JP6604938B2 - タンパク質を官能基または固体表面に共有結合的に係留するための基質 - Google Patents
タンパク質を官能基または固体表面に共有結合的に係留するための基質 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/788,257号に対する優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、ハロアルカン基質、およびそのような基質を機能要素(例えば、タグ、標識、表面等)に結合するためのリンカーを提供する。本明細書に記載される基質およびリンカーは、例えば、タンパク質、細胞、および分子の標識、検出、および固定化に用途を見出す。特に、本明細書に提供されるリンカーは、それらのハロアルカン基質と共有結合を形成するデハロゲナーゼ変異型の基質内に用途を見出す。
本明細書で使用される、用語「直鎖状に結合した原子」は、鎖またはポリマーの骨格原子を指し、主鎖または骨格を形成しないペンダント、側鎖、またはH原子を除く。
本発明は、ハロアルカン基質、およびそのような基質を機能要素(例えば、タグ、標識、表面等)に結合するためのリンカーを提供する。本明細書に記載される基質およびリンカーは、例えば、タンパク質、細胞、および分子の標識、検出、および固定化に用途を見出す。特に、本明細書に提供されるリンカーは、それらのハロアルカン基質と共有結合を形成するデハロゲナーゼ変異型の基質内に用途を見出す。
基質の反応基は、変異体タンパク質(例えば、変異体デハロゲナーゼ)によって認識され、共有結合を形成する部分である。反応基は、超安定した、またはタンパク質によって通常一過的にのみ結合するであろうその基質と共有結合を形成するために変更された任意の変異体タンパク質の任意の好適な基質であってよい。特定の実施形態では、タンパク質は変異体デハロゲナーゼであり、基質の反応基はハロアルカンである。基質のハロアルカン部分は、末端ハロゲン(例えば、Cl、Br、F、I等)によってキャッピングされるアルカン(例えば、C2−C20)を含む。いくつかの実施形態では、ハロアルカンは、式A−Xのものであり、Xは、ハロゲン(例えば、Cl、Br、F、I等)であり、Aは、2〜20個の炭素を含むアルカンである。ある特定の実施形態では、Aは、2〜12個の炭素の直鎖セグメントを含む。ある特定の実施形態では、Aは、2〜12個の炭素の直鎖セグメントである。
基質および方法に有用な官能基(R)は、基質もしくはタンパク質またはそれに結合される融合物の単離、精製、検出、局在化、固定化等に有用な分子である。官能基は、二官能性リンカーの反応置換基の1つまたはタンパク質(例えば、デハロゲナーゼ)の基質に共有結合的に連結することができ、基質の一部分として、天然に見られる基質に連結されず、変異体タンパク質(例えば、デハロゲナーゼ)と安定した複合体を形成することができる官能基として所望の特性(例えば、活性、結合等)を維持する。よって、官能基は、官能基を有する基質と変異体タンパク質(例えば、デハロゲナーゼ)との間の安定した複合体の検出、単離、固定化等を容易にする1つ以上の特性を有する。官能基は、検出が可能である、および別の分子に結合されるなどの2つ以上の官能特性を有し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の基質は、官能基と反応基との間にリンカーまたは複数のリンカー(例えば、L1−M−L2)を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、タンパク質(例えば、デハロゲナーゼ)が基質の反応部分と相互作用する(例えば共有結合)のに十分な距離を提供する。本明細書で使用される、リンカーは、単一共有結合ではない。リンカーは、その標的タンパク質(例えば、デハロゲナーゼ)によって結合され得る基質を提供する。いくつかの実施形態では、リンカーは、約5オングストローム〜約1000オングストローム以下の長さにより官能基(R)と反応基(A−X)とを分離する。他の好適なリンカーは、約5オングストローム〜約100オングストロームによりRと反応基とを分離するリンカー、ならびに約5オングストローム〜約50オングストローム、約5オングストローム〜約25オングストローム、約5オングストローム〜約500オングストローム、または約30オングストローム〜約100オングストロームによりRと基質とを分離するリンカーを含む。
上述のように、基質は、リンカー(例えば、カルバメート含有リンカー)によって結合される官能基および反応基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーのカルバメートは、2つ以上の直鎖状に結合した原子によって官能基から分離される。いくつかの実施形態では、反応基に最も近く位置するリンカーのカルバメートは、8〜16個の直鎖状に結合した原子(例えば、10〜14個の原子、11〜13個の原子、12個の原子)によって反応基から分離される。
