ES2199605T3 - Indicadores moleculares opticos de actividad del citocromo p450. - Google Patents

Indicadores moleculares opticos de actividad del citocromo p450.

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ES2199605T3 ES99965226T ES99965226T ES2199605T3 ES 2199605 T3 ES2199605 T3 ES 2199605T3 ES 99965226 T ES99965226 T ES 99965226T ES 99965226 T ES99965226 T ES 99965226T ES 2199605 T3 ES2199605 T3 ES 2199605T3
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Abstract

Un compuesto que tiene la estructura: Y-L-Q en la que: Y se selecciona del grupo que consta de Q como se ha definido en la presente invención, alquilo C1-C20 saturado, alquenilo C1-C20 insaturado, alquinilo C1-C20 insaturado, alquilo C1-C20 saturado sustituido, alquenilo C1-C20 insaturado sustituido, alquinilo C1-C20 insaturado sustituido, cicloalquilo C1-C20, cicloalquenilo C1-C20, cicloalquilo C1-C20 saturado sustituido, cicloalquenilo C1- C20 insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido; en la que si Y se selecciona de Q como se ha definido en la presente invención, L es L'', en el que L'' se selecciona del grupo de -(CR4H)(-OCR2H)p-, -(CR4H) (-O(fenil orto sustituido)CR2H)p-, -(CR4H)(-O(fenil meta sustituido)CR2H)p-, y -(CR4H) (- O(fenil para sustituido)CR2H)p-, en los que cada R2 y cada R4 se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C1-C20 saturado, alquenilo C1- C20 insaturado, alquinilo C1-C20 insaturado, alquilo C1-C20 saturado sustituido, alquenilo C1-C20 insaturado sustituido, alquinilo C1-C20 insaturado sustituido, cicloalquilo C1-C20, cicloalquenilo C1-C20, cicloalquilo C1- C20 saturado sustituido, cicloalquenilo C1-C20 insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce.

Description

Indicadores moleculares ópticos de actividad del citocromo P450.
Declaración de derechos del gobierno
Esta invención se desarrolló en parte con la subvención número 1R43GM60114-01 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales. El gobierno puede tener algunos derechos en esta invención.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
Esta invención se refiere a nuevos compuestos químicos, útiles como indicadores ópticos de la actividad del citocromo P450, y especialmente a indicadores fluorogénicos de la actividad del citocromo P450. Más específicamente, la invención se refiere a compuestos que contienen grupo éter con la estructura genérica Y-L-Q, y a métodos para ensayar sustratos e inhibidores de enzimas citocromo P450 usando estos compuestos en formatos de ensayo tradicionales, así como en formatos de selección de alta y ultra alta producción.
Descripción de la técnica relacionada
La familia de enzimas citocromo P450 (CYP450) comprende enzimas oxidasas implicadas en el metabolismo xenobiótico de fármacos hidrófobos, carcinógenos, y otros compuestos y metabolitos potencialmente tóxicos que circulan por la sangre. Se sabe que el hígado es el órgano principal para el metabolismo xenobiótico, y que contiene altos niveles de CYP450-oxidasa de función mixta. Hay muchas subfamilias de enzimas P450 humanas, a menudo denominadas "isozimas" o "isoformas". Se sabe que las de las subfamilias CYP 3A4, CYP 2D6, CYP 2C, CYP 2A1 y CYP 2E1, son importantes en el metabolismo de fármacos. Véase, por ejemplo, Murray, M., 23 Clin. Pharmacokinetics 132-46 (1992). De estas isoformas, el CYP 3A4 es de lejos la isoforma principal en el hígado y el intestino delgado, comprendiendo 30% y 70% respectivamente de la proteína CYP450 total en estos tejidos. Basándose principalmente en estudios in vitro, se ha calculado que el metabolismo de 40% a 50% de todos los fármacos usados en seres humanos implica oxidaciones catalizadas por el CYP 3A4. Véase Thummel, K.E. & Wilkinson, G.R. In vitro and In vivo Drug Interactions Involving Human CYP 3A, 38 Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 389-430 (1998).
El metabolismo eficaz de un fármaco candidato por una enzima CYP450 puede conducir a propiedades farmacocinéticas pobres, mientras que fármacos candidatos que actúan como potentes inhibidores de una enzima CYP450 pueden producir interacciones fármaco-fármaco indeseables, cuando se administran con otros fármacos que interaccionan con el mismo CYP450. Véase, por ejemplo, Peck, C.C. et al., Understanding Consequences of Concurrent Therapies, 269 JAMA 1550-52 (1993). De acuerdo con esto, una indicación fiable y temprana de que un fármaco candidato interacciona (es decir, es un sustrato o inhibidor) con un CYP450 puede reducir mucho el ciclo de descubrimiento de la investigación y desarrollo farmacéutico, y por lo tanto puede reducir el tiempo necesario para comercializar el fármaco candidato. Por consiguiente, esta información farmacocinética del CYP450 fiable y de la que se puede disponer pronto, puede dar como resultado costes de desarrollo de fármacos muy reducidos y/o aumento de los beneficios por la entrada antes en el mercado. Además, esta información farmacocinética del CYP450 fiable y de la que se puede disponer pronto, puede permitir que un fármaco candidato llegue al público antes, con menores costes de lo que sería posible de otra forma. De acuerdo con esto, recientemente los estudios farmacocinéticos exhaustivos de interacciones de fármacos en seres humanos se han convertido en una parte integrante del desarrollo farmacéutico de fármacos y de los procedimientos de evaluación de la seguridad. Véase, por ejemplo, Parkinson, A., 24 Toxicological Pathology 45-57 (1996). Por lo tanto se desean metodologías que permitan (1) la adquisición más rápida de información sobre las interacciones de los fármacos candidatos con enzimas CYP450, antes en el proceso de descubrimiento del fármaco de lo que es posible actualmente, y por lo tanto, que permitan (2) la eliminación más pronto de compuestos y series químicas inadecuadas con esfuerzos de desarrollo adicionales.
La necesidad de información en relación con las interacciones del candidato a fármaco/CYP450 ha creado una necesidad concurrente de ensayos suficientemente sensibles para ensayar, de una forma rentable, las interacciones de amplios conjuntos de compuestos con las principales enzimas CYP450 humanas implicadas en el metabolismo de fármacos. Algunas técnicas conocidas, incluyendo (1) ensayos de inhibición de CYP450 en los que se produce el metabolismo del metabolito conocido del CYP450 en presencia del compuesto de ensayo, seguido de parada de la reacción de la enzima y análisis del grado de metabolismo, (2) metabolismo por CYP450 de análogos del compuesto de ensayo radiomarcados, y (3) dosificación "cassette" in vivo de animales (normalmente ratas, perros o monos), véase Berman, J. et al., "Simultaneous Pharmacokinetic Screening of a Mixture of Compounds in the Dog using API LC/MS/MS Analysis for Increased Throughput" 40 J. Medicinal Chemistry, 827-29 (1997), no se pueden adaptar a la miniaturización, o a los otros requisitos de selección de alta o ultra alta producción.
Sin embargo, los ensayos ópticos que usan, por ejemplo, cromóforos o fenoles luminiscentes, y especialmente los ensayos basados en fluorescencia se pueden adaptar a la miniaturización y a la selección de alta o ultra alta producción. Particularmente, se han usado ensayos basados en fluorescencia en estudios farmacocinéticos de interacciones de fármacos en seres humanos, más particularmente en ensayos que implican cultivos de hepatocitos humanos, donde el número de células disponibles está seriamente limitado. Véase Donato, M.T. et al., 213 Anal. Biochem. 29-33 (1993).
Específicamente, los sustratos fluorogénicos del citocromo P450 han estado disponibles en el comercio durante una serie de años, por ejemplo en Molecular Probes, Inc. (Eugen, Oregón), SIGMA (St. Louis, Misuri), y más recientemente en GENTEST Corp. (Woburn, Massachusetts). En general, estos sustratos fluorogénicos conocidos del CYP450 son derivados éter de fluoróforos de tipo fenóxido bien conocidos, incluyendo: 7-hidroxicumarina, fluoresceína, y resorufina. Así, en general, las enzimas CYP450 catalizarán una reacción de desalquilación y convertirán el sustrato éter relativamente no fluorescente en un producto que contiene fenóxido relativamente mucho más fluorescente.
Sin embargo, incluso los sustratos fluorogénicos del CYP450 más recientemente desarrollados o tienen cinéticas relativamente pobres, o los productos enzimáticos no tienen las propiedades físicas y ópticas deseadas para permitir la reducción de la cantidad de enzima necesaria a niveles que harían la selección a gran escala razonable y viable. Más específicamente, estos sustratos fluorogénicos del CYP450 presentan velocidades de recuperación relativamente pequeñas, poca solubilidad acuosa, bajos coeficientes de extinción y rendimientos cuánticos, y/o fluorescencia débil del colorante fenólico resultante. Además, algunos de estos sustratos fluorogénicos de CYP450 se excitan en el espectro ultravioleta, en oposición al visible, y por lo tanto sus señales a menudo están enmascaradas por el fondo que resulta del compuesto de ensayo sin reaccionar. Finalmente, la mayoría de estos sustratos fluorogénicos del CYP450 no son específicos para la isozima CYP450 que se supone que detectan, y por lo tanto no se pueden usar para mediciones en preparaciones microsomales de hígado humano, un método analítico preferido que evita potenciales productos producidos por el método alternativo de usar una preparación microsomal de células de insecto. Véase Palamanda J.R. et al., "Validation of a rapid microtiter plate assay to conduct cytochrome P450 2D6 enzyme inhibition studies", 3 Drug Discovery Today, 446-470 (1998). Por estas y otras razones, existe una necesidad no satisfecha de sustratos del CYP450 ópticos, y especialmente fluorogénicos, que presenten especificidad por la isozima CYP450, mejores cinéticas, y que den productos enzimáticos que tengan mejores propiedades físicas y ópticas, para usar en la selección de interacciones de CYP450/candidato a fármaco, especialmente para usar en la selección de alta o ultra alta producción, y como parte del proceso de descubrimiento de un fármaco.
Sumario de la invención
La invención proporciona un compuesto útil como una sonda, modulador o sensor óptico de la actividad de al menos una enzima citocromo P450. La sonda óptica de la invención es un compuesto que tiene la estructura genérica Y-L-Q, en la que Y se selecciona del grupo que consta de Q como se define en la presente invención (tal que la sonda tiene la estructura general Q-L'-Q), y alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido; L se selecciona del grupo de (-OCR^{2}H)_{p}-, (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, (-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y (-O(fenil para sustituido)
CR^{2}H)_{p}-, y L' se selecciona del grupo de -(CR^{4}H)(-OCR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H) (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H)
(-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y -(CR^{4}H)(-O(fenil para sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en los que para cada p, cada R^{2} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce; y Q es un resto químico que da lugar a propiedades ópticas en su forma hidroxi o hidroxilato, fenol o fenóxido que son diferentes de las propiedades ópticas que surgen de su forma éter. Más preferiblemente, p es uno, R^{2} es hidrógeno, y Q es la forma éter de un fluoróforo fenóxido. Más preferiblemente, la forma éter del fluoróforo fenóxido son derivados éter de los fluoróforos de tipo fenóxido conocidos 7-hidroxicumarina, fluoresceína, y resorufina.
La invención también proporciona métodos para usar los compuestos sensores ópticos de la invención para determinar si un fármaco candidato, o una clase de fármacos candidatos, es un sustrato del CYP450 y/o si el fármaco candidato, o la clase de fármacos candidatos, es un inhibidor del CYP450, y métodos relacionados para seleccionar un fármaco candidato, y para formular y administrar dicho fármaco, habiendo determinado que el fármaco no será metabolizado por al menos una enzima CYP450, y/o que el fármaco no actuará como un inhibidor de al menos una enzima CYP450, y por lo tanto, habiendo determinado que el fármaco no será metabolizado demasiado eficazmente por una enzima CYP450 y/o provocará una interacción fármaco-fármaco desfavorable, respectivamente. Los métodos para seleccionar el fármaco candidato de la presente invención pueden ser métodos convencionales o pueden ser parte de la selección de alta o ultraalta producción de bibliotecas de candidatos a fármaco.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos que acompañan, los cuales se incorporan y forman parte de la memoria descriptiva, simplemente ilustran realizaciones de la presente invención. Junto con el resto de la memoria descriptiva, sirven para explicar los principios de la invención a los expertos en la técnica. En los dibujos:
La Figura 1 ilustra el Esquema de reacción 1, el cual muestra un mecanismo de reacción para la desalquilación por el CYP450 de un sustrato fluorogénico del CYP450 normalmente disponible, la fenoxazona.
La Figura 2 ilustra el Esquema de reacción 2, el cual muestra una estructura genérica del sensor/sustrato óptico de CYP450 de la presente invención, y la reacción de hidroxilación catalizada por el CYP450.
La Figura 3 ilustra el Esquema de reacción 3, que compara la reacción de hidroxilación que puede conducir a un colorante fenólico libre de un sensor óptico de CYP450 conocido (parte superior) y un compuesto sensor óptico de CYP450 de la presente invención (parte de abajo).
La Figura 4 ilustra una representación gráfica de la velocidad de conversión del éter de resorufina por el CYP 3A4 en función de la concentración de sustrato/sensor del CYP450 para los compuestos sustrato/sensor del CYP450 de la invención, benciloximetilresorufina (BOMR) (círculos) y n-octiloximetilresorufina (OOMR) (diamantes), y en función del éter bencílico de la resorufina (BR) (triángulos).
La Figura 5 ilustra una representación gráfica del porcentaje de inhibición del CYP 3A4 en función de la presencia de inhibidores seleccionados y sustratos fármaco del CYP 3A4, y demuestra el efecto que estos inhibidores (barras sombreadas con rayas cruzadas) y sustratos fármaco (barras con rayas diagonales) tienen en la velocidad de recuperación de un compuesto de la invención, benciloximetil-éter (BOMR), por la enzima CYP 3A4. La figura ilustra que los inhibidores reducen la velocidad de recuperación de la BOMR más de aproximadamente 50%, mientras que los sustratos fármacos bajan la velocidad de recuperación de la BOMR hasta aproximadamente 30%.
La Figura 6 ilustra una representación gráfica del porcentaje de inhibición del CYP 2C19 en función de la presencia de diferentes fármacos en concentraciones 10 \muM que interaccionan con el CYP 2C19, y demuestra que se puede usar la 7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina (BOMCC) como un sensor óptico del CYP450 para detectar los fármacos candidatos que interaccionan con el CYP 2C19.
La Figura 7 ilustra una representación gráfica del porcentaje de inhibición del CYP 2C9 en función de la presencia de diferentes fármacos en concentraciones 10 \muM que interaccionan con el CYP 2C9, y demuestra que la 7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina (BOMCC; barras oscuras) y la octiloximetilresorufina (OOMR; barras claras) se pueden usar como un sensor óptico del CYP450 para detectar fármacos que interaccionan con el CYP 2C9.
Las Figuras 8, 9, 10, 11 y 12, ilustran la señal mejor frente al fondo, de los sensores que contienen el conector oximetilo y oxifenilmetilo de esta invención (señales continuas) frente a sustratos previos disponibles en el comercio (líneas discontinuas). La señal de fondo acumulada que resulta de la adición de NADP^{+} y de la adición del sustrato se manifiesta por una señal fluorescente mayor que uno, 3 minutos después de la adición del sustrato (la segunda flecha indica el tiempo de adición del sustrato). El último aumento de la señal, 4 minutos después de la 2ª adición y en los tiempos posteriores, se debe a la conversión enzimática del sustrato en el producto. En las figuras 8, 9, 10, 11 y 12, la señal enzimática sobre el fondo de adición de sustrato, una media del rendimiento del ensayo, es mayor para los sensores que contienen el conector oximetilo de esta invención (líneas continuas) que para los sustratos previos disponibles en el comercio (líneas discontinuas). La Figura 8 ilustra la señal superior de la BOMR (señal continua) frente a la bencilresorufina (señal discontinua) con la isozima CYP 3A4. La Figura 9 ilustra la señal superior de la BOMCC (señal continua) frente a la 7-benciloxi-4-trifluorometilcumarina (BFC, señal discontinua) con la isozima CYP 3A4. La Figura 10 ilustra la señal superior de la MOBFC (señal continua) frente a AMMC (Gentest) (señal discontinua) con la isozima CYP 2D6. La Figura 11 ilustra la señal superior tanto de la OOMR (señal continua) como de la BOMC (señal continua) frente a la 7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (MFC, señal discontinua) con la isozima CYP 2C9. La Figura 12 ilustra la señal superior de la EOMCC (señal continua) frente a la 3-ciano-7-etoxicumarina (CEC, señal discontinua) con la isozima CYP 2C19.
