JP5774471B2 - シアノベンゾチアゾールコンジュゲートによるタンパク質標識 - Google Patents
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Description
本願は、2008年3月27日に出願された米国仮特許出願第61/040,073号(参照することにより本明細書に組み入れられる)に対して、米国特許法§119(e)下で、優先権を主張する。
本明細書において使用される時、以下の用語および表現は示された意味を有する。本発明の化合物が非対称的に置換された炭素原子を含有し、光学活性体またはラセミ体で単離されうることが認識されるだろう。たとえば、ラセミ体の分割、または光学活性な出発材料からの合成による、光学活性体の調製法は、当技術分野において周知である。すべてのキラル体、ジアステレオマー体、ラセミ体および構造のすべての幾何学的な異性体は、本発明の一部である。
リンカー戦略を用いて、レポーターモイエティ(例えば、フルオロフォア、親和性モイエティ、またはビオチン、樹脂、炭水化物、オリゴペプチド、色素もしくは薬物モイエティなどの別の標識基)をシアノベンゾチアゾールに連結し、N末端システインを有するタンパク質との反応が可能なシアノベンゾチアゾール誘導体を産出する。リンカーまたは「連結基」の使用は当技術分野において周知である。
本発明は、固定化したシアノベンゾチアゾール誘導体、およびシアノベンゾチアゾール誘導体を固定化する方法を含む。いくつかの固定化されたシアノベンゾチアゾールは、ベンゾ環上の(例えば、6’−位での)位置で固体支持体に連結したものを含む。他の固定化されたシアノベンゾチアゾールは、生体活性基(例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはその誘導体)、抗体もしくは抗原などによる非共有結合相互作用、またはニッケルカラムに対するHisタグによって、固体支持体の表面に結合されるものを含む。さらに、他の固定化されたシアノベンゾチアゾールは、対象となる末端Cys含有タンパク質とシアノベンゾチアゾールを反応させ、続いて対象となるタンパク質を結合する予定の固体支持体表面上に適切な抗体を有する固体支持体と結合させることによって調製することができる。
本発明は、タンパク質の標識および検出、ならびに/または細胞翻訳系もしくは無細胞翻訳系からの標識タンパク質の単離のための方法を含む。単離タンパク質は直接使用することができるか、またはさらに精製および/または操作することができる。1つの実施形態において、方法は、定義されたタンパク質(例えば、定義されたタンパク質の集団)と共に用いるか、または細胞もしくは発現ライブラリーから得たものなどの1以上の定義されていないタンパク質を含むタンパク質のセットと共に用いることができる。
標識は、検出できるか、または検出が可能な分子(モイエティ)を含み、1つの実施形態において、本明細書に記載される化合物および方法において有用なモイエティは、シアノベンゾチアゾールの誘導体を介してCysのアミノ基に共有結合で連結されることが可能な分子である。化合物および方法において有用なモイエティは、モイエティを含むタンパク質の検出および任意に定量化ならびに/または単離を促進する、1以上の特性を有する。1つの物理的特性は、放射もしくは吸収などの特徴的な電磁気スペクトル特性、磁性、電子スピン共鳴、静電容量、誘電率または導電率である。特定の実施形態において、モイエティは、強磁性、常磁性、反磁性、発光性、電気化学発光性、蛍光性、リン光性、染色性、抗原性、または特有な質量を有しうる。
1つの実施形態において、過剰な未反応標識(例えば化合物3028)の蛍光は、標識反応へのクエンチング試薬の添加によってクエンチングすることができる。クエンチング試薬は、例えば公知の蛍光クエンチャーにコンジュゲートした任意のβ−メルカプトエチラミンでありえる。かかるクエンチング試薬の1つの可能な具体例は化合物3191である。
電磁放射を使用して検出できるモイエティは、ダンシルフルオロフォア、クマリンおよびクマリン誘導体、蛍光アクリジニウムモイエティ、ベンゾピレンベースのフルオロフォア、に加えて7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール、ならびに3−N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール4−イル)−2,3−ジアミノ−プロピオン酸を含むが、これらに限定されない。1つの実施形態において、蛍光モイエティは生来のアミノ酸とは異なる波長で高量子収率の蛍光を有し、スペクトルのUV部分または可視部分のいずれか、またはスペクトルのUV部分および可視部分の両方で励起することができる高量子収率の蛍光を有する。あらかじめ選ばれた波長での励起に際して、肉眼的に、または従来の蛍光検出方法を使用して、モイエティを低濃度で検出できる。ルテニウムキレートおよびその誘導体またはニトロキシドアミノ酸およびその誘導体などの電気化学発光標識は、フェムトモーラー範囲およびそれ以下で検出できる。
