JP2016521250A - タンパク質を官能基または固体表面に共有結合的に係留するための基質 - Google Patents

Abstract

本発明は、ハロアルカン基質、およびそのような基質を機能要素（例えば、タグ、標識、表面等）に結合するためのリンカーを提供する。本明細書に記載される基質およびリンカーは、例えば、タンパク質、細胞、および分子の標識、検出、および固定化に用途を見出す。特に、本明細書に提供されるリンカーは、それらのハロアルカン基質と共有結合を形成するデハロゲナーゼ変異型の基質内に用途を見出す。【選択図】 なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８８，２５７号に対する優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、ハロアルカン基質、およびそのような基質を機能要素（例えば、タグ、標識、表面等）に結合するためのリンカーを提供する。本明細書に記載される基質およびリンカーは、例えば、タンパク質、細胞、および分子の標識、検出、および固定化に用途を見出す。特に、本明細書に提供されるリンカーは、それらのハロアルカン基質と共有結合を形成するデハロゲナーゼ変異型の基質内に用途を見出す。

対象とする細胞、タンパク質、および分子の検出、単離、および固定化は、現代の様々な生物学用途（例えば、基本的な分子生物学の研究、新薬の発見、臨床診断等）に必須の技法である。既存の技法に勝る利点を提供する組成物および方法が必要とされている。

本発明は、ハロアルカン基質、およびそのような基質を機能要素（例えば、タグ、標識、表面等）に結合するためのリンカーを提供する。本明細書に記載される基質およびリンカーは、例えば、タンパク質、細胞、および分子の標識、検出、および固定化に用途を見出す。特に、本明細書に提供されるリンカーは、それらのハロアルカン基質と共有結合を形成するデハロゲナーゼ変異型の基質内に用途を見出す。

いくつかの実施形態では、本発明は、式Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘの化合物を提供し、式中、Ｒは、官能基であり、Ｌ¹は、第１のリンカー部分であり、Ｍは、カルバメート基であり、Ｌ²は、第２のリンカー部分であり、Ａは、アルキル基であり、Ｘは、ハロゲンであり、Ｌ²−Ａは、６〜１８個の直鎖状に連結した原子によってＭとＸとを分離し、Ｌ¹は、２つ以上の直鎖状に連結した原子によってＲとＭとを分離する。いくつかの実施形態では、Ａは、（ＣＨ₂）₆である。いくつかの実施形態では、Ｌ²−Ａは、１２個の直鎖状に結合した原子によってＭとＸとを分離する。いくつかの実施形態では、官能基は、親和性タグ、フルオロフォア、または固体表面を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、カルバメート基を含まない。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、直鎖状に結合したＣＨ₂およびＯ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、直鎖状に結合したＣＨ₂およびＯ基からなる。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、（（ＣＨ₂）₂Ｏ）_xを含み、式中、ｘ＝０〜５である。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、（（ＣＨ₂）₂Ｏ）₂を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、直鎖状に結合したＣＨ₂およびＯ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、カルバメートを含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ₂）₂Ｏ）_xを含み、式中、ｘ＝１〜８である。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ₂）₂Ｏ）₃を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ₂）₂Ｏ）₃を含み、Ｌ²は、（（ＣＨ₂）₂Ｏ）₂を含み、Ａは、（ＣＨ₂）₆である。

ＰＢＩ−４９８０は、式Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ：
の例示的な基質である。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａを含むリンカーによって官能基に連結されるタンパク質を含む組成物を提供し、式中、Ｌ¹は、第１のリンカー部分であり、Ｍは、カルバメート基であり、Ｌ²は、第２のリンカー部分であり、Ａは、アルキル基であり、Ｌ²−Ａは、８〜１６個（例えば、１０〜１４、１２）の直鎖状に結合した原子によってタンパク質からＭを分離し、Ｌ¹は、２個以上の直鎖状に結合した原子によって官能基とＭとを分離する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、変異体デハロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、融合タンパク質の一部分である。いくつかの実施形態では、Ａは、（ＣＨ₂）₆である。いくつかの実施形態では、Ｌ²−Ａは、１２個の直鎖状に結合した原子によってＭとＸとを分離する。いくつかの実施形態では、官能基は、親和性タグ、フルオロフォア、または固体表面を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、カルバメート基を含まない。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、直鎖状に結合したＣＨ₂およびＯ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、直鎖状に結合したＣＨ₂およびＯ基からなる。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、（（ＣＨ₂）₂Ｏ）_xを含み、式中、ｘ＝０〜５である。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、（（ＣＨ₂）₂Ｏ）₂を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ₁は、直鎖状に結合したＣＨ₂およびＯ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ₁は、カルバメートを含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ₂）₂Ｏ）_xを含み、式中、ｘ＝１〜８である。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ₂）₂Ｏ）₃を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ₂）₂Ｏ）₃を含み、Ｌ²は、（（ＣＨ₂）₂Ｏ）₂を含み、Ａは、（ＣＨ₂）₆である。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、１〜１５個の直鎖状に結合した原子（例えば、１〜１２この原子、１〜１０個の原子、２〜１０個の原子、１〜９個の原子、２〜９個の原子、１〜８個の原子、２〜８個の原子、１〜７個の原子、１〜６個の原子、２〜６個の原子等）によってＲとＭとを分離する。

いくつかの実施形態では、本発明は、変異体デハロゲナーゼの存在もしくは量を検出または決定するための方法を提供し、ａ）変異体デハロゲナーゼを、デハロゲナーゼ基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）と接触させることであって、変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換が、対応する野生型デハロゲナーゼと基質との間に形成される結合よりも安定した基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）との結合を形成する変異体デハロゲナーゼをもたらし、変異体デハロゲナーゼにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、対応する野生型デハロゲナーゼと基質との間に形成された結合を切断する水分子の活性化に関連する対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換、または基質とエステル中間体を形成する対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換である、接触させることと、ｂ）Ｒの存在もしくは量を検出または決定し、それにより変異体デハロゲナーゼの存在もしくは量を検出または決定することと、を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、対象とする化合物の標的分子を特定するための方法を提供し、ａ）試料（例えば、細胞または細胞溶解物）を、デハロゲナーゼ基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）と接触させることであって、官能基が対象とする化合物である、接触させることと、ｂ）試料とデハロゲナーゼ基質の混合物を、変異体デハロゲナーゼを含む固体支持体と接触させることであって、変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換が、対応する野生型デハロゲナーゼと基質との間に形成された結合よりも安定した基質との結合を形成する変異体デハロゲナーゼをもたらし、変異体デハロゲナーゼにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、対応する野生型デハロゲナーゼと基質との間に形成された結合を切断する水分子の活性化に関連する対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換、または基質とエステル中間体を形成する対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換である、接触させることと、ｃ）標的分子を特定することとを含む。いくつかの実施形態では、対象とする化合物は、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である。いくつかの実施形態では、標的分子は、タンパク質である。いくつかの実施形態では、標的分子は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、標的分子のレポータータンパク質、例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼとの融合である。

いくつかの実施形態では、標的分子は、当業者に既知の任意の好適な方法によって特定される。いくつかの実施形態では、標的分子の特定は、対象とする標的分子を固体支持体から溶出するステップを含む。いくつかの実施形態では、標的分子は、これらに限定されないが、官能基の溶液（例えば、薬物または薬物化合物）を添加して、標的分子と特異的に競合させる方法、Ｌ１に存在する切断可能なリンカーを切断して、標的分子を特異的に溶出させる方法、緩衝液（例えば、ＳＤＳまたは尿素を含有するもの）を使用して官能基と標的分子との間の相互作用を不安定化させて、非特異的に溶出させる方法等を含む、任意の好適な方法によって、固体支持体から溶出される。いくつかの実施形態では、標的分子の特定は、標的分子を分析するステップ（例えば、固体支持体からの溶出後）を含む。いくつかの実施形態では、標的分子は、これらに限定されないが、標的分子が検出可能なマーカーに縮合される場合（例えば、標的分子が、ＮａｎｏＬｕｃ（または別のレポーター）との融合タンパク質である場合）、蛍光マーカー（例えば、ＮａｎｏＬｕｃ）の検出および定量化、ウエスタンブロット、質量分析等を介した検出を含む、任意の好適な方法によって分析される。ある特定の実施形態は、任意の好適な分析方法を用いた任意の好適な溶出方法を利用し得る。

いくつかの実施形態では、本発明は、細胞を標識するための方法を提供し、変異体デハロゲナーゼを含む細胞を、デハロゲナーゼ基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）と接触させることを含み、変異体デハロゲナーゼは、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換は、対応する野生型デハロゲナーゼと基質との間に形成された結合よりも安定した基質との結合を形成する変異体デハロゲナーゼをもたらし、変異体デハロゲナーゼにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、対応する野生型デハロゲナーゼと基質との間に形成された結合を切断する水分子の活性化に関連する対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換、または基質とエステル中間体を形成する対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換であり、それにより細胞を官能基Ｒで標識する。

いくつかの実施形態では、本発明は、細胞中の分子の存在または量を検出するための方法を提供し、変異体デハロゲナーゼを含む細胞を、デハロゲナーゼ基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）と接触させることであって、変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換が、対応する野生型デハロゲナーゼと基質との間に形成された結合よりも安定した基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）との結合を形成する変異体デハロゲナーゼをもたらす、接触させることと、ｂ）細胞中の官能基Ｒの存在もしくは量を検出または決定し、それにより細胞中の分子の存在または量を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、対象とするタンパク質と相互作用する細胞により分子を検出する方法が提供される。そのような実施形態では、分子相互作用物質（例えば、タンパク質、小分子、核酸等）を捕捉するために、基質と共に、変異体デハロゲナーゼと対象とするタンパク質との融合が使用される。そのような試薬の使用は、変異体デハロゲナーゼに縮合されたタンパク質を有する細胞において相互作用する分子の捕捉を可能にし、それにより相互作用する分子（複数可）を特定および／または捕捉（単離）する。

いくつかの実施形態では、本発明は、対象とする分子を単離するための方法を提供し、（ａ）デハロゲナーゼ基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）を提示する固体支持体を、（ｂ）（ｉ）基質と相互作用する時、基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）と共有結合を形成する変異体デハロゲナーゼと、（ｉｉ）対象とする分子に結合されるタンパク質とを含む融合タンパク質と接触させることを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、対象とするタンパク質を固定化するための方法を提供し、（ａ）基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）を含む固体支持体を、（ｂ）（ｉ）基質と相互作用する時、基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）と共有結合を形成する変異体デハロゲナーゼと、（ｉｉ）対象とするタンパク質との融合物と接触させることを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、式Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘの化合物を調製するための方法を提供し、式Ｒ−Ｙの化合物を、式Ｚ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘの化合物とカップリングすることを含み、式中、ＹおよびＺは、反応してＲ−を−リンカー−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘに連結することができる基である。いくつかの実施形態では、Ｒ−Ｙは、式Ｒの化合物の活性化エステルであり、Ｚは、活性化エステルと反応してアミド結合を形成するのに好適なアミンである。いくつかの実施形態では、Ｒ−Ｙは、反応性アミンで官能化された式Ｒの化合物であり、Ｚは、Ｒ−ＹのＺとの反応がアミドまたはカルバメート結合の形成をもたらすような活性化エステルまたはカルバメート基を表す。いくつかの実施形態では、Ｚは、ｐ−ニトロフェニルカーボネート基である。

いくつかの実施形態では、本発明は、変異体デハロゲナーゼ、アッセイを実行するための試薬、官能基を基質前駆体に付加するための試薬、正／負の対照、説明書、細胞（例えば、変異体デハロゲナーゼまたはその融合物を発現する）等と組み合わせて（例えば、同じ溶液中で、個別の容器だが、一緒にパッケージングされる等）、基質（Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）または基質前駆体（例えば、Ｚ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ、Ｒ−Ｙ等）を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、基質または基質前駆体は、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である官能基を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、基質（Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）または基質前駆体（例えば、Ｚ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ，Ｒ−Ｙ等）を含む、反応混合物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、基質（Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）もしくは基質前駆体（例えば、Ｚ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ， Ｒ−Ｙ等）および／または変異体デハロゲナーゼもしくは変異体デハロゲナーゼを含む融合物を含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の基質（Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）を提示する含む固体表面を提供する。

細胞におけるＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８融合タンパク質の捕捉に対する結合時間の作用を示す。 実施例３において使用される基質の構造を提供する。 クロロアルカン修飾メトトレキサート基質を使用した、細胞溶解物（Ａ）または細胞（Ｂ）からのＨａｌｏＴａｇ（登録商標）標的タンパク質への結合効率に対するリンカーの作用を示す。 細胞におけるＮａｎｏＬｕｃ−ＤＨＦＲ融合タンパク質の捕捉に対するリンカーの作用を示すグラフを示す。 実施例４において使用される基質の構造を提供する。 クロロアルカン修飾デキサメタゾン基質を使用した、細胞溶解物（Ａ）または細胞（Ｂ）からのＨａｌｏＴａｇ（登録商標）標的タンパク質への結合効率に対するリンカーの作用を示す。 デキサメタゾンをグルココルチコイド受容体に結合する蛍光偏光アッセイの結果を示すグラフを示す。 細胞におけるＮａｎｏＬｕｃ−ＧＲ融合タンパク質の捕捉に対するカルバメートクロロアルカンリンカーの作用を示すグラフを示す。 ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質ビーズを使用したプルダウン法の概略図を示す。 （Ａ）細胞溶解物、および（Ｂ）生細胞、ならびに（Ｃ）特定の捕捉に対するクロロアルカンリンカーの作用における修飾Ｂｉｒｂ７９６共役体のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）への結合速度論を示すグラフを示す。 （Ａ）細胞溶解物、および（Ｂ）生細胞におけるＳＡＨＡ共役体のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）への結合速度論を示すグラフを示す。 （Ａ）細胞溶解物、および（Ｂ）生細胞、ならびに（Ｃ）特定の捕捉に対するリンカーの長さの作用におけるダサチニブ共役体のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）への結合速度論を示すグラフを示す。 ＳＡＨＡおよびＰＢＩ−５０４０によるＨＤＡＣ活性の阻害を示すグラフを示す。 低親和性標的（ＨＤＡＣ８）および低存在量標的（ＨＤＡＣ３）を含むＳＡＨＡの全ての既知の標的が細胞から特異的にプルダウンされることを示すウエスタンブロットおよびＭＳ分析を示す。

