DE69731179T2

DE69731179T2 - Fluorierte xanthenderivate

Info

Publication number: DE69731179T2
Application number: DE69731179T
Authority: DE
Inventors: R. Kyle GEE; Martin Poot; H. Dieter KLAUBERT; Wei-Chuan Sun; P. Richard HAUGLAND; Fei Mao
Original assignee: Molecular Probes Inc
Current assignee: Molecular Probes Inc
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2017-04-12
Also published as: EP1441010A1; WO1997039064A1; DE69731179D1; JPH11508277A; CA2222275C; US6162931A; AU2801297A; ATE279480T1; EP0853647B1; EP0853647B2; CA2222275A1; EP0853647A1; DE69731179T3; AU717569B2; US6229055B1; JP4408451B2

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Die Erfindung betrifft neuartige fluorierte Fluoresceinfarbstoffe, Reaktivfarbstoffderivate, Farbstoffkonjugate und Farbstoffe, die Enzymsubstrate sind, und deren Benutzung. Außerdem ist eine einfache Synthese für fluorierte Resorcine und Aminophenole bereitgestellt.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Von Fluoreszenzfarbstoffen ist bekannt, daß sie besonders für biologische Anwendungen geeignet sind, in denen ein hochempfindliches Nachweisreagens erwünscht ist. Fluoreszenzfarbstoffe werden benutzt, um anderen Materialien sowohl eine sichtbare Farbe als auch Fluoreszenz zu verleihen. Die Farbstoffe dieser Erfindung sind fluorsubstituierte Analoge von Farbstoffen auf Basis von Xanthen, die typischerweise Fluoresceinderivate sind.
Zu „Fluorescein"-Farbstoffen gehören Derivate von 3H-Xanthen-6-ol-3-on, die an der 9-Position mit einer 2-Carboxyphenylgruppe substituiert sind, während zu „Rhodolfarbstoffen" Derivate von 6-Amino-3H-xanthen-3-on gehören, die an der 9-Position durch eine 2-Carboxyphenylgruppe ersetzt sind.
Rhodole und Fluoresceine sind typischerweise an der 1-Position mit einem Derivat substituiert, das in der Lage ist, einen 5- oder 6gliedrigen Lacton- oder Lactamring zu bilden:
US-A-4 318 846 beschreibt symmetrisch diethersubstituierte Fluoresceine und gibt an, daß bestimmte Substituenten Halogen oder Fluor sein können. Die Herstellung von fluorierten Fluoresceinen wird nicht beschrieben.
WO 94/05 688 und WO 91/07 507 betreffen Fluoresceinfarbstoffe, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie 4,7-dichlor-substituiert sind. Während Fluor als ein Substituent erwähnt ist, wird die Herstellung von fluorierten Fluoresceinen wiederum nicht beschrieben.
US-A-4 997 928 lehrt, daß nukleosidhaltige Reagentien ein Reportermolekül enthalten können, das eine 4,7-disubstituierte Fluoresceinverbindung ist. Fluor ist in die Liste der Substituenten eingeschlossen, jedoch wird die Herstellung von fluorierten Fluoresceinen ein weiteres Mal nicht beschrieben.
US-A-5 451 343 offenbart in ähnlicher Weise fluorsubstituierte Fluoron- und Pyronin-Y-Derivate, jedoch nicht deren Herstellung.
Durrani et al., J. Chem. Soc. Trans. 1, 1980, 1.658 bis 1.666 offenbart die Synthese von Orsellinsäurederivaten, bei der ein 5-Fluorresorcin als ein Zwischenprodukt benutzt wird.
Patrick et al., J. Org. Chem. 51, 3242 (1986) lehrt, daß Resorcine unter Benutzung von CsSO₄F fluoriert werden können, eine gefährliche Verbindung, die mit Sorgfalt gehandhabt werden muß.
Trotz der bekannten Neigung, daß sich durch Halogenierung die Wellenlänge von Fluoresceinen verschiebt, bewahren die neuen fluorierten Fluoresceine die günstigen Merkmale von Fluorescein, einschließlich eines hohen Absorptionsvermögens und starker Fluoreszenz, der Anregung bei 488 nm (z. B. Argonlaser) und der Kompatibilität mit normalen Mikroskopfiltern, bei nachgewiesenen Vorteilen gegenüber Fluorescein, einschließlich größerer photochemischer Stabilität und einem bedeutend geringeren pK_a (> 1,5 pH-Einheiten gegenüber den sonst unsubstituierten Farbstoffen, siehe 3). Die verbesserten Eigenschaften der fluorierten Farbstoffe sind in ihren Konjugaten bewahrt, und die Fluoreszenzlöschung des Farbstoffes in Konjugaten ist vermindert (z. B. 1). Die neuen Materialien sind zur Benutzung in bekannten Anwendungen von Fluoresceinen geeignet, ausgenommen in denjenigen, die Empfindlichkeit gegenüber pH-Änderungen in der Nähe von pH 7 erfordern. Außerdem stellt die Polyfluorierung des Phenylsubstituenten, der in den meisten Fluorescein- (und Rhodol-)farbstoffen vorhanden ist, einen neuartigen Weg zu reaktionsfähigen Derivaten und Konjugaten bereit. Bestimmte fluorierte Xanthene werden in Zellen unerwarteterweise gut zurückgehalten.
Die einzigartige Chemie des Fluors ist mit den Verfahren, die typischerweise benutzt werden, um chlor-, brom- oder iodsubstituierte Fluoresceinderivate herzustellen, inkompatibel, und es sind bisher keine effizienten Verfahren zum Herstellen von Fluorresorcin- und Fluoraminophenol-Zwischenprodukten beschrieben worden. Es wird ebenfalls ein neuartiges Mittel zum Herstellen von 1'- und/oder 8'-substituierten Xanthenen beschrieben.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Fluoreszenz gegen den Substitutionsgrad für Farbstoffkonjugate von Ziege-Anti-Maus-Immunoglobulin G (GAM IgG). Die Fluoreszenz wird durch Messen der Quantenausbeute des Farbstoffkonjugats im Verhältnis zu dem freien Farbstoff und Multiplizieren mit der Zahl der Fluorophore pro Protein bestimmt: Verbindung 109 (
), Verbindung 64 (
), Verbindung 61 (
) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC, ☐).
2: Relative Lichtstabilität von Farbstoffkonjugaten von GAM IgG. Die Konjugate von fluorierten Farbstoffen weisen im Verhältnis zu nichtfluorierten Farbstoffen eine erhöhte Lichtstabilität auf: Verbindung 59 (
), Verbindung 109 (
), Verbindung 35 (☐) und 6-Carboxyfluorescein (
).
3: Die Auswirkung der Fluorierung auf die pH-abhängige Fluoreszenz: Verbindung 35 (
) und 6-Carboxyfluorescein (o) (Anregung/Emission bei 490/520 nm).
4: Die relative Lichtstabilität von Phalloidinkonjugaten von 6-Carboxymethylthio-2',4,5,7,7'-pentafluorfluorescein (
) und 6-Carboxyfluorescein (
).
5: Bewahrung der Fluoreszenz in Zellen, die mit 1) Fluoresceindiacetat (FDA) und 2) Verbindung 26 behandelt wurden.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG UND BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Verfahren zum Synthetisieren von fluorierten Resorcinen bereit, die bei der Synthese von fluorierten Xanthenfarbstoffen nützlich sind. Die Erfindung stellt auch neuartige Xanthenfarbstoffe bereit.
Unter einem Gesichtspunkt stellt die Erfindung somit ein Verfahren zum Herstellen eines fluorierten Resorcins bereit, das die Formel
aufweist, wobei
R¹, R² und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, Fluor, Chlor, Hydroxy, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind, mit der Maßgabe daß mindestens eines von R¹, R² und R⁴ Fluor ist,
welches die Schritte des

a) Behandelns eines substituierten Nitrofluorbenzols mit der Formel
wobei R¹ und R² unabhängig voneinander Wasserstoff, Fluor, Chlor, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind, R⁴ Wasserstoff, Fluor, Chlor, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Nitro ist, R³ und R⁵ unabhängig voneinander Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Benzyloxy oder F sind, und R⁶ H oder Nitro ist, mit der Maßgabe, daß genau eines von R⁴ und R⁶ Nitro ist, mindestens eines von R³ und R⁵ F ist und mindestens eines von R¹, R² und R⁴ F ist, mit einem verdrängenden Ion, das ein Alkoxid mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein Benzyloxid-Ion ist, um einen Nitroresorcindiether zu erhalten,
b) Reduzierens des Nitroresorcindiethers, um einen Aminoresorcindiether zu erhalten,
c) Diazotierens des Aminoresorcindiethers, um ein Resorcindiether-Diazoniumsalz zu erhalten,
d) Dediazotierens des Resorcindiether-Diazoniumsalzes, um einen Resorcindiether zu erhalten, und
e) Spaltens des Resorcindiethers, um das fluorierte Resorcin zu erhalten, umfaßt, und das Verfahren wahlweise ferner das Kondensieren des fluorierten Resorcins umfaßt, um einen Xanthyliumfarbstoff zu bilden, und, falls gewünscht, das Modifizieren des Xanthyliumfarbstoffes.

Die Farbstoffe der Erfindung sind Fluoresceine, die direkt an einem oder mehreren aromatischen Kohlenstoffatomen mit Fluor substituiert sind. Bei der Beschreibung der Farbstoffe bedeutet Carboxy -COOH, ein biologisch kompatibles Salz einer Carbonsäure oder einen biologisch kompatiblen Ester einer Carbonsäure, Sulfo bedeutet -SO₃H oder ein biologisch kompatibles Salz einer Sulfonsäure. Ein biologisch kompatibles Salz bedeutet ein Salz, das für biologische Systeme nicht schädlich ist, einschließlich K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ und NR₄ ⁺-Salzen, wobei R = H, C₁-C₄-Alkyl oder C₂-C₄-Alkanol oder Kombinationen aus diesen ist. Ein biologisch kompatibler Ester bedeutet ein leicht hydrolysierbarer Ester, der in biologischen Systemen benutzt wird, z. B. α-Acyloxyalkylester (typischerweise -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸, wobei R¹⁸ C_1-4-Alkyl ist, insbesondere Acetoxymethyl-(CH₃CO₂CH₂-)-ester).
In einer Ausführungsform weisen die Farbstoffe die Formel auf:
Formel I
Die Substituenten R¹ und R⁶ sind unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈-Alkoxy. R¹ und R⁶ sind typischerweise H oder F.
Die Substituenten R², R³, R⁴ und R⁵ sind unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I oder CN oder eine C₁-C₁₈-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkylthiogruppe. Ein Alkyl-, Alkoxy- oder Alkylthio-Farbstoffsubstituent ist wahlweise ferner mit F, Cl, Br, I, Carboxy, Sulfo, Amino, Alkylamino, Dialkylamino oder Alkoxy substituiert, deren Alkylabschnitte unabhängig voneinander jeweils 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen. Außerdem sind die Farbstoffsubstituenten R³ und R⁴ wahlweise jeweils -CH₂-N-(CR¹⁹HCOOR¹⁷)₂, wobei R¹⁷ H, ein biologisch kompatibles Gegenion, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein α-Acyloxyalkylester ist und R¹⁹ H oder C₁-C₆-Alkyl ist.
Ein Merkmal der Verbindungen der Erfindung ist, daß R² und R⁵ F sind und/oder R³ und R⁴ F sind.
Der Substituent A ist -OR⁷, wobei R⁷ H, C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈-Acyl ist, das wahlweise mit Amino, Hydroxy oder Carboxy substituiert ist, oder R⁷ eine Trialkylsilylgruppe ist, deren Alkylabschnitte 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen.
Der Substituent R¹⁰ ist F, Carboxy oder eine C₁-C₁₈-Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe. Wenn R¹⁰ Alkyl ist, ist es wahlweise mit F, Cl, Br, Carboxy, Sulfo, Amino, Alkylamino oder Dialkylamino substituiert, wobei die Alkylabschnitte jedes Substituenten 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen. Alternativ ist R¹⁰ ein Aryl:
(zuweilen als der „Bodenring" bezeichnet). Die Substituenten R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ sind unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, Carboxy, Sulfo, CN, Nitro, Hydroxy, Azido, Amino oder Hydrazino oder C₁-C₁₈-Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Alkylamino, Alkylester, Alkylamido oder Arylamido, deren Alkyl- oder Arylabschnitte wahlweise mit F, Cl, Br, I, Hydroxy, Carboxy, Sulfo, Amino, Alkylamino, Dialkylamino oder Alkoxy substituiert sind, deren Alkylabschnitte 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen. Alternativ bilden zwei beliebige benachbarte Substituenten R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶, wenn sie zusammengefaßt werden, einen kondensierten 6gliedrigen aromatischen Ring (wozu R¹⁰ ein Naphthyl wird), der wahlweise ferner mit Carboxy substituiert ist.
In einer Ausführungsform ist R¹⁰ ein substituiertes Aryl, vorzugsweise Phenyl, R¹² ein Carboxy und R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ sind unabhängig voneinander H, F oder Carboxy. In einer anderen Ausführungsform ist R¹² ein Carboxy oder ein Sulfo und keines von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ oder R¹⁶ ist F. In einer noch anderen Ausführungsform sind drei von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ F, und R¹² ist ein Carboxy oder ein Sulfo.
In einer anderen Ausführungsform weisen die Farbstoffe die Formel
Formel II auf, wobei die Substituenten R^1–7, R¹⁰ und A sind wie vorstehend definiert und R¹¹ H, Hydroxy, CN oder C_1-6-Alkoxy ist oder R¹⁰ und R¹¹ einen 5gliedrigen Spirolactonring bilden oder R¹¹ und R¹² einen 5- oder 6gliedrigen Spirolactonring oder einen 5- oder 6gliedrigen Sultonring bilden, z. B. (zusätzlich Substituenten sind nicht dargestellt):
Die Methylenkohlenstoffatome des Spirolactonrings oder Spirosultonrings sind wahlweise und unabhängig voneinander mit H, F oder CH₃ substituiert.
Alternativ ist R¹⁰ gemeinsam mit R¹¹ ein Carbonylsauerstoffatom, gemäß der vereinfachten untenstehenden Formel (zusätzliche Substituenten sind nicht dargestellt).
Farbstoffausführungsformen, in die ein Spirolactonring einbezogen ist, sind typisch für ein Strukturisomer, das im Gleichgewicht mit dem Isomeren vorliegen kann, wobei R¹² eine Carbonsäure ist oder R¹⁰ eine Propion- oder Buttersäure ist. Farbstoffe, in die ein Spirosultonring einbezogen ist, können im Gleichgewicht mit dem Isomeren vorliegen, wobei R¹² eine Sulfonsäure oder R¹⁰ ein mit Sulfonsäure substituiertes Ethyl oder Propyl ist. Isomere, in die ein Spirolacton- oder ein Spirosultonring einbezogen ist, sind nicht fluoreszierend, solange der Ring geöffnet ist.