本発明の方法によって調製されたモイエティ含有タンパク質は、特定のタンパク質の量または存在の検出、タンパク質の単離、ハイスループットスクリーニングまたはロースループットスクリーニングの促進、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−DNA相互作用または他のタンパク質ベースの相互作用の検出(例えば、モイエティを使用するタンパク質マイクロアレイを使用して、アレイにタンパク質を結合させるか、または結合したタンパク質を検出する)、タンパク質の免疫原性の促進(例えば、1以上のタンパク質のN末端は、タンパク質に対する抗体の産生を促進しさらに免疫の前に抗原精製を促進するハプテンで標識することができる)、特定の細胞位置または細胞レベル以下の位置へのタンパク質の標的化(例えば、タンパク質局在化ドメインである標識は、タンパク質を、核、葉緑体もしくはミトコンドリアへ、または例えば肝臓特異的抗体を介して特異的細胞へ標的化することができる)、タンパク質の部位特異的配向の提供(例えば、モイエティのためのリガンドは、半固体表面もしくは固体表面に添付されるか、または半固体表面もしくは固体表面(ガラスなど)へ添付された任意の長さのリンカー(例えばポリエチレングリコール(「PEG」)のような有機リンカー)に添付される)、レポーター標識(例えばルシフェラーゼ)および対象となるタンパク質(例えばCYP450)を含むキメラタンパク質の調製、タンパク質マーカーの調製、またはタンパク質上のペプチド、抗原エピトープおよび結合部位のマッピングを、含むがこれらに限定されない任意の目的に有用である。
標識および検出できるモイエティ(例えばシアノベンゾチアゾールまたはその誘導体に共有結合で連結されるもの)は、対象となるペプチドとの反応後に複雑な混合物中のその分子を即座に検出することを可能にする。標識は、本明細書に記載される技術による化学合成によって、または当業者に周知の技術によって、シアノベンゾチアゾールコアに付加されるものでありえる。例えば、コア分子上への蛍光標識または他の標識の添付は、化学的修飾によって遂行することができる。Greg T. Hermanson、Bioconjugate Techniques、アカデミックプレス(Academic Press)社、サンディエゴ、カリフォルニア(1996)を参照。本明細書に記載される化合物を調製するのに使用することができる一般的な合成方法に関する追加情報は、Michael B. Smith and Jerry MarchによるMarch’s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms, and Structure、第5版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社;およびWuts et al.(1999)、Protective Groups in Organic Synthesis、第3版、ジョン・ワイリー・アンド・サン社中に見出すことができる。
シアノベンゾチアゾール誘導体の調製
パートA。4−(3−(2−シアノベンゾ[d]チアゾール−6−イルオキシ)プロピルカルバモイル)−2−(3−(ジメチルアミノ)−6−(ジメチルイミニオ)−6H−キサンテン−9−イル)ベンゾアートの合成;「2−シアノ−(6−オキソプロピルアミドテトラメチル−5’−カルボキシローダミン)ベンゾチアゾール」(化合物3028):
ジクロロメタン(1mL)、トリフルオロ酢酸(1mL)およびアニソール(250μL)中に、100mgの6−(N−Boc−3−アミノプロピルオキシ)−2−シアノ−ベンゾチアゾール(または「tert−ブチル3−(2−シアノベンゾ[d]チアゾール−6−イルオキシ)プロピルカルバマート」(W. Zhou, J. Amer. Chem. Soc. 2006, 128(10), 3122))を含有するフラスコを、0℃で撹拌した。2時間後に溶媒を蒸発させた。エーテル(2mL)を加えて産物を沈殿させた。白色固体を2mLのジエーテルエーテルで2回洗浄し、真空下で乾燥した。固体はさらなる精製なしに使用された。
フルオレセイン標識、アレクサ633標識、ビオチン標識およびIC−5標識を持つ類似した化合物は、適切なFAM−SE(シグマ社)、ビオチンSE(シグマ社)、アレクサ−633−SE(インビトロゲン社)またはIC−5−SE(バイオサーチ・テクノロジーズ(Biosearch Technologies)社、カタログ番号FC−1065S−25)でTAMRA−SEを置き換えて、方法Aを使用して合成された。当業者によって容易に認識されるように、対象となる他の基(レポーターモイエティ、親和性標識、クエンチャーモイエティ、光架橋モイエティ、または固体支持体を含む)に連結されたシアノベンゾチアゾール誘導体を調製するために、類似した技術を使用することができる。
4(および5)−(3−(2−シアノベンゾ[d]チアゾール−6−イルオキシ)プロピルカルバモイル)−2−(3−ヒドロキシ−6−オキソ−6H−キサンテン−9yl)安息香酸(例えば、化合物3066):
(E)−N−(2−(2−アミノ−3−メルカプトプロパンアミド)エチル)−4−((4−(ジメチルアミノ)フェニル)ジアゼニル)ベンズアミド(化合物3191)の合成:
シアノベンゾチアゾール誘導体によるN末端のペプチド標識
この実施例において、シアノベンゾチアゾール−ローダミン試薬を、様々な濃度のシステイン残基含有材料を含有する溶液に加える。溶液は、N末端システイン残基と試薬との間で付加物を形成できる条件下で、シアノベンゾチアゾール−ローダミン試薬と共にインキュベートされる。試薬とのインキュベーション後に、新しく標識された種の存在は、シリカ薄層クロマトグラフィー(TLC)プレートの上での反応混合物の一部分の分画および蛍光種の存在の検討によって検出される。