定義
本明細書で使用される、用語「直鎖状に結合した原子」は、鎖またはポリマーの骨格原子を指し、主鎖または骨格を形成しないペンダント、側鎖、またはＨ原子を除く。

本明細書で使用される、用語「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」は、第２のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）に縮合されるポリペプチドまたは対象とするタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、親和性タグ、標的配列、細胞標的、分析されるタンパク質）のキメラを指す。

本明細書で使用される、用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に見られ、よって、遺伝子の「野生型」形態と任意に称されるものである。逆に、用語「変異体」は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した際、配列および／または機能特性（例えば、変更された特徴）において修飾を表す遺伝子または遺伝子産物を指す。自然に存在する変異体が単離され得ることに留意する。これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した際、変更された特徴を有するという事実により特定される。

本明細書で使用される、用語「固体支持体」は、基質、変異体タンパク質、薬物様分子、および他の試験成分などの試薬が結合される任意の固体または固定材料に関して使用される。固体支持体の例としては、顕微鏡スライド、マイクロタイタープレートのウェル、カバースリップ、ビーズ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１４／１０４，８１４号を参照）、粒子、樹脂、細胞培養フラスコ、ならびに多くの他の好適な物品が挙げられる。 ビーズ、粒子、または樹脂は、磁気性または常磁性であってよい。

本明細書で使用される、用語「対象とする化合物」は、標的分子、例えば、タンパク質、核酸等に結合し得る薬物、薬物化合物、生体分子、小分子等に言及するために使用される。

発明を実施するための形態
本発明は、ハロアルカン基質、およびそのような基質を機能要素（例えば、タグ、標識、表面等）に結合するためのリンカーを提供する。本明細書に記載される基質およびリンカーは、例えば、タンパク質、細胞、および分子の標識、検出、および固定化に用途を見出す。特に、本明細書に提供されるリンカーは、それらのハロアルカン基質と共有結合を形成するデハロゲナーゼ変異型の基質内に用途を見出す。

本発明は、タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）または融合タンパク質（例えば、対象とするタンパク質に縮合されたデハロゲナーゼ）を、官能基（例えば、タグ、標識等）または固体表面（例えばビーズ、アレイ、スライド、チップ、チューブ等）に連結するための（例えば、共有結合ないしは別の方法で安定した結合を介して）方法、組成物、およびキットを提供する。タンパク質は、構造的に野生型（天然の）タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）に関連するが、タンパク質基質（例えば、ハロアルカン基質）と安定した結合（例えば、共有結合）を形成するタンパク質をもたらす、対応する野生型タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）と基質との間の結合（例えば、共有結合）の形成は、タンパク質およびそれに縮合するものの、基質およびそれに連結されるものへの連結をもたらす。前述の連結は、例えば、溶液もしくは懸濁液中、細胞中、固体支持体上、または溶液／表面接触面で生じる。

基質は、典型的には、リンカー基によって１つ以上の官能基に連結される反応基である部分を含む。本明細書で使用される、「官能基」は、検出可能である、もしくは検出が可能である分子（例えば、発色団、フルオロフォア、または発光団）であるか、または第２の分子（例えば、ビオチン、ハプテン、または架橋基）に結合または付加され得るか、あるいは１つ以上のアミノ酸、例えば、抗体もしくは受容体を含むペプチドまたはポリペプチド、１つ以上のヌクレオチド、脂質二重層を含む脂質、固体支持体、例えば、沈降粒子等を含む。官能基は、検出が可能である、および別の分子に結合されるなどの２つ以上の特性を有し得る。本明細書で使用される、「反応基」は、特定の野生型または本発明の変異体デハロゲナーゼによって特異的に認識される基質の部分である。基質および野生型デハロゲナーゼにおける反応基の相互作用は、産物および野生型タンパク質の再生をもたらす。しかしながら、反応基（例えば、ハロアルカン）の変異体（例えば、デハロゲナーゼ）との相互作用は、タンパク質と反応基との間に安定した結合形成（例えば、共有結合形成）をもたらす。

それらの基質（例えば、ハロアルカン基質）に共有結合する変異体タンパク質（例えば、変異体加水分解酵素（例えば、変異体デハロゲナーゼ）を含む系は、例えば、米国特許第７，２３８，８４２号、米国特許第７，４２５，４３６号、米国特許第７，４２９，４７２号、米国特許第７，８６７，７２６号に記載されており、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ある特定の実施形態では、基質は、デハロゲナーゼ、例えば、ハロアルカンデハロゲナーゼ、またはロドコッカス、スタフィロコッカス、シュードモナス、バークホルデリア、アグロバクテリウム、もしくはキサントバクターデハロゲナーゼの基質、またはセリンβ−ラクタマーゼの基質などの脂肪族もしくは芳香族ハロゲン化基質における炭素−ハロゲン結合を切断するデハロゲナーゼの基質である。いくつかの実施形態では、基質は、任意に、基質において１つ以上の官能基を反応基から物理的に分離するリンカーを含む。例えば、基質は、基質の１つ以上の官能基が基質のタンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）と反応基（例えば、ハロアルカン）の相互作用を妨げないような、十分な長さ、構造、電荷、および疎水性のリンカーを含み得る。

いくつかの実施形態では、基質は、式（Ｉ）：Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘの化合物を含み、式中、Ｒは、１つ以上の官能基であり、Ｌ¹は、Ｃ、Ｎ、Ｓ、もしくはＯを含む多核直鎖または分枝鎖であり、Ｍは、カルバメート基であり、Ｌ²は、Ｃ、Ｎ、Ｓ、もしくはＯを含む多核直鎖または分枝鎖であり、Ａは、少なくとも２個の炭素（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２等）のアルカンであり、Ｘは、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ等）であり、Ａ−−Ｘは、デハロゲナーゼの基質である。

Ａ．反応基
基質の反応基は、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）によって認識され、共有結合を形成する部分である。反応基は、超安定した、またはタンパク質によって通常一過的にのみ結合するであろうその基質と共有結合を形成するために変更された任意の変異体タンパク質の任意の好適な基質であってよい。特定の実施形態では、タンパク質は変異体デハロゲナーゼであり、基質の反応基はハロアルカンである。基質のハロアルカン部分は、末端ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ等）によってキャッピングされるアルカン（例えば、Ｃ₂−Ｃ₂₀）を含む。いくつかの実施形態では、ハロアルカンは、式Ａ−Ｘのものであり、Ｘは、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ等）であり、Ａは、２〜２０個の炭素を含むアルカンである。ある特定の実施形態では、Ａは、２〜１２個の炭素の直鎖セグメントを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、２〜１２個の炭素の直鎖セグメントである。

Ｂ．官能基
基質および方法に有用な官能基（Ｒ）は、基質もしくはタンパク質またはそれに結合される融合物の単離、精製、検出、局在化、固定化等に有用な分子である。官能基は、二官能性リンカーの反応置換基の１つまたはタンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）の基質に共有結合的に連結することができ、基質の一部分として、天然に見られる基質に連結されず、変異体タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）と安定した複合体を形成することができる官能基として所望の特性（例えば、活性、結合等）を維持する。よって、官能基は、官能基を有する基質と変異体タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）との間の安定した複合体の検出、単離、固定化等を容易にする１つ以上の特性を有する。官能基は、検出が可能である、および別の分子に結合されるなどの２つ以上の官能特性を有し得る。

官能基は、これらに限定されないが、１つ以上の小分子（例えば、薬物、薬物様分子）、生体分子、アミノ酸（例えば、天然に存在するアミノ酸または非天然アミノ酸）、抗体もしくはその断片を含むペプチドまたはポリペプチド（タンパク質）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、酵素、補因子、補酵素、酵素のペプチドもしくはタンパク質、例えば、分枝状ペプチド基質（例えば、Ｚ−アミノベンゾイル（Ａｂｚ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−４−ニトロベンジルアミド（ＮＢＡ）、自殺基質、または受容体、１つ以上のヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＴＰ、またはＧＤＰ）（その類似体を含む、例えば、オリゴヌクレオチド、遺伝子もしくはその部分に対応する２本鎖もしくは１本鎖ＤＮＡ、例えば、転写因子などのタンパク質に結合することが可能なＤＮＡ、遺伝子に対応するＲＮＡ、例えば、停止コドンもしくはその部分を欠失するｍＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはそのベクターの２本鎖ＲＮＡ）、糖タンパク質、多糖類、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、脂質二重層を含む脂質を含むか、または固体支持体、例えば、磁気粒子、セファロース、もしくはセルロースビーズなどの沈降粒子、膜、ガラス（例えば、ガラススライド）、セルロース、アルギネート、プラスチックもしくは他の合成により調製されたポリマー（例えば、エッペンドルフチューブまたは多重ウェルプレートのウェル、自己組織化単層、表面プラズモン共鳴チップ、または電子伝導表面を有する固体支持体）、薬物（例えば、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、またはｃａｍｐｔｏｓａｒ（ＣＰＴ−１１；イリノテカン）などの化学療法薬）、アミノアシル化阻害剤ｔＲＮＡもしくはアミノアシル化アンバー抑制因子ｔＲＮＡなどのアミノアシル化ｔＲＮＡ、Ｃａ²⁺に結合する分子、Ｋ⁺に結合する分子、Ｎａ⁺に結合する分子、ｐＨ感受性である分子、放射性核種、電子不透明である分子、造影剤（例えば、バリウム、ヨウ素、または他のＭＲＩもしくはＸ線造影剤）、ＮＯの存在下で蛍光を発するか、もしくは反応酸素に感受性である分子、ナノ粒子（例えば、免疫金粒子、常磁性ナノ粒子、アップコンバーティング（ｕｐｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ）ナノ粒子、または量子ドット、酵素のナノタンパク質基質、酵素の阻害剤、可逆性または不可逆性のいずれかの阻害剤、キレート剤、架橋基（例えば、スクシンイミジルエステルもしくはアルデヒド）、グルタチオン、ビオチン、もしくは他のアビジン結合分子、アビジン、ストレプトアビジン、ｃＡＭＰ、ホスファチジルイノシトール、ヘム、ｃＡＭＰ用リガンド、金属、ＮＴＡであり、一実施形態では、１つ以上の色素、例えば、キサンテン色素、カルシウム感受性色素（例えば、１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）−フェノキシ］−２−（２’−ａｍ−イノ−５’−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（Ｆｌｕｏ−３））、ナトリウム感受性色素（例えば、１，３−ベンゼンジカルボン酸、４，４’−［１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン−７，１６−ジイルビス（５−メトキシ− −６，２−ベンゾフランジイル）］ビス（ＰＢＦＩ））、ＮＯ感受性色素（例えば、４−アミノ−５−メチルアミノ−２’，７’−ジフルオレセイン）、または他のフルオロフォア（例えば、カルボキシローダミン類似体、例えば、米国第１３／６８２，５８９号を参照）を含む。いくつかの実施形態では、官能基は、ハプテンまたは免疫原性分子、例えば、その分子に特異的な抗体によって結合されるものである。いくつかの実施形態では、官能基は、放射性核種ではない。他の実施形態では、官能基は、放射性核種、例えば、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ、１２５Ｉ、¹³¹Ｉであり、診断方法に有用な分子を含む。

ある特定の実施形態では、官能基は、基質および／またはタンパク質もしくはそれに結合する融合物の検出を可能にする検出可能な特性を有する。検出可能な官能基は、放射もしくは吸光度、磁性、電子スピン共鳴、電気容量、誘電定数もしくは導電率などの特徴的な電磁気スペクトル特性を有するもの、ならびに強磁性、常磁性、反磁性、発光、電気化学発光、蛍光、リン光、色、抗原性であるか、または独特な質量を有する官能基を含む。官能基は、これらに限定されないが、核酸分子（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、オリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチド）、タンパク質（例えば、発光タンパク質、ペプチド、造影剤（例えば、ＭＲＩ造影剤）、放射性核種、親和性タグ（例えば、ビオチンもしくはストレプトアビジン）、ハプテン、アミノ酸、脂質、脂質二重層、固体支持体、フルオロフォア、発色団、レポーター分子、放射性核種、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤（例えば、マンガン、ガドリニウム（ＩＩＩ）、もしくは鉄酸化物粒子）等を含む。特定の官能基を検出する、または基質およびそれに結合されるものを単離する方法は、当該技術分野において既知である。

例示的な官能基は、ハプテン（例えば、キーホールリンペットヘマシアニンなどの免疫原性を強化するために有用な分子）、切断可能な標識（例えば、光切断可能なビオチン）、および蛍光標識（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）修飾クマリンおよびスクシンイミドもしくはスルホノスクシンイミド修飾ＢＯＤＩＰＹ（ＵＶにより検出可能である、および／または可視励起蛍光検出）、ローダミン（Ｒ１１０、ロドール、ＣＲＧ６、テキサスメチルレッド（ＴＡＭＲＡ）、Ｒｏｘ５、ＦＡＭ、またはフルオロセイン）、クマリン誘導体（例えば、７アミノクマリン、および７−ヒドロキシクマリン、２−アミノ−４−メトキシナフタレン、１−ヒドロキシピレン、レゾルフィン、フェナレノン、またはベンズフェナレノン（米国特許第４，８１２，４０９号））、アクリジノン（米国特許第４，８１０，６３６号）、アントラセン、ならびにαおよびβ−ナフトールの誘導体、フッ素化フルオレセインおよびロドールを含むフッ素化キサンテン誘導体（例えば、米国特許第６，１６２，９３１号）、ならびに生物発光分子（例えば、ルシフェラーゼ（例えば、エビ由来ルシフェラーゼ（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国出願第１２／７７３，００２号、米国出願第１３／２８７，９８６号）、またはＧＦＰもしくはＧＦＰ誘導体）を含む。対応する野生型タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）の基質に連結されるという理由で、変異体タンパク質（例えばデハロゲナーゼ）に連結される蛍光（または生物発光）官能基は、リアルタイムで、リン酸化のような系の変化を感知するために使用され得る。さらに、基質における金属イオンの化学センサなどの蛍光分子が基質に結合するタンパク質を標識するために採用され得る。ＢＯＤＩＰＹ、ローダミン緑色、ＧＦＰ、または赤外色素などの生物発光または蛍光官能基は、官能基としての用途も見出し、例えば、相互作用研究（例えば、ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、ＬＲＥＴ、または電気泳動を使用して）において採用され得る。