Wenn A OR⁷ ist, R¹⁰ Aryl ist und R¹² Carboxy ist, ist der beschriebene Farbstoff ein Fluorescein (Formel I) oder ein Dihydrofluorescein (Formel II).
Die fluorierten Xanthene der Erfindung besitzen wahlweise eine reaktionsfähige Gruppe, die mittels einer Einfachbindung oder einer Verknüpfungsgruppierung an das Fluorophor gebunden ist, und können benutzt werden, um ein Farbstoffkonjugat herzustellen. Die Farbstoffe enthalten wahlweise einen R⁷-Substituenten, der den Farbstoff photochemisch aktivierbar oder eindringfähiger in die Zellen macht oder den Farbstoff zu einem Substrat für ein Enzym macht oder seine spektralen Eigenschaften modifiziert.
In einer Ausführungsform ist eines oder sind mehrere von R¹, R², R³, R⁴, R⁵, und R⁶ F (natürlich mit der Maßgabe, daß (i) R² und R⁵ und/oder R³ und R⁴ F sind). In einer zusätzlichen Ausführungsform ist keines von R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ F. In einer noch anderen Ausführungsform ist mindestens eines von R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ F. In einer anderen Ausführungsform sind andere Substituenten als R³ und R⁴ F. Alternativ sind R¹ und R⁶ H und R², R³, R⁴ und R⁵ sind H, F, Cl, Br, I oder C₁-C₆-Alkoxy (natürlich mit der Maßgabe, daß R² und R⁵ und/oder R³ und R⁴ F sind). In einer weiteren Ausführungsform ist mindestens eines von R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ F. In einer Ausführungsform sind vier von R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ F. In einer anderen Ausführungsform sind mindestens drei und wahlweise alle von R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ F. In einer noch anderen Ausführungsform ist R¹⁰ F.
Entweder sind R² und R⁵ F, oder R³ und R⁴ sind F; zuweilen sind R², R³, R⁴ und R⁵ alle F. Wenn jedes von R¹³ bis R¹⁶ fluoriert ist, reagieren die resultierenden Farbstoffe bereitwillig mit Nukleophilen, und wenn zusätzlich R¹¹ und R¹² zusammengefaßt Spirolacton sind, werden die resultierenden Farbstoffe gut in Zellen zurückgehalten oder lagern sich bereitwillig an biologische Moleküle an.
Ein bevorzugte Klasse von Farbstoffen weist die Formel
auf, wobei
R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander H oder F sind, mit der Maßgabe, daß R² und R⁵ F sind und/oder R³ und/oder R⁴ F sind,
R¹² eine Carbonsäure, ein Salz einer Carbonsäure, ein Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, eine Sulfonsäure oder ein Salz einer Sulfonsäure ist,
R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander H, F, Carbonsäure, ein Salz einer Carbonsäure, ein Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, ein Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸, eine Sulfonsäure, ein Salz einer Sulfonsäure oder C₁-C₆-Alkylthio sind, das wahlweise mit Carbonsäure, einem Salz einer Carbonsäure, einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols oder einem Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸ substituiert ist.
Die Erfindung stellt auch Verbindungen bereit, welche die Formel
aufweisen, wobei
R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und A sind, wie oben definiert, und

genau eines von R², R³, R⁴, R⁵, R⁷ und R¹⁰ -L-S_c ist,
wobei L ein kovalente Einfachbindung ist oder L eine kovalente Verknüpfung mit 1 bis 24 Nichtwasserstoffatomen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus C, N, O und S besteht, und aus einer beliebigen Kombination von Einfach-, Doppel-, Dreifach- oder aromatischen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen, Stickstoff-Stickstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen und Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen zusammengesetzt ist, und
S_c eine konjugierte Substanz ist, die eine ionenkomplexierende Gruppierung ist,
mit der Maßgabe, daß R² und R⁵ und/oder R³ und R⁴ F sind.
Andere Gesichtspunkte und Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen bekanntgegeben.
Bevorzugte Farbstoffe ergeben in wäßriger Lösung (pH = 6) eine Quantenausbeute von größer als 0,50. Vorzugsweise besitzen diese Farbstoffe einen pKa von kleiner als 5,0. Der Extinktionskoeffizient bevorzugter Farbstoffe, gemessen bei einer Wellenlänge von größer als 490 nm bei pH 6,0, ist größer als 60.000 cm^–1M^–1. Vorzugsweise weisen die fluorierten Farbstoffe ein Fluoreszenzemissionsmaximum auf, das im Verhältnis zu dem nichtfluorierten Analogon um weniger als 15 nm verschoben ist. Die spektralen Eigenschaften ausgewählter Farbstoffe sind in der Tabelle 1 angegeben.
Konjugate von Reaktivfarbstoffen
Eine Ausführungsform des fluorierten Fluorophors enthält mindestens eine -L-R_x-Gruppe, wobei R_x die reaktionsfähige Gruppe ist, die durch eine kovalente Verknüpfung L an das Fluorophor gebunden ist. In bestimmten Ausführungsformen (siehe Tabelle 9) ist R_x über mehrere dazwischenliegende Atome, die als ein Abstandshalter dienen, an den Farbstoff gebunden. Die Farbstoffe mit einer reaktionsfähigen Gruppe (R_x) markieren eine breite Vielfalt an organischen oder anorganischen Substanzen mit Fluoreszenz, die funktionelle Gruppen mit geeigneter Reaktionsfähigkeit enthalten oder so modifiziert sind, daß sie diese enthalten, was zur chemischen Anbindung der konjugierten Substanz (S_c) führt und durch -L-S_c dargestellt ist. Die reaktionsfähige Gruppe und die funktionelle Gruppe sind typischerweise ein Elektrophil und ein Nukleophil, die eine kovalente Verknüpfung bilden können. Alternativ ist die reaktionsfähige Gruppe eine photochemisch aktivierbare Gruppe und wird erst nach Belichtung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge chemisch reaktionsfähig. In der Tabelle 2 sind ausgewählte Beispiele für funktionelle Gruppen und Verknüpfungen dargestellt, wobei die Reaktion einer elektrophilen Gruppe und einer nukleophilen Gruppe eine kovalente Verknüpfung ergibt.
TABELLE 2: Beispiele für einige Wege zu nützlichen kovalenten Verknüpfungen
Die kovalente Verknüpfung L bindet die reaktionsfähige Gruppe R_x oder die konjugierte Substanz S_c an das Fluorophor, entweder direkt (L ist eine Einfachbindung) oder durch eine Kombination stabiler chemischer Bindungen, zu denen wahlweise Einfach-, Doppel-, Dreifach- oder aromatische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen sowie Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen, Stickstoff-Stickstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen und Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen gehören. L umfaßt typischerweise Ether-, Thioether-, Carboxamid-, Sulfonamid-, Harnstoff-, Urethan- oder Hydrazingruppierungen. Bevorzugte L-Gruppen weisen 1 bis 20 Nichtwasserstoffatome auf, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus C, N, O und S besteht, und sind aus einer beliebigen Kombination von Ether-, Thioether-, Amin-, Ester-, Carboxamid-, Sulfonamid-, Hydrazidbindungen und aromatischen oder heteroaromatischen Bindungen zusammengesetzt. L ist vorzugsweise eine Kombination von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindungen und Carboxamid- oder Thioetherbindungen. Der längste lineare Abschnitt der Verknüpfung L enthält vorzugsweise 4 bis 10 Nichtwasserstoffatome, einschließlich ein oder zwei Heteroatome. Beispiele für L sind substituiertes oder unsubstituiertes Polymethylen, Arylen, Alkylarylen oder Arylenalkyl. In einer Ausführungsform enthält L 1 bis 6 Kohlenstoffatome; in einer anderen ist L eine Thioetherverknüpfung. In einer noch anderen Ausführungsform weist L die Formel -(CH₂)_a(CONH(CH₂)_b)_z- auf, wobei a einen beliebigen Wert von 0 bis 5, b einen beliebigen Wert von 1 bis 5 aufweist und z 0 oder 1 ist.
Die Gruppe R_x ist an einem beliebigen von R²–R⁵ oder R⁷–R¹⁶, vorzugsweise an einem von R¹³–R¹⁶, insbesondere an R¹⁴ oder R¹⁵ direkt an das Fluorophor gebunden oder ist als ein Substituent an einem Alkyl-, Alkoxy-, Alkylthio- oder Alkylaminosubstituenten vorhanden. In einer Ausführungsform ist genau eines von R², R³, R⁴, R⁵, R⁷, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ oder R¹⁶ eine -L-S_c-Gruppierung. In einer anderen Ausführungsform ist genau eines von R¹³, R¹⁴, R¹⁵, oder R¹⁶ eine -L-S_c-Gruppierung. Wenn genau eines von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ oder R¹⁶ eine -L-S_c-Gruppierung ist, ist typischerweise entweder jedes der restlichen von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ oder R¹⁶ Fluor oder jedes der restlichen von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ oder R¹⁶ ist Wasserstoff. In einer Ausführungsform ist genau eines von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ eine -L-R_x-Gruppierung. In einer anderen Ausführungsform ist genau eines von R², R³, R⁴, R⁵, R⁷ oder R¹⁰ eine -L-R_x-Gruppierung. In einer anderen Ausführungsform, in der R¹² eine Carbonsäure oder eine Sulfonsäure ist, ist in dem fluorierten Farbstoff eine zusätzliche -L-R_x-Gruppierung vorhanden.
Die Auswahl der kovalenten Verknüpfung, die das Fluorophor an die konjugierte Substanz binden soll, hängt typischerweise von der funktionellen Gruppe an der zu konjugierenden Substanz ab. Zu den Typen funktioneller Gruppen, die in den organischen oder anorganischen Substanzen typischerweise vorhanden sind, gehören Amine, Thiole, Alkohole, Phenole, Aldehyde, Ketone, Phosphate, Imidazole, Hydrazine, Hydroxylamine, disubstituierte Amine, Halogenide, Epoxide, Sulfonatester, Purine, Pyrimidine, Carbonsäuren oder eine Kombination dieser Gruppen, sind aber nicht auf diese beschränkt. In der Substanz kann ein einziger Typ einer reaktionsfähigen Stelle verfügbar sein (typisch für Polysaccharide) oder eine Vielzahl an Stellen (z. B. Amine, Thiole, Alkohole, Phenole) vorkommen, wie es für Proteine typisch ist. Eine konjugierte Substanz kann an mehr als einem Fluorophoren, das gleich oder verschieden sein kann, oder an einer Substanz konjugiert sein, die zusätzlich durch ein Hapten modifiziert ist. Obwohl durch sorgfältiges Steuern der Reaktionsbedingungen eine gewisse Selektivität erhalten werden kann, wird die Selektivität des Markierens am besten durch Auswahl eines geeigneten Reaktivfarbstoffes erhalten.
R_x wird typischerweise mit einem Amin, einem Thiol oder einem Alkohol reagieren. In einer Ausführungsform ist R_x eine Acrylamid-, eine aktivierte Estergruppe einer Carbonsäure, eine Acylazid-, eine Acylnitril-, eine Aldehyd-, eine Alkylhalogenid-, eine Amin-, eine Anhydrid-, eine Anilin-, eine Arylhalogenid-, eine Azid, eine Aziridin-, eine Boronat-, eine Carbonsäure-, eine Diazoalkan-, eine Halogenacetamid-, eine Halogentriazin-, eine Hydrazin-, eine Imidoster-, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanat-, eine Maleinimid-, eine Phosphoramidit-, eine Sulfonylhalogenid- oder eine Thiolgruppe. R_x ist vorzugsweise eine Carbonsäure-, eine Succinimidylester-, eine Amin-, eine Halogenacetamid-, eine Alkylhalogenid-, eine Sulfonylhalogenid-, eine Isothiocyanat-, eine Maleinimid- oder eine Azidoperfluorbenzamidogruppe.
Die Substitution mit einem Halogenalkyl, Halogenacetamid, Halogenmethylbenzamid ermöglicht die Zurückhaltung fluorierter Fluorophore in Zellen oder Organellen gemäß den Verfahren die früher beschrieben wurden (US-Patentschriften 5,362,628 und 5,576,424 (in Zellen) und US-Patentschrift 5,459,268 und UK 9 420 661.2 (in Mitochondrien)). Farbstoffe, die an dem Bodenring fluoriert sind, ergeben Addukte von Glutathion (z. B. Verbindung 25) und Protein, die in Zellen zurückgehalten werden.
Zu nützlichen Farbstoffkonjugaten gehören Konjugate von Antigenen, Steroiden, Vitaminen, Arzneimitteln, Haptenen, Metaboliten, Toxinen, Umweltschadstoffen, Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Nucleinsäuren, Nucleinsäurepolymeren, Kohlenhydraten, Lipiden, ionenkomplexierenden Gruppierungen und Polymeren. Alternativ sind diese Konjugate von Zellen, Zellsystemen, Zellfragmenten oder subzellulären Teilchen. Beispiele sind Virusteilchen, Bakterienteilchen, Viruskomponenten, biologische Zellen (wie z. B. Tierzellen, Pflanzenzellen, Bakterien oder Hefe) oder Zellkomponenten. Fluorierte Reaktivfarbstoffe markieren reaktionsfähige Stellen an der Zellenoberfläche, in Zellmembranen, Organellen oder im Zytoplasma oder derivatisieren Verbindungen von geringem Molekulargewicht zur Analyse mittels Kapillarzonenelektrophorese, HPLC oder anderer Trenntechniken. Die konjugierte Substanz ist vorzugsweise eine Aminosäure, ein Peptid, ein Protein, ein Polysaccharid, eine ionenkomplexierende Gruppierung, ein Nucleotid, ein Oligonucleotid, eine Nucleinsäure, ein Hapten, ein Arzneimittel, ein Lipid, ein Phospholipid, ein Lipoprotein, ein Lipopolysaccharid, ein Liposom, ein lipophiles Polymer, ein Polymer, ein polymeres Mikroteilchen, eine biologische Zelle oder ein Virus.
