des Anti körpermoleküls an, die langsamer ist als die des relativ kleinen Tracermoleküls, wodurch die festgestellte Polari sation verstärkt wird. Wenn daher ein Ligand mit dem Tracer um die Antikörperstellen konkurriert, wird die festgestellte Polarisation der Fluoreszenz des Tracer- Antikörper-Komplexes zu einem Wert, der irgendwo zwischen dem des Tracers und des Tracer-Antikörper-Komplexes liegt. Wenn eine Probe eine hohe Konzentration an Ligan den enthält, so ist der festgestellte Polarisationswert näher dem des freien Liganden, d. h. gering. Wenn die Testprobe eine geringe Konzentration des Liganden ent hält, so ist der Polarisationswert näher dem des gebun denen Liganden, d. h. hoch. Durch sequentielle Anregung des Reaktionsgemischs eines Immunoassays mit vertikal und anschließend horizontal polarisiertem Licht und lediglich Analysieren der vertikalen Komponente des emittierten Lichts kann die Polarisation der Fluoreszenz des Reaktionsgemischs genau bestimmt werden. Die genaue Beziehung zwischen Polarisation und Konzentration des zu bestimmenden Liganden wird durch Messen der Polari sationswerte von geeichten Proben bekannter Konzentra tionen bestimmt. Die Konzentration des Liganden kann aus einer auf diese Weise aufgestellten Standardkurve extrapoliert werden.

Der pH-Wert, bei dem die erfindungsgemäße Verfahrens weise durchgeführt wird, muß ausreichen, um es den Tracern der Formel I zu ermöglichen, im ionisierten Zustand vorzuliegen. Der pH-Wert kann im Bereich von etwa 3 bis 12, üblicher im Bereich von 5 bis 10 und am bevorzugtesten bei etwa 6 bis 9 liegen. Es können ver schiedene Puffer verwendet werden, um den pH-Wert während des Assayverfahrens zu erreichen und aufrecht zu erhalten. Beispiele für Puffer umfassen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris und Barbital. Der speziell verwendete Puffer ist für die Erfindung nicht kritisch, jedoch kann in einem Einzelversuch ein spezieller Puffer, bezogen auf den verwendeten Antikörper und den zu bestimmenden Li ganden bevorzugt sein. Der Kationenteil des Puffers be stimmt im allgemeinen den Kationenteil des Tracer-Salzes in Lösung.

Die erfindungsgemäßen Methoden werden bei mäßigen Temperaturen und vorzugsweise bei konstanter Temperatur durchgeführt. Die Temperatur liegt normalerweise im Bereich von etwa 0 bis etwa 50°C, insbesondere von etwa 15 bis 40°C.

Die Liganden-Konzentration, die bewertet werden kann, variiert im allgemeinen von etwa 10^-2 bis 10^-13 m, insbesondere von etwa 10^-4 bis 10^-10 m. Höhere Konzen trationen an Liganden können durch Verdünnen der Origi nalprobe bewertet werden.

Zusätzlich zu dem Konzentrationsbereich des interessie renden Liganden bestimmen normalerweise Betrachtungen derart, ob die Bewertung qualitativ, halbquantitativ oder quantitativ ist, der verwendeten Ausrüstung und der Charakteristika von Tracer und Antikörper, die Kon zentration des zu verwendenden Tracers und Antikörpers.

Während die Konzentration des Liganden in der Probe den Konzentrationsbereich der anderen Reagentien, d. h. von Tracer und Antikörper bestimmt, um normalerweise die Empfindlichkeit des Assays zu optimieren, werden ein zelne Reagenskonzentrationen empirisch bestimmt. Die Konzentrationen von Tracer und Antikörper lassen sich leicht durch den normalen Fachmann bestimmen.

Wie vorstehend erwähnt, werden die bevorzugten erfin dungsgemäßen Tracer hergestellt aus 5-Aminofluoreszein oder 4-Aminofluoreszein und liegen vorzugsweise vor als Isomere der Formel

oder

worin R und X wie vorstehend definiert sind.