La Figura 13 ilustra la utilidad de los sensores que contienen el conector oximetilo para seleccionar inhibidores del CYP450. Se hizo una selección de una muestra aleatoria de 160 compuesto adquiridos en Chembridge que inhibían el CYP 3A4 usando BOMR como sensor para evaluar el grado de inhibición.
La Figura 14 ilustra la utilidad de los sensores que contienen conector oximetilo para identificar patrones estructurales en productos químicos que estén asociados con la inhibición del CYP 3A4.
La Figura 15 ilustra la utilidad de los sensores que contienen conector oxifenilmetilo en la selección de inhibidores de CYP450. Se hizo una selección de una muestra aleatoria de 240 compuestos adquiridos en Chembridge que inhibieran el CYP 2D6 usando MOBFC como sensor para evaluar el grado de inhibición.
La Figura 16 ilustra la utilidad de los sensores que contienen conector oxifenilmetilo para identificar patrones estructurales en productos químicos, que estén asociados con la inhibición del CYP 2D6.
Descripción detallada de la realización preferida
Los miembros de la familia de enzimas citocromos P450 (CYP) catalizan principalmente reacciones de epoxidación e hidroxilación. La hidroxilación de un éter fenóxido fluorogénico libera el fenóxido libre que es detectado fácilmente en virtud de su fluorescencia. Se ha estudiado exhaustivamente los mecanismos de las reacciones de desalquilación catalizadas por el CYP450 y se puede prever que transcurren por la vía descrita en el Esquema de reacción 1, ilustrado en la Fig. 1. Véase Groves, J.T. et al., Models and Mechanisms of Cytochrome P450 Action, en ``Cytochrome P450: Structure, Mechanism, Biochemistry'', Plenum Press, 3-48, 1997. Las pruebas experimentales sugieren que la etapa determinante de la velocidad en la reacción es la reacción de abstracción de hidrógeno ilustrada en la primera etapa del Esquema de reacción 1, ilustrado en la Fig. 1. De acuerdo con esto, se puede desear que un sustrato fluorogénico con una velocidad de recuperación más rápida, especialmente en relación con la etapa limitante de la velocidad, alcance las necesidades inherentes de la técnica. Se proporciona un tipo de dichos sustratos/sensores, los compuestos sensores ópticos de la presente invención, en los que la abstracción de cualquiera de los hidrógenos adicionales todavía genera un compuesto libre y su forma hidroxi o hidroxilato, normalmente fenóxido, que presenta propiedades ópticas superiores que las del compuesto en su forma éter.
La presente invención proporciona, en una realización preferida, la "inserción" de un conector oximetilo entre el fluoróforo y el resto éter reactivo unido al grupo lábil. Dicha "inserción" se lleva a cabo, de acuerdo, por ejemplo, con los métodos sintéticos de los Ejemplos 1 a 7, que son métodos preferidos para preparar los sensores ópticos del CYP450 de la presente invención.
En general, como será evidente cuando los expertos en la técnica revisen los Ejemplos 1 a 7, los compuestos de la presente invención se pueden sintetizar de acuerdo con el siguiente esquema de reacción:
H-Q + R^{3}CH_{2}OCHX \rightarrow R^{3}CH_{2}OCH_{2}-Q
en el que X es un grupo lábil adecuado, por ejemplo un átomo de halógeno, un grupo tosilo, un grupo mesilo, un grupo triflato, y en el que la reacción se lleva a cabo, preferiblemente, en presencia de DMF/K_{2}CO_{3}, diisopropiletilamina/DMF a temperaturas iguales o ligeramente por enzima del punto de congelación del agua; en el que Q es un compuesto que presenta propiedades ópticas superiores en su forma hidroxi o hidroxilato, típicamente pero no exclusivamente fenóxido, que las que tiene en su forma éter, y preferiblemente es un fluoróforo o un cromóforo, y más preferiblemente es un fluoróforo seleccionado del grupo que consta de 7-hidroxicumarina, resorufina, y los fluoróforos fenóxido conocidos; y R^{3} se selecciona del grupo que consta de Q como se ha definido en la presente invención, R^{1} de los sustratos fluorogénicos del citocromo P450 conocidos, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
Además, en una descripción más general de los compuestos de la presente invención, uno de los protones del metilo del conector se puede sustituir por un grupo químico distinto, R^{2}, en el que R^{2} se selecciona del grupo que consta de grupos alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido. Además, múltiples grupos oximetilo unidos, o más general múltiples grupos OCR^{2}H pueden formar el conector del sensor del CYP450 de la invención. En un conector multímero los grupos R^{2} se seleccionan independientemente uno de otro. Por ejemplo, un conector indicado como (CR^{2}H)_{p} con
p = 3 tiene la siguientes estructura: -(OCR^{2_{(1)}}H)-(OCR^{2_{(2)}}H)-(OCR^{2_{(3)}}H)-, en la que R^{2_{(1)}} y R^{2_{(2)}} y R^{2_{(3)}} se seleccionan independientemente del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
Por lo tanto, la presente invención proporciona compuestos, útiles como sondas ópticas para cuantificar la actividad de al menos una enzima citocromo P450; teniendo dicho compuesto la estructura genérica Y-L-Q en la que:
Y se selecciona del grupo que consta de (i) Q como se define en la presente invención, siempre que L sea L' como se define en la presente invención, y (ii) el grupo consta de alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
L se selecciona del grupo de (-OCR^{2}H)_{p}-, (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, (-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y (-O(fenil para sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en el que para cada p, cada R^{2} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce. Cuando Y se selecciona de Q como se ha definido en la presente invención, L es L', en el que L' se selecciona del grupo de -(CR^{4}H)(-OCR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H) (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H)(-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y
-(CR^{4}H) (-O(fenil para sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en los que cada R^{2} y R^{4} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce.
El uso de las estructuras Q-L'-Q del sensor de CYP450 de la invención tiene la ventaja de dar dos restos Q ópticos, en lugar de uno, en forma de hidroxi o hidroxilato cuando interacciona el sensor óptico de la invención con al menos una enzima CYP450.
Las expresiones fenilo orto sustituido, fenilo meta sustituido, y fenilo para sustituido, se refieren a un fenilo que es parte del conector que conecta Y con Q, en el que orto, meta y para se refiere a las posiciones de los carbonos en el anillo de fenilo que sirven de unión para Y y Q. Orto sustituido se refiere a la unión de Y y Q por carbonos adyacentes en el anillo de fenilo, meta sustituido se refiere a la unión de Y y Q por carbonos separados por un carbono en el anillo de fenilo, y para sustituido se refiere a la unión de Y y Q en el anillo de fenilo por carbonos que están separados por dos carbonos en el anillo de fenilo. Cuando se usa para definir sustitución adicional del anillo de fenilo en el conector oxifenilmetilo, el término sustituido se refiere a la sustitución del resto de los carbonos no implicados en la unión de Y y Q en el anillo de fenilo.
El término "sustituido" significa cualquier sustitución de un átomo de hidrógeno por un grupo funcional. Los grupos funcionales se seleccionan del grupo que consta de un átomo de halógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro, -SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -N=N-R_{n1}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c},
-OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o},
-PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano. También cuando se usa en el contexto en que se definen Y y R^{2}, el término "sustituido" significa cualquier sustitución de un hidrógeno por un grupo funcional como se ha definido en la presente invención siempre que no se produzca sustitución de heteroátomo en el carbono \alpha.
El término "desactivador" se refiere a una molécula cromófora o parte de un compuesto que es capaz de reducir la emisión de un donador fluorescente cuando se une al donador. La desactivación se puede producir por cualquiera de los diferentes mecanismos, incluyendo transferencia de energía de resonancia, transferencia de electrón fotoinducida, potenciación paramagnética del cruce entre sistemas, acoplamiento de intercambio de Dexter, y acoplamiento de excitación tal como la formación de complejos oscuros.
El término "aceptor" se refiere a un desactivador que opera por transferencia de energía. Los aceptores pueden reemitir la energía transferida en forma de fluorescencia y son "restos fluorescentes aceptores". Entre los ejemplos de aceptores se incluyen cumarinas y fluoróforos relacionados, xantenos tales como fluoresceínas, rodoles y rodaminas, resorufinas, cianinas, difluoroboradiazaindacenos, y ftalocianinas. Otras clases químicas de aceptores generalmente no reemiten la energía transferida en forma de luz. Entre los ejemplos se incluyen índigos, benzoquinonas, antraquinonas, compuestos azo, compuestos nitro, indoanilinas, y di y trifenilmetanos.
Q está unido a L por un enlace éter, por el oxígeno indicado con la flecha, y tiene una estructura seleccionada del grupo que consta de las siguientes estructuras:
1 
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2
3 
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4 
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5 
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6
7 
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8 
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9 
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10
11 
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12 
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13
en las que:
m es un número entero positivo no mayor que cinco;
R_{a}, R_{b}, R_{c}, R_{d}, R_{e}, R_{f}, R_{g}, R_{h}, R_{i}, R_{j}, R_{k}, y R_{l}, se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro, azido, -SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -N=N-R_{n1}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s};
R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático;
R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano, y puede constituir partes de un homo o heterociclo alifático o aromático;
A se selecciona del grupo que consta de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, SO, SO_{2}, C(CH_{3})_{2} y C(CF_{3})_{2};
E y E' se seleccionan por separado del grupo que consta de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre y NR_{n1};
G se selecciona del grupo que consta de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, y NR_{n1}R_{n2}, en el que si G se selecciona de NR_{n1}R_{n2}, G y R_{c} así como G y R_{d} pueden constituir partes de un heterociclo; y
T se selecciona del grupo que consta de un átomo de oxígeno y NR_{n1}.
\newpage
Como se entenderá por referencia a los ejemplos presentados ahora de sensores ópticos de CYP450 de la presente invención, los sensores ópticos preferidos de la presente invención son sensores fluorogénicos de CYP450, en los que Q es la forma éter de un fluoróforo fenóxido. Además, los ejemplos precedentes de Q ponen de relieve el punto de que Q puede ser cualquier estructura química, siempre que Q sea un medio químico para generar una señal óptica alterada por escisión de un enlace C-O. Los expertos en la técnica reconocerán variaciones de las estructuras de Q descritas en la presente invención para lograr esta función. Además, la función de generar una señal óptica alterada por escisión de un enlace C-O se puede lograr liberando un colorante cuando se escinde un enlace C-O, e incluso más preferiblemente, liberando un colorante fenólico fluorescente cuando se escinde un enlace C-O. Preferiblemente, la señal óptica alterada es una señal óptica potenciada.
En el caso en el que Q es una forma éter de un fluoróforo, Y puede actuar como un desactivador. En este caso, la actividad del CYP450 se detecta por un aumento de la fluorescencia de Q, que se debe a la pérdida de desactivación de su fluorescencia por Y. Si la desactivación de la fluorescencia por Y se produce por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, entonces Y se denomina un aceptor. En el caso en el que Q sea una forma éter de un fluoróforo e Y actúe como un desactivador, la unión de Y-L a Q puede ser por sustitución de cualquier hidrógeno en el fluoróforo por Y-L-O-, indicando O un átomo de oxígeno. En este caso Q puede ser cualquier fluoróforo, formándose su forma éter por sustitución de uno o más átomos de hidrógeno del fluoróforo por Y-L-O. Véase la Patente nº: 5.741.657 de Tsien and Zlokarnik (cedida el 21 de Abril, 1998), que se incorpora como referencia en la presente invención.
En los sensores ópticos de CYP450 de la presente invención, Y se selecciona preferiblemente de alquilo C_{1}-C_{8}, alquenilo C_{1}-C_{8}, alquilo C_{2}-C_{8} sustituido, alquenilo C_{2}-C_{8} sustituido, alcoxialquilo, arilo, arilo sustituido, aminoalquilo terciario y cuaternario y grupos guanidinio. Entre los arilos y arilos sustituidos, se prefieren más los grupos bencilo y bencilo sustituido. Más preferiblemente, Y se selecciona de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, octilo y bencilo.
Preferiblemente, L se selecciona del grupo que consta de -(OCR^{2}H)_{p}- y -(O-para-fenilo-CR^{2}H)_{p} en los que R^{2} es un átomo de hidrógeno o metilo, y p es igual a uno o dos. Más preferiblemente R^{2} es un átomo de hidrógeno y p es igual a uno.
Preferiblemente, Q es un fluoróforo. Más preferiblemente, Q se selecciona del grupo que consta de 7-hidroxicumarina, resorufina, fluoresceína y otros fluoróforos fenóxido. Sin embargo, Q puede ser un cromóforo, siempre que presente propiedades ópticas en sus forma hidroxi o hidroxilato, por ejemplo, después de interaccionar con una enzima CYP450 activa, que difieran de su forma éter, por ejemplo en su estado sin reaccionar. Más generalmente, Q es un resto químico que presenta propiedades ópticas en su forma de hidroxi libre o hidroxilato, generalmente fenóxido, que son diferentes de las propiedades ópticas que presenta en su forma éter. También se pueden encontrar estructuras de Q adecuadas, usadas en la presente invención, en la patente de EE.UU. nº 5.741.657, que se incorpora como referencia en la presente invención.
Los compuestos sensores ópticos de CYP450 de la presente invención se pueden usar para determinar las actividades del CYP450 por una variedad de señales ópticas, incluyendo por ejemplo, en el contexto de (a) formación de fenoles cromógenos o fluorogénicos o luminiscentes catalizada por CYP450, (b) formación de precipitados cromógenos o fluorogénicos catalizada por CYP450, (c) generación de luz catalizada por CYP450 de la conversión de un sustrato dioxetano fenólico, (d) liberación de un salicilato u otro ligando fenólico catalizada por CYP450, detectable por la formación de quelato con metal pesado para dar un producto fluorescente, fosforescente o electroquimioluminiscente, y (e) liberación catalizada por CYP450 de un sensibilizador para generar luz por peróxido/luminol, y (f) liberación catalizada por CYP450 de un sustrato adecuado para la detección secundaria de enzimas (por ejemplo, la liberación de una luciferina, que se puede detectar con una luciferasa).
Tal como se usa en la presente invención, las expresiones "halógeno" y "átomo de halógeno" se refieren a cualquiera de los átomos radioestables de la columna 17 de la Tabla Periódica de los Elementos, es decir, flúor, cloro, bromo o yodo, siendo más preferidos flúor y cloro.
Tal como se usa en la presente invención, el término "alquilo" significa cualquier hidrocarburo saturado no ramificado, ramificado o cíclico, prefiriéndose hidrocarburos C_{1}-C_{8} no ramificados, saturados y no sustituidos, y siendo más preferidos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo y n-octilo.
La expresión "alquilo sustituido" significa cualquier hidrocarburo saturado sustituido, no ramificado, ramificado o cíclico, sustituido con uno o más grupos funcionales. Los grupos funcionales se seleccionan del grupo que consta de un átomo de halógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro, -SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, 
\hbox{-CO _{2} R _{o} ,}
-SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}
R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano. Cuando se usa en el contexto en el que se definen Y y R^{2}, la expresión "alquilo sustituido" significa cualquier hidrocarburo saturado, sustituido, ramificado o no ramificado, siempre que no haya sustitución de heteroátomo en el carbono \alpha.
El término "alquenilo" significa cualquier hidrocarburo insaturado, sustituido o no sustituido, no ramificado, ramificado o cíclico, prefiriéndose C_{1}-C_{8} no ramificado, monoinsaturado y diinsaturado. La expresión "alquenilo sustituido" significa cualquier hidrocarburo insaturado sustituido, no ramificado o ramificado, sustituido con uno o más grupos funcionales. Los grupos funcionales se seleccionan del grupo que consta de un átomo de halógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro, -SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c},
-C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}
R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S
(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano, y puede constituir partes de un homo o heterociclo alifático. Cuando se usa en el contexto en el que se definen Y y R^{2}, la expresión "alquenilo sustituido" significa cualquier hidrocarburo insaturado, sustituido, ramificado o no ramificado, siempre que no haya doble enlace carbono-carbono, ni sustitución de heteroátomo en el carbono \alpha.
Las expresiones "arilo", "arilo sustituido", "heteroarilo", y "heteroarilo sustituido" se refieren a anillos hidrocarbonados aromáticos, que preferiblemente tienen cinco o seis átomos que comprenden el anillo. La expresión "arilo sustituido" incluye arilos mono y polisustituidos, sustituidos con grupos funcionales seleccionados del grupo de un átomo de halógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro, azido, -SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -N=N-R_{n1}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, y pueden constituir partes de un homo o heterociclo alifático o aromático. "Heteroarilo" y "heteroarilo sustituido" se refieren a anillos hidrocarbonados aromáticos en los que hay al menos un heteroátomo, por ejemplo, átomo de oxígeno, azufre o nitrógeno, en el anillo junto con al menos un átomo de carbono.