シアノベンゾチアゾール試薬によるタンパク質の標識
この実施例において、N末端システイン残基を持つタンパク質を、本発明の化合物で標識した。標識の量を、溶液中の他のタンパク質に対して、およびN末端システイン残基をアラニン残基と交換した以外は標的タンパク質と同一であるタンパク質で標的タンパク質を置き換えた並列反応に対して、比較した。実施例は以下のことを実証する。1)融合タンパク質コンストラクトは、TEVプロテアーゼにより消化したときに、コンストラクトがN末端システインを持つ対象となるタンパク質を生成するように構築することができる;2)蛍光性モイエティを含有する本発明の化合物に暴露されたときに、反応においけるN末端システイン残基のない他のタンパク質は蛍光をほとんどまたは全く獲得しないのだが、N末端システイン残基を持つタンパク質(適切にデザインされた融合タンパク質コンストラクトのTEVプロテアーゼによる消化によって産生されたものなど)を暴露すると高度に蛍光性になる、および;3)TEV消化に際してシステイン残基を暴露するものに同一のTEVに消化された融合コンストラクト(しかしそれはアラニン残基を暴露する)を含有する並列反応では、N末端システインを有するタンパク質と同一であるがN末端システインをアラニンで置き換えたタンパク質を含む溶液中のタンパク質の標識は、ほとんどまたは全くない。
原核生物のプロモーター、および翻訳開始領域、続いてインフレームでグルタチオンSトランスフェラーゼ[GST、親和性タンパク質タグ]のコード配列をコードしたプラスミド種がデザインされた。1つのバージョンは、GST、続いてインフレームでTEVプロテアーゼのための認識配列を含有するコード配列、続いてシステイン、続いてインフレームで他のタンパク質を有していた。第2のプラスミド種は、上述のプラスミドと同一であるが、TEV部位の後にコードされたシステインをアラニンで置き換えるようにデザインした。次に、甲虫ルシフェラーゼのタンパク質コード領域は、すべてのこれらのポリペプチドセグメントをコードした1つの連続的なコード領域があるように、TEVプロテアーゼ部位をコードするコード配列の端部とインフレームで融合された。
GST−Luc(AlaおよびCys)のアミノ酸およびヌクレオチドの配列は以下の通りである。
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSGGGGGENLYFQCIAMEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVNITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKLV(配列番号:10)
atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttgaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgtttcaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatccggaggtggtggcggagaaaacctgtacttccaatgcatcgccATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCTCTAGAGGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGAACATCACGTACGCGGAATACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTGTTTGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGGATCTACTGGGTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGATCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGCTAGTACCAACCCTATTTTCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCAAAACGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAGAGAGGCGAATTATGTGTCAGAGGACCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATAGTTGACCGCTTGAAGTCTTTAATTAAATACAAAGGATATCAGGTGGCCCCCGCTGAATTGGAATCGATATTGTTACAACACCCCAACATCTTCGACGCGGGCGTGGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGTCCAAATTGgtttAA(配列番号:11)
SPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSGGGGGENLYFQAIAMEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVNITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKLV(配列番号:12)
atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttgaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgtttcaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatccggaggtggtggcggagaaaacctgtacttccaagcgatcgccATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCTCTAGAGGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGAACATCACGTACGCGGAATACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTGTTTGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGGATCTACTGGGTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGATCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGCTAGTACCAACCCTATTTTCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCAAAACGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAGAGAGGCGAATTATGTGTCAGAGGACCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATAGTTGACCGCTTGAAGTCTTTAATTAAATACAAAGGATATCAGGTGGCCCCCGCTGAATTGGAATCGATATTGTTACAACACCCCAACATCTTCGACGCGGGCGTGGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGTCCAAATTGgtttA(配列番号:13)
確認したプラスミドで形質転換された培養菌を増殖し、タンパク質発現を誘導した。培養の増殖後に、予想されるサイズの融合タンパク質生成の発現を、タンパク質バンドを検出するクマシーブルー染色による細胞サンプルのSDS PAGE分画によって確認した。融合タンパク質の発現は、細胞溶解物中の全可溶性タンパクの1〜5%であると推測された。
培養の増殖後に、細胞を遠心分離によって回収し、処理の準備ができるまで−20℃で凍結した。いったん精製の準備ができれば、細胞沈殿を解凍して緩衝液A(1×PBS(pH7.3)、1mM PMSF、ロッシュ(Roche)社のコンプリート・プロテアーゼ・タブレットを50mLあたり1個)中に再懸濁し、1グラム細胞ペーストあたり緩衝液の8〜10mLの比率でこの緩衝液中に細胞を再懸濁した。次に細胞を超音波処理によって溶解し、不溶性細胞残屑は溶解細胞の4℃で10分間3900×Gの遠心分離によって沈殿させた。
透析された融合タンパク質のタンパク質濃度は、製造業者のプロトコールの通りピアース社のクマシー・プラス(Coomassie Plus)タンパク質試薬の使用によって決定した。等量のペアのタンパク質コンストラクトを、ProTEVプロテアーゼ緩衝剤中に〜1μMに希釈した。ProTEVを加え、融合タンパク質を4℃で一晩で消化した。ProTEV緩衝液は、50mMヘペス(pH7.0)、0.5mM EDTA、1mM DTTであった。消化物のサンプルをSDS PAGEによって分析した。TEV切断部位の後にアラニンを持つ融合コンストラクト、およびTEV切断部位の後にシステインを持つコンストラクトは両方とも、新しいタンパク種(TEV部位でのコンストラクトの切断について予想されるサイズ)の出現およびインタクトな融合タンパク質バンドの消失に基づいて、90%以上まで消化された。
シアノベンゾチアゾール標識試薬による蛍光タグ付加タンパク質のN末端標識の確認
この実施例において、非常に特異的な融合タンパク質コンストラクトが、様々なシアノベンゾチアゾール標識試薬で標識される。次に、2回目はTEV消化タンパク質の新しいアミノ末端から少数のアミノ酸のみを切断する第2の部位特異的プロテアーゼに、タンパク質を暴露する。この切断により、第2の消化の前に達成された標識の特異性の検査が可能になる。したがって、タンパク質が新しいアミノ末端でのみ標識されるならば、消化されたタンパク質上の蛍光はすべて第2のプロテアーゼの作用によって除去されるに違いない。しかしながら、タンパク質が複数の部位で標識されているならば、第2のプロテアーゼによる標識タンパク質の処理は、最初の産物よりもわずかに小さくまだ高度に蛍光性である第2のタンパク種を生成するだろう。