In einer Ausführungsform ist die konjugierte Substanz (S_c) eine Aminosäure (einschließlich derjenigen, die durch Phosphate, Kohlenhydrate oder C₁- bis C₂₂-Carbonsäuren geschützt oder damit substituiert sind) oder ein Polymer von Aminosäuren, wie z. B. ein Peptid oder ein Protein. Bevorzugte Konjugate von Peptiden enthalten mindestens fünf Aminosäuren, insbesondere 5 bis 36 Aminosäuren. Zu bevorzugten Peptiden gehören Neuropeptide, Zytokine, Toxine, Proteasesubstrate und Proteinkinasesubstrate, sind aber nicht auf diese beschränkt. Zu bevorzugten Proteinkonjugaten gehören Enzyme, Antikörper, Lectine, Glycoproteine, Histone, Albumine, Lipoproteine, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G, Phycobiliproteine und andere fluoreszierende Proteine, Hormone, Toxine und Wachstumsfaktoren. Das konjugierte Protein ist typischerweise ein Antikörper, ein Antikörperfragment, Avidin, Streptavidin, ein Toxin, ein Lectin oder ein Wachstumsfaktor. Zu Farbstoff-Peptid- und -Protein-Konjugaten gehören diejenigen, die mit einem Farbstoff der Erfindung in Kombination mit einem zweiten fluoreszierenden oder nichtfluoreszierenden Farbstoff markiert sind, um ein Energieübertragungspaar zu bilden.
In einer anderen Ausführungsform ist die konjugierte Substanz (S_c) eine Nucleinsäurebase, ein Nucleosid, Nucleotid oder ein Nucleinsäurepolymer, das wahlweise einen zusätzlichen Verknüpfer oder Abstandhalter für die Anbindung eines Fluorophors oder eines anderen Liganden enthält, wie z. B. eine Alkinylverknüpfung (US-Patentschrift 5,047,519), eine Aminoallylverknüpfung (US-Patentschrift 4,711,955) oder eine andere Verknüpfung. Das konjugierte Nucleotid ist vorzugsweise ein Nucleosidtriphosphat oder ein Desoxynucleosidtriphosphat oder ein Didesoxynucleosidtriphosphat.
Bevorzugte Nucleinsäurekonjugate sind markierte, ein- oder mehrsträngige, natürliche oder synthetische DNA- oder RNA-Oligonucleotide oder DNA/RNA-Hybride oder beinhalten einen ungewöhnlichen Verknüpfer, wie z. B. morpholinderivatisierte Phosphate (AntiVirals, Inc., Corvallis OR), oder Peptidnucleinsäuren, wie z. B. N-(2-Aminoethyl)glycin-Einheiten, wobei die Nucleinsäure weniger als 50 Nucleotide, typischer weniger als 25 Nucleotide enthält. Der Farbstoff ist typischerweise über eine oder mehrere Purin- oder Pyrimidinbasen durch eine Amid-, Ester-, Ether- oder Thioetherbindung gebunden oder ist an das Phosphat oder Kohlenhydrat durch eine Bindung gebunden, die ein Ester, Thioester, Amid, Ether oder Thioether ist. Alternativ ist mindestens ein Farbstoff der Erfindung an ein Oligonucleotid konjugiert, das gleichzeitig mit mindestens einem zweiten Farbstoff markiert ist, um ein Fluoreszenz-Energieübertragungspaar zu bilden, oder an ein Hapten, wie z. B. Biotin oder Digoxigenin, oder an ein Enzym, wie z. B. alkalische Phosphatase, oder an ein Protein, wie z. B. einen Antikörper. Nucleotidkonjugate der Erfindung lassen sich von DNA-Polymerase leicht einbeziehen und können zur In-situ-Hybridisierung (siehe unten) und Nucleinsäuresequenzierung (z. B. US-Patentschriften 5,332,666; 5,171,534 und 4,997,928 und WO-Anmeldung 94/05 688) benutzt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist die konjugierte Substanz (S_c) ein Kohlenhydrat, das typischerweise ein Polysaccharid, wie z. B. Dextran, FICOL, Heparin, Glycogen, Amylopectin, Mannan, Inulin, Stärke, Agarose und Cellulose, ist. Bevorzugte Polysaccharidkonjugate sind Dextran- oder FICOL-Konjugate.
In einer anderen Ausführungsform ist die konjugierte Substanz (S_c) ein Lipid (typischerweise mit 6 bis 25 Kohlenstoffatomen), einschließlich Glycolipiden, Phospholipiden und Sphingolipiden. Alternativ ist die konjugierte Substanz ein Lipidvesikel, wie z. B. ein Liposom, oder ist ein Lipoprotein (siehe unten). Die lipophile Gruppierung kann benutzt werden, um die Verbindungen in Zellen zurückzuhalten, wie beschrieben in der US-Patentschrift 5,208,148.
Konjugate, die eine ionenkomplexierende Gruppierung aufweisen, dienen als ein Indikator für Calcium, Natrium, Magnesium, Kalium oder ein anderes biologisch wichtiges Metallion. Bevorzugte ionenkomplexierende Gruppierungen sind Kronenether, einschließlich Diaryldiaza-Kronenether (US-Patentschrift 5,405,975), BAPTA (US-Patentschrift 5,453,517, US-Patentschrift 5,516,911 und US-Patentschrift 5,049,673), Derivate APTRA (AM. J. PHYSIOL. 256, C540 (1989)) und pyridin- und phenanthrolinbasierte Metallionenchelatbildner, vorzugsweise ein Diaryldiaza-Kronenether- oder ein BAPTA-Chelatbildner. Die Ionenindikatoren werden wahlweise an Kunststoff- oder biologische Polymere, wie z. B. Dextrane, konjugiert, um deren Nützlichkeit als Sensoren zu verbessern. Alternativ wirkt der Farbstoff bei pH-Werten innerhalb von 1,5 pH-Einheiten des jeweiligen pKa des Farbstoffs selber als ein Indikator für H⁺. Diejenigen Ausführungsformen von Farbstoffen, die an R² und R⁵ Fluor aufweisen, sind als pH-Indikatoren über den Bereich von pH 4 bis 6 äußerst nützlich.
Schließlich sind die Konjugate wahlweise Farbstoffkonjugate von Polymeren, polymeren Teilchen, polymeren Mikroteilchen, einschließlich magnetischen und nichtmagnetischen Mikrokügelchen, polymeren Membranen, leitfähigen und nichtleitfähigen Metallen und Nichtmetallen und Glas- und Kunststoffoberflächen und -teilchen. Konjugate werden wahlweise durch Copolymerisation eines fluorierten Farbstoffes, der eine geeignete Funktionalität enthält, während des Herstellens des Polymers oder durch chemische Modifizierung eines Polymers, das funktionelle Gruppen mit geeigneter chemischer Reaktionsfähigkeit enthält, hergestellt. Zu anderen Reaktionstypen, die zum Herstellen von Farbstoffkonjugaten von Polymeren nützlich sind, gehören katalysierte Polymerisationen oder Copolymerisationen von Alkenen und Reaktionen von Dienen mit Dienophilen, Umesterungen oder Umaminierungen. In einer anderen Ausführungsform ist die konjugierte Substanz ein Glas oder Silika, das zu einer optischen Faser oder einer anderen Struktur gebildet werden kann.
Die Herstellung von Farbstoffkonjugaten unter Benutzung von Reaktivfarbstoffen ist gut dokumentiert, z. B. von R. Haugland, MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Serie 1 bis 7 (1992) und Brinkley, BIOCONJUGATE CHEM., 3,2 (1992). Konjugate resultieren typischerweise aus dem Vermischen geeigneter fluorierter Reaktivfarbstoffe und der zu konjugierenden Substanz in einem geeigneten Lösemittel, in dem beide löslich sind. Für diejenigen Reaktivfarbstoffe, die photochemisch aktiviert werden, erfordert die Konjugation die Belichtung der Reaktionsmischung, um den Reaktivfarbstoff zu aktivieren. Das Farbstoff-Biomolekül-Konjugat wird in Lösung oder lyophilisiert benutzt.
Markierte Glieder eines spezifischen Bindungspaars werden als fluoreszierende Sonden für das komplementäre Glied dieses spezifischen Bindungspaars benutzt, wobei jedes spezifische Bindungspaarglied einen Bereich an der Oberfläche oder in einem Hohlraum aufweist, der sich spezifisch an eine besondere räumliche und polare Organisation des anderen bindet und zu dieser komplementär ist. Typische spezifische Bindungspaare sind in der Tabelle 3 dargestellt. Derartige Sonden enthalten wahlweise einen BLOCK, der durch ein Enzym oder Licht entfernt wird, oder R¹¹ ist H und die Verbindung fluoresziert nach der Oxidation.
Tabelle 3 – Typische spezifische Bindungspaare
BLOCKIERTE Farbstoffe und andere Substrate
In Ausführungsformen, in denen R⁷ eine BLOCK-Gruppierung ist (die gleich oder verschieden sein kann), welche die Fluoreszenz des Fluorophors wesentlich verändert, führt die Entfernung von BLOCK die Fluoreszenz des Mutterfarbstoffes wieder herbei. BLOCK ist typischerweise eine einwertige Gruppierung, die durch Entfernen einer Hydroxygruppe aus einem Phosphat oder Sulfat abgeleitet ist, oder ein biologisch kompatibles Salz davon, oder aus einer Carboxygruppe einer aliphatischen oder aromatischen Carbonsäure oder einer Aminosäure, einer geschützten Aminosäure, einem Peptid oder einem geschützten Peptid oder einem Alkohol oder einem Mono- oder Polysaccharid abgeleitet ist. Die BLOCK-Fluorophor-Bindung an R⁷ ist typischerweise eine Ether- oder eine Esterbindung.
Alternativ ist Block eine photochemisch labile, absperrende Gruppe an einem Farbstoff oder einem Farbstoffkonjugat. Die Absperrung an R⁷ ist typischerweise ein substituiertes oder unsubstituiertes Derivat von o-Nitroarylmethin (einschließlich α-Carboxy-o-nitroarylmethin und Bis(5-t-butoxycarbonylmethoxy)-2-nitrobenzyl (Verbindung 101)), von 2-Methoxy-5-nitrophenyl oder Desyl.
Wenn die Abspaltung von BLOCK ein nachweisbares Ansprechen ergibt, welches das Vorhandensein einer Enzymaktivität anzeigt, ist die Verbindung ein Enzymsubstrat. Zu Enzymen, die dafür bekannt sind, daß sie diese konjugierten Gruppierungen abspalten, gehören mikrosomale Dealkylasen (z. B. Cytochrom-P450-Enzyme), Glycosidasen (z. B. β-Galactosidase, β-Glucosidase, α-Fucosidase, β-Glucosaminidase), Phosphatasen, Sulfatasen, Esterasen, Lipasen, Guanidinobenzoatasen und andere. Fluorierte Fluoresceindiacetatverbindungen treten bereitwillig in unversehrte Zellen ein, wo die Acetatgruppierungen durch intrazelluläre Esterasen in lebensfähigen Zellen gespalten werden, wodurch die Eigenfluoreszenz wiederhergestellt wird und Durchführbarkeit angezeigt wird. In ähnlicher Weise treten fluorierte Farbstoffe, die mit Acetoxymethylestern (wie z. B. fluorierten Analoga von Calcein-AM, z. B. Verbindung 99) substituiert sind, bereitwillig in unversehrte Zellen ein und können als Zell-Tracer oder Lebensfähigkeitsindikatoren dienen, insbesondere wenn R¹¹ H ist.
Jeder der Substituenten, die oben zum Zurückhalten der Farbstoffe in Zellen beschrieben sind, kann benutzt werden, um die Substrate in Zellen zurückzuhalten. Bevorzugte Enzymsubstrate sind an dem Bodenring fluoriert. Besonders bevorzugte Substrate weisen zwei identische BLOCK-Gruppierungen auf, die Acetat oder Glycosid sind, wie z. B. β-D-Galactopyranosid, die am Bodenring mindestens tetrafluoriert sind.
Farbstoffverbindungen, die in wäßriger Lösung einen pKa von < 6, insbesondere von kleiner als etwa 5 aufweisen, sind bevorzugte Substrate in einer sauren Umgebung (z. B. einer sauren β-Galactosidase, wie z. B. β-D-Galactopyranosid, oder in sauren Organellen, wie z. B. Substrate für Lysosomalglycosidasen (siehe Tabelle 14). Substrate, bei denen -BLOCK durch ein Phosphataseenzym abspaltbar ist, sind nützlich, um sowohl saure als auch alkalische Phosphatase nachzuweisen. Bevorzugte Substrate zum Nachweis von Enzymen mit maximalen Umsatzraten unterhalb von pH 7 sind an den 2'- und 7'-Positionen fluoriert.
In einer anderen Substratausführungsform, sind Farbstoffe, bei denen R¹¹ H ist, Substrate für oxidative Enzyme und andere Oxidationsmittel, z. B. Peroxidaseenzyme. Im Gegensatz zu ihren nichtfluorierten Analoga sind fluorierte Dihydrofluoresceine ohne die Benutzung von blockierenden Gruppen, die typischerweise die Löslichkeit verringern, in wäßrigen Lösungen stabil. Z. B. ist die Verbindung 84 (4,5,6,7-Tetrafluordihydrofluorescein) in Wasser zu mindestens 2 mM löslich.
Anwendungsverfahren
Die neuen Farbstoffe werden im allgemeinen verwendet, um eine Probe anzufärben, um unter gewünschten Bedingungen ein nachweisbares optisches Ansprechen zu ergeben, indem die interessierende Probe mit einer Lösung eines Farbstoffes (hergestellt gemäß Verfahren, die in dem Fachgebiet allgemein bekannt sind) für einen Zeitraum zusammengegeben wird, der ausreichend ist, damit die Farbstoffverbindung unter den gewünschten Bedingungen ein nachweisbares optisches Ansprechen ergibt. Die erforderliche Konzentration für die Farbstofflösung (typischerweise nanomolar bis mikromolar) wird durch systematisches Variieren der Farbstoff- oder Farbstoffkonjugatkonzentration bestimmt, bis ein zufriedenstellendes Anfärben mit dem Farbstoff erreicht wird.
Die Farbstoffverbindungen werden am vorteilhaftesten benutzt, um Proben mit biologischen Komponenten anzufärben. Die Probe kann heterogene Mischungen aus Komponenten (einschließlich unversehrter Zellen, Zellextrakte, Bakterien, Viren, Organellen und Mischungen davon) oder eine einzelne Komponente oder eine homogene Gruppe von Komponenten (z. B. natürliche oder synthetische Aminosäuren, Nucleinsäuren oder Kohlenhydratpolymere oder Lipidmembrankomplexe) umfassen. Diese Farbstoffe sind in den Anwendungskonzentrationen für lebende Zellen und andere biologische Komponenten im allgemeinen ungiftig, obwohl diejenigen fluorierten Farbstoffe, die zusätzlich ein- oder mehrfach mit Br oder I substituiert sind, effiziente Photosensibilisatoren sind.