Las expresiones fenilo orto sustituido, fenilo meta sustituido, y fenilo para sustituido, se refieren a un fenilo que es parte del conector que conecta Y con Q, en el que orto, meta y para se refieren a las posiciones de los carbonos en el anillo de fenilo que sirven de unión para Y y Q. Orto sustituido se refiere a la unión de Y y Q por carbonos adyacentes en el anillo de fenilo, meta sustituido se refiere a la unión de Y y Q por carbonos separados por un carbono en el anillo de fenilo, y para sustituido se refiere a la unión de Y y Q en el anillo de fenilo por carbonos que están separados por dos carbonos en el anillo de fenilo. Cuando se usa para definir sustitución adicional del anillo de fenilo en el conector oxifenilmetilo, el término "sustituido" se refiere a la sustitución de los hidrógenos del resto de los carbonos no implicados en la unión de Y y Q en el anillo de fenilo. El término "fenilo sustituido" incluye fenilos mono y polisustituidos, sustituidos con grupos funcionales. Los grupos funcionales se seleccionan del grupo que consta de un átomo de halógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, azido, nitro,
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c},
-CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, y pueden constituir partes de un homo o heterociclo alifático o aromático.
La expresión "sustrato fluorogénico del CYP450" en general se refiere a cualquier compuesto que, cuando interacciona con una enzima CYP450, presenta propiedades de fluorescencia superiores que las que presentaba el compuesto antes de interaccionar con la enzima CYP450. Tal como se usa en la presente invención, las expresiones "sonda óptica" y "sensor óptico", son sinónimos, refiriéndose cada una a un compuesto que se puede usar para ensayar una actividad que cataliza la conversión de la forma éter del compuesto en la forma hidroxi o hidroxilato, normalmente fenóxido, del compuesto, en virtud del hecho de que cada uno contiene un resto químico que presenta propiedades ópticas en su forma hidroxi o hidroxilato, normalmente fenóxido, que son distintas y preferiblemente superiores a las propiedades ópticas que el resto químico presenta en forma de un éter. Las expresiones "sonda óptica de CYP450" y "sensor óptico de CYP450" son sinónimos; cada una es una expresión más amplia que la expresión "sustrato fluorgénico de CYP450"; y se refiere cada una a un compuesto que se puede usar para ensayar la presencia, y especialmente donde puede haber presente un inhibidor de CYP450, la actividad de al menos una enzima CYP450 en virtud del hecho de que cada uno contiene un resto químico que presenta propiedades ópticas en sus formas hidroxi o hidroxilato, normalmente su fenóxido, que son distintas, y preferiblemente superiores, a las propiedades ópticas que el resto químico presenta en forma de un éter. En virtud del hecho de que al menos una enzima CYP450 catalizará la conversión de la forma éter en la forma hidroxi o hidroxilato, normalmente fenóxido, estas sondas o sensores ópticos se pueden usar para ensayar la presencia y actividad de al menos una enzima CYP450.
La expresión "compuesto reactivo" se refiere a los compuestos de la invención, descritos en la presente invención, especialmente a los compuestos de estructura general Y-L-Q. La expresión "compuesto candidato" es una expresión más amplia que los términos "fármaco candidato" y "modulador candidato", tal como se usan dichos términos en la presente invención, y se refieren a cualquier compuesto, cualquiera que sea su origen, adecuado para ser seleccionado por su actividad como un sustrato o inhibidor de una enzima CYP450 de acuerdo con los métodos de la presente invención.
En la presente invención, se prefieren colorantes fluorescentes de longitud de onda larga frente a colorantes que se excitan en el UV, pero son útiles como Q todos los colorantes que se excitan en el UV o IR, en los compuestos sensores ópticos y métodos de la invención.
Muchas bibliotecas de compuestos para seleccionar, a menudo contienen compuestos fluorescentes. Típicamente los compuestos fluorescentes en las bibliotecas tienen absorbancias en el UV o en la parte visible de longitud de onda corta del espectro. Por lo tanto, para muchos ensayos fluorescentes, las moléculas indicadoras de longitud de onda más larga, normalmente dan como resultado ensayos que tienen menos señal de fondo y menos interferencia. Además, los compuestos de la presente invención preferiblemente tienen mejor solubilidad tanto en agua como en acetonitrilo comparado con los sustratos de CYP450 más estrechamente relacionados disponibles actualmente. La solubilidad acuosa es importante, puesto que son necesarias concentraciones del sustrato 1-20 \muM para conducir a una señal de fluorescencia fuerte en el ensayo. Una buena solubilidad en acetonitrilo (1-10 mM) permite el suministro de las moléculas de sustrato hidrófobas en el medio de ensayo acuoso en pequeños volúmenes. El acetonitrilo es un disolvente preferido, ya que no inhibe el CYP450 en concentraciones de hasta 2%. Otros disolventes, tales como DMSO y etanol, usados típicamente para suministrar moléculas hidrófobas en el medio de ensayo acuoso, inhiben la actividad de la mayoría de las enzimas CYP450 en concentraciones menores, y por lo tanto no son el suministro de sustrato preferido. Sin embargo, se sabe que el CYP450 y compuestos relacionados toleran el DMSO en concentraciones de hasta 0,5%, permitiendo el suministro de los compuestos de ensayo al medio de ensayo en este disolvente.
Con referencia a la siguiente estructura, se ha demostrado que la introducción de un espaciador oximetilo
(R^{2} = H) entre el resto R^{1} y el colorante fenólico de sensores fluorogénicos de CYP450 actualmente disponibles, tiende a aumentar la eficacia (k_{cat}/K_{m}) de recuperación por muchas enzimas CYP450 y compuestos relacionados. Los R^{1} de los sensores fluorogénicos de CYP450 actualmente disponibles son alquilo o metilo sustituido, siendo el sustituyente un grupo arilo o esteroide, véase la patente de EE.UU. 5.110.725. Una sonda óptica de CYP450 de la presente invención, mostrada en la siguiente estructura, ilustra esta "inserción" para proporcionar los compuestos sensores ópticos de CYP450 de la presente invención.
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Esta mejor recuperación, y mejores propiedades ópticas, se han demostrado para una variedad de sustratos estructuralmente distintos. Además, las solubilidades de los sensores de la invención en acetonitrilo, así como en agua, son excelentes, superando una de las limitaciones antes mencionadas de los sustratos fluorogénicos de CYP450 actualmente disponibles. De acuerdo con esto, la estructura anterior ilustra compuestos sensores ópticos de CYP450 de la presente invención, en la que R^{1} es una estructura como se ha definido en la presente invención para Y. Por lo tanto, R^{1} en la estructura anterior de los compuestos sensores de CYP450 de la presente invención se selecciona de un grupo que consta de todos los Y definidos en la presente invención. Sin embargo, los grupos correspondientes a R^{1} que se encuentran en los sustratos éter-fenol de CYP450 actualmente disponibles en el comercio, son un subconjunto de Y como se ha definido en la presente invención; los compuestos que tienen el conector de la presente invención y usan grupos R^{1} que se encuentran en los compuestos sustratos éter-fenol de CYP450 actualmente disponibles en el comercio que carecen del conector de la presente invención, presentan mejores propiedades físicas y ópticas con respecto a los sustratos éter-fenol de CYP450 actualmente disponibles en el comercio.
R^{2} en la estructura anterior de compuestos sensores de CYP450 de la presente invención se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, grupos alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, tal como se han definido dichas expresiones en la presente invención.
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Además, se ha demostrado que la introducción de un espaciador oxifenilmetilo (R^{2} = H) entre el resto R^{1} y el colorante fenólico de sensores fluorogénicos de CYP450 actualmente disponibles, también tiende a aumentar la eficacia (k_{cat}/K_{m}) de recuperación por las enzimas CYP450 y compuestos relacionados.
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De acuerdo con esto, la estructura anterior ilustra compuestos sensores ópticos de CYP450 de la presente invención que contienen oxifenilmetilo, en la que R^{1} es una estructura como se ha definido en la presente invención para Y. Por lo tanto, R^{1} en la estructura anterior de los compuestos sensores de CYP450 de la presente invención, se selecciona de un grupo que consta de todos los Y como se ha definido en la presente invención. Sin embargo, los grupos correspondientes a R^{1} que se encuentran en los sustratos éter-fenol de CYP450 actualmente disponibles en el comercio, son un subconjunto de Y como se ha definido en la presente invención; los compuestos que tienen el conector de la presente invención y usan grupos que corresponden a los R^{1} que se encuentran en los compuestos sustratos éter-fenol de CYP450 actualmente disponibles en el comercio que carecen del espaciador de la presente invención, presentan mejores propiedades físicas y ópticas con respecto a los que sustratos éter-fenol de CYP450 actualmente disponibles en el comercio.
R^{2} en la estructura anterior de los compuestos sensores de CYP450 de la presente invención se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, tal como se han definido dichas expresiones en la presente invención.
De acuerdo con la presente invención, la Fig. 2 ilustra el Esquema de reacción 2, que muestra una estructura genérica del sustrato/sensor óptico de CYP450 de la presente invención, y la reacción de hidroxilación catalizada por el CYP450. La Fig. 3 ilustra el Esquema de Reacción 3, que compara la reacción de hidroxilación que puede conducir a un colorante fenólico libre de un sensor óptico de CYP450 conocido (parte superior) y un compuesto sensor óptico de CYP450 de la presente invención (parte inferior).
Como se describe en la presente invención, los fármacos candidatos se pueden seleccionar y evaluar por sus actividades como sustratos de, o inhibidores de una enzima CYP450, usando los sensores ópticos de CYP450 de la presente invención. Se puede determinar si un fármaco candidato es un inhibidor o un sustrato de una enzima citocromo P450 poniendo en contacto una enzima citocromo P450 con el fármaco candidato, en condiciones adecuadas para que interaccionen entre ellos, proporcionando al menos un sensor óptico de la enzima citocromo P450, en condiciones que, en ausencia de un inhibidor o sustrato de la enzima citocromo P450, serían adecuadas para la interacción entre el sensor óptico de la enzima citocromo P450 y la enzima citocromo P450, y detectando la presencia de señal de un colorante fenólico libre, en el que el colorante fenólico, en ausencia de un inhibidor de la enzima citocromo P450, sería el producto de reacción entre la enzima citocromo P450 y el sensor óptico de la enzima citocromo P450. Dichos sustratos e inhibidores de CYP450 eficaces, considerados apropiados por los expertos en la técnica, se pueden sacar de una biblioteca de selección en la que no se desean dichos sustratos e inhibidores de CYP450 en el resto de la selección de un fármaco candidato.
Para distinguir entre un sustrato y un inhibidor de las enzimas citocromo P450, típicamente, el compuesto candidato se incuba con al menos una enzima citocromo P450 en condiciones que permitan el metabolismo del compuesto candidato antes de proporcionar el sensor óptico de la enzima citocromo P450 en condiciones que, en ausencia de un inhibidor o sustrato de la enzima citocromo P450, serían adecuadas para la interacción entre el sensor óptico de la enzima citocromo P450 y la enzima citocromo P450. La señal óptica resultante se compara con la obtenida poniendo en contacto una enzima citocromo P450 con el fármaco candidato, en condiciones adecuadas para la interacción entre ellos, proporcionando al menos un sensor óptico de la enzima citocromo P450, en condiciones que, en ausencia de un inhibidor de la enzima citocromo P450, serían adecuadas para la interacción entre el sensor óptico de la enzima citocromo P450 y la enzima citocromo P450. El metabolismo del fármaco candidato por una enzima citocromo P450 reduce su concentración en el medio de ensayo y puede conducir a una pérdida aparente de la actividad inhibidora del citocromo P450 comparado con condiciones sin metabolismo del compuesto, lo cual indicarían que era un sustrato para la enzima. Un compuesto inhibidor que no fuera metabolizado mostraría igual potencia, sin tener en cuenta el tiempo de adición del sustrato óptico de la enzima citocromo P450.
Los siguientes procedimientos se pueden usar para la posterior selección, formulación y administración de los fármacos candidatos de la presente invención. Estos fármacos están dentro de la presente invención en la medida en que no se han identificado todavía como fármacos o moduladores candidatos, y en la medida en que son identificados como fármacos o moduladores candidatos mediante el uso de sensores ópticos de la presente invención.
En algunos casos, se puede determinar que un fármaco candidato es un sustrato de la enzima citocromo P450 de al menos una enzima citocromo P450, seleccionando un sensor óptico de la enzima citocromo P450 que es un derivado del fármaco candidato; poniendo en contacto una enzima citocromo P450 con el sensor óptico de la enzima citocromo P450 en condiciones adecuadas para la interacción entre ellos, y detectando la ausencia de señal de un colorante fenólico libre, que sería el producto de reacción entre la enzima citocromo P450 y el sensor de la enzima citocromo P450.
Biodisponibilidad y toxicología de los moduladores candidatos
Una vez identificados, se puede evaluar además la biodisponibilidad y efectos toxicológicos de los fármacos o moduladores candidatos usando métodos conocidos. Véase, Lu, Basic Toxicology, Fundamentals, Target Organs, and Risk Assessment, Hemisphere Publishing Corp., Washington (1985); Patente de EE.UU. nº: 5.196.313 de Culbreth (expedida el 23 de Marzo, 1993), patente de EE.UU. nº 5.567.952 de Benet (expedida el 22 de Octubre, 1996). Por ejemplo, se puede establecer la toxicología de un modulador candidato determinando la toxicidad in vitro frente a una línea celular, tal como una línea celular de mamífero, es decir, de ser humano. Los moduladores candidatos se pueden tratar, por ejemplo con extractos de tejidos, tal como preparaciones de hígado, tal como preparaciones microsomales, para determinar el aumento o disminución de las propiedades toxicológicas de los productos químicos después de haber sido metabolizados por un organismo entero. Los resultados de estos tipos de estudios a menudo predicen las propiedades toxicológicas de productos químicos en animales, tales como mamíferos, incluyendo seres humanos.
Dichos métodos de biodisponibilidad y toxicológicos se pueden llevar a cabo como parte o complementarios a los sistemas y métodos de selección de la presente invención. Dichos métodos incluyen poner en contacto una muestra que tiene una diana con al menos un agente productor de fotones, al menos un agente reductor de fotones, y un producto químico de ensayo. Se detecta una señal óptica de dicho agente productor de fotones, en el que dicha señal óptica está relacionada con una actividad toxicológica. La biodisponibilidad es cualquiera conocida en la técnica, y se puede detectar, por ejemplo, midiendo los genes indicadores que son activados durante los criterios de biodisponibilidad. La actividad toxicológica es cualquiera conocida en la técnica, tal como la apoptosis, lisis celular, crenación, muerte celular y similares. La actividad toxicológica se puede medir usando genes indicadores que son activados durante la actividad toxicológica o por lisis celular (véase el documento WO 98/13353, publicado el 2/4/98). Los genes indicadores preferidos producen un producto de traducción fluorescente o luminiscente (tal como, por ejemplo, una proteína verde fluorescente (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.625.048 de Tsien et al, expedida el 29/4/98; patente de EE.UU. nº 5.777.079 de Tsien et al., expedida el 7/7/98; documento WO 96/23810 de Tsien, publicado el 8/8/96; documento WO 97/28261, publicado el 8/7/97; documento PCT/US97/12410, presentado el 16/7/97; documento PCT/US97/14595, presentado el 15/8/97)), o un producto de traducción que puede producir un producto fluorescente o luminiscente (tal como, por ejemplo, beta-lactamasa, por ejemplo, Patente de EE.UU. nº 5.741.657 de Tsien, expedida el 21/4/98, y documento WO 96/30540, publicado el 3/10/96), tal como un producto de degradación enzimática. La lisis celular se puede detectar en la presente invención como una reducción de la señal de fluorescencia en al menos un agente productor de fotones dentro de una célula en presencia de al menos un agente reductor de fotones. Dichas determinaciones toxicológicas se pueden hacer usando células procariotas o eucariotas, opcionalmente usando perfiles toxicológicos, como se describe en el documento PCT/US94/00583, presentado el 21/1/94, patente Alemana nº 69406772.5-08, expedida el 25/11/97; documento EPC 0680517, expedido el 12/11/94; patente de EE.UU. nº 5.589.337, expedida el 31/12/96; EPO 651825, expedida el 14/1/98, y patente de EE.UU. nº 5.585.232, expedida el 17/12/96.