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSGGGGGENLYFQCIAMIEGRAMGSEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPRDGTPVLFLHGNPTSSYLWRNIIPHVAPSHRCIAPDLIGMGKSDKPDLDYFFDDHVRYLDAFIEALGLEEVVLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGIACMEFIRPIPTWDEWPEFARETFQAFRTADVGRELIIDQNAFIEGALPMGVVRPLTEVEMDHYREPFLKPVDREPLWRFPNELPIAGEPANIVALVEAYMNWLHQSPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAARLAESLPNCKTVDIGPGLFLLQEDNPDLIGSEIARWLPGLV (配列番号:14)
atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttgaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgtttcaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatccggaggtggtggcggagaaaacctgtacttccaatgcatcgctatgatagagggtagagctatgggatccgaaatcggtacaggcttccccttcgacccccattatgtggaagtcctgggcgagcgtatgcactacgtcgatgttggaccgcgggatggcacgcctgtgctgttcctgcacggtaacccgacctcgtcctacctgtggcgcaacatcatcccgcatgtagcaccgagtcatcggtgcattgctccagacctgatcgggatgggaaaatcggacaaaccagacctcgattatttcttcgacgaccacgtccgctacctcgatgccttcatcgaagccttgggtttggaagaggtcgtcctggtcatccacgactggggctcagctctcggattccactgggccaagcgcaatccggaacgggtcaaaggtattgcatgtatggaattcatccggcctatcccgacgtgggacgaatggccagaattcgcccgtgagaccttccaggccttccggaccgccgacgtcggccgagagttgatcatcgatcagaacgctttcatcgagggtgcgctcccgatgggggtcgtccgtccgcttacggaggtcgagatggaccactatcgcgagcccttcctcaagcctgttgaccgagagccactgtggcgattccccaacgagctgcccatcgccggtgagcccgcgaacatcgtcgcgctcgtcgaggcatacatgaactggctgcaccagtcacctgtcccgaagttgttgttctggggcacacccggcgtactgatccccccggccgaagccgcgagacttgccgaaagcctccccaactgcaagacagtggacatcggcccgggattgttcttgctccaggaagacaacccggaccttatcggcagtgagatcgcgcgctggctccccgggctggtttaa(配列番号:15)
タンパク質相互作用反応における標識タンパク質の使用
この実施例は、タンパク質相互作用研究においてベンゾチアゾール色素コンジュゲートで標識されたタンパク質を使用することができることを実証する。本発明の化合物の標識に依存せずに無細胞発現系の発現されたタンパク質を容易に同定するために、反応のセットのうち1つは、フルオロテクト(FluoroTect)(商標)グリーンリズ・インビトロ翻訳標識システム(GreenLys in vitro Translation Labeling System)(プロメガ社)を含有する並列のタンパク質発現反応を行なった。フルオロテクトにより発現されたタンパク質は、タンパク質の内部から末端まで加えられた色素で蛍光標識される。標識は、488nmの光へタンパク質のサンプルを暴露すること、および510nm以上の放射光を検出することによって検出される。特定のこの第2の標識方法の使用は、タンパク質のN末端の標識に使用される本発明の化合物からのシグナルと、フルオロテクトによるタンパク質の標識の容易な区別を可能にする。本発明の化合物によりN末端で標識されたタンパク質は、488nmの光によってあまり励起されないが、633nmの光によって強く励起される。一方、フルオロテクト色素は633nmの光によってあまり励起されないが、488nmの光によって強く励起される。したがって、488nmおよび633nmの個別の励起波長を使用して下記の反応からのサンプルをスキャンすることによって、本発明の化合物を使用して標識されたタンパク種から、インビトロタンパク質合成反応において作製されたタンパク種を区別することができる。
レーン1+4、ベイト=緩衝液、プレイ=RI−α。
レーン2+5、ベイト=TNT高収率溶解物(翻訳なし)、プレイ=RI−α。
レーン3+6、ベイト=ハロタグ−PKA、プレイ=RI−α。