Die Probe wird gemäß bekannter Verfahren im Verlauf des Anfärbens wahlweise mit anderen Lösungen kombiniert, einschließlich Waschlösungen, Permeabilisations- und/oder Fixierlösungen und anderen Lösungen, die zusätzliche Nachweisreagentien enthalten. Mit ausgewählten Ausführungsformen, die in Zellen gut zurückgehalten werden, bewahren die Zellen nach der Fixierung eine beträchtliche fluoreszierende Anfärbung. Wenn das zusätzliche Nachweisreagens spektrale Eigenschaften besitzt, die von denjenigen der Farbstoffverbindungen der Erfindung abweichen, sind Mehrfarbenanwendungen möglich.
Nach oder während des Anfärbens wird die Probe belichtet, um ein nachweisbares optisches Ansprechen zu ergeben, und mit einem Mittel zum Nachweisen des optischen Ansprechens unter Benutzung eines Fluorometers, Mikroskops, Mikroplattenlesers, Durchflußzytometers, Laserscanners, einer Handlampe oder einer anderen Vorrichtung beobachtet. Das optische Ansprechen ist typischerweise eine Änderung der Fluoreszenz, wie z. B. eine Änderung der Intensität oder der Anregungs- oder Emissionswellenlänge, der Fluoreszenzverteilung, der Fluoreszenzlebensdauer, der Fluoreszenzpolarisierung, oder eine Kombination dieser.
Das Anfärben wird benutzt, um gemäß bekannter Verfahren die Anwesenheit, die Menge oder die räumliche oder zeitliche Verteilung von Komponenten oder eines Mechanismus in einer Probe zu bestimmen. Die Farbstoffe der Erfindung sind gut geeignet zur Herstellung eines Kits, das einen fluorierten Reaktivfarbstoff und Anweisungen für das Konjugieren des Farbstoffs an jede beliebige Substanz, die eine geeignete funktionelle Gruppe besitzt, und wahlweise für das Zurückgewinnen oder Reinigen der Materialien umfaßt, die damit markiert sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf biologische Polymere (z. B. Proteine, Oligonucleotide oder Kohlenhydrate), polymere Harze und Kunststoffe (z. B. Polystyrol), Metalle, Gläser und andere organische oder anorganische Substanzen. Fluorierte Xanthenfarbstoffe sind auch nützliche Haptene, da die Fluorierung bei der Erkennung des Fluorophors durch den Anti-Fluoreszein-Antikörper nicht stört, was typischerweise zu einer Fluoreszenzlöschung des Farbstoffes führt (siehe Tabelle 15).
Farbstoffsynthese
Der erste Schritt beim Herstellen eines fluorierten Fluoresceinfarbstoffes ist die Herstellung eines entsprechend substituierten Resorcins. Obwohl Verfahren zum Herstellen von fluorierten Resorcinen bekannt sind (Patrick et al., J. ORG. CHEM. 51, 3242 (1986), Lerman et al., J. ORG. CHEM., 49, 806 (1984)), werden fluorierte Resorcine zweckmäßiger aus einem (handelsüblichen) Polyfluornitrobenzol oder einem alkoxysubstituierten Derivat synthetisiert. Die Fluoratome in ortho- und para-Stellung zum Nitro werden mit zwei Äquivalenten Alkoxid oder Benzyloxid verdrängt. Dann wird die Nitrogruppe reduziert, gefolgt von Diazotierung und reduktiver Dediazotierung (siehe Tabelle 4). Alternativ werden die Diazoniumkationen als reine Salze isoliert, gefolgt von Reduktion mit Natriumhydroborat. Die Dealkylierung mit BBr₃ oder einem anderen etherspaltenden Reagens oder, im Falle von Benzylethern, die katalytische Hydrogenolyse liefert reine fluorierte Resorcine. Wahlweise sind andere Substituenten während der Synthese anwesend, vorausgesetzt jedoch, daß diese das Syntheseverfahren überstehen, z. B. Alkyl-, Carboxyalkyl-, Chlor-, Brom-, Iod-, Alkoxy- und Hydroxygruppierungen.
Xanthyliumfarbstoffe, die in dem Xanthenabschnitt des Farbstoffes Fluorsubstituenten aufweisen, werden typischerweise durch Kondensation eines fluorierten Resorcins mit einer Phthalsäure, einem Phthalsäureanhydrid, einer Sulfobenzoesäure oder einem Sulfobenzoesäureanhydrid (wie z. B. Phthalsäureanhydrid, Trimellitsäureanhydrid, Nitrophthalsäureanhydrid, o-Sulfobenzoesäureanhydrid, Sulfoterephthalsäure) oder mit Benzaldehyden (wenn von Oxidation gefolgt) oder mit aliphatischen Dicarbonsäuren oder -anhydriden, wie z. B. einem Bernsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid, hergestellt. Die Kondensation wird wahlweise katalysiert (wie z. B. durch ZnCl₂ oder Methansulfonsäure) und ergibt nach wäßriger Aufarbeitung den gewünschten fluorierten Xanthyliumfarbstoff.
Fluorierte Xanthyliumfarbstoffe werden auch durch Kondensieren von zwei Äquivalenten eines Resorcins mit einer fluorierten Benzolcarbonylverbindung, wie z. B. Tetrafluorphthalsäureanhydrid, Tetrafluorphthalsäure oder Fluorphthalsäurederivaten, Pentafluorbenzoesäure, und fluorierten Benzaldehyden, wie z. B. Pentafluorbenzaldehyd, hergestellt, obwohl nach der Benutzung von fluorierten Benzaldehyden ein Oxidationsschritt erforderlich ist, um den fluoreszierenden Xanthyliumfarbstoff zu ergeben. Die resultierenden Farbstoffe sind an dem Arylring fluoriert, der an das Xanthenringsystem gebunden ist. Wenn der Arylring an den 4- und 6-Positionen fluoriert ist, können Nucleophile, wie z. B. reduziertes Glutathion, Mercaptoessigsäure, Mercaptoethylamin und Azid das Fluoridion an der 4- oder 6-Position verdrängen, wodurch ein Syntheseweg für die nachfolgende Konjugationschemie geschaffen ist (siehe Tabelle 8). Z. B. wird ein Mercaptoessigsäureaddukt in einen Succinimidylester umgewandelt oder ein Mercaptoethylamino wird in ein Isothiocyanat, Maleinimid oder Halogenacetamid umgewandelt. Alternativ wird die Azidgruppe zu einem Amin reduziert, das dann mit Iodessigsäureanhydrid acyliert wird, um ein Iodacetamid zu liefern.
Fluorierte Xanthyliumfarbstoffe werden auch von polyfluorierten Benzonitrilen ausgehend erhalten. Die Zugabe eines Alkoxids oder eines Benzyloxids zu dem Benzonitril verdrängt die Fluoratome in ortho- und para-Stellung zu der Nitrilgruppe. Die Zugabe eines arylorganometallischen Reagens, wie z. B. Pentafluorphenylmagnesiumchlorid, wandelt die Nitrilgruppe in ein Imin um, das anschließend hydrolysiert wird und ein substituiertes Benzophenon mit Alkoxygruppen an den 2- und 4-Positionen liefert. Die Alkoxygruppen werden dealkyliert, z. B. mit Bromwasserstoffsäure und Essigsäure. Die Behandlung mit NaOH in Methanol ergibt dann ein Xanthenon, in dem die 2-Hydroxygruppe das 2'-Fluoratom verdrängt hat; gleichzeitig verdrängt eine Alkoxygruppe das 4'-Fluoratom. Die 3-Hydroxygruppe in dem resultierenden Xanthon wird typischerweise durch eine basestabile Schutzgruppe, wie z. B. einen 2-Methoxyethylmethylether (MEM-Ether) geschützt, und dann wird der Xanthoncarbonylgruppe ein arylorganometallisches Reagens, wie z. B. Pentafluorphenylmagnesiumchlorid oder ein Alkyllithiumreagens, zugegeben. Die anschließende Behandlung mit Bromwasserstoff- und Essigsäure entwässert das resultierende tertiäre Carbinol zu dem gewünschten Xanthyliumfarbstoff, bei gleichzeitiger Umwandlung der 6-Methoxygruppe in eine Hydroxygruppe.
Für asymmetrische Xanthyliumfarbstoffe, wie z. B. asymmetrische Fluoresceine, kann die Kondensation unter Benutzung von einem Äquivalent jedes der geeigneten substituierten oder unsubstituierten Resorcine mit einem Äquivalent eines anderen Resorcins (wie bei Khanna et al., US-Patentschrift Nr. 4,439,359 (1984)), eines Aminophenols und mit einem Äquivalent des geeigneten Phthalsäurederivats oder Benzaldehyds durchgeführt werden. Die Synthese kann gemeinsam oder schrittweise durchgeführt werden, wie in dem US-Patent Nr. 5,227,487 an Haugland et al. (1993)(siehe Tabelle 7) beschrieben.
Modifikationen fluorierter Xanthyliumfarbstoffe werden gemäß bekannter Verfahren zum Modifizieren von Fluoresceinen durchgeführt. Z. B. kann das fluorierte Fluorescein mit einem geeigneten Halogenierungsmittel, wie z. B. flüssigem Brom (z. B. Verbindung 31) halogeniert werden. Wenn die 4'- und/oder 5'-Positionen eines fluorierten Fluoresceins durch Wasserstoffatome besetzt sind, können diese Positionen unter Benutzung von Mannich-Bedingungen (wie bei Kirkemo et al., US-Patentschrift Nr. 4,510,251, oben) mit Aminomethylgruppen substituiert werden, insbesondere wenn das substituierte Amin Iminodiessigsäure oder eine Aminosäure ist. Wenn am Bodenring ein Carboxylat vorhanden ist, kann es durch Reduktion, gefolgt von der Behandlung mit HCl oder HBr, in einen Chlormethyl- oder Brommethylsubstituenten umgewandelt werden. Wenn zwei isomere Carboxylate vorhanden sind, werden diese wahlweise getrennt (Allgemeines Verfahren J) oder als eine Mischung aus Isomeren benutzt. Reduzierte Xanthyliumfarbstoffe mit der Formel 2 werden durch Reduktion des Xanthenons mit Zinkstaub oder Hydroborat in organischen Lösemitteln hergestellt (siehe Tabelle 11). Diese dihydrofluorierten Farbstoffe dienen als Substrate für Enzyme, die Elektronen aufnehmen, oder bei dem Nachweis von Oxidationsmitteln, reaktionsfähigen Sauerstoffspezies oder Stickstoff(II)-oxiden. Die Herstellung anderer Enzymsubstrate umfaßt die Acylierung von phenolischen Hydroxylen mit Phosphat, um Phosphatasesubstrate zu ergeben, mit Carbonsäuren, um Esterasesubstrate zu ergeben, die Alkylierung, um Dealkylasesubstrate zu ergeben, und mit Kohlenwasserstoffen, um Glycosidasesubstrate zu ergeben.
Die Dihydroxanthen- und Xanthyliumvarianten der Farbstoffe der Erfindung sind durch gut bekannte Oxidations- oder Reduktionsmittel, einschließlich Hydroborate, Aluminiumhydride, Wasserstoff/Katalysator und Dithionite, frei ineinander umwandelbar. Eine Vielzahl an Oxidationsmitteln vermittelt die Oxidation von Dihydroxanthenen, einschließlich molekularer Sauerstoff in Gegenwart oder bei Abwesenheit eines Katalysators, Stickstoff(II)-oxid, Peroxynitrit, Dichromat, Triphenylcarbenium und Chloranil. Die Xanthene werden auch durch Enzymwirkung, einschließlich Meerrettich-Peroxidase in Kombination mit Peroxiden oder durch Stickstoff(II)-oxid, oxidiert.
Die untenstehenden Beispiele sind gegeben, um die praktische Anwendung dieser Erfindung zu veranschaulichen. Sie sollen den Gesamtumfang dieser Erfindung nicht begrenzen oder definieren.
Beispiele
Herstellung von fluorierten Resorcinen
Allgemeines Verfahren A
Natriummethoxid (1,0 M) wird durch portionsweises Zugeben von metallischem Natrium zu wasserfreiem Methanol (Aldrich) unter Stickstoff bei 0ºC hergestellt. Zu einem reinen fluorierten Nitrobenzol (1,0 Äquiv.) unter Stickstoff bei Raumtemperatur wird während 5 bis 10 Minuten Natriummethoxidlösung (2,2 Äquiv.) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur gerührt. Wenn die DC-Analyse zeigt, daß die Reaktion vollständig ist (1 bis 24 Stunden), werden mehrere Tropfen 1 M Zitronensäure zugegeben. Wasser wird zugegeben, gefolgt von der Extraktion mit Ether. Die organische Schicht wird mit Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, eingedampft und aus Hexanen/CH₂Cl₂ umkristallisiert, um das gewünschte Dimethoxyfluornitrobenzol zu erhalten.
Allgemeines Verfahren B
Die Nitrogruppe des Fluornitrobenzols wird durch katalytische Hydrierung bei 40 psi in Ethanol/Ethylacetat über 10% Pd/C reduziert. Wenn die DC-Analyse zeigt, daß die Reaktion vollständig ist, wird der Katalysator durch Filtration entfernt und das Filtrat wird verdampft, um das reine, aminsubstituierte, fluorierte Benzol zu ergeben.
Allgemeines Verfahren C
Die Nitrogruppe des Fluornitrobenzols wird durch homogene Reduktion in Ethylacetat/Ethanol (2 : 1, 0,10 M) unter Rückfluß unter Benutzung von Zinn(II)chloriddihydrat (5 Äquiv.) reduziert. Das Fortschreiten der Reaktion wird mittels DC überwacht. Die Reaktionsmischung wird gekühlt, in Wasser gegossen und mit 1 M NaOH auf pH 7 neutralisiert. Die Mischung wird mit Ethylacetat extrahiert, mit Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mittels Flash-Chromatographie gereinigt.
Allgemeines Verfahren D
Das gewünschte Aminofluorbenzol in Wasser/HCl (2 : 1, 0,3 M) wird in Eis gekühlt und mit einer kalten Lösung aus NaNO₂ (1,05 Äquiv.) in Wasser behandelt. Die Diazoniumsalzlösung wird 15 Minuten lang gerührt, dann wird hypophosphorige Säure (50%ige wäßrige Lösung, 20 Äquiv.) während 5 Minuten zugegeben. Die Mischung wird zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Wasser verdünnt. Die Mischung wird mit wäßrigem Na₂CO₃ oder NaOH neutralisiert und zweimal mit Ether extrahiert. Der organische Extrakt wird mit Wasser gewaschen, dann mit Sole und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Lösung wird eingedampft, und der Rückstand wird mittels Flash-Chromatographie gereinigt.