Die folgenden Beispiele, die keine Einschränkung darstellen sollen, dienen zur weiteren Erläuterung der Art und Weise, wie spezielle Tracer gemäß der Erfindung hergestellt werden können. Das in den Strukturformeln, die die in den folgenden Beispielen hergestellten Verbindungen darstellen, auftretende Symbol [AF] stellt einen Rest der folgenden Formel

dar, worin der Iminostickstoff in der 4- oder 5-Stellung der vorstehenden Formel gebunden ist, je nach dem als Ausgangsmaterial verwendeten spezifischen Aminofluoreszein.

Beispiel 1

Zu 0,71 g Lidocain wurden 2, 8 g Chlorsulfonsäure ge fügt, und das resultierende Gemisch wurde 1 h bei 60°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt, und ge brochenes Eis und Wasser wurden dem Gemisch zugesetzt, um jegliche nichtumgesetzte Chlorsulfonsäure zu ver nichten. Die resultierende wäßrige Lösung wurde unter Verwendung von Natriumhydroxid auf den pH-Wert 7 neu tralisiert. Das resultierende Produkt wurde zweimal mit 10 ml-Anteilen von Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte wurden vereint, über Natrium sulfat getrocknet, filtriert, und unter Bildung von 100 mg eines Gemischs von metha- und para-Chlorsulfonyl lidocain als gummiartiges Öl zur Trockne verdampft. Zu einer Lösung von 5 mg 4-Aminofluoreszein in 0,5 ml Pyridin wurden 5 mg des vorstehenden Chlorsulfonyl lidocaingemischs gefügt. Nach 10 min bildete sich ein rohes Produkt. Das Rohprodukt wurde durch Dünnschicht chromatographie, unter Verwendung von Siliciumdioxidgel und Chloroform gereinigt, und anschließend wurde ein Gemisch von Chloroform : Aceton (1 : 1) und schließlich ein Gemisch von Chloroform : Methanol (1 : 1) als Ent wicklungslösungsmittel zugefügt, unter Bildung eines Gemischs von Sulfonyllidocain-Aminofluoreszein-Konjugat der allgemeinen Formel

Beispiel 2

Zu 1,2 g Phenobarbital wurden langsam 4,5 g Chlorsulfon säure gefügt, und das resultierende Gemisch wurde 1 h bei 60°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt, und gebrochenes Eis und Wasser wurden zu dem Gemisch gefügt, um jegliche nichtumgesetzte Chlorsulfonsäure zu zerstören. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend filtriert, unter Bildung einer weißen Ausfällung, die mit Wasser gespült und in einem Vakuum-Exsikkator unter Bildung von 0,8 g eines Gemischs von meta- und para- Chlorsulfonylphenobarbital mit einem Fp. von 190-195°C getrocknet. Zu einer Lösung von 5 mg 5-Aminofluoreszein in 0,5 ml Pyridin wurden 5 mg des vorstehenden Gemischs von Chlorsulfonylphenobarbital gefügt. Nach 10 min hatte sich ein Rohprodukt gebildet und wurde zweimal unter Anwendung von Dünnschichtchromatographie-Techniken unter Verwendung von Siliciumdioxidgel und einem Gemisch von Chloroform : Methanol (2 : 1) als Entwicklungslösungsmittel gereinigt, unter Bildung eines Sulfonylphenobarbital- Aminofluoreszein-Konjugats der Formel