官能基の別のクラスは、アクセプター基（「親和性」分子）を含む分子と選択的に相互作用する分子である。よって、親和性分子を含むタンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）の基質は、親和性分子の別の分子（例えば、生物由来または非生物由来であってよいアクセプター分子）との選択的相互作用のため、そのような基質および変異体タンパク質を有する複合体の分離を容易にすることができる。例えば、親和性分子が相互作用する特定の分子（アクセプター分子と称される）は、小さい有機分子、スルフヒドリル基（−ＳＨ）などの化学基、または親和性分子の抗体もしくは他の天然に存在するリガンドなどの大きい生体分子であってよい。結合は、通常、化学的な性質であり、共有結合もしくは非共有結合の形成、またはイオンもしくは水素結合などの相互作用を伴い得る。アクセプター分子は、溶液中で遊離しているか、または固体もしくは半固体表面に結合される、ポリマーマトリックスであるか、あるいは固体もしくは半固体基質の表面上に存在し得る。相互作用は、光、温度、圧力、または触媒として作用する化学もしくは生体分子の添加などの外部作用物によっても誘発され得る。反応混合物からの複合体の検出および／または分離は、通常、結合の種類である、親和性分子とアクセプター分子との間の相互作用のため生じる。

親和性分子の例としては、免疫原性分子（例えば、タンパク質のエピトープ、ぺプチド、炭水化物、または脂質（例えば、その分子に特異的な抗体を調製するために有用な任意の分子））；ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびそれらの誘導体；金属結合分子；ならびにこれらの分子の断片および組み合わせなどの分子を含む。例示的な親和性分子は、Ｈｉｓ５（ＨＨＨＨＨ）、ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ）、Ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＳｔｅｐｔＴａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ＨＡ Ｔａｇ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、Ｓ−ペプチド、Ｔ７ペプチド、カルモジュリン結合ペプチド、Ｃ末端ＲＮＡタグ、金属結合ドメイン、金属結合反応基、アミノ酸反応基、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、およびマルトース結合タンパク質を含む。例えば、ビオチンを含むタンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）の基質を、変異体タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）と接触させる。共有結合は、タンパク質（例えばデハロゲナーゼ）と基質の反応基との間に形成される。変異体タンパク質と基質との間の複合体におけるビオチンの存在は、複合体のアビジン分子（例えば、表面（例えば、ビーズ、マイクロウェル、ニトロセルロース等）上にコーティングされたストレプトアビジン分子）への選択的結合を可能にする。好適な表面は、クロマトグラフィー分離用樹脂、組織培養表面もしくは結合プレートなどのプラスチック、マイクロタイター皿およびビーズ、セラミックおよびガラス、磁気粒子、ポリマー、および他のマトリックスを含む粒子を含む。いくつかの場合では、これらの材料は、光ファイバ、ｃｈｅｍｆｅｔ、およびプラズモン検出器などの生体分子感知デバイスの一部分であってよい。

親和性分子の別の例は、ダンシルシリンである。ダンシル環と相互作用する抗体は、市販されているか（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、またはＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８）などに記載される既知のプロトコルを使用して調製することができる。例えば、抗ダンシル抗体は、クロマトグラフィーカラムのパッキング材料上に固定化される。親和性カラムクロマトグラフィーのこの方法は、他の分子がカラムを通過する一方で、変異体加水分解酵素と基質との間の複合体を、固定化抗体とのその相互作用によりカラム上に保持させることにより分離を実現する。複合体は、次いで、抗体−光源相互作用を妨げることにより解放され得る。イオン交換または親和性セファロース、セファクリル、セファデックス、および他のクロマトグラフィー樹脂などの特定のクロマトグラフィーカラム材料が市販されている（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）。ダンシルリシンは、便宜上、その蛍光特性により検出され得る。

アクセプター分子として抗体を採用する場合、分離は、免疫沈降、およびフィルタまたはビーズ、プレート、もしくは樹脂などの他の表面上への抗体の固定化などの他の生化学的分離方法を通して行うこともできる。例えば、変異体加水分解酵素と基質との複合体は、親和性分子特異的または加水分解酵素特異的抗体で磁気ビーズをコーティングすることにより単離され得る。ビーズは、しばしば、磁場を使用して混合物から分離される。

官能分子の別のクラスは、電磁放射線を使用して検出可能な分子を含み、これらに限定されないが、キサンテンフルオロフォア、ダンシルフルオロフォア、クマリン、およびクマリン誘導体、蛍光アクリジニウム部分、ベンゾピレン系フルオロフォア、ならびに７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール、および３−Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−２，３−ジアミノ−プロピオン酸を含む。好ましくは、蛍光分子は、天然のアミノ酸とは異なる波長の蛍光の高量子収率を有し、より好ましくは、スペクトルの可視、またはＵＶおよび可視部分の両方で励起され得る蛍光の高量子収率を有する。事前に選択された波長での励起時、分子は、視覚的にまたは従来の蛍光検出方法を使用するかのいずれかにより、低濃度で検出可能である。ルテニウムキレートおよびその誘導体またはニトロキシドアミノ酸およびそれらの誘導体などの電気化学発光分子は、フェムトモル範囲以下で検出可能である。

蛍光分子に加え、分子の電磁場および放射線への相互作用および応答に基づく物理的特性を有する様々な分子は、変異体加水分解酵素と基質との間の複合体を検出するために使用され得る。これらの特性は、ラマン活性である発色団の存在の電磁場スペクトルのＵＶ、可視、および赤外領域における吸収を含み、共鳴ラマン分光法、電子スピン共鳴活性、ならびに核磁気共鳴、および例えば、質量分析計を介した分子質量によりさらに強化され得る。

親和性分子を有する複合体を検出および／または単離する方法は、ゲル濾過、拘束圧力または高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ならびにイオン交換クロマトグラフィーを含む、クロマトグラフィー技法を含む。タンパク質分離の他の方法は、変異体加水分解酵素と基質との間の複合体の検出および後続の単離、例えば、電気泳動、等電焦点、および質量分析にも有用である。

ある特定の実施形態では、官能基は、細胞浸透性（例えば、基質単独の文脈において）である。いくつかの実施形態では、細胞外的に付加された官能基は、細胞に侵入するために（例えば、拡散、エンドサイトーシス、能動輸送、受動輸送等を介して）細胞膜を通過することができる。

Ｃ．リンカー
いくつかの実施形態では、本発明の基質は、官能基と反応基との間にリンカーまたは複数のリンカー（例えば、Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）が基質の反応部分と相互作用する（例えば共有結合）のに十分な距離を提供する。本明細書で使用される、リンカーは、単一共有結合ではない。リンカーは、その標的タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）によって結合され得る基質を提供する。いくつかの実施形態では、リンカーは、約５オングストローム〜約１０００オングストローム以下の長さにより官能基（Ｒ）と反応基（Ａ−Ｘ）とを分離する。他の好適なリンカーは、約５オングストローム〜約１００オングストロームによりＲと反応基とを分離するリンカー、ならびに約５オングストローム〜約５０オングストローム、約５オングストローム〜約２５オングストローム、約５オングストローム〜約５００オングストローム、または約３０オングストローム〜約１００オングストロームによりＲと基質とを分離するリンカーを含む。

特定の実施形態では、リンカーは、カルバメート基を含む。例えば、基質は、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘを含み得、式中、Ｒは、官能基であり、Ｌ¹は、第１のリンカー部分であり、Ｍは、カルバメート基（例えば、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＯ等）であり、Ｌ²は、第２のリンカー部分であり、Ａは、アルキル基であり、Ｘは、ハロゲンである。いくつかの実施形態では、カルバメートは、窒素端が反応基に向かって配向されるように配向される。いくつかの実施形態では、カルバメートは、酸素端が反応基に向かって配向されるように配向される。いくつかの実施形態では、リンカーは、単一のカルバメート基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、２つ以上のカルバメート基（例えば、２、３、４、５、６、７、８等）を含む。複数のカルバメートが存在するいくつかの実施形態では、Ｍは、反応基（例えばＡ−Ｘ）に最も近いカルバメートであり、他のカルバメート基は、Ｌ¹の一部分である。いくつかの実施形態では、Ｌ¹および／またはＬ²のうちの１つまたは両方は、独立して、アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等）を含む。他の実施形態では、Ｌ¹および／またはＬ²のうちの１つまたは両方は、独立して、−（（ＣＨ₂）₂Ｏ）_p−または−（Ｏ（ＣＨ₂）₂）ｐ−基を含み、式中、ｐ＝１〜１０である。いくつかの実施形態では、Ｌ¹および／またはＬ²のうちの１つまたは両方は、基質（例えば、Ｒ−Ｌ¹−Ｍ−Ａ−ＸまたはＲ−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ）から不在である。

ある特定の実施形態では、Ｌ₁は、切断可能なリンカー部分である。いくつかの実施形態では、Ｌ₁は、切断可能、化学的に切断可能、光切断可能などの酵素である。本発明の実施形態において使用するのに好適な切断可能リンカーは、例えば、Ｂｉｅｌｓｋｉ ａｎｄ Ｗｉｔｃｚａｋ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１３，１１３，２２０５‐２２４３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含む。しかしながら、本発明は、そのような切断可能なリンカーに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｌ₁の切断は、官能基（例えば、フルオロフォア、固体表面等）からの変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）の解放をもたらす。他の実施形態では、Ｌ１の切断は、表面に結合される変異体タンパク質（デハロゲナーゼ）からのＲおよびＲに結合される任意の標的分子の解放をもたらす。

いくつかの実施形態では、リンカーは、基質とタンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）との間の相互作用を最適化する距離で、Ｘ（ハロゲン）とＭ（カルバメート）とを分離するように構成される。ある特定の実施形態では、ＸおよびＭは、６〜１８個の直鎖状に結合した原子（例えば、（ＣＨ２）₆Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）_6-18等）によって分離される。いくつかの実施形態では、ＡおよびＬ₂は、６〜１８個の直鎖状に結合した原子（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８個）を含む。いくつかの実施形態では、ＡおよびＬ²は、９〜１５個の直鎖状に結合した原子（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個）を含む。いくつかの実施形態では、ＡおよびＬ²は、１２個の直鎖状に結合したＣ、Ｎ、および／またはＯ原子（例えば、（ＣＨ₂）₆Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）₆（ＣＨ₂）₃Ｏ（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）₆Ｏ（ＣＨ₂）₂（ＣＨ₂）₃等）を含む。

いくつかの実施形態では、リンカーは、官能基とタンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）との間の相互作用を減少させる距離で、Ｒ（官能基）とＭ（Ｘに最も近いリンカーカルバメート）とを分離するように構成される。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、２個以上の直鎖状に結合したＣ、Ｓ、Ｎ、および／またはＯ原子を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、１つ以上のカルバメート基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、１つ以上のアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、１つ以上のＯ（ＣＨ₂）₂または（ＣＨ₂）Ｏ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、１〜１０個の直鎖状に結合した原子（例えば、１〜９、２〜９、１〜８、２〜８、１〜７、２〜７、１〜６、２〜６等）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、１〜１０個の長さの直鎖状に結合した原子（例えば、１〜９、２〜９、１〜８、２〜８、１〜７、２〜７、１〜６、２〜６等）である。

ある特定の実施形態では、リンカーは、反応基から官能基を分離するカルバメート含有鎖である。いくつかの実施形態では、カルバメート基に近接する反応基は、１２個の直鎖状に結合した原子（例えば、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ等）によってハロゲン（Ｘ）から分離される。いくつかの実施形態では、カルバメート基に近接する反応基は、合計１０〜１４個の直鎖状に結合した原子（例えば、１２個の原子）のＣＨ₂およびＯ基の組み合わせによってハロゲン（Ｘ）から分離される。いくつかの実施形態では、カルバメート基に近接する反応基は、２〜２４個の直鎖状に結合した原子（例えば、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ等）によって官能基（Ｒ）から分離される。いくつかの実施形態では、カルバメート基に近接する反応基は、合計２〜２４個の直鎖状に結合した原子（例えば、１２個の原子）のＮＨ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯ、ＣＨ₂、およびＯ基の組み合わせによって官能基（Ｒ）から分離される。

いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも２個の直鎖状に結合したＣ、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子（例えば、２〜５０個の原子、２〜４０個の原子、２〜３０個の原子、２〜２０個の原子、２〜１０個の原子等）によって官能基から分離され、８〜１６個の直鎖状に結合したＣ、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子（例えば、１０〜１４個の原子、１１〜１３個の原子、１２個の原子）によってハロゲン（Ｘ）から分離されるカルバメートを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、上記の基準を満たし、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、＝Ｃ＝、炭素−炭素３重結合、Ｃ＝Ｏ、ＮＨ、ＳＨ、ＯＨ、ＣＮ等から選択される１つ以上の骨格基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、任意の適切な有機官能基を含む、１つ以上の置換基、ペンダント、側鎖等を含む。

Ｄ．基質
上述のように、基質は、リンカー（例えば、カルバメート含有リンカー）によって結合される官能基および反応基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーのカルバメートは、２つ以上の直鎖状に結合した原子によって官能基から分離される。いくつかの実施形態では、反応基に最も近く位置するリンカーのカルバメートは、８〜１６個の直鎖状に結合した原子（例えば、１０〜１４個の原子、１１〜１３個の原子、１２個の原子）によって反応基から分離される。