Alternativamente, o además de estos estudios in vitro, se puede determinar la biodisponibilidad y propiedades toxicológicas de un modulador candidato en un modelo animal, tal como en ratones, ratas, conejos, o monos, usando métodos establecidos. Véase, Lu. véase antes (1985); y Creasey. Drug Disposition in Humans, The Basis of Clinical Pharmacology, Oxford University Press, Oxford (1979), Osweiler, Toxicology, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1995), Yang, Toxicology of Chemical Mixtures, Case Studies, Mechanisms, and Novel Approaches, Academic Press, Inc.. San Diego, CA (1994), Burrell et al., Toxicology of the Immune System: A Human Approach. Van Nostrand Reinhld. Co. (1997), Niesink el al, Toxicology, Principles and Applications. CRC Press, Boca Raton. FL (1996). Dependiendo de la toxicidad, órgano diana, tejido, locus, y presunto mecanismo del modulador candidato, el experto en la técnica no tendrá problemas para determinar las dosis adecuadas, valores de DL_{50}, vías de administración y regímenes que serían adecuados para determinar las propiedades toxicológicas del modulador candidato. Además de los modelos animales, se pueden llevar a cabo ensayos clínicos con seres humanos siguiendo los procedimientos establecidos, tales como los descritos por la administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (USFDA) o equivalentes de otros gobiernos. Estos estudios de toxicidad proporcionan la base para determinar los efectos indeseados de un modulador candidato in vivo.
Eficacia de los moduladores candidatos
La eficacia de un modulador candidato se puede establecer usando varios métodos reconocidos en la técnica, tales como métodos in vitro, modelos animales, o ensayos clínicos con seres humanos, véase, Creasey (véase antes) (1979). Existen modelos in vitro reconocidos para varias enfermedades o estados. Por ejemplo, la capacidad de un producto químico para prolongar la duración de la vida de células infectadas por el VIH in vitro, se reconoce como un modelo aceptable para identificar productos químicos que se espera que sean eficaces para tratar la infección por VIH o SIDA, véase, Daluge et al., Antimicro. Agents Chemother. 41: 1082-1093 (1995). Además, la capacidad de la ciclosporina a (CsA) para prevenir la proliferación de células T in vitro, se ha establecido como un modelo aceptable para identificar productos químicos que se espera que sean eficaces como inmunosupresores, véase, Suthanthiran et al., véase antes (1996). Para casi cada clase de terapéutica, enfermedad o estado, hay disponible un modelo in vitro o modelo animal. Por ejemplo, existen dichos modelos para trastornos gastrointestinales, cánceres, cardiología, neurobiología, e inmunología. Además, estos modelos in vitro pueden usar extractos de tejidos, tales como preparaciones de hígado, tales como preparaciones microsomales, para proporcionar una indicación fiable de los efectos del metabolismo en un modulador candidato. Igualmente, se pueden usar modelos animales aceptables para establecer la eficacia de productos químicos para tratar diferentes enfermedades o estados. Por ejemplo, la rodilla de conejo es un modelo aceptado para ensayar la eficacia de productos químicos para tratar la artritis. Véase Shaw and Lacy, J. Bone Joint Surg. (Br) 55: 197-205 (1973). La hidrocortisona, que está aprobada para usar en seres humanos para tratar la artritis, es eficaz en este modelo, lo cual confirma la validez de este modelo. Véase. Mc Donough, Phys. Ther. 62: 835-839 (1982). Cuando se elige un modelo adecuado para determinar la eficacia de un modulador candidato, el experto en la técnica se puede guiar por el estado de la técnica para elegir un modelo, dosis, y vía de administración, régimen, y punto final adecuados, y como tal no tendrá muchos problemas.
Además de los modelos animales, se pueden usar ensayos clínicos con seres humanos para determinar la eficacia de un modulador candidato en seres humanos. La USFDA, o agencias gubernamentales equivalentes, han establecido procedimientos para dichos estudios, véase, por ejemplo, http://www/fda.gov.
Selectividad de los moduladores candidatos
Los métodos in vitro e in vivo descritos antes como parte de la presente invención también establecen la selectividad de un fármaco o modulador candidato. Se reconoce que los productos químicos pueden modular una gran variedad de procesos biológicos o ser selectivos. Se pueden usar paneles de células basados en la presente invención, para determinar la especificidad del modulador candidato. Por ejemplo, la selectividad es evidente en el campo de la quimioterapia, donde obviamente se desea la selectividad de un producto químico para que sea tóxico frente a células cancerosas, pero no frente a células no cancerosas. Se prefieren los moduladores selectivos porque tienen menos efectos secundarios en el cuadro clínico. La selectividad de un modulador candidato se puede establecer in vitro ensayando la toxicidad y efectos de un modulador candidato en una pluralidad de líneas celulares que presentan una variedad de caminos y sensibilidades celulares. Los datos obtenidos de estos estudios de toxicidad in vitro se pueden extender a estudios de modelos animales, incluyendo ensayos clínicos con seres humanos, para determinar la toxicidad, eficacia y selectividad del modulador candidato.
La identificación de productos químicos, moduladores o composiciones terapéuticas
La invención incluye composiciones, tal como nuevos productos químicos y composiciones terapéuticas, en los que se ha identificado por al menos un método de la presente invención, que tienen actividad como un sustrato o inhibidor del CYP450 mediante el uso de métodos, sistemas o componentes descritos aquí. Nuevos productos químicos, como se usa en la presente invención, no incluyen productos químicos que se sabe ya públicamente en la técnica que son fármacos o moduladores útiles en la fecha de presentación de esta solicitud. Típicamente, se identificará que un producto químico tiene actividad para el CYP450 usando la presente invención, y después se pondrá de manifiesto su estructura a partir de una base de datos de estructuras químicas o se determinará usando técnicas analíticas tales como espectroscopía de masas.
Una realización de la invención es un producto químico con actividad útil, que comprende un producto químico identificado por el método descrito en la presente invención. Dichas composiciones incluyen pequeñas moléculas orgánicas, ácidos nucleicos, péptidos u otras moléculas fácilmente sintetizadas por técnicas disponibles y desarrolladas en el futuro. Por ejemplo, los siguientes compuestos combinatorios son adecuados para seleccionar como fármacos candidatos: peptoides (publicación PCT nº WO 91/19735, 26 de Diciembre, 1991), péptidos codificados (publicación PCT nº WO 93/20242, 14 de Oct. 1993), biooligómeros aleatorios (publicación PCT nº WO 92/00091, 9 de Enero, 1992), benzodiazepinas (Patente de EE.UU. nº 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs DeWitt. S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al.. J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con andamiaje de Beta-D-Glucosa (Hirschmann. R. et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas de análogos de bibliotecas de pequeños compuestos (Chen. C. et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho, C.Y. et al., Science 261: 1303 (1993)), y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell. D.A. et al., J. Org. Chem. 59: 658 (1994)). Véase, en general, Gordon, E. M. et al., J. Med Chem. 37: 1385 (1994). Los contenidos de todas las publicaciones mencionadas se incorporan en la presente invención como referencia.
La presente invención también abarca las composiciones, identificadas por los métodos de la presente invención, comprendiendo una composición farmacéutica un vehículo farmacéuticamente aceptable preparado para almacenamiento y posterior administración, que tiene una cantidad farmacéuticamente eficaz de los productos antes descritos en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico son conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (ABR. Gennaro edit. 1985. Se pueden proporcionar conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes de sabor en la composición farmacéutica. Por ejemplo, se puede añadir benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, como conservantes. Además, se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.
Estas composiciones se pueden formular y usar como comprimidos, cápsulas o elixires para administración oral; supositorios para administración rectal; solución estériles, suspensiones para administración inyectable; y similares. Las composiciones inyectables se pueden preparar de forma convencional, como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de inyección, o como emulsiones. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, manitol, lactosa, lecitina, albúmina, glutamato sódico, hidrocloruro de cisteína, y similares. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas inyectables pueden contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes, agentes de tamponamiento de pH, y similares. Si se desea, se pueden usar preparaciones que potencian la absorción (por ejemplo, liposomas).
La cantidad farmacéutica eficaz de la composición como una dosis necesaria, dependerá de la vía de administración, el tipo de animal que se va a tratar, y las características físicas del animal específico que se considera. La dosis se puede diseñar para lograr un efecto deseado, pero dependerá de factores tales como peso, dieta, medicación concurrente y otros factores que reconocerán los expertos en la técnica médica.
Cuando se practican los métodos de la invención, los productos o composiciones se pueden usar solos o combinados entre sí, o una combinación con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. Estos productos se pueden usar in vivo, normalmente en un mamífero, preferiblemente en un ser humano, o in vitro. Cuando se usan in vivo, los productos o composiciones se pueden administrar a un mamífero en una variedad de formas, incluyendo vía parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, colónica, rectal, nasal o intraperitoneal, usando una variedad de formas de dosificación. Dichos métodos también se pueden aplicar para ensayar la actividad química in vivo.
Como verá enseguida claramente un experto en la técnica, la dosificación in vivo útil que se va a administrar y el modo particular de administración variará dependiendo de la edad, peso y especie mamífera que se va a tratar, los compuestos particulares usados, y el uso específico para el que se usan estos compuestos. La determinación de niveles de dosificación eficaces, que son los niveles de dosificación necesarios para lograr el resultado deseado, puede ser llevada a cabo por un experto en la técnica usando métodos farmacológicos rutinarios. Típicamente, las aplicaciones clínicas de los productos en seres humanos se empiezan con niveles de dosificación más bajos, aumentándose el nivel de dosificación hasta que se logre el efecto deseado. Alternativamente, los estudios in vitro aceptables se pueden usar para establecer las dosis útiles y vías de administración de las composiciones identificadas por los métodos de la presente invención, usando métodos farmacológicamente establecidos.
En estudios con animales no humanos, las aplicaciones de los potenciales productos se empiezan con niveles de dosificación más altos, diminuyéndose la dosis hasta que ya no se logra el efecto deseado o desaparecen los efectos adversos. La dosificación para los productos de la presente invención puede variar ampliamente dependiendo de los efectos deseados y la indicación terapéutica. Típicamente, las dosificaciones pueden estar entre aproximadamente 10 microg/kg y 100 mg/kg de peso caporal, preferiblemente entre aproximadamente 100 microg/kg y 10 mg/kg de peso corporal. La administración preferiblemente es por vía oral en una base diaria.
La formulación exacta, vía de administración y dosificación pueden ser elegidos por el médico individual en vista del estado del paciente. Véase por ejemplo, Fingl et al., en The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975. Hay que indicar que el médico que atiende sabrá como y cuando terminar, interrumpir, o ajustar la administración debido a toxicidad, o a disfunciones de órganos. A la inversa, el médico que atiende también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo toxicidad). La magnitud de una dosis administrada para manejar el trastorno que interese, variará con la gravedad del estado que se va a tratar y con la vía de administración. La gravedad del estado se puede evaluar, por ejemplo, en parte por métodos patrón de evaluación de pronóstico. Además, la dosis y quizás la frecuencia de la dosis, también variarán de acuerdo con la edad, el peso corporal, y la respuesta del paciente individual. Se puede usar un programa comparable con el discutido antes en medicina veterinaria.
Dependiendo de los estados específicos que se van a tratar, dichos agentes se pueden formular y administrar sistémicamente o localmente. Se pueden encontrar una variedad de técnicas de formulación y administración en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton PA (1990). Entre las vías de administración adecuadas se pueden incluir la administración por vía oral, rectal, transdérmica, vaginal, transmucosa, o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales, o intraoculares.
Para inyección, los agentes de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o tampón salino fisiológico. Para dicha administración transmucosa, se usan en la formulación penetrantes adecuados para penetrar la barrera. Dichos penetrantes en general son conocidos en la técnica. El uso de vehículos farmacéuticamente aceptables para formular los compuestos descritos en la presente invención para la práctica de la invención en dosificaciones adecuadas para la administración sistémica, está dentro del alcance de la invención. Con la elección adecuada del vehículo y la práctica de fabricación adecuada, las composiciones de la presente invención, en particular las formuladas como soluciones, se pueden administrar por vía parenteral, tal como por inyección intravenosa. Los compuestos se pueden formular fácilmente usando vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica, en dosificaciones adecuadas para administración oral. Dichos vehículos permiten que los compuestos de la invención se formulen en comprimidos, pastillas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, y similares para ingestión oral por un paciente que se trate.
Los agentes que se pretenden administrar intracelularmente se pueden administrar usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dichos agentes se pueden encapsular en liposomas, y después administrar como se ha descrito antes. Todas las moléculas presentes en una solución acuosa en el momento de la formación del liposoma son incorporadas al interior acuoso. El contenido del liposoma está protegido del microentorno exterior y debido a que los liposomas se funden con las membranas celulares, se liberan eficazmente en el citoplasma celular. Adicionalmente, debido a su hidrofobicidad, se pueden administrar por vía intracelular directamente pequeñas moléculas orgánicas.
Entre las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar como se ha descrito en la presente invención, se incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. La determinación de las cantidades eficaces, depende de la competencia del experto en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente invención. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Las preparaciones formuladas para administración por vía oral pueden estar en forma de comprimidos, grageas, cápsulas o soluciones. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar de una forma que es conocida, por sí misma, por ejemplo, mediante procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, formación de gragea, levitación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones aceitosas para inyección. Entre los disolventes o vehículos lipófilos adecuados se incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil-celulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes adecuados o agentes que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir preparar soluciones altamente concentradas.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener combinando los compuestos activos con excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir agentes auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metil-celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetil-celulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una de sus sales, tales como alginato sódico. Los núcleos de las grageas se proporcionan con revestimientos adecuados. Para este propósito, se pueden usar soluciones de azúcar concentradas, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de barniz, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o revestimientos de las grageas para identificar o caracterizar diferentes combinaciones de las dosis de compuesto activo. Para este propósito, se pueden usar soluciones concentradas de azúcar, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones barniz, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o revestimientos de las grageas para identificar o caracterizar diferentes combinaciones de las dosis del compuesto activo. Dichas formulaciones se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, patentes de EE.UU. nº 5.733.888 (composiciones inyectables); 5.762.181 (compuestos poco solubles en agua); 5.707.641 (proteínas o péptidos terapéuticamente activos); 5.667.809 (agentes lipófilos); 5.576.012 (agentes polímeros solubilizantes); 5.707.615 (formulaciones antivíricas); 5.683.676 (medicamentos en partículas); 5.654.286 (formulaciones tópicas); 5.688.529 (suspensiones orales); 5.445.829 (formulaciones de liberación prolongada); 5.653.987 (formulaciones líquidas); 5.641.515 (formulaciones de liberación controlada) y 5.601.845 (formulaciones de esferoides)).
Los siguientes ejemplos son para describir los modos preferidos de los autores de la invención de llevar a cabo la invención, es decir, de preparar, caracterizar, y usar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica percibirán sin duda las variaciones de los detalles de los métodos particulares usados y de las composiciones químicas precisas usadas.
Ejemplo 1 Síntesis de sustratos fluorogénicos para el CYP450 Preparación de benciloximetilresorufina (BOMR)
Para todas las síntesis de los compuestos de la invención, como se describen aquí y en los siguientes Ejemplos, se siguieron los siguientes protocolos (o se siguen respecto al Ejemplo 7), salvo que se indique otra cosa. Las condiciones de reacción se llevaron (o se llevan) a cabo en atmósfera de nitrógeno. Todos los disolventes usados se secaron sobre tamices moleculares de 3 \ring{A}. Todos los productos químicos y reactivos se usaron como se adquirieron sin purificación adicional salvo que se indique. El bencil-clorometil-éter se adquirió en Fluka Chemie AG. La resorufina se adquirió en Aldrich Chemical Co. La 7-hidroxi-3-trifluorometilcumarina y 7-hidroxi-3-cianocumarina se adquirieron en Molecular Probes, y todos se usaron tal como se recibieron. Véase también, Wolfbeis, Otto, Z. Naturforsch (1977) 32a, 1065-1067. La cromatografía en columna se realizó con gel de sílice J.T. Baker (tamaño de partículas = 0,04-0,061 mm) usando combinaciones de disolventes determinadas por análisis inicial por TLC con placas de gel de sílice prerrevestidas Merk Kieselgel 60 F_{254}. Los espectros de ^{1}H RMN se registraron a 500 MHz, se analizaron por NuMega Resonance Labs, Inc. Los espectros de masas se midieron por ESI con un aparato PE-SCIEX API 150EX.