Beispiel 3

Zu 2 g α-Phenäthyl-α-methylsuccinimid wurden tropfen weise 2,5 g Chlorsulfonsäure gefügt, und das resultie rende Gemisch wurde 1 h bei 26°C gerührt. Gebrochenes Eis und Wasser wurden zu dem Gemisch zur Zerstörung von nichtumgesetzter Chlorsulfonsäure gefügt. Ein Reak tionsprodukt, das sich gebildet hatte, wurde zweimal mit 10 ml-Anteilen Chloroform extrahiert. Die Chloro formextrakten wurden vereint, über Natriumsulfat ge trocknet, und unter Bildung eines schweren Öls verdampft. Das Öl wurde aus einem Gemisch von Toluol und Petroläther kristallisiert, unter Bildung von 0,29 g eines Gemischs von α-(meta- und para-Chlorsulfonylphenäthyl)-α-methyl succinimid mit einem Fp. von 145-150°C. Zu einer Lösung von 5 mg 4-Aminofluoreszein in 0,5 ml Pyridin wurden 5 mg des vorstehenden Gemischs von α-(Chlorsulfonyl phenäthyl)-α-methylsuccinimid gefügt. Nach 10 min hatte sich ein Rohprodukt gebildet, das zweimal unter Verwen dung von Dünnschichtchromatographie-Techniken gereinigt wurde, unter Anwendung von Siliciumdioxidgel und eines Gemischs von Chloroform : Methanol (2 : 1) als Entwicklungs lösungsmittel, unter Bildung eines Gemischs von α-(Sul fonylphenäthyl)-α-methylsuccinimid-Aminofluoreszein- Konjugat der Formel

Beispiel 4

Zu einer Lösung von 2 g Iminostilben und 2 ml Triäthyl amin in 50 ml Chloroform wurden 1,5 g Methyloxalylchlorid gefügt. Das resultierende Gemisch wurde 1 h unter Rück fluß gehalten und anschließend zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde in 50 ml Chloroform aufgenommen und anschließend mit 50 ml Wasser extrahiert. Die Chloro formschicht wurde zur Trockne verdampft. Zu dem Rückstand wurden 100 ml 2n Natriumhydroxid gefügt, und das resul tierende Gemisch wurde 30 min unter Rückfluß gehalten. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt und an schließend mit 50 ml Chloroform extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde auf den pH-Wert 1 unter Verwendung von konz. Chlorwasserstoffsäure angesäuert und anschließend mit 100 ml Äther extrahiert. Der organische Extrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde in 50 ml Methanol aufge nommen und mit Wasser, unter Bildung einer Kristallaus fällung trituriert. Das Gemisch wurde filtriert, und die Kristalle wurden 16 h gekühlt, unter Bildung von 2,4 g von N-Hydroxyoxalyl-iminostilben (Fp 162-163°C).

Zu 5 mg des N-Hydroxyoxalyl-iminostilbens wurde eine Mischung von 5 mg 4-Aminofluoreszein in 0,5 ml Pyridin gefügt. Die Reaktion konnte 2 h bei 26°C erfolgen, unter Bildung eines Rohprodukts. Das Rohprodukt wurde gereinigt, unter Anwendung der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Siliciumdioxidgel und einer Ent wicklerlösung, die aus einem Gemisch von Chloroform : Aceton (1 : 1) bestand, unter Bildung eines N-Oxalyl iminostilben-aminofluoreszein-Konjugats der Formel:

Folgende Tracer wurden ebenfalls nach den vorstehenden Verfahrensweisen hergestellt:

Beispiel 5

Sulfonylprimidonaminofluoreszein-Konjugate

Beispiel 6

para-Methyl-meta-sulfonylprimidon-aminofluoreszein- Konjugat

Beispiel 7

para-Methyl-meta-sulfonylphenobarbital-aminofluoreszein- Konjugat

Beispiel 8

5-Sulfonylphenyl-5-äthylhydantoin-aminofluoreszein- Konjugat

Beispiel 9

α-(Sulfonylphenyl)-α-methylsuccinimid-aminofluoreszein- Konjugat

Beispiel 10

O-Sulfonamidocarbonylpropanolol-aminofluoreszein-Konjugat

Beispiel 11

N-Sulfonamidocarbonyl-iminostilben-aminofluoreszein- Konjugat

Beispiel 12

N-Sulfonamidocarbonyl-procainamid-aminofluoreszein- Konjugat

Beispiel 13

O-Sulfonamidocarbonyl-chloramphenicol-aminofluoreszein- Konjugat

Beispiel 14

N-Sulfonamidocarbonyl-disopyramid-aminofluoreszein- Konjugat

Beispiel 15

O-Sulfonamidocarbonyl-chinidin-aminofluoreszein- Konjugat

Beispiel 16

O-Oxalyl-propranolol-aminofluoreszein-Konjugat

Beispiel 17

N-Oxalyl-procainamid-aminofluoreszein-Konjugat

Beispiel 18

N-Acetyl-N′-desäthyl-N′-oxalylprocainamid aminofluoreszein-Konjugat

Beispiel 19

N-Oxalyl-nortriptylin-aminofluoreszein-Konjugat

Beispiel 20

N-Oxalyl-iminodibenzyl-aminofluoreszein-Konjugat

Wie vorstehend erwähnt, sind die erfindungsgemäßen Tracer wirksame Reagentien zur Anwendung bei Fluoreszenz- Polarisation-Immunassays. Die folgenden Beispiele veran schaulichen die Eignung der erfindungsgemäßen Tracer in Immunassays unter Anwendung von Fluoreszenz-Polarisations techniken. Derartige Assays werden nach folgender allge meiner Verfahrensweise durchgeführt:

1. Ein gemessenes Volumen von Standard- oder Testserum wird in ein Testrohr gefüllt und mit Puffer verdünnt;
2. eine bekannte Konzentration eines Tracers gemäß der Erfindung, der gegebenenfalls ein oberflächenaktives Mittel enthält, wird anschließend in jedes Rohr ge fügt;
3. eine bekannte Konzentration Antisera wird in die Rohre gefügt;
4. das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur inku biert; und
5. die Tracermenge, die an Antikörper gebunden ist, wird durch Fluoreszenz-Polarisationstechniken als Maß für die Menge des Liganden in der Probe ge messen.

Beispiel 21 Lidocain-Assay Materialien

1. Puffer: 0,1 m in Phosphat, pH 7,5, enthaltend 0,01% (Gew./Vol) Natriumazid und 0,01% (Gew./Vol.) Rinder- Gammaglobulin (im folgenden als "BGG-Puffer" bezeich net).
2. Tracer: Sulfonyllidocain-aminofluoreszein-Konjugat (hergestellt im Beispiel 1) in einer Konzentration von 2,34 × 10^-7 m in 0,1 m in Tris-Hydrochloridpuffer, pH 7,8, enthaltend 0,1% (Gew./Vol.) Natriumdodecyl sulfat, 0,01% (Gew./Vol.) Rinder-Gammaglobulin und 0,01% (Gew./Vol.) Natriumazid.
3. Antikörper: Kaninchen-Antiserum zu Lidocain, ver dünnt auf 1 : 80 in BGG-Puffer.
4. Standards oder unbekannt: menschliches Serum (oder andere biologische Flüssigkeit) mit einem Gehalt an Lidocain in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 10 µg/ml.
5. Fluoreszenz-Polarimeter: Instrument, geeignet zur Messung der Polarisation der Fluoreszenz einer 1 × 10^-9 in Fluoreszeinlösung zu ± 0,001 Polarisations einheiten.

Protokoll

1. Zu 20 µl von Standards und unbekannten Proben werden 200 µl BGG-Puffer gefügt.
2. Zu 20 µl jedes verdünnten Standards oder jeder unbe kannten Probe in einem Kulturrohr werden 200 µl BGG- Puffer gefügt.
3. Zu jedem Kulturrohr mit einem Gehalt an verdünntem Standard und unbekannter Probe werden 40 µl Tracer und 1000 µl BGG-Puffer gefügt.
4. Anschließend werden 40 µl Antikörper und 1000 µl BGG-Puffer in jedes Kulturrohr gefügt.
5. Die Reagentien werden vermischt, und die Kulturrohre, die die Standards und unbekannten Proben enthalten, werden etwa 15 min bei 22°C inkubiert.
6. Die Fluoreszenzpolarisation sämtlicher Rohre wird gemessen. Typische Ergebnisse für Standardproben sind in der Tabelle I aufgeführt.