いくつかの実施形態では、基質は、細胞の原形質膜に浸透性である。ある特定の実施形態では、リンカー部分（Ｌ¹およびＬ²）間のカルバメート（Ｍ）の存在は、基質の他の部分に対する変更（例えば、Ｌ¹、Ｌ２、または基質全体の伸長）にも関わらず、予想外の細胞浸透度を提供する。いくつかの実施形態では、カルバメート（例えば、位置Ｍで）を含む基質は、カルバメート（例えば、アミドリンカー）を欠失する基質が細胞透過性である長さで細胞透過性を維持する（例えば、実施例３〜４を参照）。いくつかの実施形態では、細胞培地に添加される、または細胞に施される場合、基質は、効率的に細胞に侵入する。特定の実施形態では、基質は、変異体タンパク質（例えばデハロゲナーゼ）の不在下で、細胞内に迅速かつ効率的に充填され、細胞から除去される。変異体タンパク質（例えばデハロゲナーゼ）の存在下で、基質の少なくとも一部分は、細胞内に結合され、除去されるのを防止する。よって、基質の結合部分は、マーカーとして、または変異体タンパク質（例えばデハロゲナーゼ）もしくはその融合物を捕捉するための機構として機能することができる。他の実施形態では（例えば、官能基が固体表面である場合）、基質は、細胞の原形質膜に透過性ではない。いくつかの実施形態では、基質は、細胞透過性官能基（例えば、固体表面ではない）を含む。

ある特定の実施形態では、基質（例えば、大量の官能基（例えば、変異体タンパク質（またはそのチャネル）の活性部位内に収まることができない官能基を含む）は、官能基を変異体タンパク質の外面に残留させる一方で、反応基が変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）の活性部位にアクセスできる十分な長さのものでなければならない。多くの基質による長さの追加（例えば、最適な点を超えて）は、結合親和性または細胞透過性の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、カルバメート（例えば、位置Ｍで）を含む基質は、カルバメートを欠失する基質（例えば、アミドリンカーを含む基質）が減少した性能を呈する長さで、高結合親和性（例えば、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）に関して）、結合速度論、および／または細胞透過性を維持する（例えば実施例３〜４を参照）。

ある特定の実施形態では、基質は、２つ以上の官能基を含む。いくつかの実施形態では、官能基のうちの１つは酵素である。他の実施形態では、官能基のうちの１つは、酵素の基質である。例えば、官能基の１つはルシフェリンであり、他はプロテアーゼ認識部位（例えば、切断される部位を含むプロテアーゼによる認識に十分な配列を含むもの）である、官能基の１つは、親和性タグ（例えば、ビオチン）であり、他はフルオロフォアである、または官能基の１つはプロテアーゼ認識部位であり、他はフルオロフォアであってよい。基質は、本明細書に記載される、または当該技術分野において理解される官能基のうちの２つ以上の任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される基質の組成物ならびに合成および／または生成のための方法を提供する。本発明は、１つ以上の官能基を含むように修飾されるデハロゲナーゼの基質を調製するための方法をさらに提供する。

Ｅ．変異体デハロゲナーゼ
例えば、米国特許第７，２３８，８４２号、米国特許第７，４２５，４３６号、米国特許第７，４２９，４７２号、米国特許第７，８６７，７２６号（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳細に記載される変異体タンパク質、加水分解酵素、および／またはデハロゲナーゼは、対応する野生型タンパク質、加水分解酵素、またはデハロゲナーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）は、組換え技法（例えば、部位特異的突然変異誘発または再帰的突然変異誘発）を介して調製されるものに限定されず、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）に、１つ以上の官能基を含む基質などの基質と安定した結合（例えば、共有結合）を形成することを可能にする１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、変異体加水分解酵素である。ある特定の実施形態では、変異体タンパク質は、変異体デハロゲナーゼである。少なくとも１つのアミノ酸置換は、対応する野生型タンパク質と基質との間に形成される結合よりも安定した基質との結合（例えば、共有結合）を形成する変異体タンパク質をもたらす。変異体タンパク質における少なくとも１つのアミノ酸置換は、対応する野生型タンパク質と基質との間に形成される結合を切断する水分子の活性化に関連する対応する野生型タンパク質におけるアミノ酸残基での置換、または基質とエステル中間体を形成する対応する野生型タンパク質におけるアミノ酸残基での置換である。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、対応する野生型タンパク質と比較して少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、１つの置換は、野生型タンパク質において、水分子の活性化に関連する残基、または野生型タンパク質において、加水分解酵素の基質の求核攻撃によりエステル中間体を形成する残基に存在し、別の置換は、野生型タンパク質において、加水分解酵素基質の結合部位（複数可）の、もしくはその近くにある残基に存在するが、対応する野生型タンパク質において、水分子の活性化に関連する、または基質とエステル中間体を形成する残基に存在しない。一実施形態では、第２の置換は、野生型タンパク質において、タンパク質の触媒ポケット内への基質侵入のための部位（複数可）を並べる残基に存在する。追加の置換（複数可）は、好ましくは、対応する野生型タンパク質の基質に結合するそれらの変異体の安定した共有結合形成の速度を増加する。タンパク質、加水分解酵素、およびデハロゲナーゼの配列および変異の詳細は、例えば、米国特許第７，２３８，８４２号、米国特許第７，４２５，４３６号、米国特許第７，４２９，４７２号、米国特許第７，８６７，７２６号に記載されており、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Ｆ．融合物
様々な実施形態では、本発明は、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）および対象とするタンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列（例えば、薬物標的、マーカータンパク質（例えば、選択可能マーカータンパク質、親和性タグ（例えば、ポリヒスチジン配列）））、対象とする酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ＲＮａｓｉｎ、ＲＮａｓｅ、および／またはＧＦＰ）、核酸結合タンパク質、細胞外基質タンパク質、分泌されたタンパク質、Ｆｃなどの抗体もしくはその一部分、生物発光タンパク質、受容体リガンド、調節タンパク質、血清タンパク質、免疫原性タンパク質、蛍光タンパク質、反応性システインを有するタンパク質、受容体タンパク質（例えば、ＮＭＤＡ受容体、チャネルタンパク質（例えば、ＨＥＲＧチャネルタンパク質を含むナトリウム、カリウム、またはカルシウム感受性チャネルタンパク質などのイオンチャネルタンパク質））、膜タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、核タンパク質、構造タンパク質、リンタンパク質、キナーゼ、シグナル伝達タンパク質、代謝タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、受容体関連タンパク質、蛍光タンパク質、酵素基質（例えば、プロテアーゼ基質）、転写因子、タンパク質不安定化配列、または輸送タンパク質（例えば、ＥＡＡＴ１−４グルタメート輸送体）、ならびに標的シグナル（例えば、変異体加水分解酵素を特定の位置に指向する、ミトコンドリア局在化配列、核局在化シグナル、またはミスチル化配列などの色素体標的シグナル）を含む融合タンパク質を提供する。

ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）および対象とするまたは化学合成から形成された少なくとも１つのタンパク質をコードする組換えＤＮＡから発現される。対象とするタンパク質は、変異体加水分解酵素のＮ末端またはＣ末端に縮合され得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端に対象とするタンパク質、および変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）のＣ末端に別のタンパク質、例えば、異なるタンパク質を含む。例えば、対象とするタンパク質は、蛍光タンパク質または抗体であってよい。任意に、融合におけるタンパク質は、コネクタ配列（例えば、１３〜１７のアミノ酸残基を有するものなどの、少なくとも２つのアミノ酸残基を有するもの）によって分離される。融合タンパク質におけるコネクタ配列の存在は、各それぞれのタンパク質の機能に対して融合物におけるいずれのタンパク質の機能を実質的に変更しない。よって、変異体デハロゲナーゼおよびルシフェラーゼ（例えば、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、エビ由来ルシフェラーゼ（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国出願第１２／７７３，００２号、米国出願第１３／２８７，９８６号）を参照）の融合物に関して、コネクタ配列の存在は、変異体デハロゲナーゼと基質との間に形成された結合の安定性、したがって、またはルシフェラーゼの活性を実質的に変更しない。融合物におけるタンパク質の任意の特定の組み合わせに関して、多種多様のコネクタ配列が採用され得る。いくつかの実施形態では、コネクタ配列は、酵素によって認識される配列（例えば、切断可能な配列（例えば、酵素切断可能、化学的に切断可能、光切断可能等））である。

Ｇ．キット
本発明は、本明細書に記載される基質（例えば、基質と共有結合を形成する変異体タンパク質との組み合わせで）を含む組成物およびキットも提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される基質を含み、官能基は、対象とする化合物（例えば、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子）であり、固体支持体は変異体デハロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の基質を含む固体支持体を含み、固体支持体は、変異体タンパク質またはその融合物を含み、キットは、本発明の基質を含むか、またはキットは、デハロゲナーゼもしくはその融合物をコードするベクターを含む。いくつかの実施形態では、キットは、アッセイを行うための試薬、官能基をリンカー／反応基上に付加するための試薬、正および／または負の対照、説明書等をさらに含む。

Ｈ．用途
基質および変異体タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）は、インビトロおよび／またはインビボの対象とする分子、生細胞撮像を含む標識細胞、もしくは標識タンパク質を単離、検出、特定、撮像、表示、または局在化するのに有用である。例えば、固体支持体（例えば、微小球、膜、ポリマープレート、ビーズ（例えば、ガラス、磁気ポリマー等）、ガラススライド等）に結合される基質、または固体支持体に結合される変異体タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）は、タンパク質アレイ、細胞アレイ、小胞／小器官アレイ、遺伝子アレイ、および／または細胞膜アレイを生成するために使用され得る。よって、いくつかの実施形態では、方法は、対象とする分子を単離または特定するために提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載される基質を有する試料（例えば、細胞または細胞溶解物）を含み、官能基は、対象とする化合物（例えば、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子）であり、固体支持体は、変異体デハロゲナーゼを含む。その後、基質に結合される対象とする分子が特定される。いくつかの実施形態では、本方法は、変異体タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）、ならびに対象とする分子および本明細書に記載される１つ以上の基質を含む固体支持体に結合されるタンパク質のうちの少なくとも１つを含む、１つ以上の融合タンパク質を含む試料を接触させることを含む。例えば、本方法は、変異体タンパク質に縮合されるタンパク質に結合されるＤＮＡを単離するために採用され得る。

いくつかの実施形態では、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）もしくはその融合物の存在または量を検出もしくは決定するための方法が提供される。本方法は、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）を１つ以上の官能基を含む基質と接触させることを含む。試料、細胞等との相互作用時、変異体タンパク質および基質は、共有結合を形成する。未結合の基質は除去され得る。官能基の存在または量が検出または決定され、それにより変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）の存在もしくは量を検出または決定する。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、細胞の表面に、またはその上に存在する。他の実施形態では、変異体タンパク質は、細胞溶解物に存在する。

分子を単離する、または細胞中のある特定の分子の存在もしくは量、位置（例えば、細胞内、細胞下、もしくは細胞外の位置）、または移動を検出もしくは決定するために、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）および基質を使用する方法も提供する。一実施形態では、試料中の対象とする分子を単離するための方法が提供される。本方法は、試料を、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）と、１つ以上の官能基を含む変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）の基質を有する対象とする分子に結合するタンパク質とを含む融合タンパク質と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの官能基は、固体支持体、または固体支持体に結合する分子である。いくつかの実施形態では、試料は無傷細胞を含む一方、他の実施形態では、試料は細胞溶解物または細胞下画分である。次いで、対象とする分子が単離される。

いくつかの実施形態では、本発明は、対象とするタンパク質を単離する方法を含む。本方法は、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）と、対象とするタンパク質とを含む融合タンパク質を、少なくとも１つの官能基を含む基質と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの官能基は、固体支持体、または固体支持体に結合する分子である。次いで、対象とするタンパク質が単離される。

他の実施形態では、本発明は、対象とするタンパク質の、対象とするタンパク質と相互作用すると思われる分子との相互作用を変更する作用物質を特定する方法を含む。本方法は、少なくとも１つの作用物質を、対象とするタンパク質と相互作用すると思われる分子と接触させることを含み、融合タンパク質は、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）および対象とするタンパク質ならびに１つ以上の官能基を含む基質を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの官能基は、固体支持体、または固体支持体に結合する分子である。次いで、作用物質が対象とするタンパク質と、対象とするタンパク質と相互作用すると思われる分子との間の相互作用を変更するか否かが決定される。

さらに、固体支持体に結合される基質、または固体支持体に結合される変異体デハロゲナーゼは、タンパク質アレイ、細胞アレイ、小胞／小器官アレイ、および細胞膜アレイを生成するために使用され得る。

ある特定の実施形態では、細胞中のタンパク質の発現、位置、および／または移動（追跡）を監視する、ならびに細胞内の微小環境の変化を監視する方法が提供される。

細胞を単離、選別、または精製するために、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）は、細胞の外面上に発現され得る（例えば、原形質膜タンパク質との融合を介して）。小器官を単離、精製、または分離するために、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）は、対象とする小器官の細胞質ゾル表面上に発現される。別の実施形態では、異なる細胞を成長させるための最適なプラットホームを作製するために、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）は、細胞外マトリックス成分または外膜タンパク質と縮合され、組織工学のために、３次元細胞培養物またはプラットホームに係留される。例として、一次ニューロンまたは胚性幹細胞は、支持細胞層を形成するために、プラットホーム上で成長させることができる。