例えば、米国特許第7,238,842号、米国特許第7,425,436号、米国特許第7,429,472号、米国特許第7,867,726号(それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)により詳細に記載される変異体タンパク質、加水分解酵素、および/またはデハロゲナーゼは、対応する野生型タンパク質、加水分解酵素、またはデハロゲナーゼと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。変異体タンパク質(例えば、変異体デハロゲナーゼ)は、組換え技法(例えば、部位特異的突然変異誘発または再帰的突然変異誘発)を介して調製されるものに限定されず、変異体タンパク質(例えば、変異体デハロゲナーゼ)に、1つ以上の官能基を含む基質などの基質と安定した結合(例えば、共有結合)を形成することを可能にする1つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、変異体加水分解酵素である。ある特定の実施形態では、変異体タンパク質は、変異体デハロゲナーゼである。少なくとも1つのアミノ酸置換は、対応する野生型タンパク質と基質との間に形成される結合よりも安定した基質との結合(例えば、共有結合)を形成する変異体タンパク質をもたらす。変異体タンパク質における少なくとも1つのアミノ酸置換は、対応する野生型タンパク質と基質との間に形成される結合を切断する水分子の活性化に関連する対応する野生型タンパク質におけるアミノ酸残基での置換、または基質とエステル中間体を形成する対応する野生型タンパク質におけるアミノ酸残基での置換である。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、対応する野生型タンパク質と比較して少なくとも2つのアミノ酸置換を含み、1つの置換は、野生型タンパク質において、水分子の活性化に関連する残基、または野生型タンパク質において、加水分解酵素の基質の求核攻撃によりエステル中間体を形成する残基に存在し、別の置換は、野生型タンパク質において、加水分解酵素基質の結合部位(複数可)の、もしくはその近くにある残基に存在するが、対応する野生型タンパク質において、水分子の活性化に関連する、または基質とエステル中間体を形成する残基に存在しない。一実施形態では、第2の置換は、野生型タンパク質において、タンパク質の触媒ポケット内への基質侵入のための部位(複数可)を並べる残基に存在する。追加の置換(複数可)は、好ましくは、対応する野生型タンパク質の基質に結合するそれらの変異体の安定した共有結合形成の速度を増加する。タンパク質、加水分解酵素、およびデハロゲナーゼの配列および変異の詳細は、例えば、米国特許第7,238,842号、米国特許第7,425,436号、米国特許第7,429,472号、米国特許第7,867,726号に記載されており、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態では、本発明は、変異体タンパク質(例えば、変異体デハロゲナーゼ)および対象とするタンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列(例えば、薬物標的、マーカータンパク質(例えば、選択可能マーカータンパク質、親和性タグ(例えば、ポリヒスチジン配列)))、対象とする酵素(例えば、ルシフェラーゼ、RNasin、RNase、および/またはGFP)、核酸結合タンパク質、細胞外基質タンパク質、分泌されたタンパク質、Fcなどの抗体もしくはその一部分、生物発光タンパク質、受容体リガンド、調節タンパク質、血清タンパク質、免疫原性タンパク質、蛍光タンパク質、反応性システインを有するタンパク質、受容体タンパク質(例えば、NMDA受容体、チャネルタンパク質(例えば、HERGチャネルタンパク質を含むナトリウム、カリウム、またはカルシウム感受性チャネルタンパク質などのイオンチャネルタンパク質))、膜タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、核タンパク質、構造タンパク質、リンタンパク質、キナーゼ、シグナル伝達タンパク質、代謝タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、受容体関連タンパク質、蛍光タンパク質、酵素基質(例えば、プロテアーゼ基質)、転写因子、タンパク質不安定化配列、または輸送タンパク質(例えば、EAAT1−4グルタメート輸送体)、ならびに標的シグナル(例えば、変異体加水分解酵素を特定の位置に指向する、ミトコンドリア局在化配列、核局在化シグナル、またはミスチル化配列などの色素体標的シグナル)を含む融合タンパク質を提供する。