Allgemeines Verfahren E
Eine Lösung des fluorierten Dimethoxybenzols in wasserfreiem CH₂Cl₂ (0,3 M) bei Raumtemperatur unter Stickstoff wird mittels einer Spritze mit BBr₃ (3,0 Äquiv., 1,0 M in CH₂Cl₂) während fünf Minuten behandelt. Die DC zeigt, daß die Reaktion 24 bis 48 Stunden benötigt, um Vollständigkeit zu erreichen; zuweilen ist zusätzliches 0,5 Äquiv. BBr₃-Lösung notwendig, um Vollständigkeit zu erreichen. Die Lösung wird sorgfältig mit Wasser abgeschreckt und gerührt, um einen Niederschlag aufzulösen. Die Lösung wird mit Ether extrahiert, die Extrakte werden mit Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und eingedampft und mittels Sublimation gereinigt, um das gewünschte fluorierte Resorcin zu ergeben.
Tabelle 4
Herstellung von fluorierten Fluoresceinen
Allgemeines Verfahren H
Ein fluoriertes Resorcin (2 Äquiv.), eine Phthalsäure oder -anhydrid (1 Äquiv.) und wasserfreies ZnCl₂ (2,5 Äquiv.) werden bei etwa 170 bis 180ºC 30 Minuten lang unter Rühren geschmolzen. Die abgekühlte Mischung wird in Wasser suspendiert und abgenutscht. Der Feststoff, der das fluorierte Fluorescein enthält, wird durch Auflösen in Methanol/Wasser, gefolgt von Filtration durch Diatomeenerde und Eindampfen, weiter gereinigt.
Allgemeines Verfahren H'
Alternativ wird das rohe fluorierte Fluorescein aus Verfahren H in Essigsäureanhydrid und Pyridin unter kurzem Erhitzen in ein Diacetat umgewandelt, und die Mischung wird der wäßrigen Aufarbeitung und chromatographischen Reinigung oder Umkristallisierung des (der) in organischen Lösemitteln löslichen Produkts (Produkte) unterworfen.
Allgemeines Verfahren I
Alternativ werden ein gewünschtes fluoriertes Resorcin (2 Äquiv.) und ein Phthalsäureanhydrid (1 Äquiv.) in Methansulfonsäure als eine 10 gew./vol.-%-ige Lösung für 48 h auf 80 bis 85ºC erhitzt. Die abgekühlte Lösung wird in 7 Volumina einer Eis/Wasser-Mischung gegossen. Der Niederschlag wird aufgefangen, mit kaltem Wasser gewaschen, unter Vakuum bei 60ºC getrocknet und, wie unter Verfahren H beschrieben, gereinigt.
Allgemeines Verfahren I'
Brom (6 Äquiv.) wird tropfenweise zu einer Lösung eines fluorierten Farbstoffes (1 Äquiv.) in MeOH gegeben. Die Mischung wird 3 Stunden lang gerührt, dann eingedampft. Der Rückstand wird mit Essigsäureanhydrid und Pyridin 1 Stunde lang gerührt, mit Ethylacetat verdünnt, mit 1 M Zitronensäure, dann mit Sole gewaschen und eingedampft. Der Rückstand wird mittels Säulenchromatographie gereinigt, um den bromierten Farbstoff zu erhalten.
Allgemeines Verfahren J
Isolierung von Carboxyfluorescein-Isomeren: Das fluorierte Carboxyfluorescein (1 Äquiv.), Pyridin (4 Äquiv.) und Essigsäureanhydrid (100 Äquiv.) werden für 5 Minuten auf 80ºC erhitzt. Die Reaktion wird für 24 Stunden auf –4ºC gekühlt. Der kristalline Niederschlag (das Pyridiniumsalz des 6-isomeren Diacetats) wird aufgefangen, mit Essigsäureanhydrid, Ether gewaschen und getrocknet, um ein schmutzigweißes Pulver zu ergeben. Das Filtrat wird zusammen mit einem gleichen Volumen Wasser 30 min lang gerührt und mit Ethylacetat extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird mit Sole gewaschen, getrocknet, eingedampft und aus CH₂Cl₂ umkristallisiert, um das 5-isomere Diacetat als freie Säure zu ergeben. Das Filtrat wird aufkonzentriert, in Toluol wieder aufgelöst, 1,5 Äquiv. Pyridin werden zugegeben, und die Lösung wird bei 20ºC 15 Stunden lang stehen gelassen. Der resultierende Niederschlag wird aufgefangen, mit Toluol, Ether gewaschen und getrocknet, um weiteres 6-isomeres Diacetat als das Pyridiniumsalz zu ergeben. Das Filtrat wird mit Ethylacetat verdünnt, zweimal mit 1 M Zitronensäure, Sole gewaschen, getrocknet, aufkonzentriert und aus CH₂Cl₂ umkristallisiert, um eine zweite Menge des 5-isomeren Diacetats als die freie Säure zu erhalten.
Allgemeines Verfahren K
Hydrolyse eines fluorierten Fluoresceindiacetats: Eine 0,1 M Lösung des Diacetats in THF/MeOH/Wasser (4 : 4 : 2) wird bei 20ºC mit NH₄OH (10 Äquiv.) behandelt. Nach 2 Stunden wird die Reaktionsmischung in 7 Volumina Eiswasser gegossen und mit HCl auf pH 2 angesäuert. Der Niederschlag wird aufgefangen, mit kaltem Wasser gewaschen und bei 60ºC getrocknet, um das Produkt zu ergeben.
Tabelle 5
Herstellung von 1'-8'-substituierten fluorierten Fluoresceinen
1',8'-substituierte fluorierte Fluoresceine werden, wie in der Beschreibung beschrieben, aus polyfluorierten Benzonitrilen hergestellt. Das unten stehende Reaktionsschema stellt die Herstellung von 1,2,4,5,7,8-Hexafluor-6-hydroxy-9-pentafluorphenylxanthen-3-on als Beispiel dar. Die Auswahl von entsprechend substituiertem Benzonitril und arylorganometallischen Gruppen wird zu dem gewünschten fluorierten Farbstoff führen.
Herstellung von fluorierten Xanthenen
Herstellung von 2,7-Difluor-6-hydroxy-9-trifluormethylxanthen-3-on (56)
4-Fluorresorcin (Verbindung 15, 0,10 g, 0,78 mmol) wird mit Trifluoressigsäure (45 mg, 0,39 mmol) bei 80ºC in Methansulfonsäure kondensiert. Das gewünschte Produkt wird durch die Zugabe eines Überschusses an Wasser aus der Reaktionslösung gefällt. Das Produkt wird filtriert und getrocknet, um die Verbindung 56 als ein rötliches Pulver zu ergeben.
Herstellung von 2,7-Difluor-6-hydroxy-1-(1-naphthyl)-xanthen-3-on (57)
Zwei Äquivalente von 4-Fluorresorcin (Verbindung 15) werden mit einem Äquivalent Naphthalin-1-carboxyaldehyd in warmer Methansulfonsäure kondensiert. Wenn die Reaktion durch DC-Analyse als vollständig beurteilt wird, wird das Zwischenprodukt mit Wasser aus der Reaktionslösung gefällt. Der rohe Feststoff wird filtriert und getrocknet. Das Zwischenprodukt wird in Chloroform aufgelöst und mit Chloramin-T im Überschuß behandelt. Wenn die Oxidation vollständig ist, wie mittels DC beurteilt, werden die flüchtigen Bestandteile entfernt und das Rohprodukt mittels Chromatographie gereinigt, um die Verbindung 57 zu ergeben.
Herstellung von derivatisierten fluorierten Fluorophoren
Allgemeines Verfahren M zur Herstellung von Thioetherderivaten
Eine Lösung aus dem gewünschten, am „Bodenring" fluorierten Fluorescein (1 Äquiv.) und Mercaptoessigsäure (1,2 Äquiv.) in DMF, als 5 Gew./Vol.-%-ige Lösung, wird für 40 Minuten auf 80ºC erhitzt. Die Reaktionsmischung wird in Eiswasser gegossen, mit Ethylacetat extrahiert, mit Sole gewaschen, getrocknet, eingedampft und unter Benutzung der Silicagel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit CHCl₃ : Methanol : Essigsäure (85 : 15 : 0,3), dann THF : Trifluoressigsäure (100 : 0,5) gereinigt. Die Fraktionen, die das reine Produkt enthalten, werden vereinigt und eingedampft. Der Rückstand wird in einem Minimum an THF gelöst und in Petrolether (Smp. 30 bis 60ºC) filtriert. Der Niederschlag wird aufgefangen, mit Petrolether gewaschen und getrocknet.
Allgemeines Verfahren N zur Herstellung von Succinimidylesterderivaten
Zu einer Pyridinlösung des geeigneten fluorierten Fluoresceins werden 1,3 Äquiv. Succinimidyltrifluoracetat (STFA, hergestellt aus N-Hydroxysuccinimid und Trifluoressigsäureanhydrid) gegeben. Zusätzliches STFA (2 × 1 Äquiv) wird zugegeben, um die Reaktion zur Vollständigkeit zu zwingen. Nach 16 Stunden bei 20ºC wird die Reaktionsmischung mit Ether verdünnt, mit 1 M Zitronensäure, mit Sole gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird unter Benutzung der Säulenchromatographie und Eluieren mit CHCl₃ : Methanol : Essigsäure (95 : 5 : 0,1 bis 80 : 20 : 0,1 Stufengradient) gereinigt, um das gewünschte Produkt zu ergeben.
Alternativ wird ein carbonsäuresubstituiertes fluoriertes Fluorescein unter Verwendung eines Carbodiimid-Kopplungsmittels, wie z. B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (EDAC) oder N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), mittels Verfahren, die in dem Fachgebiet gut bekannt sind, an N-Hydroxysuccinimid gekoppelt.
Tabelle 6
Andere Derivate von fluoriertem Fluorescein werden durch Verfahren hergestellt, die in dem Fachgebiet bekannt sind, wie in der Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7
Herstellung von fluorierten Sulfonfluoresceinen und ihren Analogen
In einer Abwandlung des allgemeinen Verfahrens H ergibt die Kondensation eines entsprechend fluorierten Resorcins mit Sulfoterephthalsäure das gewünschte fluorierte Sulfonfluorescein.
Tabelle 8
Herstellung von fluorierten Dihydrofluoresceinen
Fluorierte Fluoresceine lassen sich leicht in ihre reduzierten Dihydrofluorescein-Analoge umwandeln. Das geeignete fluorierte Fluorescein wird in Essigsäure oder Essigsäure/Methanol gelöst und bei Raumtemperatur unter Luft mit Zinkstaub behandelt. Nach 1- bis 3tägigem Rühren wird die Mischung filtriert und das Rohprodukt mittels Chromatographie auf SEPHADEX LH-20 gereinigt.
Tabelle 9
Herstellung von fluorierten β-Galactosidasesubstraten
Allgemeines Verfahren O
Eine Mischung aus dem gewünschten fluorierten Fluorescein (1 Äquivalent), Tetra-O-acetylbromgalactose (1,5 Äquivalente) und Silber(I)-oxid (1,5 Äquivalente) in wasserfreiem THF (0,02 M in Farbstoff) wird bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Die Reaktion benötigt 72 bis 96 Stunden bis zur Vollständigkeit; nach Bedarf wird mehr Silberoxid zugegeben. Die Mischung wird filtriert und durch Eindampfen aufkonzentriert. Der Rückstand wird mittels Flash-Chromatographie gereinigt, um reines monoalkyliertes Produkt zu ergeben. Unter Benutzung dieses Verfahrens wird aus der Verbindung 29 2',7'-Difluorfluorescein, Tetra-O-acetylgalactosid (90) in 92%iger Ausbeute hergestellt.
Allgemeines Verfahren P
Eine Mischung aus dem gewünschten fluorierten Fluoresceinmono(tetra-O-acetyl)galactosid (1 Äquivalent), Tetracetobromgalactose (1,5 Äquivalente) und Cadmiumcarbonat (1,5 Äquivalente) in trockenem Toluol wird vier Tage lang unter Rückfluß gekocht. Die abgekühlte Reaktionsmischung wird filtriert und das Filtrat aufkonzentriert. Der Rückstand wird chromatographisch gereinigt, um die reinen, nichtfluoreszierenden, geschützten Galactosidasesubstrate zu ergeben. Unter Benutzung dieses Verfahrens wird aus der Verbindung 90 2',7'-Difluorfluorescein, Bis-tetra-O-acetylgalactosid (92) in 62%iger Ausbeute hergestellt.
Die Acetylschutzgruppen werden durch Reaktion der geschützten Galactosidase mit weniger als einem Äquiv. Natriummethoxid oder Lithiumhydroxid entfernt. Die Reaktion wird mit wäßriger Zitronensäure gelöscht, und das Produkt wird mittels präparativer DC oder Chromatographie auf SEPHADEX LH-20 gereinigt. Auf diese Weise wird aus der Verbindung 92 2',7'-Difluorfluorescein, Bis-O-galactosid (94) hergestellt.
Herstellung von alkalischen Phosphatasesubstraten
Allgemeines Verfahren Q
Das allgemeine Schema für die Herstellung von fluorierten Fluoresceinphosphatasesubstraten erfordert typischerweise die anfängliche Phosphorylierung des Fluorophors mit Phosphoroxidchlorid. Der Fluoresceinfarbstoff wird typischerweise in Pyridin bei 0ºC unter Stickstoff aufgelöst. Der Fluoresceinlösung wird eine Pyridinlösung von POCl₃ zugegeben. Nachdem die Reaktion mittels DC als vollständig beurteilt wurde, wird die Reaktion mit zerstoßenem Eis gelöscht und mit NH₄OH auf pH 7,0 neutralisiert. Das Pyridin wird mit Chloroform extrahiert, und die wäßrige Phase wird lyophilisiert. Das Rohmaterial wird auf SEPHADEX LH20 unter Eluieren mit Wasser gereinigt. Die Fraktionen des Reinprodukts werden vereinigt, gefroren und lyophilisiert, um reine fluorierte Fluoresceindiphosphate als ihre Tetraammoniumsalze als blaßgelbe Feststoffe zu ergeben.
Unter Benutzung des Verfahrens Q wird 2',7'-Difluorfluorescein (29) in 2',7'-Difluorfluoresceindiphosphat, Tetrammoniumsalz (96) umgewandelt, und 2',4,5,6,7,7'-Hexafluorfluorescein (26) wird in 2',4,5,6,7,7'-Hexafluorfluoresceindiphosphat, Tetraammoniumsalz (97) umgewandelt.