他の用途は、細胞を検出または標識することを含む。よって、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）および対応する基質の使用は、例えば、動物内への移植もしくは注入後にインビトロまたはインビボの細胞移動（例えば、血管新生／化学走化性アッセイ、移植したニューロンの移動、動物内に移植された／注入された正常、悪性、もしくは組換え修飾された細胞等）を検出するための細胞の検出、および生細胞撮像、続いて免疫細胞化学を可能にする。他の実施形態では、本発明は、新しく合成されたタンパク質を標識するための方法を提供する。例えば、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）またはその融合物を発現するベクターを含む細胞を、官能基を欠く基質と接触させる。次いで、細胞を、作用物質（例えば、遺伝子発現の誘発因子）、および１つ以上の官能基を含む変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）の基質と接触させる。次いで、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）もしくはその融合物の存在、量、または位置が検出または決定される。変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）またはその融合物の存在、量、または位置は、新しく合成された変異体加水分解酵素またはその融合物による。別の方法としては、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）またはその融合物を発現するベクターを含む細胞を、官能基（例えば、緑色フルオロフォア、ＮＡＮＯＬＵＣ）を有するタンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）の基質と接触させ、次いで、作用物質、および異なる官能基（例えば、別のフルオロフォア）を有する基質と接触させる。一実施形態では、変異体タンパク質（例えば、変異体デハロゲナーゼ）は、膜局在化シグナルに縮合され、そのため、膜における、またはその付近の事象を監視するために採用され得る。

いくつかの実施形態では、基質および変異体タンパク質は、相互作用する生理活性作用物質または薬物（例えば、ペプチド、小分子等）の細胞標的の捕捉および／または特定に用途を見出す。そのような捕捉および特定の方法は、例えば、米国特許第６１／７３６，４２６号および米国特許第６１／７３６，４２９号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載される基質および変異体タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）は、上記の用途に限定されない。基質および変異体タンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）は、例えば、米国特許公開第２０１２０３３０００１号、第２０１２０２５８４７０号、第２０１２０２５２０４８号、第２０１２０２２００１３号、第２０１２０２１４６７７号、第２０１１０２０７１９５号、第２０１１０２０７１９５号、第２０１１０２０１０２４号、第２０１１００５３１６２号、第２０１１００３９２５７号、第２０１１００３９２５７号、第２０１１００３９２５７号、第２０１００２７３１８６号、第２００９０２７５０５１号、第２００９０２６３８４３号、第２００９００９８６２７号、第２００９００９８６２７号、第２００９００１７４８２号、第２００８０２７４４８８号、第２００８０２６８４８２号、第２００８−１４５８８２号、第２００８００９０２９１号、第２００８００７０２９９号、第２００８００２６４０７号、第２００７０２２４６２０号、第２００７０２１２７６２号、第２００６０１２７９８８号、第２００５０１６４３２１号、第２００５０１３０２０５号、および第２００４０１４６９８７号に記載される方法および用途にも用途を見出し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

実験
実施例１
デキサメタゾンカダベリン中間体
デキサメタゾン酸（１０ｍｇ、２６ｕｍｏｌ、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、および２ｍＬのＤＭＦ中の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ、１５ｍｇ、２９ｕｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−Ｂｏｃカダベリン（１０６ｍｇ、５２０ｕｍｏｌ）を添加した。反応物を１６時間攪拌し、次いで、１ＮのＨＣｌを添加してクエンチし、０．１％の水性ギ酸中１０−＞５０％のＭｅＣＮで溶出する分取ＨＰＬＣにより生成物を単離し、そのまま続けて行われた所望のデキサメタゾンＮ−Ｂｏｃカダベリン付加物を得た。

デキサメタゾンＮ−Ｂｏｃ−カダベリン付加物（２４ｍｇ、３８ｕｍｏｌ）を、室温で、ジオキサン（０．５ｍＬ）中４ＭのＨＣｌで処理した。反応の完了時、次いで、ＣＨ₂Ｃｌ₂とＮａＨＣＯ₃（０．０５Ｍ ａｑ）の間で分配した。層を分離し、有機層を乾燥させ、濃縮し、さらに精製することなく使用された所望のデキサメタゾンカダベリン中間体（１２ｍｇ）を得た。
ＰＢＩ−４９８０：デキサメタゾンカルバメートクロロアルカン

デキサメタゾンカダベリン付加物（１０ｍｇ、２１ｕｍｏｌ）を、２−（２−（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルカルバメート（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｗ．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ ２０１１，３，３９２）（２５ｍｇ、４４ｕｍｏｌ）、および２ｍＬのＤＭＦ中のトリエチルアミンと混合した。２時間後、１ＮのＨＣｌを添加して反応をクエンチし、０．１％の水性ギ酸中１０−＞５０％のＭｅＣＮで溶出する分取ＨＰＬＣにより生成物を単離し、１９ｍｇの黄色の固体を得た。Ｍ＋Ｈ（Ｃ₄₄Ｈ₇₂ＣｌＦＮ₃Ｏ₁₂）の計算値：８８９、実測値８８９。

実施例２
実験は、カルバメートクロロアルカン薬物共役体を使用して、細胞からＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズ上への標的タンパク質のプルダウンの効率を示すために（図９の概略図を参照）、本発明の実施形態の開発中に行われた。この実施例では、生細胞からＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８α融合タンパク質をプルダウンするために、ＢＩＲＢ−カルバメートクロロアルカン共役体（ＰＢＩ−４８３４、図１を参照）を利用した。

ＨＥＫ２９３を平板培養し、ＰＥＩを使用して、９６ウェルプレートのウェル中で、ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８融合物をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞は、１０μＭのＰＢＩ−４８３４の最終濃度でインキュベートされ、一方、対照細胞は、共役された薬物で処理されなかった。２時間の平衡結合後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで直ちに洗浄し、１０分間、洗剤ベースの溶解緩衝液に溶解した。次いで、細胞溶解物を、０．５μｌの沈降常磁性ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１４／１０４，８１４号を参照）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から購入した）を含む９６ウェルプレートのウェルに移し、振盪しながら１５〜４５分間インキュベートした。結合後、未結合の画分を除去し、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質常磁性ビーズを洗浄した。次いで、１５０ｕＭの非共役ＢＩＲＢ７９６を添加し、６０分間、非共役ＢＩＲＢ７９６と競合させることにより、捕捉したＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８α融合物をビーズから特異的に解放した。解放されたＮＡＮＯＬＵＣ−ｐ３８α融合タンパク質（＋ＰＢＩ−４８３４）および対照（−ＰＢＩ４８３４）は、ＮＡＮＯＧＬＯルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用して検出された。

ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズ上の捕捉１５分以内に達成された背景に対する高シグナルは、カルバメートリンカー薬物共役体を介した捕捉方法の効率を示す（図１）。

実施例３
以下の実施例は、細胞透過性、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合親和性、およびクロロアルカン修飾薬物を介した細胞からＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ビーズ上への標的プルダウンに関するカルバメートクロロアルカンリンカーの利点を示す。この実施例では、メトトレキサート−クロロアルカン共役体ＰＢＩ−５０１５（カルバメートクロロアルカンリンカー）、ＰＢＩ−４８４８（Ｏ２クロロアルカンリンカー）、ＰＢＩ−４８４９（Ｏ４クロロアルカンリンカー）、およびＰＢＩ−４８５０（Ｏ６クロロアルカンリンカー）（図２を参照）が、細胞および溶解物におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対するそれらの結合効率に関して試験された。

ａ）溶解物におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合効率は、１μＭの最終濃度に、メトトレキサート−クロロアルカン共役体を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現する細胞からの溶解物に添加することにより測定された。結合の０〜６０分後、１μＭの蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドにより反応を追跡した。未結合のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質は、蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドへの結合を通して検出され、その後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析、および蛍光ゲルスキャナの検出が続いた。

図３Ａの結果は、Ｏ２リンカー（ＰＢＩ−４８４８）およびカルバメートリンカー（ＰＢＩ−５０１５）が、他の２つのリンカーと比較して、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対して迅速な標識速度論を提供したことを示す。Ｏ４およびＯ６リンカーの減少した結合効率は、それらの長さに起因し得る。しかしながら、プルダウン用途に重要であり得るカルバメートリンカーの長さは、ＨａｌｏＴａｇに対する結合効率に影響しなかった。

ｂ）細胞におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合効率は、１０μＭの最終濃度に、メトトレキサート−クロロアルカン共役体を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現する細胞に添加することにより測定された。結合０〜１２０分後、５μＭの蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドにより反応を追跡した。未結合のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質は、蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドへの結合を通して検出され、その後に、細胞溶解、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析、および蛍光ゲルスキャナの検出が続いた。

図３Ｂの結果は、Ｏ２リンカー（ＰＢＩ−４８４８）が、最高の細胞透過性／ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合効率を有し、その後にカルバメートリンカー（ＰＢＩ−５０１５）が続くことを示す。他の２つのリンカーＯ４およびＯ６は、著しく低い透過性／ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合効率を有した。これらの結果は、カルバメートリンカーはＯ４およびＯ６よりも非常に長いが、尚も良好な細胞透過性およびＨａｌｏＴａｇに対する結合効率を提供することを示す。

ｃ）上記の結果に基づき、最高の細胞透過性、およびＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合効率を提供したメトトレキサート−クロロアルカン共役体ＰＢＩ−５０１５（カルバメートクロロアルカンリンカー）およびＰＢＩ−４８４８（Ｏ２クロロアルカンリンカー）は、生細胞からＮａｎｏＬｕｃ−ＤＨＦＲ融合タンパク質を特異的にプルダウンするそれらの能力に関して試験された。

ＨＥＫ２９３細胞を平板培養し、ＰＥＩを使用して、９６ウェルプレートのウェル中で、ＮＡＮＯＬＵＣ−ＤＨＦＲ融合物をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。ＤＮＡを、プロモーターを含まないキャリアＤＮＡプラスミド（ｐＣＩ）を用いて、１：５０でウェル当り８０ｎｇの総ＤＮＡの最終濃度に希釈した。トランスフェクションの２４時間後、さらに２４時間、細胞を血清欠乏させ、次いで、系列希釈された１０ｕＭのＰＢＩ−４８４８またはＰＢＩ−５０１５で処理された一方、対照細胞は、共役された薬物で処理されなかった。２時間の平衡結合後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで直ちに洗浄し、１０分間、洗剤ベースの溶解緩衝液に溶解した。次いで、細胞溶解物を、０．５μｌの沈降常磁性ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質ビーズを含む９６ウェルプレートのウェルに移し、振盪しながら４５分間インキュベートした。結合後、未結合の画分を除去し、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質常磁性ビーズを洗浄し、１５０μＭの非共役メトトレキサートを添加し、６０分間、非共役メトトレキサートと競合させることにより、捕捉したＮＡＮＯＬＵＣ：ＤＨＦＲをビーズから特異的に解放した。解放されたＮＡＮＯＬＵＣ：ＤＨＦＲ（＋ＰＢＩ−５０１５または＋ＰＢＩ−４８４８）および対照試料は、ＮＡＮＯＧＬＯルシフェラーゼ検出試薬によって検出された。ＰＢＩ−４８４８およびＰＢＩ−５０１５の両方が、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に対して類似する結合効率を有し、ＰＢＩ−４８４８は高い細胞透過性を有するが、ＰＢＩ−５０１５のみがＮｌｕｃ：ＤＨＦＲ融合物を効率的にプルダウンし、よって、プルダウン用途においてカルバメートリンカーの利点を示す（図４）。

実施例４
以下の実施例は、細胞透過性、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合親和性、標的に対する結合親和性、およびクロロアルカン修飾薬物を介した細胞からＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ビーズ上への標的プルダウンに関するカルバメートクロロアルカンリンカーの利点を示す。この実施例では、デキサメタゾン−クロロアルカン共役体ＰＢＩ−４９８０（カルバメートクロロアルカンリンカー）、ＰＢＩ−４０２７（Ｏ２クロロアルカンリンカー）、ＰＢＩ−４０２６（Ｏ４クロロアルカンリンカー）、およびＰＢＩ−４０２５（Ｏ６クロロアルカンリンカー）（図５を参照）は、細胞および溶解物におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対するそれらの結合効率、ならびに標的グルココルチコイド受容体に対するそれらの結合効率に関して試験された。

ａ）溶解物におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合効率は、１μＭの最終濃度に、デキサメタゾン−クロロアルカン共役体を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現する細胞からの溶解物に添加することにより測定された。結合の０〜６０分後、１μＭの蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドにより反応を追跡した。未結合のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質は、蛍光ＨａｌｏＴａｇリガンドへの結合を通して検出され、その後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析、および蛍光ゲルスキャナの検出が続いた。

図６Ａの結果は、カルバメートリンカー（ＰＢＩ−４９８０）が、他の３つのリンカーと比較して、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対して迅速な結合速度論を提供したことを示し、ＨａｌｏＴａｇに対する急速な結合に関してその利点を示す。

ｂ）細胞におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合効率は、１０μＭの最終濃度に、デキサメタゾン−クロロアルカン共役体を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現する細胞に添加することにより測定された。結合０〜６０分後、５μＭの蛍光ＨａｌｏＴａｇリガンドにより反応を追跡した。未結合のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質は、蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドへの結合を通して検出され、その後に、細胞溶解、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析、および蛍光ゲルスキャナの検出が続いた。

図６Ｂの結果は、カルバメートリンカー（ＰＢＩ−４９８０）が、最高の細胞透過性／ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）に対する結合効率を有し、その後に、Ｏ２リンカー（ＰＢＩ−４０２７）およびＯ４リンカーならびにＯ６リンカーが続き、これは、非常に低い透過性／ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合効率を有したことを示す。この結果は、カルバメートリンカーはＯ４およびＯ６よりも非常に長いが、尚も最高の細胞透過性、およびＨａｌｏＴａｇに対する結合効率を提供することを示す。

ｃ）標的グルココルチコイド受容体（ＧＲ）に対する結合効率は、製造者によって推奨されるように、グルココルチコイド受容体競合アッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して行われた。