本発明は、本明細書に記載される基質(例えば、基質と共有結合を形成する変異体タンパク質との組み合わせで)を含む組成物およびキットも提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される基質を含み、官能基は、対象とする化合物(例えば、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子)であり、固体支持体は変異体デハロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の基質を含む固体支持体を含み、固体支持体は、変異体タンパク質またはその融合物を含み、キットは、本発明の基質を含むか、またはキットは、デハロゲナーゼもしくはその融合物をコードするベクターを含む。いくつかの実施形態では、キットは、アッセイを行うための試薬、官能基をリンカー/反応基上に付加するための試薬、正および/または負の対照、説明書等をさらに含む。
基質および変異体タンパク質(例えば、デハロゲナーゼ)は、インビトロおよび/またはインビボの対象とする分子、生細胞撮像を含む標識細胞、もしくは標識タンパク質を単離、検出、特定、撮像、表示、または局在化するのに有用である。例えば、固体支持体(例えば、微小球、膜、ポリマープレート、ビーズ(例えば、ガラス、磁気ポリマー等)、ガラススライド等)に結合される基質、または固体支持体に結合される変異体タンパク質(例えば、デハロゲナーゼ)は、タンパク質アレイ、細胞アレイ、小胞/小器官アレイ、遺伝子アレイ、および/または細胞膜アレイを生成するために使用され得る。よって、いくつかの実施形態では、方法は、対象とする分子を単離または特定するために提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載される基質を有する試料(例えば、細胞または細胞溶解物)を含み、官能基は、対象とする化合物(例えば、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子)であり、固体支持体は、変異体デハロゲナーゼを含む。その後、基質に結合される対象とする分子が特定される。いくつかの実施形態では、本方法は、変異体タンパク質(例えば、デハロゲナーゼ)、ならびに対象とする分子および本明細書に記載される1つ以上の基質を含む固体支持体に結合されるタンパク質のうちの少なくとも1つを含む、1つ以上の融合タンパク質を含む試料を接触させることを含む。例えば、本方法は、変異体タンパク質に縮合されるタンパク質に結合されるDNAを単離するために採用され得る。
実施例1
デキサメタゾンカダベリン中間体
デキサメタゾン酸(10mg、26umol、Toronto Research Chemicals)、および2mLのDMF中の(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP、15mg、29umol)の溶液に、N−Bocカダベリン(106mg、520umol)を添加した。反応物を16時間攪拌し、次いで、1NのHClを添加してクエンチし、0.1%の水性ギ酸中10−>50%のMeCNで溶出する分取HPLCにより生成物を単離し、そのまま続けて行われた所望のデキサメタゾンN−Bocカダベリン付加物を得た。
PBI−4980:デキサメタゾンカルバメートクロロアルカン
実験は、カルバメートクロロアルカン薬物共役体を使用して、細胞からHALOTAGタンパク質ビーズ上への標的タンパク質のプルダウンの効率を示すために(図9の概略図を参照)、本発明の実施形態の開発中に行われた。この実施例では、生細胞からNanoLuc−p38α融合タンパク質をプルダウンするために、BIRB−カルバメートクロロアルカン共役体(PBI−4834、図1を参照)を利用した。
以下の実施例は、細胞透過性、HaloTag(登録商標)タンパク質に対する結合親和性、およびクロロアルカン修飾薬物を介した細胞からHaloTag(登録商標)ビーズ上への標的プルダウンに関するカルバメートクロロアルカンリンカーの利点を示す。この実施例では、メトトレキサート−クロロアルカン共役体PBI−5015(カルバメートクロロアルカンリンカー)、PBI−4848(O2クロロアルカンリンカー)、PBI−4849(O4クロロアルカンリンカー)、およびPBI−4850(O6クロロアルカンリンカー)(図2を参照)が、細胞および溶解物におけるHaloTag(登録商標)タンパク質に対するそれらの結合効率に関して試験された。
以下の実施例は、細胞透過性、HaloTag(登録商標)タンパク質に対する結合親和性、標的に対する結合親和性、およびクロロアルカン修飾薬物を介した細胞からHaloTag(登録商標)ビーズ上への標的プルダウンに関するカルバメートクロロアルカンリンカーの利点を示す。この実施例では、デキサメタゾン−クロロアルカン共役体PBI−4980(カルバメートクロロアルカンリンカー)、PBI−4027(O2クロロアルカンリンカー)、PBI−4026(O4クロロアルカンリンカー)、およびPBI−4025(O6クロロアルカンリンカー)(図5を参照)は、細胞および溶解物におけるHaloTag(登録商標)タンパク質に対するそれらの結合効率、ならびに標的グルココルチコイド受容体に対するそれらの結合効率に関して試験された。