La benciloximetil-resorufina (BOMR) se preparó como sigue: Se agitó vigorosamente una suspensión de la sal sódica de resorufina (235 mg, 1 mmol) y K_{2}CO_{3} (248 mg, 1,5 mmoles) en DMF (15 ml) a 0-5ºC durante 25 min. Después se añadió rápidamente a la mezcla de reacción bencil-clorometil-éter (2,32 ml, 10,0 mmoles). La mezcla rojo oscuro se agitó a 0ºC durante 1,5 horas. Después de este tiempo la reacción se convirtió en una solución naranja. La reacción se siguió hasta completarse por TLC (R_{f} = 0,42, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,05, CHCl_{3}). Después la reacción se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con solución saturada de NaHCO_{3} (30 ml). La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30 ml). Después la bicapa de éter y de resorufina se combinaron y se filtraron a través de celita. Después el filtrado se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro, y se evaporó a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio la benciloximetiloxiresorufina en forma de un sólido naranja
(106 mg, 32%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 4,74 (s, 2H), 5,39 (s, 2H), 6,32 (s, 1H), 6,85-6,83 (m, 1H), 7,06-7,09 (m, 2H), 7,30-7,37 (m, 5H), 7,42 (d, 1H), 7,72 (d, 1H).
Ejemplo 2 Preparación de 7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina (BOMCC)
La 7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina (BOMCC) se preparó como sigue:
Se agitó vigorosamente una mezcla de 7-hidroxi-3-cianocumarina (187 mg, 1 mmol) y K_{2}CO_{3} (248 mg, 1,5 mmoles) en DMF (15 ml), a 0ºC durante 25 min. Después se añadió rápidamente a la reacción bencil-clorometil-éter
(2,32 ml, 10,0 mmoles). La mezcla amarillo brillante se agitó a 0ºC durante 45 min. Después de este tiempo la reacción se convirtió en una solución incolora. La reacción se siguió hasta completarse por TLC (R_{f} = 0,5, EtOAc:Hex 1:1, y
R_{f} = 0,24, CHCl_{3}). Después la reacción se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con solución saturada de NaHCO_{3}
(30 ml). La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30 ml). Después se combinaron las capas de éter y después se secaron con Na_{2}SO_{4} anhidro y se evaporaron a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio la 7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina pura en forma de un sólido blanco (9,21 mg, 3%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 4,73 (s, 2H), 5,39 (s, 2H), 7,08 (m, 2H), 7,32 (m, 5H), 7,49 (d, 1H), 8,17 (s, 1H).
Ejemplo 3 Preparación de 7-(p-metoxibenciloxi)-4-trifluorometilcumarina (MOBFC)
La 7-(p-metoxibenciloxi)-4-trifluorometilcumarina (MOBFC) se preparó como sigue:
Se agitó vigorosamente una mezcla de 7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina (230 mg, 1 mmol), K_{2}CO_{3} (248 mg, 1,5 mmoles), y KI (1,66 g, 10 mmoles) en DMF (15 ml), a 25ºC durante 25 min. Después se añadió rápidamente a la reacción cloruro de para-metoxibencilo (1,35 ml, 10,0 mmoles). La mezcla amarillo brillante se agitó a 25ºC durante 1 h. Después de este tiempo la reacción se convirtió en una solución incolora. La reacción se siguió hasta completarse por TLC (R_{f} = 0,67, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,3, CHCl_{3}). Después la reacción se recogió en Et_{2}O
(35 ml), y se extrajo con solución saturada de NaHCO_{3} (30 ml). La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O
(30 ml). Después se combinaron las capas de éter y después se secaron con Na_{2}SO_{4} anhidro y se evaporaron a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio la
7-parametoxibenciloxi-4-trifluorometilcumarina en forma de un sólido blanco (280 mg, 80%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 3,83 (s, 3H), 5,08 (s, 2H), 6,62 (s, 1H), 6,94 (m, 4H), 7,39 (m, 2H), 7.62 (m, 1H).
Ejemplo 4 Preparación de Octiloximetilresorufina (OOMR)
La octiloximetilresorufina (OOMR) se preparó como sigue: Se agitó vigorosamente una suspensión de la sal sódica de resorufina (235 mg, 1 mmol) y K_{2}CO_{3} (248 mg, 1,5 mmoles) en DMF (15 ml) a 0-5ºC durante 25 min. Después se añadió rápidamente a la mezcla de reacción bromometil-octil-éter (2,20 ml, 10,0 mmoles). La mezcla se agitó a
0-5ºC durante 1,5 h, y durante este tiempo la mezcla de reacción rojo oscuro se convirtió en una solución naranja. La reacción se continuó agitando a 0-5ºC mientras se seguía por TLC (R_{f} = 0,44, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,05, CHCl_{3}), y se paró en el momento en que se detectó la descomposición del producto. Después la reacción se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con 30 ml de solución saturada de NaHCO_{3}. La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30 ml), después las fracciones de éter se combinaron y se filtraron a través de celita. Después el filtrado se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro, y se evaporó a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio 62 mg de octiloximetilresorufina (OOMR) en forma de un sólido naranja. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 0,83 (t, 3H), 1,21-1,31 (m, 12H), 3,68 (t, 2H), 5,31 (s, 1H), 6,32 (s, 1H), 6,83 (dd, 1H), 7,02-7,06 (m, 2H), 7,42 (d, 1H), 7,72 (d, 1H).
Ejemplo 5 Preparación de 7-metiloximetiloxi-4-trifluorometilcumarina (MOMFC)
La 7-metiloximetiloxi-4-trifluorometilcumarina (MOMFC) se preparó como sigue:
Se agitó vigorosamente una mezcla de 7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina (230 mg, 1 mmol) y K_{2}CO_{3} (248 mg, 1,5 mmoles), en DMF (15 ml), a 0-5ºC durante 25 min. Después se añadió rápidamente a la reacción bromometil-metil-éter (0,97 ml, 10,0 mmoles). La mezcla amarillo brillante se agitó a 0-5ºC durante 45 min, y durante este tiempo la reacción se convirtió en una solución incolora. La reacción se siguió agitando a 0-5ºC mientras se seguía por TLC (R_{f} = 0,54, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,24, CHCl_{3}), y se paró en el momento en el que se detectó la descomposición del producto. Después la reacción se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con 30 ml de solución saturada de NaHCO_{3}. La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30 ml), después las fracciones de éter se combinaron, se secaron con Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtraron y se evaporaron a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio 11 mg de la 7-metiloximetiloxi-4-trifluorometilcumarina (MOMFC) purificada en forma de un sólido blanco. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 3,49 (s, 3H), 5,26 (s, 2H), 6,64 (s, 1H), 7,08-7,02 (m, 2H), 7,64 (d, 1H).
Ejemplo 6 Preparación de para-metoxibencilresorufina (MOBR)
La para-metoxibencilresorufina (MOBR) se preparó como sigue: Se agitó vigorosamente una mezcla de la sal sódica de resorufina (235 mg, 1 mmol) y K_{2}CO_{3} (248 mg, 1,5 mmoles) en DMF (15 ml) a 0ºC durante 25 min. Después se añadió rápidamente a la mezcla de reacción cloruro de para-metoxibencilo (1,35 ml, 10,0 mmoles). La mezcla rojo oscuro se agitó a 25ºC durante 1,5 h. Después de este tiempo la reacción se convirtió en una solución naranja. La reacción se siguió hasta completarse por TLC (R_{f} = 0,32, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,05, CHCl_{3}). Después la reacción se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con solución saturada de NaHCO_{3} (30 ml). La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30 ml). Después la bicapa de éter y resorufina se combinaron y se filtraron a través de celita. Después el filtrado se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro, y se evaporó a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio la para-metoxibencil-resorufina en forma de un sólido naranja (60 mg, 18%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 3,83 (s, 3H), 5,10 (s, 2H), 6,32 (s, 1H), 6,82-6,88 (m, 2H), 6,94 (d, 2H), 6,99-7,01 (dd, 1H), 7,37 (d, 2H), 7,42 (d, 1H), 7,70 (d, 1H).
Ejemplo 7 Preparación de otros sensores ópticos de CYP450 de la invención
Los siguientes esquemas de reacción se usan para sintetizar otros sensores ópticos de CYP450 de la presente invención:
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ DMF\+\cr  Q-H + CH _{2} Br _{2}  \+
------------> \+ Q-CH _{2} -Q\cr 
\+
K _{2} CO _{3} \+\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ DMF\+\cr  Q-H + ClCH _{2} OCH _{2} Cl \+
------------> \+
Q-CH _{2} OCH _{2} -Q\cr  \+
K _{2} CO _{3} \+\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ ZnCl _{2} \+\cr  Q-H + (CH _{2} O) _{n} 
\+ ------------> \+
Q-(CH _{2} O) _{n} CH _{2} -Q\cr  \+ o HCl \+
 \hskip7mm  n = 2, 3, 4, 5,
etc.\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ NaH \+ \+ Q-H\+\cr  R-OH +
ClCH _{2} OCH _{2} Cl \+ ------------> \+ ROCH _{2} OCH _{2} Cl
\+ ------------> \+  ROCH _{2} OCH _{2} -Q\cr 
(exceso) \+ \+ \+
DMF/K _{2} CO _{3} \+\cr}
Ejemplo 8 Cinética de la benciloximetilresorufina (BOMR) frente al CYP 3A4
La aplicación de la presente invención para "modificar" la bencilresorufina (BR) conduce, en una realización de la invención, a un compuesto de la invención, la benciloximetilresorufina (BOMR), la cual tiene la siguiente estructura:
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Cualquiera de los cuatro hidrógenos que se pueden abstraer (indicados como H^{1} y H^{2} en esta representación de la BOMR) que se quite en la etapa de reacción inicial, con referencia al Esquema de reacción 1 de la Figura 1, el producto de hidroxilación se descompondrá espontáneamente al colorante resorufina libre. Además, el grupo benciloxi, unido al carbono que lleva los dos hidrógenos indicados como H^{2}, contribuye con un efecto electrónico inductivo en este carbono, que puede estabilizar el radical formado durante la abstracción de uno de los hidrógenos H^{2} por el citocromo P450. Este nuevo sensor de CYP450 de la invención, BOMR, tiene una serie de ventajas frente a la bencilresorufina como sustrato del CYP 3A4, como se ha demostrado y se ilustra en la Figura 4. Los datos ilustrados en la Figura 4 se adquirieron de acuerdo con el método descrito por Henderson, P.J.F., Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993).
La optimización de las condiciones de ensayo, se llevaron, y preferiblemente se llevan a cabo, por el Diseño de metodologías experimentales validadas estadísticamente, usando el paquete de software comercial "Design-Expert®" producido por Stat-Ease® Inc. Los datos mostrados en las Figuras 4 y 5 se obtuvieron con optimización inicial.
Analizando los datos ilustrados en la Figura 4, se determinó que la velocidad de recuperación por el CYP 3A4 de la BOMR es aproximadamente cinco veces mayor que la velocidad de recuperación por el CYR 3A4 de la BR; la velocidad de recuperación de la BOMR (k_{cat}) era 0,5 s^{-1} (K_{m} de 1,9 \muM), mientras que la velocidad de recuperación de la BR (k_{cat}) era 0,10 min^{-1} (K_{m} = 5,3 \muM). Basándose en las velocidades de recuperación calculadas y los valores de K_{m}, también se determinó que la eficacia enzimática (k_{cat}/K_{m}) del CYP 3A4 frente a la BOMR era 14 veces superior que la eficacia enzimática (k_{cat}/K_{m}) del CYP 3A4 frente a la BR.
Ejemplo 9 Detección de la presencia de inhibidores de CYP450; ensayos de inhibición
Para demostrar la eficacia de la BOMR como un sensor para una subfamilia específica de CYP450 humano, se incubó CYP 3A4 con concentraciones 10 \muM de diferentes inhibidores conocidos y sustratos fármaco, y se usó BOMR para evaluar la actividad residual del CYP450 en un formato de selección típico. Como se muestra en la Figura 5, se llevó a cabo un ensayo de inhibición de CYP 3A4 usando BOMR. Este ensayo se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente y con un volumen de 100 \mul/pocillo. Se preparó tampón de enzima 1,82X y se añadieron 55 \mul a cada pocillo de la placa, para tener concentraciones finales de ensayo de NADP^{+} 1,3 mM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. Los fármacos inhibidores, miconazol, eritromicina, verapamilo, dilitazem, etinilestradiol, tamoxifeno, y los sustratos, digoxina, estrona, estradiol, warfarina, prednisona, y acetaminofeno, se diluyeron a partir de soluciones madre 10 mM en acetonitrilo, a 100 \muM en K+ fosfato 100 mM. Se añadieron 10 \mul de esta dilución a los pocillos adecuados en la placa para tener una concentración final del inhibidor de 10 \muM. El CYP 3A4 se diluyó para dar una solución que contenía 2 pmoles/10\mul en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron 10 \mul a los pocillos adecuados de la placa. Se añadieron 20 \mul de tampón a los pocillos que contenían los patrones. Los fármacos inhibidores se dejaron incubaran previamente con la enzima CYP 3A4 durante 1 h antes de añadir el sensor BOMR. El sensor BOMR se diluyó a 4 \muM (concentración final de ensayo 4X) en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados en la placa.
Se generaron datos para una curva de calibración patrón de la fluorescencia del producto de la siguiente forma: Se diluyó resorufina a 40 \muM en tampón K+ fosfato, y se hicieron siete diluciones 1:2 consecutivas. Se añadieron 25 \mul de cada dilución a los pocillos adecuados en la placa que contenía 75 \mul de tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0, y se empezó inmediatamente la lectura de las placas. Para la BOMR el filtro de excitación era 530 nm y el filtro de emisión era 580 nm.
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Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 5. Los compuestos que se sabía que eran inhibidores eficaces (por ejemplo, miconazol y verapamilo) inhibieron aproximadamente 100% la actividad del CYP 3A4 sobre la BOMR, inhibiendo de hecho completamente la actividad del CYP 3A4 sobre la BOMR.
Por lo tanto, como se demuestra con la BOMR, y se ilustra en las Figuras 4 y 5, la introducción del conector oximetilo en los sustratos fluorogénicos con fluoróforos de longitud de onda larga, tales como la resorufina, da los nuevos sensores de CYP450 de la invención con propiedades cinéticas superiores a las de los sustratos de CYP450 conocidos más estrechamente relacionados estructuralmente.
La utilidad para detectar las interacciones fármaco-CYP450 de sensores seleccionados que contienen el conector oximetilo de la presente invención, se demostró además para la 7-benciloximetoxi-3-cianocumarina (BOMCC), y el éter n-octiloximetílico de la resorufina (OMOMR), como se ilustra respectivamente en las Figuras 6, y Figuras 6 y 7. En la Figura 6, se ilustran los resultados de un ensayo de inhibición del CYP 3A4 usando BOMMC. Esta Figura ilustra que otro compuesto de la invención, la BOMCC, es útil como medio para detectar la presencia de inhibidores de la enzima CYP450, CYP 3A4. Este ensayo se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente y con un volumen de 100 \mul/pocillo. Se preparó tampón de enzima 1,82X y se añadieron 55 \mul a cada pocillo en la placa, para tener concentraciones finales de ensayo de NADP^{+} 1,3 mM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. Los fármacos inhibidores, difenilhidantoína, propanolol, imipramina, lansoprazol, pentamidina y tranilcipromina, se diluyeron a partir de soluciones madre 10 mM en acetonitrilo, a 100 \muM en K+ fosfato 100 mM. Se añadieron 10 \mul de esta dilución a los pocillos adecuados en la placa para una concentración final del inhibidor de 10 \muM. El CYP 3A4 se diluyó para dar una solución que contenía 2 pmoles/10\mul en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron 10 \mul a los pocillos adecuados de la placa. Se añadieron 20 \mul de tampón a los pocillos que contenían los patrones. Los fármacos inhibidores se dejaron incubar previamente con la enzima 3A4 durante 1 h antes de añadir el sustrato BOMCC. El sensor BOMCC se diluyó a 40 \muM (concentración final de ensayo 4X) en tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0, y se añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados en la placa.
Se generaron datos para una curva de calibración patrón de la fluorescencia del producto de la siguiente forma: Se diluyó 7-hidroxi-3-cianocumarina a 40 \muM en tampón K+ fosfato, y se hicieron siete diluciones 1:2 consecutivas. Se añadieron 25 \mul de cada dilución a los pocillos adecuados en las placas que contenían 75 \mul de tampón K+ fosfato
100 mM, pH 8,0, y se empezó inmediatamente la lectura de las placas. Para la BOMCC el filtro de excitación era 395 nm y el filtro de emisión era 460 nm.