Lidocain-Konzentration (µg/ml)

Polarisation

0

0,224

0,5 0,186

1,0 0,162

2,5 0,124

5,0 0,094

10,0 0,071

Die Polarisationswerte verringern sich, wenn die Kon zentration an Lidocain vergrößert wird, was die Auf stellung einer Standardkurve ermöglicht. Die unbekannten Proben, die in gleicher Weise behandelt wurden, können unter Bezugnahme auf die Standardkurve quantitativ be wertet werden.

Beispiel 22 Phenobarbital-Assay Materialien

1. BGG-Puffer.
2. Tracer: (para-Methyl-meta-sulfonyl)-phenobarbital aminofluoreszein-Konjugat (hergestellt im Beispiel 7) in einer Konzentration von 5,75 × 10^-8 m in 5,75% Natriumcholat.
3. Antikörper: Kaninchen-Antiserum zu Phenobarbital, verdünnt auf 1 : 78,3 in BGG-Puffer.
4. Standards und unbekannte Proben: menschliches Serum (oder andere biologische Flüssigkeit), enthaltend Phenobarbital in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 80 µg/ml.
5. Fluoreszenzpolarimeter: Instrument, geeignet zur Messung der Polarisation der Fluoreszenz einer 1 × 10^-9 in Fluoreszein-Lösung auf ± 0,001 Polari sationseinheiten.

Protokoll

1. Zu 20 µl Standards und unbekannten Proben werden 200 µl BGG-Puffer gefügt.
2. Zu 20 µl jedes verdünnten Standards und jeder unbe kannten Probe in einem Kulturrohr werden 200 µl BGG- Puffer gefügt.
3. Zu jedem Kulturrohr, das verdünnten Standard und unbekannte Probe enthält, werden 40 µl Tracer und 1000 µl BGG-Puffer gefügt.
4. Anschließend werden 40 µl Antikörper und 1000 µl BGG-Puffer zu jedem Kulturrohr gefügt.
5. Die Reagentien werden vermischt, und die Kulturrohre, die die Standards und unbekannten Proben enthalten, werden etwa 15 min bei 23°C vermischt.
6. Die Fluoreszenz-Polymerisation sämtlicher Rohre wird gemessen. Typische Ergebnisse für Standardproben sind in der Tabelle II aufgeführt.

Phenobarbital-Konzentration (µg/ml)

Polarisation

0

0,155

10 0,108

20 0,092

40 0,074

80 0,060

Die Polarisationswerte verringern sich, wenn die Kon zentration an Phenobarbital gesteigert wird, was die Aufstellung einer Standardkurve ermöglicht. Unbekannte Proben, die in identischer Weise behandelt wurden, können quantitativ unter Bezugnahme auf die Standard kurve bewertet werden.

Beispiel 23 Carbamazepin-Assay Materialien

1. BGG-Puffer.
2. Tracer: N-Oxalyliminostilben-Aminofluoreszein- Konjugat (hergestellt im Beispiel 4) in einer Kon zentration von 2nm in BGG-Puffer, enthaltend 0,2% (Gew./Vol.) Natriumcholat.
3. Antikörper: Kaninchen-Antiserum zu Carbamazepin, verdünnt auf 1 : 3040 in BGG-Puffer.
4. Standards oder unbekannte Proben: menschliches Serum (oder andere biologische Flüssigkeit), ent haltend Carbamazepin in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 20 µg/ml.
5. Fluoreszenzpolarimeter: Instrument, geeignet zur Messung der Polarisation der Fluoreszenz von 1 × 10^-9 m Fluoreszeinlösung auf ± 0,001 Polarisationseinheiten.