PBI−4848メトトレキサート−O2クロロアルカン
メトトレキサート水和物(50mg、110umol)、EDAC(63mg、330umol)、および2mLのDMF中のトリエチルアミン(77uL、550umol)の混合物に、N−Bocカダベリン(22mg、110umol)を添加した。反応を90分間攪拌し、次いで、2mLの1NのHClでクエンチし、水で希釈し、分取HPLC(0.1%の水性ギ酸中20−>50%のMeCN)にかけた。適切な画分を濃縮し、凍結乾燥し、所望の生成物を得た。M+Hの計算値:639.3、実測値639.5。
BIRB*O2クロロアルカン(PBI−4832)
ダサチニブペンチルアミン
ダサチニブ(50mg、102umol)を、p−ニトロフェニルクロロホルメート(28mg、139umol、1.36equiv)および1.8mLのDMF:THF(2:1)中20uLのTEAと混合した。反応を一晩攪拌し、次いで、カダベリン(209mg、2mmol、20equiv)を添加した。2時間攪拌した後、反応をAcOHで中和し、0.1%の水性TFA中20−>60%のMeCNの勾配を使用して、分取HPLCにより所望の生成物を単離した。適切な画分を濃縮し、凍結乾燥し、所望の生成物を得た。
Boc保護SAHAアミン
7−トリチルオキシカルバモイルヘプタン酸(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Schaefer et al.Bioorg Med Chem Lett 2008,16,2011−2033)(200mg、463umol)を、4−[(N−Boc)アミノメチル]アニリン(113mg、510umol)、HBTU(352mg、927umol)、および3mLのDMF中のトリエチルアミン(194uL、1.4mmol)と混合した。反応を一晩攪拌し、次いで、セライト上に吸着させた。ヘプタン中0−>100%のEtOAcの勾配で溶出するカラムクロマトグラフィーにより生成物を得た。M+Hの計算値:635.3、実測値635.9。
スベロイル(4−[(N−Boc)アミノメチル]アニリド)ヒドロキサム酸(286mg、450mmol)を、0.25mLのTISに添加された2mLのDCMに溶解した。次いで、トリフルオロ酢酸(0.9mL)を添加し、反応を30分間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、粗反応生成物を、分取HPLCにより精製するか、またはさらに精製することなく使用した。
PBI−5231 SAHAアミド
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、J.Med.Chem.2002,45,3296−3309。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、BioTechniques 2009,47,769−774。
以下の実施例は、細胞透過性、HaloTagに対する結合速度論、およびクロロアルカン修飾薬物を介した細胞からHaloTag(登録商標)ビーズ上への標的プルダウンに関するカルバメート−クロロアルカンリンカーの利点を示す。この実施例では、修飾されたBIRB796−クロロアルカン共役体PBI−4834(カルバメート−クロロアルカンリンカー)およびPBI−4832(O2クロロアルカンリンカー)は、細胞および溶解物においてHaloTagに対するそれらの結合速度論に関して試験された。
以下の実験は、細胞透過性、およびHaloTag(登録商標)タンパク質に対する結合速度論に関するカルバメートクロロアルカンリンカーの利点を示す。
以下の実施例は、細胞透過性、HaloTag(登録商標)タンパク質に対する結合速度論、およびクロロアルカン修飾薬物を介した細胞からHaloTag(登録商標)タンパク質ビーズ上への標的プルダウンに関するクロロアルカンリンカーにおけるカルバメート基の利点を示す。この実施例では、ダサチニブクロロアルカン共役体PBI−5270(ビスカルバメートクロロアルカンリンカー)およびPBI−5590(モノカルバメートクロロアルカンリンカー)は、細胞および溶解物においてHaloTag(登録商標)タンパク質に対するそれらの結合速度論に関して試験された。
以下の実施例は、薬物透過性および効力に対するクロロアルカン修飾の最小限の影響を示す。
以下の実施例は、低存在量および低親和性標的を含む、細胞からの内因性標的をプルダウンするクロロアルカン共役薬物の能力を示す。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕式R−L1−M−L2−A−Xの化合物であって、
式中、Rが、官能基であり、L1が、第1のリンカー部分であり、Mが、カルバメート基であり、L2が、第2のリンカー部分であり、Aが、アルキル基であり、Xが、ハロゲンであり、
L2−Aが、6〜18個の直鎖状に結合した原子によってMとXとを分離し、
L1が、2個以上の直鎖状に結合した原子によってRとMとを分離する、化合物。