Herstellung von fluorierten Analogen von Calcein-AM
Allgemeines Verfahren R
Der fluorierte Farbstoff wird in Ethanol gelöst, und 6 M KOH wird zugegeben, um eine 0,2 M Lösung herzustellen. Die resultierende Lösung wird mit 3 Äquiv. Iminodiessigsäure, gefolgt von wäßrigem Formaldehyd (4 Äquiv.) behandelt. Die Lösung wird über Nacht auf 65ºC erhitzt; dann wird ihr Volumen mit Wasser/Ethanol verdoppelt. Der pH wird unter Benutzung von wäßriger HCl auf 2,0 gesenkt und der Niederschlag mittels Filtration aufgefangen. Das Zwischenprodukt wird durch Verreiben mit Aceton, gefolgt von Filtration, Suspendieren in DMF und Behandlung mit 10 Äquiv. Diisopropylethylamin (DIEA) und Essigsäureanhydrid (4 Äquiv) teilweise gereinigt. Nach 30 Minuten wird weiteres DIEA (7 Äquiv) zugegeben, gefolgt von tropfenweise zugegebenem Wasser, bis Homogenität erreicht ist. Bromethylacetat (15 Äquiv) wird zugegeben, und die Lösung wird über Nacht gerührt. Die Mischung wird zwischen Ethylacetat und Wasser aufgeteilt. Die organische Schicht wird mit Sole gewaschen, aufkonzentriert und dann mittels präparativer DC unter Benutzung von Hexan : Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, wodurch das reine Produkt als ein farbloses Öl erhalten wird.
Tabelle 10
Herstellung von abgesperrten fluorierten Fluorophoren
Fluorierte Fluorophore werden unter Benutzung von Verfahren, die in dem Fachgebiet für das Absperren von Fluoresceinen gut bekannt sind, abgesperrt. Z. B. liefert die Behandlung von 2',4,5,6,7,7'-Hexafluorfluorescein (26) mit 5-(t-Butoxycarbonylmethoxy)-2-nitrobenzyliodid und Ag₂O, gefolgt von der Reinigung unter Benutzung der Chromatographie, nichtfluoreszierendes, durch Bis-(5-t-butoxycarbonylmethoxy)-2-nitrobenzyl abgesperrtes 2',4,5,6,7,7'-Hexafluorfluorescein (101) in 46%iger Ausbeute. Das Produkt ist anfänglich löschend, wird jedoch bei Bestrahlung fluoreszierend.
Herstellung von Ionenindikatoren, in die fluorierte Fluorophore einbezogen sind
Ionenindikatoren, in die fluorierte Fluorophore einbezogen sind, lassen sich unter Verwendung veröffentlichter Verfahren leicht herstellen.
Tabelle 11
Herstellung eines Nucleotidkonjugats von 2',7'-Difluorfluorescein-5-(und 6-)-carbonsäure
Zu 2 mg 5-(3-Aminoallyl)-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat, Ammoniumsalz in 100 μl Wasser werden 3 mg der Verbindung 72 in 100 μl DMF, gefolgt von 5 μl Triethylamin, zugegeben. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wird die Lösung eingedampft und der Rückstand auf lipophilem SEPHADEX unter Benutzung von Wasser zur Eluierung gereinigt. Die ersten grün fluoreszierenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert, um das fluoreszierende Nucleotidkonjugat als einen orangefarbenen Feststoff (Verbindung 107) zu ergeben.
Alternativ wird ein fluoreszierendes Konjugat (Verbindung 108) von Desoxyuridin-5'-triphosphat unter Benutzung von 5-(3-Amino-1-propinyl)-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat anstelle von 5-(3-Aminoallyl)-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (wie oben bei Hobbs, Jr. et al. beschrieben) hergestellt.
Herstellung eines Oligonucleotidkonjugats von 2',4',5',7'-Tetrafluorfluorescein-5-(und 6-)-carbonsäure
Eine Probe von 500 μg einer mit 5'-Amin modifizierten, 24-basigen M13-Primersequenz wird in 220 μl 0,1 M NaHCO₃, pH 8,5 gelöst. Dazu wird 1 mg der Verbindung 65 in 35 μl DMF gegeben. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur werden 15 μl 5 M NaCl und 3 Volumina kaltes 100%iges Ethanol zugegeben. Die Mischung wird auf –20ºC abgekühlt, zentrifugiert, das überstehende Ethanol wird abdekantiert, und das Pellet wird gespült und in 100 μl H₂O gelöst. Das markierte Oligonucleotid wird mittels HPLC auf einer 300A-C8-Umkehrphasensäule unter Benutzung eines Steigungsgradienten von 0,1 M Triethylammoniumacetat (pH ~ 7) und Acetonitril (15 → 60% in 30 min) gereinigt. Der gewünschte Peak wird aufgefangen und eingedampft, um das fluoreszierende Oligonucleotid zu ergeben.
Herstellung eines Arzneimittelkonjugats von 2',7'-Difluorfluorescein-5-(und -6-)-isothiocyanat
Ein fluoreszierender Dopamin-D₂-Antagonist wird wie folgt hergestellt:
Zu 10 mg N-(p-Aminophenethyl)spiperon (Amlaiky et al., FEBS LETT, 176, 436 (1984)) und 10 μl N,N-Diisopropylethylamin in 1 ml DMF werden 15 mg 2',7'-Difluorfluorescein-5-(und 6-)-isothiocyanat (Verbindung 76, Beispiel 77) gegeben. Nach 3 Stunden wird die Reaktionsmischung in 5 ml Diethylether gegossen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren aufgefangen und durch Chromatographie auf Silicagel unter Benutzung von 10%igem Methanol in Chloroform gereinigt, um das reine Produkt als einen orangefarbenen Feststoff zu ergeben.
Proteinkonjugate von fluorierten Farbstoffen
Eine Reihe von Farbstoffkonjugaten von Ziege-Anti-Maus-IgG oder Streptavidin werden unter Benutzung von Verbindung 64, Verbindung 61, 9-(4-Carboxy-2-sulfophenyl)-2,7-difluor-6-hydroxy-3H-xanthen-3-on, Succinimidylester (Verbindung 109) und Fluoresceinisothiocyanat wie folgt getrennt hergestellt:
Eine Lösung des gewünschten Proteins wird zu 10 mg/ml in 0,1 M Natriumbicarbonat hergestellt. Die Markierungsreagentien werden zu 10 mg/ml in DMF gelöst. Vorbestimmte Mengen der Markierungsreagentien werden den Proteinlösungen unter Rühren langsam zugegeben. Ein Molverhältnis von 10 Äquiv. Farbstoff zu 1 Äquiv. Protein ist typisch, obwohl die optimale Menge mit dem besonderen Markierungsreagens und dem Protein, das markiert wird, variiert. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang oder auf Eis für mehrere Stunden inkubiert. Das Farbstoff-Protein-Konjugat wird auf CELLUFINE GH-25, ausgeglichen mit PBS, von anderen Reagentien abgetrennt. Das proteinhaltige gefärbte Band zu Beginn wird aufgefangen, und der Markierungsgrad wird durch die Extinktion am Extinktionsmaximum jedes Fluorophors unter Benutzung des Extinktionskoeffizienten von 68.000 cm^–1M^–1 für Fluorescein bei pH 8 und von 70.000 cm^–1M^–1 für die anderen drei fluorierten Fluorophore bei ihren Absorptionsmaxima bestimmt. Die Proteinkonzentration wird aus der optischen Dichte bei 280 nm, korrigiert für die Farbstoffabsorption bei derselben Wellenlänge, bestimmt.
Die Gesamtfluoreszenz ausgewählter Farbstoff-Protein-Konjugate als eine Funktion des Substitutionsgrades
Eine Reihe von Ziege-Anti-Maus-IgG-Konjugaten wird unter Benutzung der Verbindung 64, der Verbindung 61, der Verbindung 109 und Fluoresceinisothiocyanat, wie oben beschrieben, hergestellt, um Derivate mit ähnlichen Substitutionsgraden zu erhalten. Die Fluoreszenz der Konjugate der fluorierten Fluoresceine ist stärker als die von FITC. Zudem erlöscht die Fluoreszenz von Antikörperkonjugaten der Verbindung 59 und der Verbindung 109 selbst bei hohen Substitutionsgraden nicht nennenswert, wie in der 1 gezeigt.
Markieren und Benutzen von Weizenkeim-Agglutinin mit 2',7'-Difluorfluorescein
Weizenkeim-Agglutinin (25 mg, EY Laboratories) wird in 5 ml Natriumcarbonatpuffer pH 9,0 gelöst, der 5 mM N-Acetylglucosamin enthält, um die aktive Stelle zu schützen. Dazu werden 3,5 mg der Verbindung 76 gegeben. Nach 1 h bei Raumtemperatur wird die Lösung, wie oben für Proteinkonjugate beschrieben, gereinigt. Gefolgt von Lyophilisierung wird aus der Absorption bei 490 nm ein Substitutionsgrad von 2 bis 3 Farbstoffen pro Molekül bestimmt. Wenn das Konjugat gemäß Sizemore et al. (US-Patentschrift Nr. 5,137,810) benutzt wird, kann es zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien unterscheiden.
Markieren von Actinfilamenten mit der Verbindung 73 und Photobleichen
CRE-BAG-2-Fibroblasten werden mit Formaldehyd fixiert, mit Aceton permeabilisiert und dann mit den fluoreszierenden Phallotoxinen Fluoresceinphalloidin und der Verbindung 73 angefärbt. Die angefärbten Zellen zeigen grün fluoreszierende F-Actinfilamente. Jede Probe wird kontinuierlich belichtet und unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Das relative Photobleichen, wie in der 4 gezeigt, zeigt deutlich die überlegene photochemische Stabilität der fluorierten Farbstoffkonjugate.
Wenn die F-Actinfilamente einmal angefärbt sind, werden wahlweise zusätzliche Zellkomponenten unter Benutzung anderer Farbstoffkonjugate angefärbt, die spektrale Eigenschaften aufweisen, die sich leicht von denjenigen des fluorierten Farbstoffkonjugates unterscheiden lassen. Z. B. werden Zellkerne unter Benutzung von DAPI fluoreszierend blau angefärbt, während Zellantigene unter Benutzung eines fluoreszierenden Antikörperkonjugates eines Rhodamin- oder Carbocyaninfarbstoffes, wie z. B. des Farbstoffs TEXAS RED bzw. des Farbstoffs CY-5, rot angefärbt werden. Sowohl das Anfärben als auch die anschließende Sichtbarmachung der einzelnen Zellkomponenten können gleichzeitig oder nacheinander erfolgen.
Herstellung eines Dextrankonjugats der Verbindung 76
Die Verbindung 76 wird mit Cyanurchlorid behandelt, um das Dichlortriazinaddukt (Verbindung 110) zu ergeben, das benutzt wird, um die freien Hydroxygruppen eines Polysaccharids zu markieren.
Ein Dextran von MG 70.000 (50 mg) wird in 2,5 ml 0,2 M Na₂CO₃ (pH 9,5) gelöst. Die Verbindung 110 (20 mg in 1 ml DMSO) wird zugegeben. Die Lösung wird für 6 Stunden auf 50ºC erhitzt, wobei der pH mit 1 M NaOH auf 9,5 bis 10,00 gehalten wird. Das Farbstoff-Dextran-Konjugat wird auf SEPHADEX G-15 unter Benutzung von 30 mM Ammoniumacetat gereinigt. Die erste gefärbte Bande wird aufgefangen und lyophilisiert.
Herstellung von Aminodextrankonjugaten von fluorierten Fluoresceinen
Ein Aminodextran von MG 70.000 (50 mg) wird zu 10 mg/ml in 0,1 M NaHCO₃ gelöst. Die Verbindung 61 wird zugegeben, um ein Farbstoff/Dextran-Verhältnis von 12 zu ergeben. Nach 6 Stunden wird das Konjugat auf SEPHADEX G-50 unter Eluieren mit Wasser gereinigt und das Produkt wird lyophilisiert. Typischerweise werden ~6 Mol Farbstoff an 70.000 g Dextran konjugiert.
Herstellung von fluoreszierenden Liposomen
Fluoreszierende Liposome, die in ihrem Inneren polare Derivate, wie z. B. die Verbindung 36 oder 2',7'-Difluorcalcein (hergestellt durch Hydrolyse der Verbindung 99) enthalten, werden im wesentlichen hergestellt und benutzt wie in J. BIOL. CHEM. 257, 13892 (1982) und PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 75, 4194 (1978) beschrieben. Alternativ werden Liposome, die lipophile fluorierte Fluoresceine innerhalb ihrer Membranen enthalten, wie z. B. die Verbindung 79 durch gemeinsames Auflösen des fluoreszierenden Lipids und des unmarkierten Phospholipids oder der unmarkierten Phospholipide, die das Liposom bilden, bevor die Liposomdispersion gebildet wird, im wesentlichen wie von Szoka, Jr. et al. (ANN. REV. BIOPHYS. BIOENG. 9, 467 (1980)) beschrieben, hergestellt.
Herstellung eines fluoreszierenden Lipoproteins von geringer Dichte
Kovalente Konjugate von Human-Lipoproteinen von geringer Dichte (LDL) des Menschen, von denen bekannt ist, daß sie von Makrophagen-, Endothel- und anderen Zellen, die „Fänger"-Rezeptoren enthalten, die für das modifizierte LDL spezifisch sind, aufgenommen werden, werden unter Benutzung der Verfahren, die für das Herstellen von Proteinkonjugaten beschrieben sind, sowie Reinigung durch Gelfiltration, hergestellt. Das Binden der fluoreszierenden Konjugate kann entweder durch Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflußzytometrie nachgewiesen werden. Alternativ kann LDL, das in seinem Lipidbereich markiert ist, durch Inkubation des LDL mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff, dispergiert in Puffer, gefolgt von Gelfiltration, hergestellt werden.
Herstellung von fluoreszierenden Konjugaten von Bakterien
Durch Hitze abgetötete Escherichia coli werden zu 10 mg/ml in einem Puffer von pH 8 bis 9 suspendiert und anschließend mit 0,5 bis 1,0 mg/ml eines aminreaktiven fluorierten Farbstoffes inkubiert. Nach 30 bis 60 Minuten werden die markierten Bakterien zentrifugiert und mit Puffer gewaschen, um nichtkonjugierten Farbstoff zu entfernen. Markierte Bakterien, die opsoniert sind, werden von Makrophage aufgenommen, wie mittels Durchflußzytometrie bestimmt.