図７の結果は、より長いリンカーＯ６（ＰＢＩ−４０２５）およびカルバメートリンカーがグルココルチコイド受容体に対して最高の親和性を有したことを示す。

ｄ）上記の結果に基づき、グルココルチコイド受容体に対して最高の結合効率をもたらしたＯ６（ＰＢＩ−４０２５）およびカルバメート（ＰＢＩ−４９８０）の２つのリンカーは、生細胞からＮａｎｏＬｕｃ：ＧＲを特異的にプルダウンするその能力に関して比較された。ＨＥＫ２９３細胞を平板培養し、ＰＥＩを使用して、９６ウェルプレートのウェル中で、ＮａｎｏＬｕｃ：ＧＲ融合物をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。ＤＮＡを、プロモーターを含まないキャリアＤＮＡプラスミド（ｐＣＩ ｎｅｏＩ）を用いて、１：５０でウェル当り８０ｎｇの総ＤＮＡの最終濃度に希釈した。トランスフェクションの２４時間後、さらに２４時間、細胞を血清欠乏させ、次いで、１０μＭのＰＢＩ−４９８０またはＰＢＩ−４０２５の最終濃度でインキュベートし、一方、対照細胞は、共役された薬物で処理されなかった。２時間の平衡結合後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで直ちに洗浄し、１０分間、洗剤ベースの溶解緩衝液に溶解した。次いで、細胞溶解物を、０．５μｌの沈降常磁性ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質ビーズを含む９６ウェルプレートのウェルに移し、振盪しながら４５分間インキュベートした。結合後、未結合の画分を除去し、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質常磁性ビーズを３×洗浄し、６０分間、１５０μＭの非共役デキサメタゾンと競合させることにより、捕捉したＮａｎｏＬｕｃ融合物をビーズから特異的に解放した。解放されたＮａｎｏＬｕｃ：ＧＲ（＋ＰＢＩ−４９８０または＋ＰＢＩ−４０２５）および対照試料は、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）を使用することにより検出された。

図８の結果は、両リンカーは類似する長さを有し、ＰＢＩ−４０２５はグルココルチコイド受容体に対して高い親和性を有するが、ＰＢＩ−４９８０（カルバメート）を介したＮｌｕｃ：ＧＲ融合物プルダウンの効率は、ＰＢＩ−４０２５を介するより非常に高いことを示し、よって、プルダウン用途におけるカルバメートリンカーの利点を示す。この効率的なプルダウンは、おそらく、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対するカルバメートリンカーの高結合効率による。

実施例５
ＰＢＩ−４８４８メトトレキサート−Ｏ２クロロアルカン

５０ｍｇのメトトレキサート水和物を、３ｍＬのＤＭＦ中で攪拌し、ＥＤＡＣ（６３ｍｇ、３３０ｕｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７７ｕＬ、５５０ｕｍｏｌ）で処理した。１０分後、２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルアミン塩酸塩（Ｐｒｏｍｅｇａ ２１．５ｍｇ、８３ｕｍｏｌ）を添加した。３時間後、分取ＨＰＬＣ（０．１％の水性ギ酸中２−＞５０％のＭｅＣＮ）により、生成物を単離した。適切な画分を濃縮し、凍結乾燥し、オレンジ色の固体を得た。Ｍ＋Ｈの計算値：６６０．３、実測値６６０．７。

ＰＢＩ−４８４９メトトレキサート−Ｏ４クロロアルカン

１８−クロロ−３，６，９，１２−テトラオキサオクタデカン−１−アミン塩酸塩（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＰＢＩ−４８４８に類似する様式でＰＢＩ４８４９を合成し、黄色の固体を得た。Ｍ＋Ｈの計算値：７４９．３、実測値７４８．９。

ＰＢＩ−４８５０メトトレキサート−Ｏ６クロロアルカン

２４−クロロ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサオクタデカン−１−アミン塩酸塩（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｎｉｎｋ ｅｔ ａｌ．；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００９，４７，７６９）を使用して、ＰＢＩ−４８４８に類似する様式でＰＢＩ−４８５０を合成し、黄色の固体を得た。Ｍ＋Ｈの計算値：８３７．４、実測値８３７．４。

メトトレキサートペンチルアミン中間体
メトトレキサート水和物（５０ｍｇ、１１０ｕｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（６３ｍｇ、３３０ｕｍｏｌ）、および２ｍＬのＤＭＦ中のトリエチルアミン（７７ｕＬ、５５０ｕｍｏｌ）の混合物に、Ｎ−Ｂｏｃカダベリン（２２ｍｇ、１１０ｕｍｏｌ）を添加した。反応を９０分間攪拌し、次いで、２ｍＬの１ＮのＨＣｌでクエンチし、水で希釈し、分取ＨＰＬＣ（０．１％の水性ギ酸中２０−＞５０％のＭｅＣＮ）にかけた。適切な画分を濃縮し、凍結乾燥し、所望の生成物を得た。Ｍ＋Ｈの計算値：６３９．３、実測値６３９．５。

メトトレキサートＮ−Ｂｏｃ−カダベリン付加物（２４ｍｇ、３８ｕｍｏｌ）を、室温で、ジオキサン（０．５ｍＬ）中４ＭのＨＣｌで処理した。反応の完了時、減圧下で溶媒を除去し、得られた残留物をジエチルエーテルと共に攪拌し、黄色の沈殿物を形成し、これは遠心分離により単離された。塩酸塩はさらに特徴付けされることなく使用された。

ＰＢＩ−５０１５メトトレキサートカルバメートクロロアルカン

メトトレキサート水和物ペンチルアミンＨＣｌ塩（８ｍｇ、１４ｕｍｏｌ）を、２−（２−（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルカルバメート（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ ２０１１，３，３９２）（１２ｍｇ、２１ｕｍｏｌ）および２ｍＬのＤＭＦ中のトリエチルアミンと混合した。２時間後、１ＮのＨＣｌを添加して反応をクエンチし、０．１％の水性ギ酸中１０−＞５０％のＭｅＣＮで溶出する分取ＨＰＬＣにより生成物を単離した。濃縮後、得られた黄色の固体をＤＣＭに取り込み、飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄した。有機層を蒸発させ、１．９ｍｇの黄色の固体を得た。Ｍ＋Ｈの計算値：９６４．５、実測値９６４．５。

実施例６

ＰＢＩ−４０２５：デキサメタゾン酸（３５ｍｇ、９．２６ｘ１０^-5ｍｏｌ）およびＰｙＢＯＰ（５３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を１ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解した。１Ｍの１−アミノ−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（１４０δｌ、０．１４ｍｍｏｌ）のＨＣｌ塩の溶液を、反応混合物に添加し、続いて、５当量のジイソプロピルエチルアミンＤＩＰＥＡ（６２δｌ、０．３７ｍｍｏｌ）を添加した。反応を３時間攪拌し、この際、揮発性試薬を真空下で蒸発させた。溶離剤としてジクロロメタンおよびメタノールを使用して、残留物をカラムクロマトグラフィーにかけた。白色の固体を単離した（５３ｍｇ、６９％）。Ｃ₄₂Ｈ₆₉ＣｌＦＮ₂Ｏ₁₁ ⁺（Ｍ⁺Ｈ⁺）のＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：８３１．５、（実測値）８３１．３。

ＰＢＩ−４０２６：デキサメタゾン酸（１６ｍｇ、４．２３ｘ１０^-5ｍｏｌ）およびＰｙＢＯＰ（２４ｍｇ、４．６５ｘ１０^-5ｍｏｌ）を１ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解した。０．４４Ｍの２４−クロロ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサテトラコサン−１−アミン（１４４δｌ、６．３５ｘ１０^-5ｍｏｌ）のＨＣｌ塩の溶液を、反応混合物に添加し、続いて、４当量のＤＩＰＥＡ（２４δｌ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。反応を３時間攪拌し、この際、揮発性試薬を真空下で蒸発させた。溶離剤としてジクロロメタンおよびメタノールを使用して、残留物をカラムクロマトグラフィーにかけた。白色の固体を単離した（３２ｍｇ、定量的）。Ｃ₃₉Ｈ₆₄ＣｌＦＮＯ₁₀ ⁺（Ｍ⁺Ｈ⁺）のＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：７６０．４、（実測値）７６０．３。

ＰＢＩ ４０２７：デキサメタゾン酸（２５ｍｇ、６．５ｘ１０^-5ｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（３７ｍｇ、７．１５ｘ１０^-5ｍｏｌ）、および１８−クロロ−３，６，９，１２−テトラオキサオクタデカン−１−塩化アミニウム（３４ｍｇ、９．７６ｘ１０^-5ｍｏｌ）を、１ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解した。次いで、４当量のＤＩＰＥＡ（４５δｌ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を３時間攪拌し、この際、揮発性試薬を真空下で蒸発させた。溶離剤としてジクロロメタンおよびメタノールを使用して、残留物をカラムクロマトグラフィーにかけた。白色の固体を単離した（４４ｍｇ、定量的）。Ｃ₃₅Ｈ₅₆ＣｌＦＮＯ₈ ⁺（Ｍ⁺Ｈ⁺）のＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：６７２．４、（実測値）６７２．４。

実施例７
ＢＩＲＢ^*Ｏ２クロロアルカン（ＰＢＩ−４８３２）

１−（１−（４−（（２−アミノアセトアミド）メチル）フェニル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−フェニル尿素（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｅｃｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ２００９，７４，５４７−５５９）（１５ｍｇ、２８ｕｍｏｌ）を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）スクシンイミジルエステル（Ｏ２）リガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ，１２ｍｇ、２８ｕｍｏｌ）および２ｍＬのＤＭＦ中のジイソプロピルエチルアミン（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）と混合した。１時間後、１％のＴＦＡを添加して反応をクエンチし、０．１％の水性トリフルオロ酢酸中５−＞１００％のＭｅＣＮで溶出する分取ＨＰＬＣにより生成物を単離し、１２ｍｇの白色の固体を得た。Ｍ＋の計算値：７２６、実測値７２６。

実施例８
ダサチニブペンチルアミン
ダサチニブ（５０ｍｇ、１０２ｕｍｏｌ）を、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（２８ｍｇ、１３９ｕｍｏｌ、１．３６ｅｑｕｉｖ）および１．８ｍＬのＤＭＦ：ＴＨＦ（２：１）中２０ｕＬのＴＥＡと混合した。反応を一晩攪拌し、次いで、カダベリン（２０９ｍｇ、２ｍｍｏｌ、２０ｅｑｕｉｖ）を添加した。２時間攪拌した後、反応をＡｃＯＨで中和し、０．１％の水性ＴＦＡ中２０−＞６０％のＭｅＣＮの勾配を使用して、分取ＨＰＬＣにより所望の生成物を単離した。適切な画分を濃縮し、凍結乾燥し、所望の生成物を得た。

ダサチニブビス−カルバメート

ダサチニブペンチルアミントリフルオロ酢酸塩（４３ｍｇ、５９ｕｍｏｌ）およびＤＭＦ中のトリエチルアミン（１２ｍｇ、１１８ｕｍｏｌ）の攪拌の溶液に、２−（２−（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルカルバメート（３７ｍｇ、６５ｕｍｏｌ）のＤＭＦ溶液を添加した。反応を室温で７５分間攪拌し、ＴＦＡで中和し、０．１％の水性ＴＦＡ中２５−＞１００％のＭｅＣＮの溶出勾配の分取ＨＰＬＣにかけた。濃縮および凍結乾燥により、フィルムとして所望の生成物を得た（３９ｍｇ）。

ダサチニブモノカルバメート

ダサチニブ（１５ｍｇ、３１ｕｍｏｌ）を、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（８．４ｍｇ、４２ｕｍｏｌ、１．３６ｅｑｕｉｖ）および１．８ｍＬのＤＭＦ：ＴＨＦ（２：１）中１０ｕＬのＴＥＡと混合した。反応を一晩攪拌し、次いで、ＤＭＦ中の溶液として２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタン−１−アミン塩酸塩（３２ｍｇ、４ｅｑｕｉｖ）を添加した。追加のＴＥＡも添加し、再度、反応を一晩攪拌した。分取ＨＰＬＣ（０．１％の水性ＴＦＡ中２０−＞６０％のＭｅＣＮ）により、無色の残留物として所望の生成物を得た（６．７ｍｇ、３０％収率）。

実施例９
Ｂｏｃ保護ＳＡＨＡアミン
７−トリチルオキシカルバモイルヘプタン酸（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２００８，１６，２０１１−２０３３）（２００ｍｇ、４６３ｕｍｏｌ）を、４−［（Ｎ−Ｂｏｃ）アミノメチル］アニリン（１１３ｍｇ、５１０ｕｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３５２ｍｇ、９２７ｕｍｏｌ）、および３ｍＬのＤＭＦ中のトリエチルアミン（１９４ｕＬ、１．４ｍｍｏｌ）と混合した。反応を一晩攪拌し、次いで、セライト上に吸着させた。ヘプタン中０−＞１００％のＥｔＯＡｃの勾配で溶出するカラムクロマトグラフィーにより生成物を得た。Ｍ＋Ｈの計算値：６３５．３、実測値６３５．９。

ＳＡＨＡアミン
スベロイル（４−［（Ｎ−Ｂｏｃ）アミノメチル］アニリド）ヒドロキサム酸（２８６ｍｇ、４５０ｍｍｏｌ）を、０．２５ｍＬのＴＩＳに添加された２ｍＬのＤＣＭに溶解した。次いで、トリフルオロ酢酸（０．９ｍＬ）を添加し、反応を３０分間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、粗反応生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製するか、またはさらに精製することなく使用した。

ＰＢＩ−５０４０ ＳＡＨＡ−カルバメート

１滴のＴＥＡを含む１ｍＬのＤＭＦ中でスベロイル［４−（アミノメチル）アニリド］ヒドロキサム酸ＴＦＡ塩（９ｍｇ、２２ｕｍｏｌ）を攪拌した。次いで、０．５ｍＬのＤＭＦ中の１３ｍｇの２−（２−（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルカルバメート（２３ｕｍｏｌ）を添加した。９０分後、Ｈ₂Ｏを添加して反応をクエンチし、少量のＴＦＡで酸性化し、０．１％の水性ＴＦＡ中５−＞６０％のＭｅＣＮで溶出する分取ＨＰＬＣにより所望の生成物を単離した。Ｍ＋Ｈの計算値：７１９．４、実測値７１９。

Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｓ．；Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｌ．；Ｅｌｉｓｅｅｖａ，Ｅ．；Ｖｅｌｅｎａ，Ａ．；Ｊｕｎｇ，Ｍ．；Ｓｃｈｗｉｅｎｈｏｒｓｔ，Ａ．；Ｓｔｒａｓｓｅｒ Ａ．；Ｄｉｃｋｍａｎｎｓ，Ａ．；Ｆｉｅｎｅｒ，Ｒ．；Ｓｃｈｌｉｍｍｅ，Ｓ．；Ｓｉｐｐｌ，Ｗ．；Ｖｅｒｄｉｎ，Ｅ．；および参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２００８，１６，２０１１−２０３３。

実施例１０
ＰＢＩ−５２３１ ＳＡＨＡアミド

ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の４−（アミノメチル）アニリン（１．１ｇ、９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の無水コハク酸（０．９ｇ、９ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくり（５分かけて）添加した。追加完了時、真空下で溶媒を除去し、シリカゲルクロマトグラフィー（０→２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により反応混合物を精製し、白色の固体として０．１６ｇ（８％収率）の酸ＳＬ＿１３０５＿６３を得た。¹Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ １３．０３-１０．４２（ｍ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．１，２Ｈ），６．４７（ｄ，Ｊ＝８．１，２Ｈ），４．９２（ｓ，２Ｈ），４．０４（ｄ，Ｊ＝５．４，２Ｈ），２．４０（ｄ，Ｊ＝６．０，２Ｈ），２．３２（ｄ，Ｊ＝６．３，２Ｈ）；Ｃ₁₁Ｈ₁₅Ｎ₂Ｏ₃ ⁺［Ｍ＋Ｈ］⁺のＨＲＭＳ（ＳＩ）計算値２２３．１１、実測値２２３．２０。

ＭｅＯＨ−ＴＨＦ（２５０ｍＬ，３：２）中のＳＬ＿１３０５＿６３（１６０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＭＳ−ジアゾメタン（１ｍＬ、ヘキサン中１Ｍの溶液）を添加した。添加完了後、得られた黄色の溶液を２２℃で０．５時間放置した。シリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により反応混合物を精製し、透明な油状物として１３９ｍｇ（８２％収率）のエステルＳＬ＿１３０５＿６９を得た。¹Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ ７．０７（ｄ，Ｊ＝８．６，２Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝８．６，２Ｈ），５．７６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），４．３０（ｄ，Ｊ＝５．１，２Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），２．７９-２．５７（ｍ，２Ｈ），２．５７-２．３５（ｍ，２Ｈ）。

ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＳＬ＿１３０５−６９（１３９ｍｇ、５８９μｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（２７０ｍｇ、７１１μｍｏｌ）、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＮＥｔ₃（４００μＬ、２．８６ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の８−オキソ−８−（（トリチルオキシ）アミノ）オクタン酸（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２９６−３３０９）（２５５ｍｇ、５９２μｍｏｌ）の溶液を添加した。透明な黄色の反応物を、２２℃で１７時間攪拌し、この時点で、ＬＣＭＳ分析は開始材料の完全な消費を示した。反応を真空中で濃縮し、残留物を１００ｍＬのＤＣＭに溶解し、水（１００ｍＬ）で洗浄した。水層をＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出し、有機相を混合し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製し、淡褐色の油状物として２６０ｍｇ（６５％収率）のアニリドＳＬ＿１３０５−７３を得た。Ｃ₃₉Ｈ₄₄Ｎ₃Ｏ₆ ⁺［Ｍ＋Ｈ］⁺のＨＲＭＳ（ＳＩ）計算値６５０．３２、実測値６５０．２５。

ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）中のＳＬ＿１３０５−７３（２６０ｍｇ、４００μｍｏｌ）の溶液に、Ｈ₂Ｏ（１．５ｍＬ）中のＫＯＨ（１１２ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を、マイクロ波で、３０分間６５℃で加熱し、この時点で、ＬＣＭＳ分析は、開始材料の完全な消費を示した。反応物を水性クエン酸（３０％、５０ｍＬ）で洗浄し、水層をＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を混合し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濃縮し、白色の固体として２５０ｍｇ（９８％収率）のＳＬ＿１３０５＿７５を得、これは、さらに精製することなく次のステップに使用された。Ｃ₃₈Ｈ₄₂Ｎ₃Ｏ₆ ⁺［Ｍ＋Ｈ］⁺のＨＲＭＳ（ＳＩ）計算値６３６．３１、実測値６３６．１６。

ＤＭＦ（０．７ｍＬ）中のＳＬ＿１３０５＿７５（６．７ｍｇ、１０μｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＦ（０．６ｍＬ）中のＨＡＴＵ（８．０ｍｇ、２１μｍｏｌ）、続いて、Ｅｔ₃Ｎ（７μＬ、５０μｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のクロロアルカン（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００９，４７，７６９−７７４）（４．２、１１μｍｏｌ）溶液と混合し、２２℃で２時間攪拌した。反応物を真空中で濃縮し、残留物を分取ＨＰＬＣ（４５分かけて３→９５％のＭｅＣＮ／（Ｈ₂Ｏ、０．１％のＴＦＡ））により精製し、白色の固体として３ｍｇ（３０％収率）のＳＬ＿１３０５＿７９を得た。Ｃ₅₆Ｈ₇₈ＣｌＮ₄Ｏ₁₁ ⁺［Ｍ＋Ｈ］⁺のＨＲＭＳ（ＳＩ）計算値１０１７．５４、実測値１０１７．５１。

ＤＣＭ（５ｍＬ）中のＳＬ＿１３０５＿７９（１．５ｍｇ、１．５μｍｏｌ）の溶液に、１滴のトリイソプロピルシラン（ＴｉＰＳ）、続いて、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１ｍＬ）を添加した。得られた溶液を２２℃で５分間放置し、この時点で、ＬＣＭＳ分析は、開始材料の完全な消費を示した。反応混合物を濃縮し、分取ＨＰＬＣ（４５分かけて３→９５％のＭｅＣＮ／（Ｈ₂Ｏ、０．１％のＴＦＡ））により精製し、白色の固体として１ｍｇ（８７％収率）のＰＢＩ−５２３１を得た。Ｃ₃₇Ｈ₆₄ＣｌＮ₄Ｏ₁₁ ⁺［Ｍ＋Ｈ］⁺のＨＲＭＳ（ＳＩ）計算値７７５．４３、実測値７７５．４７。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２９６−３３０９。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００９，４７，７６９−７７４。

実施例１１
以下の実施例は、細胞透過性、ＨａｌｏＴａｇに対する結合速度論、およびクロロアルカン修飾薬物を介した細胞からＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ビーズ上への標的プルダウンに関するカルバメート−クロロアルカンリンカーの利点を示す。この実施例では、修飾されたＢＩＲＢ７９６−クロロアルカン共役体ＰＢＩ−４８３４（カルバメート−クロロアルカンリンカー）およびＰＢＩ−４８３２（Ｏ２クロロアルカンリンカー）は、細胞および溶解物においてＨａｌｏＴａｇに対するそれらの結合速度論に関して試験された。

ａ）細胞溶解物におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論は、１μＭの最終濃度で、修飾されたＢＩＲＢ７９６−クロロアルカン共役体を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現する細胞からの溶解物に添加することにより測定された。結合の０〜６０分後、反応を１μＭ蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により追跡した。未結合のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質は、蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドへの結合を通して検出され、その後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析、および蛍光ゲルスキャナの検出が続いた。

図１０Ａの結果は、０２リンカー（ＰＢＩ−４８３２）およびカルバメートリンカー（ＰＢＩ−４８３４）の両方がＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対して迅速な結合速度論を提供したことを示す。加えて、プルダウン用途に重要であり得るカルバメートリンカーの長さは、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論に影響を及ぼさなかった。

ｂ）細胞におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論は、１０μＭの最終濃度で、修飾されたＢＩＲＢ７９６−クロロアルカン共役体を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現する細胞に添加することにより測定された。結合の０〜６０分後、５μＭの蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドにより反応を追跡した。未結合のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質は、蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドへの結合を通して検出され、その後に、細胞溶解、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析、および蛍光ゲルスキャナの検出が続いた。

図１０Ｂの結果は、カルバメートリンカー（ＰＢＩ−４８３４）が最高の細胞透過性／ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論を有したことを示す。これらの結果は、カルバメートリンカーは非常に長いが、尚も良好な細胞透過性、およびＨａｌｏＴａｇに対する結合速度論を提供することを示す。

ｃ）Ｏ２（ＰＢＩ−４８３２）およびカルバメート（ＰＢＩ−４８３４）の２つのリンカーは、生細胞からＮｌｕｃ：ｐ３８αを特異的にプルダウンするそれらの能力に関しても比較された。ＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８α融合物をコードするプラスミドＤＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした（９６ウェル形式でトランスフェクション）。ＤＮＡを、プロモーターを含まないキャリアＤＮＡプラスミド（ＰＣＩ ｎｅｏ）を用いて、１：１０でウェル当り８０ｎｇの総ＤＮＡの最終濃度に希釈した。トランスフェクションの２４時間後、細胞は、１０μＭのＰＢＩ−４８３２またはＰＢＩ−４８３４の最終濃度でインキュベートされ、一方、対照細胞は、共役された薬物で処理されなかった。２時間の平衡結合後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで直ちに洗浄し、１０分間、細胞を洗剤ベースの溶解緩衝液に溶解した。次いで、細胞溶解物を、０．５μｌの沈降常磁性ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む９６ウェルプレートに移し、振盪しながら１５分間インキュベートした。結合後、未結合の画分を除去し、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質常磁性ビーズを３×洗浄し、１５分間、１５０μＭの非共役ＢＩＲＢ７９６と競合させることにより、捕捉したＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８α融合物をビーズから特異的に解放した。実験の解放されたＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８α融合物（＋ＰＢＩ−４８３４または＋ＰＢＩ−４８３２）および対照試料は、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により検出された。

図１０Ｃの結果は、ＰＢＩ−４８３４のみがＮｌｕｃ：ｐ３８ ｐ３８α融合物を効率的にプルダウンしたことを示し、よって、プルダウン用途におけるカルバメートリンカーの利点を示す。

実施例１２
以下の実験は、細胞透過性、およびＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論に関するカルバメートクロロアルカンリンカーの利点を示す。

この実施例では、ＳＡＨＡクロロアルカン共役体ＰＢＩ−５０４０（カルバメートクロロアルカンリンカー）およびＰＢＩ−５２３１（Ｏ６クロロアルカンリンカー）は、細胞および溶解物においてＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対するそれらの結合速度論に関して試験された。

ａ）細胞溶解物におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論は、１μＭの最終濃度で、ＳＡＨＡ−クロロアルカン共役体を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現する細胞からの溶解物に添加することにより測定された。結合の０〜６０分後、反応を１μＭ蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドにより追跡した。未結合のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質は、蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドへの結合を通して検出され、その後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析、および蛍光ゲルスキャナの検出が続いた。

図１１Ａの結果は、カルバメートリンカー（ＰＢＩ−５０４０）がＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対して非常に迅速な結合速度論を提供したことを示す。

ｂ）細胞におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論は、ＳＡＨＡ−クロロアルカン共役体を、細胞質または核に局在化されるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現する細胞（１０μＭの最終濃度）に添加することにより測定された。結合の０〜１８０分後、反応は、５μＭの蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドにより追跡された。未結合のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質は、蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドへの結合を通して検出され、その後に、細胞溶解、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析、および蛍光ゲルスキャナの検出が続いた。

図１１Ｂの結果は、カルバメートリンカー（ＰＢＩ−５０４０）が非常に迅速な細胞透過性／ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論を有したことを示す。これらの結果は、カルバメートリンカーおよびＯ６リンカーは類似する長さであるが、カルバメートリンカーは良好な細胞透過性、およびＨａｌｏＴａｇに対する結合速度論を提供したことを示す。

実施例１３
以下の実施例は、細胞透過性、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論、およびクロロアルカン修飾薬物を介した細胞からＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質ビーズ上への標的プルダウンに関するクロロアルカンリンカーにおけるカルバメート基の利点を示す。この実施例では、ダサチニブクロロアルカン共役体ＰＢＩ−５２７０（ビスカルバメートクロロアルカンリンカー）およびＰＢＩ−５５９０（モノカルバメートクロロアルカンリンカー）は、細胞および溶解物においてＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対するそれらの結合速度論に関して試験された。

ａ）細胞溶解物におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論は、ダサチニブ−クロロアルカン共役体を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現する細胞からの溶解物（１μＭの最終濃度）に添加することにより測定された。結合の０〜６０分後、反応は、１μＭの蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドにより追跡された。未結合のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質は、蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドへの結合を通して検出され、その後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析、および蛍光ゲルスキャナの検出が続いた。

図１２Ａの結果は、モノカルバメートリンカー（ＰＢＩ−５５９０）がＨａｌｏＴａｇタンパク質に対して迅速な結合速度論を提供したことを示す。

ｂ）細胞におけるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論は、ダサチニブ−クロロアルカン共役体（１０μＭの最終濃度）を、細胞質または核に局在化されるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現する細胞に添加することにより測定された。結合の０〜９０分後、反応は、５μＭの蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドにより追跡された。未結合のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質は、蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドへの結合を通して検出され、その後に、細胞溶解、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析、および蛍光ゲルスキャナの検出が続いた。

図１２Ｂの結果は、両カルバメートリンカーが良好な細胞透過性、およびＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に対する結合速度論を提供したことを示し、よって、クロロアルカンリンカーにおけるカルバメート基の利点を示す。