〔2〕Aが、(CH2)6である、前記〔1〕に記載の化合物。
〔3〕L2−Aが、12個の直鎖状に結合した原子によってMとXとを分離する、前記〔1〕のいずれか一項に記載の化合物。
〔4〕前記官能基が、親和性タグ、フルオロフォア、または固体表面を含む、前記〔1〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔5〕前記官能基が、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である、前記〔1〕のいずれか一項に記載の化合物。
〔6〕L2が、カルバメート基を含まない、前記〔1〕のいずれか一項に記載の化合物。
〔7〕L2が、直鎖状に結合したCH2およびO基を含む、前記〔1〕のいずれか一項に記載の化合物。
〔8〕L2が、直鎖状に結合したCH2およびO基からなる、前記〔7〕に記載の化合物。
〔9〕L2が、((CH2)2O)xを含み、式中、x=0〜5である、前記〔7〕に記載の化合物。
〔10〕L2が、((CH2)2O)2を含む、前記〔9〕に記載の化合物。
〔11〕L1が、直鎖状に結合したCH2およびO基を含む、前記〔1〕に記載の化合物。
〔12〕L1が、カルバメートを含む、前記〔1〕に記載の化合物。
〔13〕L1が、2〜8個の長さの直鎖状に結合した原子である、前記〔12〕に記載の化合物。
〔14〕L1が、NHCOO−((CH2)2O)xを含み、式中、x=1〜8である、前記〔12〕に記載の化合物。
〔15〕L1が、NHCOO−((CH2)2O)3を含む、前記〔14〕に記載の化合物。
〔16〕L1が、NHCOO−((CH2)2O)3を含み、L2が、((CH2)2O)2を含み、Aが(CH2)6である、前記〔1〕に記載の化合物。
〔17〕前記官能基が、親和性タグ、フルオロフォア、または固体表面を含む、前記〔16〕に記載の化合物。
〔18〕前記官能基が、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である、前記〔16〕に記載の化合物。
〔19〕L1−M−L2−Aを含むリンカーによって官能基に連結されるタンパク質を含む組成物であって、
式中、L1が、第1のリンカー部分であり、Mが、カルバメート基であり、L2が、第2のリンカー部分であり、Aが、アルキル基であり、
L2−Aが、8〜16個の直鎖状に結合した原子によって前記タンパク質からMを分離し、
L1が、2個以上の直鎖状に結合した原子によって前記官能基とMとを分離する、組成物。
〔20〕前記タンパク質が、変異体デハロゲナーゼを含む、前記〔19〕に記載の組成物。
〔21〕前記タンパク質が、融合タンパク質の一部分である、前記〔19〕に記載の組成物。
〔22〕Aが、(CH2)6である、前記〔19〕に記載の組成物。
〔23〕L2−Aが、12個の直鎖状に結合した原子によって前記タンパク質からMを分離する、前記〔19〕に記載の組成物。
〔24〕前記官能基が、親和性タグ、フルオロフォア、または固体表面を含む、前記〔19〕に記載の組成物。
〔25〕前記官能基が、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である、前記〔19〕に記載の化合物。
〔26〕L2が、カルバメート基を含まない、前記〔19〕に記載の組成物。
〔27〕L2が、直鎖状に結合したCH2およびO基を含む、前記〔19〕に記載の組成物。
〔28〕L2が、直鎖状に結合したCH2およびO基からなる、前記〔27〕に記載の組成物。
〔29〕L2が、((CH2)2O)xを含み、式中、x=0〜5である、前記〔27〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔30〕L2が、((CH2)2O)2を含む、前記〔29〕に記載の組成物。
〔31〕L1が、直鎖状に結合したCH2およびO基を含む、前記〔19〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔32〕L1が、カルバメートを含む、前記〔19〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔33〕L1が、NHCOO−((CH2)2O)xを含み、式中、x=1〜8である、前記〔32〕に記載の組成物。
〔34〕L1が、NHCOO−((CH2)2O)3を含む、前記〔33〕に記載の組成物。
〔35〕L1が、2〜8個の長さの直鎖状に結合した原子である、前記〔33〕に記載の組成物。
〔36〕L1が、NHCOO−((CH2)2O)3を含み、L2が、((CH2)2O)2を含み、Aが、(CH2)6である、前記〔19〕に記載の組成物。
〔37〕前記官能基が、親和性タグ、フルオロフォア、または固体表面を含む、前記〔36〕に記載の組成物。
〔38〕前記官能基が、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である、前記〔32〕のいずれか一項に記載の化合物。