レーン1〜3中のサンプルは翻訳の間にフルオロテクトで標識されたが、4〜6は標識されなかった。遠赤外(633nm)はフルオロテクトからのスペクトルを分離するので使用され、したがって色素間のクロストークは観察されなかった。図8(b)において、少量のRI−αはTEVによって切断されなかったので、RI−αの二重線が見える。ゲル上のはるかに高分子量の弱いバンドは恐らくオリゴマーであり、図8(a)中にも存在する。このシアノベンゾチアゾール標識例において若干の非特異的標識種が存在するが、タンパク質:タンパク質相互作用を検出するシアノベンゾチアゾール標識法の能力は明らかに実証される。
本発明の一態様として、例えば以下のものがある。
〔1〕式Iの化合物
(式中、
Zは、H、F、Cl、Br、I、CN、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルエステル、カルボキシ、カルボン酸塩、アルキルアミド、ホスフェート、アルキルホスホネート、スルフェート、アルキルスルホネート、ニトロ、または任意に不飽和であり、任意にアミノ、ヒドロキシ、オキソ(=O)、ニトロ、チオールもしくはハロで置換された(C 1 −C 10 )アルキルであり;
各R 1 は、独立して、H、F、Cl、Br、I、CN、(C 1 −C 6 )アルキル、(C 1 −C 6 )アルコキシ、または(C 1 −C 6 )アルキルチオであり、各アルキル、アルコキシ、またはアルキルチオは、任意にF、Cl、Br、I、アミノ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルスルホネート、もしくはCO 2 M(式中、MはH、有機陽イオン、または無機陽イオン)で置換され;
nは、0、1、または2であり;
Yは、1以上のハロ、オキソ(=O)、(C 1 −C 6 )アルキル、または(C 1 −C 6 )アルコキシで任意に置換され、かつ1以上のN(R 1 )、O、S、または−N−C(=O)−基で任意に中断された(C 1 −C 16 )アルキルを含む連結基であるか、またはXがN 3 である場合Yは任意に存在せず;および
Xは、レポーターモイエティ、親和性モイエティ、クエンチャー、光架橋モイエティ、固体支持体、N 3 、H、またはOHであり、XがHまたはOHである場合、式Iの化合物は、放射性モイエティ、または2−ニトリルモイエティの炭素もしくは窒素原子以外の原子の同位体バリアントを含む)。
〔2〕ZがHまたはFであり、R 1 がHまたはFである、前記〔1〕に記載の化合物。
〔3〕Zが、水素、フッ素、ニトロ、またはアルキルスルホネートである、前記〔1〕に記載の化合物。
〔4〕Xがフルオロフォアである、前記〔3〕に記載の化合物。
〔5〕式Iの化合物が、
である、前記〔4〕に記載の化合物。
〔6〕Xが、レポーターモイエティ、親和性モイエティ、クエンチャー、光架橋モイエティ、または固体支持体である、前記〔3〕に記載の化合物。
〔7〕式Iの化合物が、
である、前記〔6〕に記載の化合物。
〔8〕Xが、N 3 、アレクサ−663、
である、前記〔1〕に記載の化合物。
〔9〕式Iの化合物が、
である、前記〔1〕に記載の化合物。
〔10〕タンパク質のN末端を標識する方法であって、
1以上の異なるタンパク質でありそのうちの少なくとも1つがN末端においてシステインを有するタンパク質、を含む分子集団を有する混合物を、前記〔1〕に記載の化合物であって、式I中のXが、レポーターモイエティまたは親和性モイエティである化合物と接触させて、前記システインに共有結合された前記レポーターモイエティまたは前記親和性モイエティを含む1以上のタンパク質をもたらす工程、
を含む方法。
〔11〕前記レポーターモイエティを検出する工程をさらに含む、前記〔10〕に記載の方法。
〔12〕前記親和性モイエティを含むタンパク質を単離する工程をさらに含む、前記〔10〕に記載の方法。
〔13〕N末端で標識されたタンパク質を検出する方法であって、
a)前記〔1〕に記載の化合物であって、式I中のXが、レポーターモイエティまたは親和性モイエティである化合物と接触させた、1以上の異なるタンパク質でありそのうちの少なくとも1つがN末端においてシステインを有するタンパク質、を含む分子集団を有する混合物を提供する工程であって、前記タンパク質の1以上が、前記システインに共有結合された前記レポーターモイエティまたは前記親和性モイエティを含む工程、及び
b)前記混合物中の前記レポーターモイエティまたは前記親和性モイエティの存在または非存在を検出する工程、
を含む方法。
〔14〕N末端で標識されたタンパク質を単離する方法であって、
a)前記〔1〕に記載の化合物であって、式I中のXが親和性モイエティである化合物と接触させた、1以上の異なるタンパク質でありそのうちの少なくとも1つがN末端においてシステインを有するタンパク質、を含む分子集団を有する混合物を提供する工程であって、前記タンパク質の1以上が、前記システインに共有結合された前記親和性モイエティを含む工程、及び
b)前記親和性モイエティを含む前記1以上のタンパク質を単離する工程、
を含む方法。
〔15〕前記混合物が無細胞翻訳系を含む、前記〔10〕、〔13〕または〔14〕に記載の方法。
〔16〕前記無細胞翻訳系が、コムギ麦芽抽出物、昆虫細胞溶解物、ウサギ網状赤血球溶血液、カエル卵母細胞溶解物、イヌ膵臓溶解物、ヒト細胞溶解物、精製したもしくは半精製した真核生物の翻訳因子の混合物、またはそれらの組み合わせである、前記〔15〕に記載の方法。