En la Figura 7 se ilustran los resultados de un ensayo de inhibición del CYP 2C9 usando dos compuestos de la invención BOMCC y OOMR. Esta Figura ilustra que la BOMCC y la OOMR son útiles para detectar la presencia de inhibidores de la enzima CYP450 2C9. Este ensayo se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente y con un volumen de 100 \mul/pocillo. Se preparó tampón de enzima 1,82X y se añadieron 55 \mul a cada pocillo de la placa, para tener concentraciones finales de ensayo de NADP^{+} 1,3 mM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. Los fármacos inhibidores, diclofenaco, fenitoina, tenoxicam, tolbutamida y sulfinpirazona, se diluyeron a partir de soluciones madre 10 mM en acetonitrilo, a 100 \muM en K+ fosfato 100 mM. Se añadieron 10 \mul de esta dilución a los pocillos adecuados en la placa para una concentración final del inhibidor 10 \muM. El CYP 2C9 se diluyó para dar una solución que contenía 10 pmoles/10\mul en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron 10 \mul a los pocillos adecuados de la placa. Se añadieron 20 \mul de tampón a los pocillos que contenían los patrones. Los fármacos inhibidores se dejaron incubar previamente con la enzima 2C9 durante 1 h antes de añadir los sensores BOMCC o OOMR. El sensor BOMCC se diluyó a
40 \muM (concentración final de ensayo 4X) en tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0, y se añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados. El sensor OOMR se diluyó a 8 \muM (concentración final de ensayo 4X) en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados en la placa. Los patrones 7-hidroxi-3-cianocumarina y resorufina se diluyeron a 40 \muM en tampón K+ fosfato, y se hicieron siete diluciones 1:2. Se añadieron 25 \mul de cada dilución a los pocillos adecuados en la placa que contenía 75 \mul de tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0, y se empezó inmediatamente la lectura de las placas. Para la BOMCC el filtro de excitación era 395 nm y el filtro de emisión era 460 nm. Para la MOBR el filtro de excitación era 530 nm y el filtro de emisión era 580 nm.
Ejemplo 10 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos de CYP 3A4
Se ha ensayado una variedad de sensores de la invención que contienen oximetilo frente a isozimas CYP450 humanas conocidas, implicadas principalmente en el metabolismo de fármacos en seres humanos. Se encontraron nuevos sustratos adecuados para la selección de alta producción, para CYP 3A4, CYP 2C19, CYP 2C9, CYP 1A2 y CYP 2B6. Las Tablas 1 a 9 como se describe con detalle en este y en los siguientes Ejemplos, proporcionan datos relacionados con las propiedades cinéticas de diferentes sensores fluorogénicos de CYP450 de la presente invención, comparadas con las propiedades cinéticas de los sustratos fluorogénicos de CYP450, más estrechamente relacionados estructuralmente, y actualmente disponibles.
La Tabla 1 se preparó de acuerdo con el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 1 corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente al CYP 3A4; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Para entender mejor estos términos en el contexto de esta invención, se dirige la atención a la Figura 4 y el análisis de la Figura 4. Como habrán comprendido los expertos en la técnica, los análogos de oximetilo de la presente invención (BOMR, BOMFC, BOMCC y EOMR) presentan una conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que cada uno de los sustratos más estrechamente relacionados estructuralmente (respectivamente, BR, BFC, BCC, y ER). Realmente, en todos los casos estudiados hasta el momento, excepto para el caso de un sustrato fluorogénico de CYP450 evaluado frente a una enzima CYP450 (el efecto de la MOMFC como un sustrato del CYP 2B6 como se muestra en la Tabla 5), los derivados de oximetilo de la presente invención presentaron mejores cinéticas frente a los sustratos fluorogénicos más estrechamente relacionados estructuralmente.
TABLA 1
17
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos con el CYP 3A4. La bencilresorufina (BR) y 7-benciloxi-4-trifluorometilcumarina (BFC) son sustratos del CYP450 disponibles en el comercio. Sus análogos de oximetilo (BOMR, BOMFC) se convierten más eficazmente en el correspondiente producto fluorescente. Los análogos de oximetilo de la 7-benciloxi-3-cianocumarina y etilresorufina son mejores sustratos que los sustratos relacionados (uM = \muM;
n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, ()del ajuste de Michaelis-Menten).
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Ejemplo 11 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos de CYP 2C19
La Tabla 2 se preparó de acuerdo con la misma metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 2 corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente al CYP 2C19; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, los análogos de oximetilo de la presente invención (EOMCC, BOMCC, y MOMCC) presentaron una conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que cada uno de los sustratos más estrechamente relacionados estructuralmente (respectivamente, 3CEC, BCC, y 3CMC).
TABLA 2
25
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos con CYP 2C19. La 3-ciano-7-etoxicumarina (3CEC) es un sustrato del CYP450 disponible en el comercio. Su análogo de oximetilo (EOMCC) se convierte más eficazmente en el correspondiente producto fluorescente. Los análogos de oximetilo de la 7-benciloxi-3-cianocumarina y 3-ciano-7-metoxicumarina son mejores sustratos que los sustratos relacionados (uM = \muM; n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, () del ajuste de Michaelis-Menten).
Ejemplo 12 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos de CYP 2C9
La Tabla 3 se preparó de acuerdo con la misma metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 3 corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente al CYP 2C19; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, los análogos de oximetilo de la presente invención (MOMFC, BOMCC, y MOMCC) presentaron una conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que cada uno de los sustratos más estrechamente relacionados estructuralmente (respectivamente, MFC, BCC, y 3CMC).
TABLA 3
31
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos con CYP 2C9. La 7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (MFC) es un sustrato del CYP450 disponible en el comercio. Su análogo de oximetilo (MOMFC) se convierte más eficazmente en el correspondiente producto fluorescente. Los análogos de oximetilo de la 7-benciloxi-3-cianocumarina y de la 3-ciano-7-metoxicumarina son mejores sustratos que los sustratos relacionados (uM = \muM; n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, () del ajuste de Michaelis-Menten).
Ejemplo 13 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos de CYP 1A2
La Tabla 4 se preparó de acuerdo con la misma metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 4 corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente al CYP 1A2; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, los valores de la relación de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, el análogo de oximetilo de la presente invención (EOMCC) presentó una conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que cada uno de los sustratos más estrechamente relacionados estructuralmente (3CEC).
TABLA 4
37
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos con CYP 1A2. La 3-ciano-7-etoxicumarina (3CEC) es un sustrato del CYP450 disponible en el comercio. Su análogo de oximetilo (EOMCC) se convierte de forma un poco más eficaz en el correspondiente producto fluorescente (mayor k_{cat}/K_{m}).
Ejemplo 14 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos de CYP 2B6
La Tabla 5 se preparó de acuerdo con la misma metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 5 corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente al CYP 2B6; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, dos de los análogos de oximetilo de la presente invención ensayados en este ejemplo (BOMCC, y BOMR) presentaron una conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que cada uno de los sustratos más estrechamente relacionados estructuralmente (respectivamente, BCC, y BR).
Como se ha indicado antes, el caso de MOMFC como un sustrato del CYP 2B6 es el único caso en el que el sustrato fluorogénico de CYP450 de la presente invención no presentó mejor cinética, es decir, conversión más eficaz al mismo producto fluorescente, que el sustrato más estrechamente relacionado estructuralmente, en este caso MFC. Por el método usado para identificar este único caso, o métodos comparables para seleccionar las parejas de sustrato fluorogénico de CYP450 y enzima CYP450, los expertos en la técnica pueden distinguir los sustrato fluorogénicos de CYP450 más deseables de la presente invención para su uso particular.
(TABLA 5 pasa a página siguiente)
TABLA 5
39
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos con CYP 2B6. La 7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (MFC) es un sustrato del CYP450 disponible en el comercio. Este es el caso en el que su análogo de oximetilo (MOMFC) se convierte menos eficazmente en el correspondiente producto fluorescente encontrado hasta la fecha (15/11/98). Los análogos de oximetilo de la 7-benciloxi-3-cianocumarina y de bencilresorufina son mejores sustratos que los sustratos relacionados (uM = \muM; n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, () del ajuste de Michaelis-Menten).
Ejemplo 15 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos de CYP 3A4 y CYP 2D6
La Tabla 6 se preparó de acuerdo con la misma metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 6 corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente al CYP 3A4 y CYP 2D6, como se ha indicado; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas.
TABLA 6
45
Otros sustratos sintetizados primero y ensayados con CYP 3A4 y CYP 2D6. Los derivados de oximetil-éter de la invención (OOMR, BOM-DDAO, OOMCC, MOMR) están listados en negrita; otros éteres están listados en itálica.
Ejemplo 16 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos de CYP 2C9 y CYP 2C19
La Tabla 7 se preparó de acuerdo con la misma metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 7 corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente al CYP 2C9 y CYP 2C19, como se ha indicado; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas.
TABLA 7
54
Otros sustratos sintetizados primero y ensayados con CYP 2C9 y CYP 2C19. Los derivados de oximetil-éter de la invención (OOMR, OOMCC, MOMR) están listados en negrita; otros éteres están listados en itálica.
Ejemplo 17 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos de CYP 3A4 y CYP 2D6
La Tabla 8 se preparó de acuerdo con la misma metodología general que la Tabla 1, el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 8 corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente al CYP 3A4 y CYP 2D6, como se ha indicado; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, los análogos de oxifenilmetilo de la presente invención (MOBFC y MOBR) presentaron una conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que cada uno de los sustratos más estrechamente relacionados estructuralmente (respectivamente, MFC y MR). Realmente, en todos los casos estudiados hasta el momento, los derivados de oxifenilmetilo de la presente invención presentaron mejores cinéticas frente a los sustratos fluorogénicos más estrechamente relacionados estructuralmente.
TABLA 8
62
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos con CYP 3A4 y CYP 2D6. La 7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (MFC) y la metilresorufina (MR) son sustratos del CYP450 disponibles en el comercio. Sus análogos de oxifenilmetilo (MOBFC y MOBR) se convierten más eficazmente en los correspondientes productos fluorescentes (uM = \muM;
n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, () del ajuste de Michaelis-Menten).
Ejemplo 18 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos de CYP 2C9, CYP 2C19 y 2B6
La Tabla 9 se preparó de acuerdo con la misma metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 9 corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente al CYP 2C9, CYP 2C19 y CYP 2B6, como se ha indicado; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, los análogos de oxifenilmetilo de la presente invención (MOBFC y MOBR) presentaron una conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que cada uno de los sustratos más estrechamente relacionados estructuralmente (respectivamente, MFC y MR). Realmente, en todos los casos estudiados hasta el momento, los derivados de oxifenilmetilo de la presente invención presentaron mejores cinéticas frente a los sustratos fluorogénicos más estrechamente relacionados estructuralmente.
TABLA 9
68
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos con CYP 2C9, CYP 2C19 y CYP 2B6. La 7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (MFC) y la metil-resorufina (MR) son sustratos de CYP450 disponibles en el comercio. Sus análogos de oxifenilmetilo (MOBFC y MOBR) se convierten más eficazmente en los correspondientes productos fluorescentes (uM = \muM; n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, () del ajuste de Michaelis-Menten).
Ejemplo 19 Determinación de las constantes de inhibición aparentes (k_{i}) de fármacos que interaccionan con el CYP450 2D6
Para demostrar la eficacia de la MOBFC como sensor para una subfamilia específica de CYP450 humano, CYP 2D6, y su uso para determinar constantes de inhibición aparentes, se llevaron a cabo los siguientes experimentos. Se incubó CYP 2D6 con concentraciones 10 \muM de diferentes inhibidores conocidos y sustratos fármacos, y se ensayó la actividad residual del CYP 2D6 con el sustrato fluorogénico MOBFC. El ensayo se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente con un volumen de 100 \mul/pocillo. Se preparó tampón de enzima 4X y se añadieron 25 \mul a cada pocillo en la placa, para tener concentraciones finales de ensayo de glucosa-6-fosfato 3,3 mM, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. Los fármacos inhibidores, quinidina, clorfeniramina, yohimbina, imipramina, amjalina, propanolol, doxorrubicina, haloperidol y corinantina, se diluyeron a partir de soluciones madre 10 mM en acetonitrilo, a 120 \muM en K+ fosfato 100 mM. Se hicieron seis diluciones consecutivas 1:3 y se añadieron 50 \mul de cada una a los pocillos adecuados en la placa de ensayo. El CYP 2D6 se diluyó para dar una solución que contenía 2 pmoles/10\mul en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron
10 \mul a cada pocillos. Se añadieron 20 \mul de tampón a cada pocillo que contenía el patrón. Los fármacos inhibidores se dejaron incubar previamente con la enzima CYP 2D6 durante 1 h antes de añadir el sustrato MOBF. El sustrato MOBFC se diluyó a 26,6 \muM (concentración final de ensayo 6,7X) en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron
15 \mul a los pocillos adecuados en la placa. Los datos para una curva de calibración patrón de la fluorescencia del producto se generaron de la siguiente forma: Se diluyó hidroxi-trifluoro-metilcumarina a 100 \muM en tampón K+ fosfato, y se hicieron siete diluciones consecutivas 1:2. Se añadieron 10 \mul de cada dilución a los pocillos adecuados en la placa que contenía 90 \mul de tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. Después de añadir 10 \mul de soluciones de NADP+ 13 mM a todos los pocillos, la placa de ensayo se puso en el lector de fluorescencia de placas de microvaloración y se midió la fluorescencia en intervalos de 3 minutos durante 60 min. Para la MOBFC el filtro de excitación era 395/25 nm y el filtro de emisión era 530/25 nm. Se determinaron los valores de CI_{50} (valor para inhibir 50% de la recuperación del sustrato fluorogénico) y se convirtieron en los valores de ki aparente de acuerdo con el método general descrito por Henderson, P.J.F., Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993).
TABLA 10
Fármaco Valores de k_{i} aparente [uM]
Quinidina 0,15
Clorfeniramina 2,5
Yohimbina 10
Imipramina 0,1
Amjalina > 30
Propanolol > 30
Doxorrubicina 8
Haloperidol 3
Corinantina > 30
Valores de k_{i} aparentes para la inhibición del CYP 2D6 por fármacos que se sabe que interaccionan con la enzima, determinados a partir de los valores de CI_{50} de la inhibición del metabolismo de la MOBFC por la enzima.
Ejemplo 20 Preparación del éster de succinimidilo del ácido 7-benciloximetiloxicumarina-3-carboxílico
El éster de succinimidilo del ácido 7-benciloximetiloxicumarina-3-carboxílico se preparó por el siguiente procedimiento: Se agitó vigorosamente una mezcla del éster de succinimidilo del ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico
(303 mg, 1 mmol) en carbonato potásico seco (248 mg, 1,5 mmoles) en dimetilformamida seca (15 ml), a 0ºC durante
25 min. Después se añadió rápidamente a la reacción bencil-clorometil-éter (2,32 ml, 10,0 mmoles). La mezcla amarillo brillante se agitó a 0ºC durante 45 min y durante 2 h a 25ºC. Después de este tiempo la reacción se convirtió en una solución incolora. La reacción se siguió por TLC (R_{f} = 0,5, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,24, CHCl_{3}). Después de separar la materia prima cumarina, el medio de reacción se diluyó con éter dietílico (100 ml) y se extrajo con 50 ml de ácido acético acuoso al 5%. La capa de éter se separó y se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró, y los disolventes se evaporaron a presión reducida. El sólido se recristalizó en metanol y se lavó con hexanos (20 ml, 0ºC). El producto, el éster de succinimidilo del ácido 7-benciloximetiloxicumarina-3-carboxílico, se secó a presión reducida dando un sólido blanco (85 mg, 20%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 2,91 (s, 4H), 4,74 (s, 2H), 5,40 (s, 2H), 7,07 (m, 2H), 7,32 (m, 5H), 7,53 (d, 1H), 8,75 (s, 1H).