〔39〕対象とする標的分子を特定する方法であって、a)試料を、前記〔1〕〜〔38〕のうちのいずれか一項に記載の基質と接触させることであって、前記官能基が、前記対象とする化合物である、接触させることと、b)前記試料および基質を、変異体デハロゲナーゼを含む固体支持体と接触させることと、c)前記基質に結合された前記対象とする分子を特定することと、を含む、方法。
〔40〕前記対象とする化合物が、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である、前記〔39〕に記載の方法。
〔41〕前記試料が、細胞または細胞溶解物である、前記〔39〕に記載の方法。
〔42〕前記対象とする分子が、融合タンパク質である、前記〔39〕に記載の方法。
〔43〕前記融合タンパク質が、レポータータンパク質を含む、前記〔42〕に記載の方法。
〔44〕変異体デハロゲナーゼの存在または量を検出または決定する方法であって、a)変異体デハロゲナーゼを、前記〔1〕に記載の化合物を含む基質と接触させることであって、前記変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、接触させることと、b)Rの存在もしくは量を検出または決定し、それにより前記変異体デハロゲナーゼの存在または量を検出または決定することと、を含む、方法。
〔45〕細胞を標識する方法であって、変異体デハロゲナーゼを含む細胞を、前記〔1〕に記載の化合物を含むデハロゲナーゼ基質と接触させることであって、前記変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成される結合よりも安定した前記基質との結合を形成する前記変異体デハロゲナーゼをもたらし、それにより前記細胞をRで標識する、接触させることと、を含む、方法。
〔46〕細胞中の分子の存在または量を検出するための方法であって、a)変異体デハロゲナーゼを含む細胞を、前記〔1〕に記載の化合物を含む基質と接触させることであって、前記変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成される結合よりも安定した前記基質との結合を形成する前記変異体デハロゲナーゼをもたらす、接触させることと、b)前記細胞中のRの存在または量を検出または決定することと、を含む、方法。
〔47〕対象とする分子を固定化単離する方法であって、(a)前記〔1〕に記載の化合物を含む基質を提示する固体支持体を、(b)(i)前記基質との相互作用時に前記基質と共有結合を形成する変異体デハロゲナーゼと、(ii)前記対象とする分子に結合されるタンパク質と、を含む融合タンパク質と接触させることを含む、方法。
〔48〕対象とするタンパク質を固定化する方法であって、(a)前記〔1〕に記載の基質を含む固体支持体を、(b)(i)前記基質との相互作用時に前記基質と共有結合を形成する変異体デハロゲナーゼと、(ii)対象とするタンパク質との融合物と接触させることを含む、方法。
〔49〕前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成される結合よりも安定した前記基質との結合を形成する前記変異体デハロゲナーゼをもたらし、前記変異体デハロゲナーゼにおける少なくとも1つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成された前記結合を切断する水分子の活性化に関連する前記対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換、または前記基質とエステル中間体を形成する前記対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換である、前記〔39〕〜〔48〕のいずれか一項に記載の方法。
〔50〕前記〔1〕に記載の化合物を調製するための方法であって、式R−Yの化合物を、式Z−L1−M−L2−A−Xの化合物とカップリングすることを含み、式中、YおよびZが、反応してR−を−リンカー−L1−M−L2−A−Xに連結することができる基である、方法。
〔51〕R−Yが、式Rの化合物の活性化エステルであり、Zが、前記活性化エステルと反応してアミド結合を形成するのに好適なアミンである、前記〔50〕に記載の方法。
〔52〕前記〔1〕に記載の基質を含む、細胞。
Claims (16)
- 式R−L1−M−L2−A−Xの化合物であって、
式中、
Rが、下記の基からなる群より選ばれる官能基であり、
(各官能基中、*はL1に対する結合点を示す)
L1が、式:NHCOO-((CH2)2O)x -CH 2 CH 2 -(式中、x=1-8)で表される第1のリンカー部分であり、
Mが、カルバメート基であり、
L2が、((CH2)2O)x(式中、x=2-5)であり、
Aが、アルキレン基であり、
Xが、ハロゲンであり、
L2−Aが、7〜18個の直鎖状に結合した原子によってMとXとを分離する、化合物。 - L1−M−L2−Aを含むリンカーによって官能基に連結されるタンパク質を含む組成物であって、