〔17〕前記混合物がインタクトな真核生物細胞を含む、前記〔10〕、〔13〕または〔14〕に記載の方法。
〔18〕前記細胞が、組織培養細胞または初代細胞であり、前記細胞が任意にヒト細胞である、前記〔17〕に記載の方法。
〔19〕前記レポーターモイエティを含む前記タンパク質を単離する工程をさらに含む、前記〔10〕または〔13〕に記載の方法。
〔20〕前記モイエティを含む前記タンパク質が、組換え遺伝子産物、遺伝子融合産物、酵素、サイトカイン、炭水化物結合タンパク質、脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ホルモン、免疫原性タンパク質、ヒトタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、またはその断片である、前記〔10〕、〔13〕または〔14〕に記載の方法。
〔21〕前記レポーターモイエティがフルオロフォアである、前記〔10〕または〔13〕に記載の方法。
〔22〕前記親和性モイエティが、3つ以上のアミノ酸のペプチドである、前記〔10〕、〔13〕または〔14〕に記載の方法。
〔23〕前記ペプチドが、エピトープまたは3つ以上の連続したヒスチジン残基を含む、前記〔22〕に記載の方法。
〔24〕前記モイエティが核酸である、前記〔10〕、〔13〕または〔14〕に記載の方法。
〔25〕前記モイエティがRNAまたはDNAである、前記〔24〕に記載の方法。
〔26〕前記親和性モイエティがハプテンである、前記〔10〕、〔13〕または〔14〕に記載の方法。
〔27〕前記モイエティがビオチンを含み、前記ビオチンが、任意に、光切断できるビオチンモイエティである、前記〔10〕、〔13〕または〔14〕に記載の方法。
〔28〕N末端で標識されたタンパク質を検出する方法であって、
a)前記〔1〕に記載の化合物であって、式I中のXが、レポーターモイエティまたは親和性モイエティである化合物、と反応させた、1以上の異なるタンパク質でありそのうちの少なくとも1つがN末端においてシステインを含むN末端で標識されたタンパク質、を含む分子集団を有する混合物を提供する工程
b)前記N末端で標識されたタンパク質を含む混合物を、前記異なるタンパク質と相互作用するように選択されるかまたは相互作用すると疑われる第2のタンパク質を含むサンプルと組み合わせて、この相互作用が複合体をもたらし、第2の混合物を提供する工程、及び
c)前記複合体中の前記レポーターモイエティまたは前記親和性モイエティの存在を検出する工程、
を含む方法。
〔29〕前記第2の混合物から1つの複合体を単離する工程をさらに含む、前記〔28〕に記載の方法。
〔30〕前記第2のタンパク質が融合タンパク質である、前記〔28〕に記載の方法。
〔31〕前記融合タンパク質が、合成基質を結合する第3のタンパク質を含む、前記〔30〕に記載の方法。
〔32〕前記第3のタンパク質が変異体デハロゲナーゼを含む、前記〔31〕に記載の方法。
〔33〕前記合成基質が、固体支持体およびデハロゲナーゼ基質を含む、前記〔32〕に記載の方法。
〔1’〕式Iの化合物
(式中、
Zは、H、F、Cl、Br、I、CN、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルエステル、カルボキシ、カルボン酸塩、アルキルアミド、ホスフェート、アルキルホスホネート、スルフェート、アルキルスルホネート、ニトロ、または任意に不飽和であり、任意にアミノ、ヒドロキシ、オキソ(=O)、ニトロ、チオールもしくはハロで置換された(C 1 −C 10 )アルキルであり;
各R 1 は、独立して、H、F、Cl、Br、I、CN、(C 1 −C 6 )アルキル、(C 1 −C 6 )アルコキシ、または(C 1 −C 6 )アルキルチオであり、各アルキル、アルコキシ、またはアルキルチオは、任意にF、Cl、Br、I、アミノ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルスルホネート、もしくはCO 2 M(式中、MはH、有機陽イオン、または無機陽イオン)で置換され;
nは、0、1、または2であり;
Yは、1以上のハロ、オキソ(=O)、(C 1 −C 6 )アルキル、または(C 1 −C 6 )アルコキシで任意に置換され、かつ1以上のN(R 1 )、O、S、または−N−C(=O)−基で任意に中断された(C 1 −C 16 )アルキルを含む連結基であるか、またはXがN 3 である場合Yは任意に存在せず;および
Xは、レポーターモイエティ、親和性モイエティ、クエンチャー、光架橋モイエティ、固体支持体、N 3 、H、またはOHであり、XがHまたはOHである場合、式Iの化合物は、放射性モイエティ、または2−ニトリルモイエティの炭素もしくは窒素原子以外の原子の同位体バリアントを含む)。
〔2’〕ZがHまたはFであり、R 1 がHまたはFである、前記〔1’〕に記載の化合物。
〔3’〕Xがフルオロフォアである、前記〔1’〕に記載の化合物。
〔4’〕式Iの化合物が、
又は
である、前記〔1’〕に記載の化合物。
〔5’〕Xが、N 3 、アレクサ−633、アレクサ−488、
である、前記〔1’〕に記載の化合物。
〔6’〕タンパク質のN末端を標識する方法であって、