ｃ）２つのカルバメートリンカーは、生細胞からＡＢＬ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合タンパク質を特異的にプルダウンするそれらの能力に関しても比較された。ＡＢＬ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合物をコードするプラスミドＤＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした（トランスフェクションは９６ウェル形式で行われた）。ＤＮＡを、プロモーターを含まないキャリアＤＮＡプラスミド（ｐＣＩ ｎｅｏＩ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、１：１００でウェル当り８０ｎｇの総ＤＮＡの最終濃度に希釈した。トランスフェクションの２４時間後、細胞は、２０μＭのＰＢＩ−５２７０またはＰＢＩ−５５９０の最終濃度でインキュベートされ、一方、対照細胞は、共役された薬物で処理されなかった。２時間の平衡結合後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで直ちに洗浄し、１０分間、細胞を洗剤ベースの溶解緩衝液に溶解した。次いで、細胞溶解物を、０．５μｌの沈降常磁性ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質ビーズを含む９６ウェルプレートに移し、振盪しながら１５分間インキュベートした。結合後、未結合の画分を除去し、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質常磁性ビーズを３×洗浄し、１５分間、４００μＭの非共役ダサチニブと競合させることにより、捕捉したＡＢＬ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合物をビーズから特異的に解放した。実験の解放されたＡＢＬ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合物（＋ＰＢＩ−５２７０または＋ＰＢＩ−５５９０）および対照試料は、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）試薬により検出された。

図１２Ｃの結果は、ＰＢＩ−５２７０のみがＡＢＬ：ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）を効率的にプルダウンしたことを示し、よって、リンカーの長さがプルダウンの効率に非常に重要であることを示す。モノカルバメートの迅速な結合速度論に基づき、モノカルバメートのリンカーの長さの伸長は、良好なプルダウンを提供すると予測される。

実施例１４
以下の実施例は、薬物透過性および効力に対するクロロアルカン修飾の最小限の影響を示す。

ＨＥＫ２９３細胞を、１×１０⁵細胞／ｍｌで、９６ウェルプレート内で平板培養し、２４時間後、培地を無血清培地に交換した。Ｋ５６２細胞を、２×１０⁵細胞／ｍｌで、無血清培地（９６ウェルプレート）内で平板培養した。細胞をＳＡＨＡまたはＰＢＩ−５０４０（ＳＡＨＡ−クロロアルカン）の系列希釈で２時間処理し、次いで、非溶解性ＨＤＡＣ−Ｇｌｏ（商標）Ｉ／ＩＩアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）．を使用して、細胞内ＨＤＡＣ活性に関して試験した。

図１３の結果は、ＳＡＨＡおよびＰＢＩ−５０４０によるＨＤＡＣ活性の類似する阻害を示す。クロロアルカン修飾によるＳＡＨＡ効力の約２倍の減少は、細胞透過性または効力に対するクロロアルカンの最小限の影響を示す。

実施例１５
以下の実施例は、低存在量および低親和性標的を含む、細胞からの内因性標的をプルダウンするクロロアルカン共役薬物の能力を示す。

Ｋ５６２細胞を、１．６６×１０⁶細胞／ｍｌで、１５０ｍｍの皿内で平板培養した（皿当り合計５×１０⁷細胞）。最終濃度の２０ｕＭのＳＡＨＡクロロアルカン（ＰＢＩ−５０４０）を、３つの皿に添加し、一方、３つの対照皿は、共役薬物で処理されなかった。２時間の平衡結合後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで直ちに洗浄し、１０分間、潜在ベースの溶解緩衝液に溶解し、３０００ｘｇで１分間遠心分離した。次いで、透明な溶解物を７５ｕｌの沈降常磁性ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質ビーズに添加し、振盪しながら１５分間インキュベートした。結合後、未結合の画分を除去し、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質常磁性ビーズを３×洗浄し、６０分間、４００μＭの非共役ＳＡＨＡと競合させることにより、捕捉した標的をビーズから特異的に解放した。解放された標的は、質量スペクトル分析（図１４Ｂ）ならびに抗ＨＤＡＣ１抗体（ＡＢＣＡＭ）、抗ＨＤＡＣ２抗体（ＡＢＣＡＭ）、抗ＨＤＡＣ６抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＨＤＡＣ３抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、抗ＨＤＡＣ１０（ＡＢＣＡＭ）、および抗ＨＤＡＣ８抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いて、ウエスタンブロット分析（図１４Ａ）を受けた。

図１４の結果は、低親和性標的（ＨＤＡＣ８）および低存在量標的（ＨＤＡＣ３）を含む、ＳＡＨＡの全ての既知の標的が細胞から特異的にプルダウンされることを示す。ＰＢＩ５０４０の高細胞透過性は、核（ＨＤＡＣ１）および細胞質（ＨＤＡＣ６）などの異なる細胞コンパートメントからのタンパク質の効率的なプルダウンも可能にする。

本明細書に記載される全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。記載される特徴および実施形態の様々な修正、組換え、および変形が本発明の範囲および趣旨から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。特定の実施形態が記載されてきたが、特許請求されるように、本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解するべきである。実際、関連分野の当業者に明らかである記載されるモードおよび実施形態の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内であるものとする。

Claims (52)

1. 式Ｒ−Ｌ１−Ｍ−Ｌ２−Ａ−Ｘの化合物であって、
   式中、Ｒが、官能基であり、Ｌ１が、第１のリンカー部分であり、Ｍが、カルバメート基であり、Ｌ２が、第２のリンカー部分であり、Ａが、アルキル基であり、Ｘが、ハロゲンであり、
   Ｌ２−Ａが、６〜１８個の直鎖状に結合した原子によってＭとＸとを分離し、
   Ｌ１が、２個以上の直鎖状に結合した原子によってＲとＭとを分離する、化合物。
2. Ａが、（ＣＨ２）６である、請求項１に記載の化合物。
3. Ｌ２−Ａが、１２個の直鎖状に結合した原子によってＭとＸとを分離する、請求項１のいずれか一項に記載の化合物。
4. 前記官能基が、親和性タグ、フルオロフォア、または固体表面を含む、請求項１のいずれか１項に記載の化合物。
5. 前記官能基が、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である、請求項１のいずれか一項に記載の化合物。
6. Ｌ２が、カルバメート基を含まない、請求項１のいずれか一項に記載の化合物。
7. Ｌ２が、直鎖状に結合したＣＨ２およびＯ基を含む、請求項１のいずれか一項に記載の化合物。
8. Ｌ２が、直鎖状に結合したＣＨ２およびＯ基からなる、請求項７に記載の化合物。
9. Ｌ２が、（（ＣＨ２）２Ｏ）ｘを含み、式中、ｘ＝０〜５である、請求項７に記載の化合物。
10. Ｌ２が、（（ＣＨ２）２Ｏ）２を含む、請求項９に記載の化合物。
11. Ｌ１が、直鎖状に結合したＣＨ２およびＯ基を含む、請求項１に記載の化合物。
12. Ｌ１が、カルバメートを含む、請求項１に記載の化合物。
13. Ｌ１が、２〜８個の長さの直鎖状に結合した原子である、請求項１２に記載の化合物。
14. Ｌ１が、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ２）２Ｏ）ｘを含み、式中、ｘ＝１〜８である、請求項１２に記載の化合物。
15. Ｌ１が、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ２）２Ｏ）３を含む、請求項１４に記載の化合物。
16. Ｌ１が、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ２）２Ｏ）３を含み、Ｌ２が、（（ＣＨ２）２Ｏ）２を含み、Ａが（ＣＨ２）６である、請求項１に記載の化合物。
17. 前記官能基が、親和性タグ、フルオロフォア、または固体表面を含む、請求項１６に記載の化合物。
18. 前記官能基が、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である、請求項１６に記載の化合物。
19. Ｌ１−Ｍ−Ｌ２−Ａを含むリンカーによって官能基に連結されるタンパク質を含む組成物であって、
    式中、Ｌ１が、第１のリンカー部分であり、Ｍが、カルバメート基であり、Ｌ２が、第２のリンカー部分であり、Ａが、アルキル基であり、
    Ｌ２−Ａが、８〜１６個の直鎖状に結合した原子によって前記タンパク質からＭを分離し、
    Ｌ１が、２個以上の直鎖状に結合した原子によって前記官能基とＭとを分離する、組成物。
20. 前記タンパク質が、変異体デハロゲナーゼを含む、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記タンパク質が、融合タンパク質の一部分である、請求項１９に記載の組成物。
22. Ａが、（ＣＨ２）６である、請求項１９に記載の組成物。
23. Ｌ２−Ａが、１２個の直鎖状に結合した原子によって前記タンパク質からＭを分離する、請求項１９に記載の組成物。
24. 前記官能基が、親和性タグ、フルオロフォア、または固体表面を含む、請求項１９に記載の組成物。
25. 前記官能基が、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である、請求項１９に記載の化合物。
26. Ｌ２が、カルバメート基を含まない、請求項１９に記載の組成物。
27. Ｌ２が、直鎖状に結合したＣＨ２およびＯ基を含む、請求項１９に記載の組成物。
28. Ｌ２が、直鎖状に結合したＣＨ２およびＯ基からなる、請求項２７に記載の組成物。
29. Ｌ２が、（（ＣＨ２）２Ｏ）ｘを含み、式中、ｘ＝０〜５である、請求項２７のいずれか一項に記載の組成物。
30. Ｌ２が、（（ＣＨ２）２Ｏ）２を含む、請求項２９に記載の組成物。
31. Ｌ１が、直鎖状に結合したＣＨ２およびＯ基を含む、請求項１９のいずれか一項に記載の組成物。
32. Ｌ１が、カルバメートを含む、請求項１９のいずれか一項に記載の組成物。
33. Ｌ１が、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ２）２Ｏ）ｘを含み、式中、ｘ＝１〜８である、請求項３２に記載の組成物。
34. Ｌ１が、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ２）２Ｏ）３を含む、請求項３３に記載の組成物。
35. Ｌ１が、２〜８個の長さの直鎖状に結合した原子である、請求項３３に記載の組成物。
36. Ｌ１が、ＮＨＣＯＯ−（（ＣＨ２）２Ｏ）３を含み、Ｌ２が、（（ＣＨ２）２Ｏ）２を含み、Ａが、（ＣＨ２）６である、請求項１９に記載の組成物。
37. 前記官能基が、親和性タグ、フルオロフォア、または固体表面を含む、請求項３６に記載の組成物。
38. 前記官能基が、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である、請求項３２のいずれか一項に記載の化合物。
39. 対象とする標的分子を特定する方法であって、ａ）試料を、請求項１〜３８のうちのいずれか一項に記載の基質と接触させることであって、前記官能基が、前記対象とする化合物である、接触させることと、ｂ）前記試料および基質を、変異体デハロゲナーゼを含む固体支持体と接触させることと、ｃ）前記基質に結合された前記対象とする分子を特定することと、を含む、方法。
40. 前記対象とする化合物が、薬物、薬物化合物、生体分子、または小分子である、請求項３９に記載の方法。
41. 前記試料が、細胞または細胞溶解物である、請求項３９に記載の方法。
42. 前記対象とする分子が、融合タンパク質である、請求項３９に記載の方法。
43. 前記融合タンパク質が、レポータータンパク質を含む、請求項４２に記載の方法。
44. 変異体デハロゲナーゼの存在または量を検出または決定する方法であって、ａ）変異体デハロゲナーゼを、請求項１に記載の化合物を含む基質と接触させることであって、前記変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、接触させることと、ｂ）Ｒの存在もしくは量を検出または決定し、それにより前記変異体デハロゲナーゼの存在または量を検出または決定することと、を含む、方法。
45. 細胞を標識する方法であって、変異体デハロゲナーゼを含む細胞を、請求項１に記載の化合物を含むデハロゲナーゼ基質と接触させることであって、前記変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成される結合よりも安定した前記基質との結合を形成する前記変異体デハロゲナーゼをもたらし、それにより前記細胞をＲで標識する、接触させることと、を含む、方法。
46. 細胞中の分子の存在または量を検出するための方法であって、ａ）変異体デハロゲナーゼを含む細胞を、請求項１に記載の化合物を含む基質と接触させることであって、前記変異体デハロゲナーゼが、対応する野生型デハロゲナーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成される結合よりも安定した前記基質との結合を形成する前記変異体デハロゲナーゼをもたらす、接触させることと、ｂ）前記細胞中のＲの存在または量を検出または決定することと、を含む、方法。
47. 対象とする分子を固定化単離する方法であって、（ａ）請求項１に記載の化合物を含む基質を提示する固体支持体を、（ｂ）（ｉ）前記基質との相互作用時に前記基質と共有結合を形成する変異体デハロゲナーゼと、（ｉｉ）前記対象とする分子に結合されるタンパク質と、を含む融合タンパク質と接触させることを含む、方法。
48. 対象とするタンパク質を固定化する方法であって、（ａ）請求項１に記載の基質を含む固体支持体を、（ｂ）（ｉ）前記基質との相互作用時に前記基質と共有結合を形成する変異体デハロゲナーゼと、（ｉｉ）対象とするタンパク質との融合物と接触させることを含む、方法。
49. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成される結合よりも安定した前記基質との結合を形成する前記変異体デハロゲナーゼをもたらし、前記変異体デハロゲナーゼにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、前記対応する野生型デハロゲナーゼと前記基質との間に形成された前記結合を切断する水分子の活性化に関連する前記対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換、または前記基質とエステル中間体を形成する前記対応する野生型デハロゲナーゼのアミノ酸残基での置換である、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 請求項１に記載の化合物を調製するための方法であって、式Ｒ−Ｙの化合物を、式Ｚ−Ｌ１−Ｍ−Ｌ２−Ａ−Ｘの化合物とカップリングすることを含み、式中、ＹおよびＺが、反応してＲ−を−リンカー−Ｌ１−Ｍ−Ｌ２−Ａ−Ｘに連結することができる基である、方法。
51. Ｒ−Ｙが、式Ｒの化合物の活性化エステルであり、Ｚが、前記活性化エステルと反応してアミド結合を形成するのに好適なアミンである、請求項５０に記載の方法。
52. 請求項１に記載の基質を含む、細胞。