式中、
官能基が、下記の基からなる群より選ばれ、
(各官能基中、*はL1に対する結合点を示す)
L1が、式:NHCOO-((CH2)2O)x -CH 2 CH 2 -(式中、x=1-8)で表される第1のリンカー部分であり、
Mが、カルバメート基であり、
L2が、((CH2)2O)x(式中、x=2-5)であり、
Aが、アルキレン基であり、
L2−Aが、8〜16個の直鎖状に結合した原子によって前記タンパク質からMを分離する、組成物。 - 前記タンパク質が、変異体デハロゲナーゼを含む、又は、融合タンパク質の一部分である、請求項2に記載の組成物。
- Aが、(CH2)6である、請求項1に記載の化合物又は請求項2に記載の組成物。
- L2−Aが、12個の直鎖状に結合した原子によってX又は前記タンパク質からMを分離する、請求項1に記載の化合物又は請求項2に記載の組成物。
- L1が、式:NHCOO−((CH2)2O)3 −CH 2 CH 2 −で表され、L2が、((CH2)2O)2を含み、Aが(CH2)6である、請求項1に記載の化合物又は請求項2に記載の組成物。
- 対象とする標的分子を特定する方法であって、
a)試料を、請求項1に記載の化合物を含む基質と接触させること、ここで、前記官能基が、前記対象とする標的分子である、
b)前記試料および基質を、変異体デハロゲナーゼを含む固体支持体と接触させることと、
c)前記基質に結合された前記対象とする標的分子を特定することと、を含む、方法。 - 前記試料が、細胞または細胞溶解物である、請求項7に記載の方法。
- 変異体デハロゲナーゼの存在または量を検出または決定する方法であって、
a)変異体デハロゲナーゼを、請求項1に記載の化合物を含む基質と接触させること、ここで、前記変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、
b)Rの存在もしくは量を検出または決定し、それにより前記変異体デハロゲナーゼの存在または量を検出または決定することと、を含む、方法。 - 細胞を標識する方法であって、変異体デハロゲナーゼを含む細胞を、請求項1に記載の化合物を含むデハロゲナーゼ基質と接触させることを含み、
前記変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成される結合よりも安定した前記基質との結合を形成する前記変異体デハロゲナーゼをもたらし、それにより前記細胞をRで標識する、方法。 - 細胞中の分子の存在または量を検出するための方法であって、
a)変異体デハロゲナーゼを含む細胞を、請求項1に記載の化合物を含む基質と接触させること、ここで、前記変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成される結合よりも安定した前記基質との結合を形成する前記変異体デハロゲナーゼをもたらす、及び
b)前記細胞中のRの存在または量を検出または決定することを含む、方法。 - 対象とする分子を固定化又は単離する方法であって、(a)請求項1に記載の化合物を含む基質を提示する固体支持体を、(b)(i)前記基質との相互作用時に前記基質と共有結合を形成する変異体デハロゲナーゼと、(ii)前記対象とする分子に結合されるタンパク質と、を含む融合タンパク質と接触させることを含む、方法。
- 対象とするタンパク質を固定化する方法であって、(a)請求項1に記載の化合物を含む基質を含む固体支持体を、(b)(i)前記基質との相互作用時に前記基質と共有結合を形成する変異体デハロゲナーゼと、(ii)対象とするタンパク質との融合物と接触させることを含む、方法。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成される結合よりも安定した前記基質との結合を形成する前記変異体デハロゲナーゼをもたらし、前記変異体デハロゲナーゼにおける少なくとも1つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成された前記結合を切断する水分子の活性化に関連する前記対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換、または前記基質とエステル中間体を形成する前記対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1に記載の化合物を調製するための方法であって、式R−Yの化合物を、式Z−L1−M−L2−A−Xの化合物とカップリングすることを含み、式中、YおよびZが、反応してR−をリンカー−L1−M−L2−A−Xに連結することができる基であり、
任意にR−Yが、式Rの化合物の活性化エステルであり、Zが、前記活性化エステルと反応してアミド結合を形成するのに好適なアミンである、方法。 - 請求項1に記載の化合物を含む基質を含む、細胞。
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