1以上の異なるタンパク質でありそのうちの少なくとも1つがN末端においてシステインを有するタンパク質、を含む分子集団を有する混合物を、前記〔1’〕に記載の化合物であって、式I中のXが、レポーターモイエティまたは親和性モイエティである化合物と接触させて、前記システインに共有結合された前記レポーターモイエティまたは前記親和性モイエティを含む1以上のタンパク質をもたらす工程、
を含む方法。
〔7’〕前記レポーターモイエティを検出する工程をさらに含む、前記〔6’〕に記載の方法。
〔8’〕前記親和性モイエティを含むタンパク質を単離する工程をさらに含む、前記〔6’〕に記載の方法。
〔9’〕前記混合物が無細胞翻訳系を含む、前記〔6’〕に記載の方法。
〔10’〕前記混合物がインタクトな真核生物細胞を含む、前記〔6’〕に記載の方法。
〔11’〕前記モイエティを含む前記タンパク質が、組換え遺伝子産物、遺伝子融合産物、酵素、サイトカイン、炭水化物結合タンパク質、脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ホルモン、免疫原性タンパク質、ヒトタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、またはその断片である、前記〔6’〕に記載の方法。
〔12’〕前記N末端で標識されたタンパク質を、前記異なるタンパク質と相互作用するように選択されるかまたは相互作用すると疑われる第2のタンパク質を含むサンプルと組み合わせて、この相互作用が複合体をもたらし、第2の混合物を提供する工程、及び
前記複合体中の前記レポーターモイエティまたは前記親和性モイエティの存在を検出する工程、
をさらに含む、前記〔6’〕に記載の方法。
〔13’〕前記第2の混合物から1つの複合体を単離する工程をさらに含む、前記〔12’〕に記載の方法。
〔14’〕前記第2のタンパク質が融合タンパク質である、前記〔12’〕に記載の方法。
〔15’〕前記融合タンパク質が変異体デハロゲナーゼを含む、前記〔14’〕に記載の方法。
Claims (13)
- 式Iの化合物
Zは、Hであり;
各R1は、Hであり;
nは、0、1、または2であり;
Yは、
であり;および
Xは、フルオロフォア又は固体支持体であり、
前記フルオロフォアが、フルオロセイン、テキサスレッド、DAPI、PI、アクリジンオレンジ、アレクサフルオル、シアニン色素、エチジウムブロマイド、フルオレセイン、BODIPY、ロードール、Rox、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシフルオレセイン、アントラセン、2−アミノ−4−メトキシナフタレン、フェナレノン、アクリドン、フッ素化キサンテン誘導体、α−ナフトール、β−ナフトール、1−ヒドロキシピレン、クマリン、ローダミン、クレシルバイオレット及びレゾルフィンからなる群から選択される化合物に由来する)。 - Xがフルオロフォアである、請求項1に記載の化合物。
- 式Iの化合物が、
- Xが、
である、請求項1に記載の化合物。 - タンパク質のN末端を標識する方法であって、
1以上の異なるタンパク質でありそのうちの少なくとも1つがN末端においてシステインを有するタンパク質、を含む分子集団を有する混合物を、請求項1に記載の化合物であって、式I中のXが、フルオロフォアである化合物と接触させて、前記システインに共有結合された前記フルオロフォアを含む1以上のタンパク質をもたらす工程、
を含む方法。 - 前記フルオロフォアを検出する工程をさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記混合物が無細胞翻訳系を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記混合物がインタクトな真核生物細胞を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記フルオロフォアを含む前記タンパク質が、組換え遺伝子産物、遺伝子融合産物、酵素、サイトカイン、炭水化物結合タンパク質、脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ホルモン、免疫原性タンパク質、ヒトタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、またはその断片である、請求項5に記載の方法。
- 前記N末端で標識されたタンパク質を、前記異なるタンパク質と相互作用するように選択されるかまたは相互作用すると疑われる第2のタンパク質を含むサンプルと組み合わせて、この相互作用が複合体をもたらし、第2の混合物を提供する工程、及び
前記複合体中の前記レポーターモイエティまたは前記親和性モイエティの存在を検出する工程、
をさらに含む、請求項5に記載の方法。 - 前記第2の混合物から1つの複合体を単離する工程をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記第2のタンパク質が融合タンパク質である、請求項10に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が変異体デハロゲナーゼを含む、請求項12に記載の方法。
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