Nützlichkeit von Proteinkonjugaten als Immunoreagentien und Beständigkeit gegenüber dem Photobleichen
Antikörperkonjugate der Verbindung 59, Verbindung 61, Verbindung 109 und Fluorescein, Succinimidylester werden mit Substitutionsgraden von ungefähr 4 bis 6 hergestellt. INOVA-Objektträger werden in 1%igem Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) 30 Minuten lang rehydratisiert. Der Objektträger wird gründlich entwässert. Human-Auto-Antikörper wird aufgebracht, der Objektträger wird 30 Minuten inkubiert und mit PBS gespült. Maus-Anti-Mensch-Antikörper wird aufgebracht und der Objektträger wird 30 Minuten inkubiert und mit PBS gespült. Jedes grüne, fluoreszierende Ziege-Anti-Maus-Antikörperkonjugat wird als eine Lösung von 10 μg/ml, in 1%iger BSA/PBS verdünnt, aufgebracht. Nach 30 Minuten werden die markierten Objektträger in PBS gespült, dann in 50 mM Tris von pH 8,0, in 50 mM Tris pH 8,0 eingesetzt und durch ein Langpaß-Fluoresceinfilter betrachtet. Alle Proben ergeben vorwiegend eine Kernanfärbung. Während 100 Sekunden wird bei kontinuierlicher Belichtung der Probe unter Benutzung eines Langpaßfilters alle 5 Sekunden ein Bild des Objektträger angefertigt. Unter Benutzung dieses Verfahrens werden drei Zellengebiete gebleicht, und die Werte des Photobleichens werden standardisiert und gemittelt. Der Mittelwert aus drei Durchgängen für jedes Konjugat wird dann standardisiert und aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der 2 dargestellt. Es wird beobachtet, daß Antikörperkonjugate der fluorierten Farbstoffe photochemisch bedeutend stabiler sind als die Fluoresceinkonjugate.
In-situ-Hybridisierung einer RNA-Sonde, die unter Benutzung von fluoreszierenden Nucleotidkonjugaten hergestellt ist
Ein UTP-Konjugat der Verbindung 72 wird unter Benutzung von 5-(3-Aminoallyl)-uridin-5'-triphosphat, Ammoniumsalz (Sigma Chemical), hergestellt.
Mausfibroblasten werden fixiert und unter Benutzung von normaler Arbeitsvorgänge zur In-situ-mRNA-Hybridisierung vorbereitet. Eine fluorophormarkierte RNA-Sonde wird hergestellt durch In-vitro-Transkription eines Plasmids, welches das Maus-Actin-Strukturgen, stromabwärts von einem Phage-T3-RNA-Polymerasepromotor geklont, enthält. Die Markierungsreaktionen bestehen aus dem Kombinieren von 2 μl DNA-Template (1 μg DNA), jeweils 1 μl 10 mM ATP, CTP und GTP, 0,75 μl 10 mM UTP, 2,5 μl 1 mM fluoreszierendes UTP-Verbindung-72-Konjugat, 2 μl 10X-Transkriptionspuffer (400 mM Tris, pH 8,0, 100 mM MgCl₂, 20 mM Spermidin, 100 mM NaCl), 1 μl T3-RNA-Polymerase (40 Einheiten/μl), 1 μl BSA von 2 mg/ml und 8,75 μl Wasser. Die Reaktionsmischungen werden bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert.
Das DNA-Template wird durch Behandlung der Reaktionsmischung mit 20 Einheiten DNase I für 15 Minuten bei 37ºC entfernt. Das RNA-Transkript wird durch Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol : Chloroform, 1 : 1, dann mittels Chromatographie durch SEPHADEX G50 gereinigt. Die markierte RNA wird während 5 Minuten bei 50ºC denaturiert, dann unter Benutzung normaler Arbeitsvorgänge zu Zellpräparaten hybridisiert. Wenn die Präparate gewaschen und durch ein Fluoresceinfilter an einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden, zeigen Zellen, die Actin-mRNA exprimieren, hellgrüne Fluoreszenz.
Die Benutzung der Verbindung 96 zum Nachweis der Aktivität saurer Phosphatase
Die Rate der Erzeugung von fluoreszierendem Produkt wird durch Anregen einer Lösung von 10 μM der Verbindung 96 oder Fluoresceindiphosphat (FDP) bei 490 nm gemessen, während die Emission in einem Fluorimeter bei 515 nm in Gegenwart von 0,1 Einheiten prostataspezifischer saurer Phosphatase bei pH 5 überwacht wird. Unter diesen Bedingungen erzeugt die saure Phosphatase bei Benutzung von Verbindung 96 eine etwa 6,5mal so große Signaländerung wie bei Benutzung von FDP.
Die Benutzung der Verbindung 94 zum Nachweis der Aktivität saurer β-Galactosidase
Die Fluoreszenz, die aus dem Einwirken saurer β-Galactosidase aus Rinderinspektionen auf Fluoresceindigalactosid (FDG) und auf die Verbindung 94 resultiert, wird verglichen. Die Fluoreszenzerhöhung bei 512 nm, wenn bei 490 nm angeregt, wird gegen die Zeit für 50 μM Substrat mit 4,6 nM Enzym in Assaypuffer (200 mM Natriumphosphat + 75 mM Zitronensäure, pH 4,5) gemessen. Die anfängliche Rate der Fluoreszenzerzeugung durch Verbindung 94 ist 3mal so groß wie die, die unter Benutzung von FDG erhalten wird.
Markieren von Zellen mit fluorierten Fluoresceindiacetaten
Zellen von einer Lymphoid-B-Zellkultur vom Menschen in Medium RPMI 1640 werden bei 37ºC 30 Minuten lang mit 1 μM der Verbindung 26 oder Fluoresceindiacetat (FDA) behandelt. Im Anschluß an das Zentrifugieren und Waschen in PBS werden die Pellets im Medium RPMI 1640 für 15 min wieder suspendiert, wieder zentrifugiert, in PBS gewaschen, mit 3,7%igem Formaldehyd in PBS fixiert und mittels Durchflußzytometrie unter Benutzung einer Anregung bei 488 nm analysiert. Zellen, die mit der Verbindung 26 angefärbt sind, zeigen nach zwei Stunden eine bedeutend größere Fluoreszenz als diejenigen, die mit FDA angefärbt sind (5). Die Fluoreszenz in den Zellen kann mindestens während 24 Stunden nachgewiesen werden, und der Farbstoff überträgt sich nicht auf andere Zellen, wenn die markierten Zellen mit unmarkierten Zellen vermischt werden. Zellen, die mit 2',4',5',7'-Tetrafluorfluoresceindiacetat angefärbt sind, sind ebenfalls schwach fluoreszierend. Alternativ werden die angefärbten und gewaschenen Zellen ohne Fixierung betrachtet oder analysiert.
Löschen der Fluoreszenz von 2',7'-Difluorfluorescein durch eine polyklonale Anti-Fluorescein-IgG-(H + L)-Fraktion vom Kaninchen
Lösungen aus 5 × 10^–9 M Fluorescein und 5 × 10^–9 M Verbindung 29 werden in 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0 hergestellt. Die Fluoreszenz jeder Lösung wird mit einer Anregung bei 490 nm abgelesen. Aufeinanderfolgende Zugaben von 0,5 mg/ml polyklonaler Anti-Fluorescein-IgG-(H + L)-Fraktion vom Kaninchen (Molecular Probes, Inc.) werden zugegeben, und die Fluoreszenzmessungen werden wiederholt. Die Intensitäten sind in der Tabelle 13 aufgezeichnet:
Tabelle 13
Die Ergebnisse zeigen ein praktisch identisches Binden und Löschen der zwei Farbstoffe.
Arbeitsvorgänge für die pH-Titration von fluorierten Fluorophoren
Der interessierende Farbstoff wird zuerst in einer Reihe von Puffern gelöst, die alle unter Benutzung eines pH-Meters kalibriert worden sind. Acetatpuffer werden typischerweise in dem Bereich von pH 4 bis 6 und Phosphatpuffer in dem pH-Bereich von 6 bis 8 benutzt. Die Absorptionsmessungen werden unter Benutzung von Lösungen durchgeführt, die eine Konzentration von ungefähr 10 μM aufweisen, und die Fluoreszenzmessungen werden unter Benutzung von Lösungen durchgeführt, die eine Konzentration von ungefähr 1 μM aufweisen. Die Absorptions- oder Emissionsdaten werden dann gegen den pH aufgetragen, um die pKa-Werte zu bestimmen. Z. B. zeigt die 3 die Fluoreszenzemissionsdaten für 2',7'-Difluorfluorescein (pK_a ~ 4,7) und Fluorescein (pK_a ~ 6,4), aufgetragen gegen den pH der Lösung. Die Daten zeigen, daß die Fluorierung des Fluorophors den pKa von Fluorescein bedeutend vermindert hat. Der pKa des fluorierten Fluoresceins ist sogar kleiner als der von 2',7'-Dichlorfluorescein (pK_a ~ 5,1).
Es versteht sich, daß, obwohl die vorstehende Erfindung durch Abbildungen und Beispielen ausführlich beschrieben worden ist, zahlreiche Modifikationen, Ersatz und Änderungen möglich sind, ohne den Umfang der Erfindung zu verlassen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines fluorierten Resorcins mit der Formel
wobei R¹, R² und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, Fluor, Chlor, Hydroxy, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind, mit der Maßgabe, daß mindestens eines von R¹, R² und R⁴ Fluor ist, das die Schritte a) des Behandelns eines substituierten Nitrofluorbenzols mit der Formel
wobei R¹ und R² unabhängig voneinander Wasserstoff, Fluor, Chlor, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind, R⁴ Wasserstoff, Fluor, Chlor, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Nitro ist, R³ und R⁵ unabhängig voneinander Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Benzyloxy oder F sind, und R⁶ H oder Nitro ist, mit der Maßgabe, daß genau eines von R⁴ und R⁶ Nitro ist, mindestens eines von R³ und R⁵ F ist und mindestens eines von R¹, R² und R⁴ F ist, mit einem verdrängenden Ion, das ein Alkoxid-Ion mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein Benzyloxid-Ion ist, um einen Nitroresorcindiether zu ergeben, b) des Reduzierens des Nitroresorcindiethers, um einen Aminoresorcindiether zu ergeben, c) des Diazotierens des Aminoresorcindiethers, um ein Resorcindiether-Diazoniumsalz zu ergeben, d) des Dediazotierens des Resorcindiether-Diazoniumsalzes, um einen Resorcindiether zu ergeben, und e) des Spaltens des Resorcindiethers, um das fluorierte Resorcin zu ergeben, umfaßt und wobei das Verfahren wahlweise ferner das Kondensieren des fluorierten Resorcins, um einen Xanthyliumfarbstoff zu bilden, und, falls gewünscht, das Modifizieren des Xanthyliumfarbstoffes umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das fluorierte Resorcin 2-Fluorresorcin, 4-Fluorresorcin, 5-Fluorresorcin, 2,4-Difluorresorcin, 4,5-Difluorresorcin, 2,5-Difluorresorcin oder 2,4,5-Trifluorresorcin ist.
Verbindung mit der Formel I
oder der Formel II
wobei R¹ und R⁶ unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈-Alkoxy sind, R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, CN oder C₁-C₁₈-Alkyl, C₁-C₁₈-Alkoxy oder C₁-C₁₈-Alkylthio sind, wobei jedes Alkyl, Alkoxy oder Alkylthio wahlweise ferner mit F, Cl, Br, I, einer Sulfonsäure, einem Salz einer Sulfonsäure, einer Carbonsäure, einem Salz einer Carbonsäure, einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, einem Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸, wobei R¹⁸ ein C₁-C₆-Alkyl oder Amino, Alkylamino, Dialkylamino oder Alkoxy ist, deren Alkylabschnitte unabhängig voneinander 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen, substituiert ist, oder eines oder beide von R³ und R⁴ -CH₂N(CR¹⁹HCOOR¹⁷)₂ ist bzw. sind, wobei R¹⁹ H oder ein C₁-C₆-Alkyl ist, R¹⁷ H, ein biologisch kompatibles Gegenion, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸ ist, A OR⁷ ist, wobei R⁷ unabhängig voneinander jeweils H, C₁-C₁₈-Alkyl, ein C₁-C₁₈-Acyl, das wahlweise mit Amino, Hydroxy, einer Carbonsäure, einem Salz einer Carbonsäure, einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, einem Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸ substituiert ist, ein Trialkylsilyl, wobei die Alkylgruppe unabhängig voneinander jeweils 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, oder ein BLOCK ist, wobei die BLOCK-Gruppierung unabhängig voneinander jeweils eine einwertige Gruppierung ist, die durch das Entfernen einer Hydroxygruppe aus Phosphat oder Sulfat abgeleitet ist, oder ein biologisch kompatibles Salz davon ist, oder eine einwertige Gruppierung, die durch das Entfernen einer Hydroxygruppe aus einer Carboxygruppe einer aliphatischen oder aromatischen Carbonsäure oder einer Aminosäure, einer geschützten Aminosäure, einem Peptid oder einem geschützten Peptid abgeleitet ist, oder eine einwertige Gruppierung, die durch das Entfernen einer Hydroxygruppe aus einem Alkohol oder aus einem Mono- oder Polysaccharid abgeleitet ist, wobei der BLOCK ausgewählt ist, um durch die Wirkung eines Enzyms aus der Verbindung entfernbar zu sein, oder BLOCK eine photochemisch labile, absperrende Gruppe ist, R¹⁰ F, eine Carbonsäure, ein Salz einer Carbonsäure, ein Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols oder ein Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸ ist oder R¹⁰ C₁-C₁₈-Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl ist, das wahlweise ein- oder mehrfach mit F, Cl, Br, einer Carbonsäure, einem Salz einer Carbonsäure, einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, einem Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸, einer Sulfonsäure, einem Salz einer Sulfonsäure, Amino, Alkylamino oder Dialkylamino substituiert ist, deren Alkylgruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen, oder R¹⁰ eine Arylgruppierung mit der Formel
ist, wobei R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I oder eine Sulfonsäure, ein Salz einer Sulfonsäure, eine Carbonsäure, ein Salz einer Carbonsäure, ein Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, ein Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸, CN, Nitro, Hydroxy, Azido, Amino, Hydrazino oder C₁-C₁₈-Alkyl, C₁-C₁₈-Alkoxy, C₁-C₁₈-Alkylthio, C₁-C₁₈-Alkylamino, C₁-C₁₈-Alkylester, C₁-C₁₈-Alkylamido oder C₁-C₁₈-Arylamido sind, deren Alkyl- oder Arylabschnitte wahlweise ein- oder mehrfach mit F, Cl, Br, I, Hydroxy, einer Carbonsäure, einem Salz einer Carbonsäure, einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, einem Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸, einer Sulfonsäure, einem Salz einer Sulfonsäure, Amino, Alkylamino, Dialkylamino oder Alkoxy substituiert sind, deren Alkylabschnitte jeweils 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen, oder ein Paar benachbarter Substituenten R¹³ und R¹⁴, R¹⁴ und R¹⁵ oder R¹⁵ und R¹⁶, wenn sie zusammengefaßt sind, einen kondensierten 6gliedrigen aromatischen Ring bilden, der wahlweise ferner mit Carbonsäure, einem Salz einer Carbonsäure, einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, einem Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸ substituiert ist, und R¹¹ H, Hydroxy, CN oder ein C₁-C₆-Alkoxy ist, oder R¹⁰ gemeinsam mit R¹¹ einen 5gliedrigen Spirolactonring oder einen 5gliedrigen Spirosultonring bildet, oder R¹¹ gemeinsam mit R¹² einen 5- oder 6gliedrigen Spirolactonring oder einen 5- oder 6gliedrigen Spirosultonring bildet, der wahlweise und unabhängig voneinander mit H, F oder CH₃ substituiert ist, oder R¹⁰, wenn mit R¹¹ zusammengefaßt, ein Carbonylsauerstoff ist, oder wobei mindestens eines von R², R³, R⁴, R⁵, R⁷, R¹⁰, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ -L-R_x oder -L-S_c ist, wobei -L-R_x und/oder -L-S_c jeweils gleich oder verschieden sind, und L eine kovalente Einfachbindung ist oder L eine kovalente Verknüpfung mit 1 bis 24 Nichtwasserstoffatomen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus C, N, O und S besteht, und aus einer beliebigen Kombination von Einfach-, Doppel-, Dreifach- oder aromatischen Kohlenstoff-Kohlenstoff- Bindungen, Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen, Stickstoff-Stickstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen und Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen besteht, R_x eine reaktionsfähige Stelle ist und S_c eine konjugierte Substanz ist, mit der Maßgabe, daß R² und R⁵ F sind und/oder R³ und R⁴ F sind.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei mindestens eines von R², R³, R⁴, R⁵, R⁷, R¹⁰, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ L-R_x ist.