Protokoll

1. Zu 10 µl Standards und unbekannten Proben werden 300 µl BGG-Puffer gefügt.
2. Zu 10 µl jedes verdünnten Standards und jeder unbe kannten Probe in einem Kulturrohr werden 300 µl BGG-Puffer gefügt.
3. 1 ml Tracer wird in jedes Kulturrohr gefügt.
4. Anschließend wird 1,0 ml Antikörper in jedes Kulturrohr gefügt.
5. Die Reagentien werden vermischt und die Kulturrohre, die die Standards und unbekannten Proben enthalten, werden etwa 15 min bei 23°C inkubiert.
6. Messung der Fluoreszenz-Polarisation sämtlicher Rohre. Typische Ergebnisse für Standardproben sind in der Tabelle III aufgeführt.

Carbamazepin-Konzentration (µg/ml)

Polarisation

0

0,224

2 0,108

4 0,135

8 0,105

12 0,088

20 0,077

Die Polarisationswerte werden geringer, wenn die Kon zentration an Carbamazepin erhöht wird, was die Auf stellung einer Standardkurve ermöglicht. Unbekannte Proben, die in identischer Weise behandelt werden, können quantitativ unter Bezugnahme auf die Standard kurve bewertet werden.

Folgende Tabelle stellt die verschiedenen Fluoreszenz- Polarisations-Immunassays dar, die entsprechend der vor stehenden Verfahrensweise unter Verwendung der Tracer, die in den vorstehenden Beispielen hergestellt wurden, durchgeführt wurden. Die verwendeten Tracer sind durch die Beispiel-Nr. angegeben, und der bzw. die spezifi schen Ligand(en), die bestimmt wurden, sind angegeben.

Tracer, hergestellt in Beispiel Nr.
bewerteter Ligand bzw. bewertete Liganden
I
Lidocain
II	Phenobarbital
III	Ethosuximid
IV	Carbamazepin
V	Primidon
VI	Primidon
VII	Phenobarbital
VIII	Phenytoin
IX	Ethosuximid
X	Propanolol
XI	Carbamazepin
XII	Procainamid
XIII	Chloramphenicol
XIV	Disopyramid
XV	Quinidin
XVI	Propanolol
XVII	Procainamid
XVIII	N-Acetyl Procainamid
XIX	Desipramin; Imipramin
XX	Nortriptylin; Amitriptylin

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Tracer wirksame Reagentien bei Fluoreszenz-Polarisations-Immunassays sind. Zusätzlich zu den vor stehend erwähnten Eigenschaften weisen die erfindungsgemäßen Tracer ein hohes Ausmaß an thermi scher Stabilität, ein hohes Ausmaß an gebundener Polari sation, hohe Quantenausbeuten auf und sind relativ leicht herzustellen und zu reinigen.

Die vorstehenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Claims

1. Verbindung der Formel worin X eine Gruppe darstellt, ausgewählt aus der Klasse einer Oxalylgruppe mit der Formel einer Sulfonylgruppe mit der Formel und einer Carboamidosulfonylgruppe mit der Formel und worin R ein Ligandenanaloges ist, das ausgewählt ist aus, falls ist,

- Lidocain der Formel einschließlich der Isomerengemische,
- Phenytoin der Formel
- Primidon der Formel worin R′ Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist, und falls ist,
- Nortriptylin der Formel
- Desipramin der Formel
- Carbamazepin der Formel
- Thyroxin der Formel und und, falls ist,
- Carbamazepin der Formel
- Thyroxin,
- Propanolol der Formel
- Procainamid der Formel und und biologisch brauchbare Salze davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel oder und biologisch brauchbare Salze davon.

3. Verfahren zur Bestimmung von Liganden in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man mit der Probe ein biologisch brauchbares Salz einer Tracer-Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 und einen Antikörper, der zur spezifischen Erkennung des Liganden und des Tracers geeignet ist, ver mischt und anschließend die Menge an Tracer, die an den Antikörper gebunden ist, durch Fluoreszenz- Polarisationstechniken als Maß für die Menge des Liganden in der Probe, bestimmt.