Ejemplo 21 Acoplamiento del éster de succinimidilo del ácido 7-benciloximetiloxicumarina-3-carboxílico con el 1,2-diaminociclohexano racémico, para dar el producto indicado como BOM-09B
Se mezclaron cinco (5) \mumoles de éster de succinimidilo del ácido 7-benciloximetiloxicumarina-3-carboxílico en dimetilformamida seca (50 \mul) con una solución 1 M de una mezcla racémica de 1,2-diaminociclohexanos (50 \mumoles) en un tubo de centrífuga de plástico. La reacción se dejo avanzar con tratamiento con ultrasonidos a temperatura ambiente durante 2 h, y después de este tiempo se añadieron 500 \mul de agua desionizada al tubo y se formó un precipitado blanco. La reacción se centrifugó en una centrífuga y se decantó el disolvente. Los resultados de los espectros de UV-visible (absorbancia máxima a 340 nm) y EM de electropulverización (M+H = 423, M+Na = 445) llevados a cabo en una muestra del sólido, estaban de acuerdo con la estructura del siguiente producto (mezcla de estereoisómeros):
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BOM-09B
Ejemplo 22 Determinación de la velocidad de hidroxilación de BOM-09B por el CYP 3A4
Se ensayó la actividad de la mezcla racémica del compuesto (indicado como BOM-09B) con isozimas citocromo P450. BOM-09B mostró una actividad particularmente alta con la isozima CYP 3A4. En ensayo con el CYP 3A4 se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos a 37ºC en un volumen de 100 \mul/pocillo. Se diluyó BOM-09B de una solución madre 1 mM en acetonitrilo a una concentración 4X de 80 \muM en tampón K+ fosfato 100 mM del cual se añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados. Se preparó tampón de enzima y se añadieron 65 \mul a cada pocillo en la placa, para tener concentraciones finales de ensayo de NADP^{+} 1,3 mM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. La isozima citocromo P450 CYP 3A4 se diluyó para dar 2 pmoles de enzima por pocillo. La conversión enzimática del sustrato en los productos se dejó avanzar durante 1 hora tomando lecturas de fluorescencia cada 4 minutos en un lector de fluorescencia de placas de microvaloración. La solución se iluminó con un filtro de excitación de 395/25 nm y se detectó la emisión de fluorescencia a través de un filtro de emisión de 460/40 nm. La velocidad de conversión de este sustrato (BOM-09B) se comparó con el sustrato BOMCC en condiciones idénticas, y se encontró que era la mitad de la de BOMCC (velocidad de conversión _{(BOM-09B)} = 0,75 pmoles de sustrato/pmoles de enzima \cdot min).
Ejemplo 23 Síntesis de bibliotecas de sustratos fluorogénicos a partir de colorantes fenólicos altamente fluorescentes
Se sintetizan bibliotecas de derivados de éteres de 7-hidroxicumarinas y resorufinas como se indica a continuación, es decir, a continuación se muestran los caminos de reacción que conducen a bibliotecas de sustratos fluorogénicos candidatos de CYP450. El éster de succinimidilo del ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico está disponible en el comercio en Molecular Probes. Las materias primas de resorufina se preparan fácilmente siguiendo los procedimientos de las patentes de EE.UU. 4.954.630 y 5.304.645, que describen la preparación de los ácidos y su conversión en ésteres activos usando TSTU. Los ésteres activos de los colorantes son estables en las condiciones de alquilación necesarias para preparar los éteres de los fenoles colorantes. Después de alquilación, los éteres colorantes fluorogénicos resultantes se modifican en el resto éster activo por reacción con una biblioteca de aminas alifáticas primarias y secundarias. Las cadenas laterales alifáticas se eligen para que incluyan diversos restos aromáticos y heterocíclicos. También se incluyen 20 diaminas en la biblioteca de aminas. Cuando se hacen reaccionar con los ésteres colorantes activos con grandes excesos molares, las reacciones con diaminas dan como resultado sustratos candidatos cargados positivamente, que se seleccionan por su actividad frente a la isozima CYP 2D6, que se sabe que prefiere sustratos cargados positivamente.
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Los compuestos se purifican por cromatografía en columna o recristalización después de la alquilación del fenol colorante. El acoplamiento con las aminas se lleva a cabo en una escala de 10 \mumoles en dimetilformamida y normalmente se produce con alto rendimiento. Las reacciones se siguen en paralelo por cromatografía en capa fina para asegurar que las reacciones se completan y detectar y separar los miembros de la biblioteca que reaccionan mal. El disolvente se separa con alto vacío y el exceso de amina se separa suspendiendo el residuo en ácido acético acuoso al 10%, seguido de recuperación del producto por centrifugación. Este procedimiento conduce a compuestos con suficiente pureza (ensayados por TLC) para el ensayo inicial del metabolismo por las enzimas CYP450. Los sustratos prometedores se vuelven a sintetizar en una escala mayor (100 \mumoles), se purifican por cromatografía incluyendo separación de regioisómeros (sustratos basados en resorufina) y se analizan por EM de electropulverización y se analizan por ^{1}H-RMN.
Ejemplo 24 Ensayos de bibliotecas de sustratos fluorogénicos frente a un grupo de isozimas CYP450 humanas
Las bibliotecas de sustratos putativos recién sintetizados se disuelven a una concentración 2 mM en disolventes orgánicos miscibles con el agua adecuados, prefiriéndose generalmente el acetonitrilo, porque las enzimas CYP450 generalmente toleran hasta 2%. Los diferentes derivados de éter de cualquier colorante fenólico tienen coeficientes de extinción similares, que permite la calibración de la concentración de sustrato por absorbancia. Las soluciones se transfieren a placas de almacenamiento de 96 pocillos, para permitir la dispensación paralela múltiple automática en placas de ensayo de microvaloración de 96 pocillos. Para los ensayos rápidos, todos los ensayos se llevan acabo en placas de microvaloración usando un lector de fluorescencia de placa Fluorstar o Cytofluor, para obtener las velocidades de la enzima.
Los experimentos iniciales determinan las condiciones para cada isozima CYP450 (usando isozimas CYP450 humanas disponibles en el comercio expresadas en microsomas de insecto de GENTEST) dando velocidades lineales de formación del producto; la velocidad es proporcional a la concentración de enzima. Las isozimas CYP450 ensayadas para encontrar sustratos más activos son: CYP 3A4, CYP 2D6, CYP 2C9, CYP 2C19. El ensayo también incluye las isozimas CYP450 CYP 1A2, CYP 2E1, CYP 2B6, y CYP 2A6. Esto es para evaluar si cualquier sustrato que sea activo con una de las isozimas 3A4, 2D6 o 2C9 y 2C19, es selectivo para esa isozima. Cada isozima requiere condiciones ligeramente diferentes, y las variables optimizadas incluyen pH, concentración de NADPH, concentración de CYP450, si es necesario añadir citocromo b como cofactor, tiempo de incubación, y efecto de la temperatura, y otras variables que serán evidentes para los expertos en la técnica. En la selección inicial de sustratos, se ensayan candidatos basados en cumarina con concentraciones 5 y 20 \muM, y candidatos basados en resorufina 2 y 10 \muM. La elección de diferentes concentraciones para los éteres de resorufinas frente a éteres de cumarinas tiene en cuenta la menor solubilidad acuosa de los derivados de resorufina comparado con los derivados de cumarina, y del descubrimiento en experimentos preliminares de que los derivados de resorufina, siendo más hidrófobos, tienden a unirse más ávidamente a las enzimas CYP450 (menor K_{m}). Se usa un pmol por pocillo de enzima expresada por insecto coexpresada con NADPH-citocromo P450-reductasa. El tampón de ensayo contendrá Mg^{2+} 10 mM y la fuerza iónica adecuada de la solución de ensayo se ajusta con soluciones madre de tampón concentrado. El NADPH necesario para la NADPH-citocromo P450-reductasa se suministra en forma de NADP^{+} 1,3 mM, que es convertido en niveles estacionarios de NADPH por la gluocosa-6-fosfato-deshidrogenasa y glucosa-6-fosfato 3 mM añadidos al tampón de ensayo. Los valores de k_{cat} aparente y K_{m} para todos los candidatos activos se determinan a partir de diluciones de ocho puntos de cada sustrato por duplicado, usando los resultados de los ensayos preliminares para determinar el intervalo de concentración real para la evaluación precisa de la cinética.
La optimización de las condiciones de ensayo se lleva a cabo por metodologías de Diseño de Experimentos validados estadísticamente, usando el paquete de software comercial "Design-Expert®" producido por Stat-Ease® Inc. Los datos mostrados en las Figuras 4 y 5 se obtuvieron con optimización inicial.
Ejemplo 25 Síntesis dirigida a grupos de sustratos fluorogénicos
Los sustratos encontrados en la ronda inicial de síntesis y ensayos se vuelven a sintetizar en una escala mayor
(100 \mumoles) y se purifican por cromatografía y/o recristalización. Los éteres de resorufina regioisómeros obtenidos en la síntesis se separan y se determinan las propiedades cinéticas de cada isómero por separado, como se ha descrito antes. Los datos cinéticos obtenidos para estos sustratos se usarán para dirigir la síntesis de unas pocas bibliotecas centradas pequeñas. Se adquieren o sintetizan haluros de alquilo y aminas adicionales, estrechamente relacionados con los que dan como resultado actividad con la isozima, con el objetivo de obtener sustratos incluso con mayor actividad, y sustratos que pueden ser específicos de la isozima. Se siguen las mismas rutas sintéticas discutidas en el Ejemplo 23, excepto que todos los compuestos se purifican y analizan por RMN y EM antes de llevar a cabo las cinéticas enzimáticas. Estos candidatos a sustrato se ensayan por duplicado en diluciones de ocho puntos usando los resultados de los sustratos estructuralmente relacionados para determinar el intervalo de concentración real para la evaluación precisa de la cinética.
Ejemplo 26 Validación de los sustratos específicos de isozima usando microsomas de hígado humano
Debido a que los microsomas de hígado humano contienen una variedad de isozimas CYP450, sólo se ensayan sustratos que son específicos para una de las enzimas CYP450 humanas expresada en insecto en preparaciones de microsomas de hígado humano disponibles en el comercio. Esto verifica que, como se esperaba en general, la especificidad observada con los CYP450 microsomales de insecto se mantiene en los microsomas de hígado humano. Inicialmente, las condiciones para los ensayos son las especificadas por los suministradores de microsomas. Sin embargo, debido a que los sustratos pueden tener cinéticas diferentes a aquellas para las que se diseñaron las condiciones publicadas, se lleva a cabo alguna optimización como se describe en el Ejemplo 24. Todos los ensayos se llevan a cabo en placas de microvaloración de 96 ó 384 pocillos como en el Ejemplo 24.
La especificidad para una isozima en las preparaciones microsomales de hígado humano, se confirma por la falta de metabolismo del sustrato en presencia de un inhibidor selectivo de la isozima CYP450 para la isozima que se está investigando. Por ejemplo, los inhibidores selectivos para la CYP 3A4, CYP 2D6 y CYP 2C9 son troleandomicina, quinidina, y sulfafenazol, respectivamente. Además, los sustratos/sensores fluorogénicos se usan para determinar los valores de CI_{50} para un panel de inhibidores de isozima CYP450 conocidos, y los datos se comparan con los valores publicados. Para esta etapa, se lleva a cabo una curva de concentración de 8 puntos de los inhibidores, por duplicado. Se puede encontrar alguna dificultad en cuanto que la bibliografía publicada contiene una gran variedad de valores de CI_{50} para cualquier inhibidor dado, a menudo debido a diferentes condiciones experimentales entre los estudios. Los resultados de la invención se compararán con los estudios publicados más relevantes que tengan las condiciones de ensayo más parecidas.
Ejemplo 27 Selecciones validadas frente a inhibidores y sustratos conocidos de CYP450
Se seleccionaron las isozimas CYP450 más relevantes (CYP 3A4, CYP 2D6, CYP 2C9, CYP 2C19) con sus nuevos sustratos/sensores fluorogénicos más adecuados frente a una biblioteca de compuestos que contienen inhibidores del CYP450 conocidos. Para este ejemplo, se usan isozimas CYP450 humanas recombinantes expresadas en microsomas de insectos de GENTEST. La biblioteca que se va a ensayar es la biblioteca de farmacóforos genéricos de Microsource® que tiene 480 moléculas biológicamente activas, incluyendo inhibidores y sustratos conocidos de CYP450.
Puesto que el valor comercial final de los nuevos sustratos/sensores de CYP450 se produce si los ensayos se adaptan a los protocolos de selección automáticos de alto rendimiento, es necesario verificar que las condiciones de ensayo desarrolladas en el Ejemplo 24 son adecuadas para el uso automático, y si no modificarlas de forma adecuada. Esto es una práctica común con cualquier ensayo que se va a realizar en un sistema robótico, e implica comprobar parámetros tales como: estabilidad de la enzima y sustrato para permitir realizar un gran número de ensayos sin la intervención manual constante; reproducibilidad del ensayo con los sistemas de manejo de líquidos automáticos; tiempos y temperaturas de incubación específicos adecuados para el programa robótico; captura de datos adecuada y reducción de rutinas, y otros parámetros similares. También se determina si será necesaria una "lectura previa" de las placas antes de añadir el NADPH para iniciar la reacción, puesto que esto a veces puede eliminar falsos positivos producidos por compuestos fluorescentes de la biblioteca.
Inicialmente, todos los compuestos se ensayan con una concentración 10 \muM usando las condiciones robóticas optimizadas, para determinar de una forma sencilla de acierto/fallo qué compuestos están interaccionando con qué isozima CYP450. Aunque esto implica ensayar cuatro enzimas frente a 480 compuestos (aproximadamente 2.000 ensayos con testigos), esto sólo requiere 25 placas de microvaloración de 96 pocillos o 6 de 384 pocillos, los cual se puede realizar en un solo día usando los formatos automáticos actualmente disponibles.
Todos los aciertos se vuelven a ensayar con concentraciones 1 y 10 \muM, y se ensayan con concentración 10 \muM usando un colorante fluorescente rojo sensible a la reacción redox identificado como adecuado para comprobar que un compuesto no está interfiriendo con la etapa de la citocromo P450-reductasa. Se determinan los valores de CI_{50} (usando una curva de ocho puntos por duplicado) para los inhibidores o sustratos conocidos y se comparan los datos con los valores publicados. Para considerar que los nuevos sustratos/sensores son adecuados para la selección de compuestos de alta producción rutinaria como parte del procedimiento de desarrollo de fármacos, los ensayos deben detectar 100% de los compuestos con afinidades para la isozima CYP450 relevante <1 \muM, y >90% de los compuestos con afinidades entre 1 y 10 \muM.
Ejemplo 28 Determinación de si un compuesto de ensayo es un sustrato para una isozima CYP450
Para determinar si un compuesto de ensayo es un sustrato para una isozima CYP450 se lleva a cabo el siguiente experimento. Una preparación de isozima CYP450 humana se trata con compuesto de ensayo durante un periodo de incubación de varias horas en condiciones adecuadas para el metabolismo del compuesto de ensayo por la isozima CYP450. Se ensaya la actividad residual de la isozima CYP450 con un sustrato fluorogénico para esta isozima CYP450. La isozima CYP450 también se trata con el mismo compuesto de ensayo durante el mismo periodo de tiempo pero en ausencia de NADP+, unas condiciones que no permiten el metabolismo del compuesto de ensayo. Después del periodo de incubación, se añade NADP+, y se ensaya la actividad residual de la isozima CYP450 con un sustrato fluorogénico para esa isozima CYP450. Una actividad de la isozima CYP450 ensayada en condiciones adecuadas para el metabolismo del compuesto de ensayo que sea mayor que la actividad de la enzima en condiciones que no permiten el metabolismo del compuesto de ensayo durante el periodo de incubación, indica que el compuesto de ensayo es un sustrato de la isozima CYP450.
El ensayo se lleva a cabo en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente y con un volumen de 100 \mul/pocillo. Se prepara tampón de enzima 4X y se añaden 25 \mul a cada pocillo en la placa, para concentraciones finales de ensayo de glucosa-6-fosfato 3,3 mM, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en un tampón K+ fosfato de concentración adecuada, y a pH 8,0. El compuesto de ensayo se disuelve a una concentración 20 \muM en agua y se añaden 50 \mul de la solución a dos pocillos de cada, seguido de adición de 10 \mul de tampón que contiene
10 pmoles de isozima CYP450. Uno de los dos pocillos ahora recibe 10 \mul de NADP+ 13 mM y el compuesto de ensayo en ambos pocillos se incuba con la isozima CYP450 durante 2 h. Después de la incubación, el otro pocillo recibe
10 \mul de NADP+ 13 mM, y ambos reciben sustrato fluorogénico adecuado para detectar la actividad de la isozima CYP450, en un volumen de 5 \mul de tampón. La placa de ensayo de microvaloración se transfiere a un lector de fluorescencia de placas de microvaloración y se mide la fluorescencia de los pocillos en intervalos de 3 min durante 60 min. La velocidad de aumento de la fluorescencia del pocillo se usa para evaluar la actividad residual de la isozima CYP450 en los pocillos. Un resultado en el que la actividad residual del CYP450 en el pocillo que recibe el NADP+ antes de la incubación con el compuesto de ensayo es mayor que en el pocillo duplicado al que se añade el NADP+ después del periodo de incubación, indica que el compuesto de ensayo es un sustrato para la isozima CYP450.