Verbindung nach Anspruch 3 oder 4, wobei R_x eine Acrylamidgruppe, eine aktivierte Estergruppe einer Carbonsäure, eine Acylazid-, eine Acylhalogenid-, eine Acylnitril-, eine Hydroxy-, eine Aldehyd-, eine Alkylhalogenid-, eine Sulfonat-, eine Amin-, eine Anhydrid-, eine Anilin-, eine Arylhalogenid-, eine Azid-, eine Aziridin-, eine Boronat-, eine Carbonsäure-, eine Carbodiimid-, eine Diazoalkan-, eine Epoxid-, eine Glycol-, eine Halogenacetamid-, eine Halogentriazin-, eine Hydrazin-, eine Hydroxylamin-, eine Imidoester-, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanat-, eine Keton-, eine Maleinimid-, eine Phosphoramidit-, eine Silylhalogenid-, eine Sulfonylhalogenid- oder eine Thiolgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 3 oder 4, wobei L eine kovalente Einfachbindung ist und R_x eine Carbonsäuregruppe, eine aktivierte Estergruppe einer Carbonsäure, eine Amin-, eine Azid-, eine Halogenacetamid-, eine Alkylhalogenid-, eine Sulfonylhalogenid-, eine Isothiocyanat- oder eine Maleinimidgruppe ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 6, wobei L unabhängig voneinander jeweils 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, eine kovalente Einfachbindung ist oder das längste lineare Segment von L 4 bis 10 Nichtwasserstoffatome, einschließlich 1 bis 2 Heteroatome, enthält.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei mindestens eines von R², R³, R⁴, R⁵, R⁷, R¹⁰, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ -L-S_c ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei entweder (i) genau eines von R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ -L-R_x oder -L-S_c ist oder (ii) genau eines von R², R³, R⁴, R⁵, R⁷ oder R¹⁰ -L-R_x oder -L-S_c ist.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei R¹² eine -L-R_x-Gruppe ist, die eine Carboxygruppe ist.
Verbindung, welche die Struktur einer Verbindung nach Anspruch 10 aufweist, wenn die -L-R_x-Gruppe in eine -L-S_c-Gruppe umgewandelt worden ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 9 oder 11, wobei S_c (i) eine Aminosäure, ein Peptid, ein Protein, ein Polysaccharid, eine ionenkomplexierende Gruppierung, ein Nucleotid, ein Oligonucleotid, eine Nucleinsäure, ein Arzneimittel, ein Lipid, ein lipophiles Polymer, ein nichtbiologisches organisches Polymer, eine Tierzelle, eine Pflanzenzelle, ein Bakterium, eine Hefe oder ein Virus ist oder (ii) ein Phospholipid, ein Lipoprotein, ein Lipopolysaccharid oder Liposom ist oder (iii) eine Aminosäure, ein Peptid, ein Protein, ein Nucleotid, ein Oligonucleotid, eine Nucleinsäure, eine ionenkomplexierende Gruppierung, ein Polysaccharid oder ein nichtbiologisches organisches Polymer oder polymeres Mikroteilchen ist oder (iv) ein Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Avidin, ein Streptavidin, ein Lectin, ein Protein A oder Protein G ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 12, wobei mindestens ein R⁷ ein BLOCK ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 13, wobei BLOCK ein Ether eines Alkohols oder ein Mono- oder Polysaccharid ist.
Verbindung nach Anspruch 13, wobei BLOCK eine photochemisch labile, absperrende Gruppe ist, die eine o-Nitroarylmethin-, eine 2-Methoxy-5-nitrophenyl- oder eine Desylgruppierung ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 12, wobei R⁷ der Formel I H ist oder R⁷ der Formel II jeweils H ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 16, wobei R¹¹ H ist.
Verbindung nach Anspruch 13, wobei BLOCK ein Ester von Phosphat, Sulfat oder einer aliphatischen oder einer aromatischen Carbonsäure ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 18, wobei (i) R², R³, R⁴ und R⁵ jeweils F ist, oder (ii) R¹ und R⁶ H sind und R², R³, R⁴, R⁵ unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I oder C₁-C₆-Alkoxy sind.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 19, wobei R² und R⁵ F sind.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 20, welche die folgende Formel aufweist:
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 20, wobei R¹⁰ die folgende Formel aufweist:
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 20, welche die folgende Formel aufweist:
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 23, wobei R¹² eine Carbonsäure, ein Salz einer Carbonsäure, eine Sulfonsäure oder ein Salz einer Sulfonsäure ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 24, wobei mindestens drei von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ F sind.
Verbindung nach Anspruch 25, wobei R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ F sind.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 26, wobei die Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ jeweils entweder F oder H sind.
Verbindung nach Anspruch 3 mit der Formel
wobei R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander H oder F sind, R¹² eine Carbonsäure, ein Salz einer Carbonsäure, ein Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, eine Sulfonsäure oder ein Salz einer Sulfonsäure ist, R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander H, F, Carbonsäure, ein Salz einer Carbonsäure, ein Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, ein Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸, eine Sulfonsäure, ein Salz einer Sulfonsäure oder C₁-C₆-Alkylthio, das wahlweise mit Carbonsäure, einem Salz einer Carbonsäure, einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols oder einem Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸ substituiert ist sind, oder wobei genau eines von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ -L-R_x, wie definiert in einem der Ansprüche 3 oder 5 bis 7, oder -L-S_c, wie definiert in einem der Ansprüche 3, 7 oder 12, ist.
Verbindung nach Anspruch 28, wobei R² und R⁵ beide F sind.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R³ und R⁴ beide F sind.
Verbindung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei genau eines von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ -L-R_x oder -L-S_c ist.
Verbindung nach Anspruch 31, wobei das eine von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ -L-R_x ist und R_x ist, wie in dem Anspruch 6 definiert.
Verbindung nach Anspruch 31, wobei das eine von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ -L-S_c ist und S_c ist, wie in dem Anspruch 12 (iii) definiert.
Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 20, welche die folgende Formel aufweist:
Verbindung nach Anspruch 34, wobei R¹¹ H ist.
Verbindung mit der Formel
wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und A sind wie in dem Anspruch 3 definiert, und genau eines von R², R³, R⁴, R⁵, R⁷ und R¹⁰ -L-S_c ist, wobei L eine kovalente Einfachbindung ist oder L eine kovalente Verknüpfung mit 1 bis 24 Nichtwasserstoffatomen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus C, N, O und S besteht, und aus einer beliebigen Kombination von Einfach-, Doppel-, Dreifach- oder aromatischen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen, Stickstoff-Stickstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen und Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen besteht, und S_c eine konjugierte Substanz ist, die eine ionenkomplexierende Gruppierung ist, mit der Maßgabe, daß R² und R⁵ F sind und/oder R³ und R⁴ F sind.
Verbindung nach Anspruch 36, wobei die ionenkomplexierende Gruppierung ein Kronenether, ein BAPTA, ein APTRA, ein Pyridin oder ein Phenanthrolin ist.
Verbindung nach Anspruch 35 oder 36, wobei R² und R⁵ jeweils F sind.
Verbindung nach Anspruch 37, wobei L eine kovalente Einfachbindung ist und die ionenkomplexierende Gruppierung ein BAPTA oder ein APTRA ist.
Verfahren zum Anfärben einer biologischen Probe, das die Schritte des a) Herstellens einer Farbstofflösung, die eine Farbstoffverbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 39 in einer Konzentration umfaßt, die ausreichend ist, um unter den gewünschten Bedingungen ein nachweisbares optisches Ansprechen zu ergeben. b) Zusammengebens der interessierenden Probe mit der Farbstofflösung für einen Zeitraum, der für die Farbstoffverbindung ausreichend ist, bei Belichtung ein nachweisbares optisches Ansprechen zu ergeben, und c) Belichtens der Probe bei einer Wellenlänge, die ausgewählt ist, um das optische Ansprechen hervorzurufen, umfaßt.
Verfahren zum Anfärben nach Anspruch 40, das ferner (i) das Kombinieren der Probe mit einem zusätzlichen Nachweisreagens, das spektrale Eigenschaften aufweist, die nachweisbar verschieden sind von dem optischen Ansprechen, und/oder (ii) den Schritt des Bestimmens eines Kennzeichens der Probe durch Vergleichen des optischen Ansprechens mit einem Standardparameter des Ansprechens umfaßt.
Verfahren zum Anfärben nach Anspruch 41 (ii), wobei entweder (i) das Kennzeichen der Probe, das bestimmt wird, die Aktivität eines oxidativen Enzyms in einer Probe ist, und wobei R¹¹ für die Farbstoffverbindung H ist, oder (ii) die Probe Zellen umfaßt und das Kennzeichen der Probe, das bestimmt wird, die Zurückhalteeffizienz der Zellen ist, und wobei die Farbstofflösung mindestens eine Mindestkonzentration umfaßt, um ein nachweisbares optisches Ansprechen zu ergeben, das die Fluoreszenzemission eines Farbstoffes mit der Formel
ist, wobei R², R³, R₄ und R⁵ unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, CN, C₁-C₁₈-Alkyl, C₁-C₁₈-Alkoxy oder C₁-C₁₈-Alkylthio sind, wobei das Alkyl, Alkoxy oder Alkylthio wahlweise jeweils ferner mit F, Cl, Br, I, Amino, Alkylamino, Dialkylamino oder Alkoxy, deren Alkylabschnitte unabhängig voneinander 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen, substituiert ist, oder eines oder beide von R³ und R⁴ -CH₂N(CH₂COOR¹⁷)₂ ist bzw. sind, wobei R¹⁷ ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸ ist, wobei R¹⁸ ein C₁-C₄-Alkyl ist, und BLOCK Acetat ist,
Verfahren zum Anfärben nach Anspruch 41 oder 42, das ferner des Aufspüren der Zeit oder des Ortes des optischen Ansprechens innerhalb der biologischen Probe umfaßt.
Verfahren zum Anfärben nach Anspruch 43, wobei für die Farbstoffverbindung R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander H oder F sind, R¹² eine Carbonsäure, ein Salz einer Carbonsäure, ein Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkyls, ein Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸, eine Sulfonsäure oder ein Salz einer Sulfonsäure ist, R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander H, F, eine Carbonsäure, ein Salz einer Carbonsäure, ein Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkyls, ein Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸, eine Sulfonsäure, ein Salz einer Sulfonsäure oder C₁-C₆-Alkylthio ist, das wahlweise mit Carbonsäure, einem Salz einer Carbonsäure, einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkyls oder einem Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸ substituiert ist.
Verfahren zum Anfärben nach einem der Ansprüche 40 bis 43, wobei für die Farbstoffverbindung eines oder beide von R³ und R⁴ -CH₂N(CR¹⁹HCOOR¹⁷)₂ sind, wobei R¹⁷ H, ein biologisch kompatibles Gegenion, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸ ist, wobei R¹⁸ ein C₁-C₄-Alkyl ist und R¹⁹ H oder CH₃ ist, oder eines von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ eine Carbonsäure, ein Salz einer Carbonsäure, ein Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, ein Carbonsäureester von -CH₂-O-(C=O)-R¹⁸ ist, wobei R¹⁸ ein C₁-C₄-Alkyl, eine Sulfonsäure, ein Salz einer Sulfonsäure, C₁-C₁₈-Alkyl, C₁-C₁₈-Alkoxy, C₁-C₁₈-Alkylthio, C₁-C₁₈-Alkylamino, C₁-C₁₈-Alkylamido oder C₁-C₁₈-Arylamido ist, und wobei wahlweise eines von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ C₁-C₁₈-Alkyl, C₁-C₁₈-Alkoxy, C₁-C₁₈-Alkylthio, C₁-C₁₈-Alkylamino, C₁-C₁₈-Alkylamido oder C₁-C₁₈-Arylamido ist.
Verfahren zum Anfärben nach Anspruch 43, wobei für die Farbstoffverbindung (i) mindestens eines von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ -L-R_x ist, wobei R_x ein Halogenacetamid, ein Alkylhalogenid, Halogenmethylbenzamido oder Perfluorbenzamido ist, oder (ii) mindestens eines von R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ -L-S_c ist, wobei S_c ein Protein, ein Polysaccharid, eine ionenkomplexierende Gruppierung, ein Lipid oder ein nichtbiologisches organisches Polymer oder polymeres Mikroteilchen ist, das wahlweise an ein oder mehrere zusätzliche Fluorophore gebunden ist, die gleich oder verschieden sind, oder (iii) mindestens ein R⁷ ein BLOCK ist, das eine einwertige Gruppierung ist, die durch das Entfernen einer Hydroxygruppe aus einer Carboxygruppe einer Carbonsäure abgeleitet ist, oder das eine photochemisch labile, absperrende Gruppe ist.
Verfahren zum Anfärben nach Anspruch 40 oder 41, wobei die Probe ferner Zellen umfaßt und wobei für die Farbstoffverbindung mindestens ein R⁷ ein BLOCK oder H ist, R¹¹ gemeinsam mit R¹² einen 5- oder 6gliedrigen Spirolactonring oder einen 5- oder 6gliedrigen Spirosultonring bildet und R¹³ bis R¹⁶ jeweils F ist, das Verfahren nach dem Zusammengeben der Probe mit der Farbstoffverbindung wahlweise ferner das Waschen der Zellen umfaßt, um restliche Farbstoffverbindung, die sich außerhalb der Zellen befindet, zu entfernen.
Benutzung einer Verbindung nach Anspruch 17 als ein Peroxidasesubstrat, das nach der Oxidation fluoresziert.