Ejemplo 29 Análisis de la señal de fluorescencia del metabolismo enzimático del sustrato frente a la señal de fondo de las adiciones de reactivo
Para demostrar las cualidades ópticas superiores de los sensores moleculares de la invención, una de las cuales es la mejor señal frente a la señal de fondo, se llevaron a cabo comparaciones en paralelo con sustratos fluorogénicos actualmente disponibles. Los ensayos se llevaron a cabo en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente y con un volumen de 100 \mul/pocillo. Se añadió tampón 2X NADPH/sistema reciclado a la placa con un volumen de 50 \mul para concentraciones de ensayo finales de glucosa-6-fosfato 3,3 mM, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en un tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0 (con excepción de los ensayos de CYP 2C9 y CYP 2C19 para los que se usó K+ fosfato 50 mM, pH 8,0) (Véase Tabla 11). La enzima se preparó en el tampón K+ fosfato adecuado a 10X, y se añadieron 10 \mul/pocillo a los pocillos adecuados (Véase Tabla 11). La placa se leyó en intervalos de 3 minutos durante 12 minutos para obtener los niveles de fluorescencia de fondo. Las lecturas se interrumpieron brevemente para permitir la adición de 10 \mul de 10X NADP+ en tampón K+ fosfato a cada pocillo (Véase Tabla 11). Las lecturas se reanudaron a intervalos de 3 minutos durante otros 12 minutos. Se interrumpieron otra vez las lecturas para permitir la adición de sustrato 3,3X con un volumen de 30 \mul/pocillo (Véase las concentraciones de sustrato en la Tabla 11). La conversión enzimática del sustrato en productos se dejó avanzar durante 1 hora, tomándose lecturas de fluorescencia a intervalos de 3 ó 4 minutos en un lector de fluorescencia de placas de microvaloración con la longitud de onda de excitación y emisión adecuadas (listadas para cada sustrato en la Tabla 11). Las Figuras 8, 9, 10, 11 y 12 ilustran los cambios de la intensidad de fluorescencia, o su falta, para la adición de reactivos y sustrato a los pocillos, y la señal del metabolismo enzimático del sustrato. Para permitir la comparación cuantitativa entre los sensores que se metabolizaron o metabolizarían para dar productos fluorescentes de diferentes propiedades ópticas, la intensidad de la señal correspondiente a cada pocillo se normalizó por división entre la intensidad de la señal inicial (pocillos que contenían enzima y tampón). Las Figuras 8, 9, 10, 11 y 12 ilustran la mejor señal frente a la señal de fondo de los sustratos que contienen conector oximetilo y oxifenilmetilo de esta invención (señales continuas) frente a sustratos disponibles previamente en el comercio (líneas discontinuas). La señal de fondo acumulada que resulta de la adición de NADP+ y de la adición del sustrato se manifiesta por una señal fluorescente mayor que una, 3 minutos después de la adición de sustrato (la segunda flecha indica el tiempo de adición del sustrato). El posterior aumento de la señal, aproximadamente cuatro minutos después de la segunda adición y en los puntos de tiempo posteriores, se cree que se debe a la conversión enzimática del sustrato en el producto. En las Figuras 8, 9, 10, 11 y 12, la señal enzimática frente a la señal de fondo de adición del reactivo, como medida del rendimiento del ensayo, es mayor para los sensores que contienen conector oximetilo de esta invención (señales continuas) que para los sustratos previos disponibles en el comercio (líneas discontinuas). La Figura 8 ilustra la señal superior de BOMR (señal continua) frente a la bencil-resorufina (señal discontinua) con la isozima CYP 3A4. La Figura 9 ilustra la señal superior de la BOMCC (señal continua) frente a la 7-benciloxi-4-trifluorometilcumarina (BFC, señal discontinua) con la isozima CYP 3A4. La Figura 10 ilustra la señal superior de la MOBFC (señal continua) frente a la AMMC (Gentest) (señal discontinua) con la isozima CYP 2D6. La Figura 11 ilustra la señal superior tanto de la OOMR (señal negra) como la BOMCC (señal continua) frente a la 7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (MFC, señal discontinua) con la isozima CYP 2C9. La Figura 12 ilustra la señal superior de la EOMC (señal continua) frente a la 3-ciano-7-etoxicumarina (CEC, señal discontinua) con la isozima CYP 2C19.
TABLA 11 Condiciones de ensayo de CYP450 para cada isozima CYP450
Isozima CYP 3A4 CYP 3A4 CYP 2D6 CYP 2C9 CYP 2C19
Sustratos en poci- BOMR 1 \muM BOMCC 20 \muM MOBFC 5 \muM OOMR 2,5 \muM EOMCC 20 \muM
llos separados Bencil- BFC 20 \muM AMMC 2,5 \muM BOMCC 10 \muM CEC 20\muM
cada uno resorufina 5 \muM MFC 40 \muM
Glucosa-6-fosfato 33 33 33 33 33
(mM)
Glucosa-6-fosfato- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
deshidrogenasa
(unidades/ml)
MgCl_{2} (mM) 10 10 10 10 10
Tampón K+ fosfato, 100 100 100 50 50
pH 8,0 (mM)
Concentración 0,5 0,5 2 1 0,5
de enzima
(pmoles/100 \mul)
NADP^{+} (\muM) 100 100 30 100 100
Excitación/ Ex. 530(25)/ Ex. 405(20)/ Ex. 405(40)/ Ex. 530(25)/ Ex. 405(20)/
emisión (nm) Em. 605(50) Em. 460(40) Em. 490(40) Em. 605(50) Em. 460(40)
Longitud de Ex. 405(40)/ Ex. 360(40)/ Ex. 405(20)/
onda central Em. 490(40) Em. 460(40) Em. 460(40)
(ancho de banda) Ex. 405(40)/
Em. 490(40)
Figuras Fig. 8 Fig. 9 Fig. 10 Fig. 11 Fig. 12
correspondientes
Las molaridades indican concentraciones después de añadir todos los reactivos a cada pocillo. Los sustratos se compararon en pocillos paralelos con las concentraciones indicadas (segunda fila). Diferentes tipos de letra para los sustratos indican los filtros con los que se corresponden en la segunda a última fila (por ejemplo, un filtro en itálica se usó para el sustrato en itálica).
Ejemplo 30 Preparación de dibenciloximetilfluoresceína (DBOMF)
La dibenciloximetilfluoresceína se preparó como sigue:
Se agitó vigorosamente una mezcla de fluoresceína (332 mg, 1 mmol) y diisopropiletilamina (870 \mul, 5 mmoles) en cloroformo (15 ml), a 0ºC durante 25 minutos. Después se añadió rápidamente a la reacción bencil-clorometil-éter (2,32 ml, 10,0 mmoles). La reacción desprendió gas durante la adición, y se dejó agitar durante 2 horas a 25ºC. La reacción se siguió por TLC (R_{f} = 0,36, MeOH 5%:CHCl_{3} 95%). Después la solución de la reacción se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) que dio la DBOMF puro en forma de un sólido naranja (154 mg, 27%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): 4,37 (c, 2H), 4,70 (s, 2H), 5,29 (c, 2H), 5,33 (s, 2H), 6,47 (d, 1H), 6,57 (m, 1H), 6,86-6,93 (m, 3H), 7,14-7,24 (m, 2H), 7,25-7,36 (m, 10H), 7,67-7,77 (m, 2H), 8,23 (d, 1H).
Ejemplo 31 Preparación de benciloximetilfluoresceína (BOMF)
La dibenciloximetilfluoresceína (BOMF) se preparó como sigue:
Se agitó vigorosamente una mezcla de fluoresceína (332 mg, 1 mmol) y diisopropiletilamina (870 \mul, 5 mmoles) en cloroformo (15 ml), a 0ºC durante 25 minutos. Después se añadió rápidamente a la reacción bencil-clorometil-éter (2,32 ml, 10,0 mmoles). La reacción desprendió gas durante la adición, y se dejó agitar durante 2 horas a 25ºC. La reacción se siguió por TLC (R_{f} = 0,56, MeOH 5%:CHCl_{3} 95%). Después la solución de la reacción se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) que dio la BOMF puro en forma de un sólido naranja (36 mg, 8%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): 4,72 (s, 2H), 5,31 (s, 2H), 6,52 (c, 1H), 6,59 (d, 1H), 6,68-6,76 (m, 3H), 7,00 (d, 1H), 7,17 (d, 1H), 7,29-7,37 (m, 5H), 7,60-7,69 (m, 2H), 8,02 (d, 1H).
Ejemplo 32 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos basados en fluoresceína con CYP 3A4
La Tabla 12 se preparó de acuerdo con la misma metodología general de la Tabla 1, que en general, es el método descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 12 corresponden a sustratos fluorogénicos basados en fluoresceína específicos ensayados frente al CYP 3A4; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, v_{max} (para cinéticas sigmoidales), K_{1/2max} (concentración a 1/2 de la velocidad máxima para cinéticas sigmoidales) y los tipos de cinéticas detectadas. La dibencilfluoresceína (DBF) se adquirió en Gentest, Woburn, Mass. El ensayo del CYP 3A4 se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente con un volumen de 100 \mul/pocillo. Se diluyeron DBF, BOMF y DBOMF a partir de una solución madre 2 mM en acetonitrilo a una concentración 4X de 80 \muM en tampón K+ fosfato 100 mM. Se hicieron siete diluciones 1:2 de cada sustrato de las cuales se añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados. Se preparó tampón de enzima 1,54X y se añadieron 65 \mul a cada pocillo en la placa, para tener concentraciones de ensayo finales de NADP^{+} 100 \muM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. La isozima citocromo P450 CYP 3A4 se diluyó para dar 0,5 pmoles de enzima por pocillo, y se añadió a un volumen de 10 \mul/pocillo en K+ fosfato, pH 8,0. La conversión enzimática del sustrato en productos se dejó avanzar durante 1 hora, tomando lecturas de fluorescencia cada cuatro minutos en un lector de fluorescencia de placas de microvaloración. La solución se iluminó usando un filtro de excitación de 485/20 nm y la emisión de fluorescencia se detectó por un filtro de emisión de 530/25 nm. Como comprenderán los expertos en la técnica, los sensores de análogos de oximetilo de la presente invención (DBOMF y BOMF) presentaron una conversión más eficaz en el mismo producto fluorescente que el sensor estructuralmente relacionado (DBF).
TABLA 12 Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos basados en fluoresceína con CYP 3A4
80
La dibencilfluoresceína (DBF) se adquirió en Gentest. Su análogo de oxifenilmetilo la dibenciloximetilfluoresceína (DBOMF) se convierte más eficazmente en el correspondientes producto fluorescente. La benciloximetilfluoresceína (BOMF) es otro derivado de éter oxifenilmetílico de la fluoresceína estructuralmente relacionado que también se convierte eficazmente en fluoresceína y presenta cinética de tipo Michaelis-Menten.
Ejemplo 33 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos basados en fluoresceína con CYP 2C9
La Tabla 13 se preparó de acuerdo con la misma metodología general de la Tabla 12 en el Ejemplo 32, que es el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). En una desviación del protocolo descrito en el Ejemplo 32, el tampón basado en fosfato (K+ fosfato 100 mM, pH 8,0) se sustituyó en todo el procedimiento por tampón Tris-HCl 200 mM, pH 7,5. Las filas de la Tabla 13 corresponden a sensores fluorogénicos basados en fluoresceína específicos ensayados frente al CYP 2C9; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, el análogo de mono-oximetilo de la fluoresceína de la presente invención, BOMF, presentaba una conversión muy eficaz al producto fluorescente comparado con los sustratos listados en la Tabla 3.
TABLA 13 Propiedades cinéticas del sustrato BOMF con CYP 2C9
83
Ejemplo 34 Análisis de las cinéticas relativas de sustratos fluorogénicos basados en fluoresceína con la isozima CYP450 2C8
La Tabla 14 se preparó de acuerdo con la misma metodología general de la Tabla 12, el método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993). En una desviación del protocolo descrito en el Ejemplo 32, el tampón basado en fosfato (K+ fosfato
100 mM, pH 8,0) se sustituyó en todo el procedimiento por tampón K+ fosfato 100 mM, pH 7,5. Las filas de la Tabla 13 corresponden a sensores fluorogénicos basados en fluoresceína específicos ensayados frente al CYP 2C8; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Específicamente, se ensayó la actividad del sustrato dibencilfluoresceína (DBF) (adquirida en Genstet, Woburn, Mass) y del sensor de la presente invención DBOMF con el CYP 2C8. Como comprenderán los expertos en la técnica, el análogo de oximetilo del sensor de la presente invención (DBOMF), presentaba una conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que el sustrato estructuralmente relacionado (DBF).
TABLA 14 Propiedades cinéticas de los sustratos fluorogénicos basados en fluoresceína con CYP 2C8
84
La dibenzofluoresceína (DBF) se adquirió en Gentest. su análogo de oxifenilmetilo, la dibenciloximetilfluoresceína (DBOMF) se convierte más eficazmente en el correspondiente producto fluorescente.
Ejemplo 35 Procedimiento para seleccionar compuestos que interaccionan con el CYP 3A4
Se llevó a cabo y se describe un procedimiento de ensayo general para los ensayos de inhibición de la isozima CYP 3A4 usando sensores de la presente invención. Las Tablas 15 y 16 describen las condiciones de tampón específicas usadas cuando se ensaya la inhibición de esta enzima. Los ensayos se llevaron a cabo en placas de fondo transparente y paredes negras de 96 pocillos, con 100 \mul/pocillo a temperatura ambiente. La fluorescencia se mide en un lector de fluorescencia de placas de microvaloración.
Se disolvió la BOMR a una concentración 2 mM en acetonitrilo por adición de 500 \mul de acetonitrilo a un vial que contenía 1 \mumol de sustrato. Se disolvió la BOMCC en acetonitrilo para preparar soluciones madre 10 mM por adición de 100 \mul de acetonitrilo a un vial que contenía 1 \mumol de sustrato. El patrón de colorante resorufina sódica se disolvió a 1 mM en agua destilada; el patrón de colorante 3-ciano-7-hidroxicumarina se preparó con concentración 1 mM en DMSO. Todas las soluciones acuosas se prepararon al principio del experimento y se mantuvieron en hielo hasta su uso.
1. Se dispensó un nanomol de compuesto de ensayo o inhibidor en el pocillo de la placa en agua destilada (40 \mul de compuesto 25 \muM en agua destilada), para una concentración final de ensayo del compuesto 10 \muM.
Alternativamente, los compuestos se dispensan de una solución orgánica y se secan en la placa, en cuyo caso se añaden 40 \mul/pocillo de agua destilada y la placa se incuba a 37ºC durante 1 h para ayudar a la redisolución de los compuestos. Los pocillos testigo recibieron los testigos de inhibición adecuados para cada isozima. También se añaden los inhibidores a los pocillos que contienen los patrones colorantes para permitir la adición de sustrato y enzima a todos los pocillos de la placa.
2. Se añadieron 20 \mul/pocillo de tampón K+ fosfato 300 mM, pH 8,0.
3. Se añadieron 30 \mul/pocillo de tampón de enzima/sistema reciclado (Tabla 15). Se añadieron los patrones de colorantes a los pocillos adecuados en la placa. Se añadieron 10 \mul/pocillo de los patrones de colorantes para tener concentraciones de ensayo finales de 5, 2,5 y 1,25 \muM.
TABLA 15 Concentración de los ingredientes en las soluciones madre de tampón de enzima/sistema reciclado (3,3X)
BOMR BOMCC
K+ fosfato, pH 8,0 (mM) 100 100
Glucosa-6-fosfato (mM) 11 11
Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (unidades/ml) 1,33 1,33
MgCl_{2} (mM) 33,33 33,33
Enzima (nanoM) 16,5 16,5
Equivalente a pmoles/pocillo 0,5 0,5
4. La placa se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente para ayudar a la interacción de los compuestos con el CYP 3A4 (en ausencia de recuperación de la enzima). Se tomó una lectura previa de la placa (Véase la siguiente Tabla 16 para los filtros de excitación y emisión para cada sustrato).
5. Se añadieron diez \mul/pocillo de tampón de sustrato/NADP+ en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0 (Tabla 16). Inmediatamente después, la placa se transfirió al lector de fluorescencia de placas de microvaloración para los análisis cinéticos, o alternativamente, la placa se deja reposar en la oscuridad durante el tiempo de reacción adecuado y se toma una lectura de punto final en el tiempo adecuado.
TABLA 16 Tampón de sustrato/NADP+ (10X)
Nombre del sustrato BOMR BOMCC
Sustrato (\muM) 50 200
NADP+ (mM) 1 1
Tiempo del ensayo (minutos) 34 45
Excitación, centro (ancho)/ 530(25)/ 405(20)/
Emisión, centro (ancho) 605(55) 460(40)
Ejemplo 36 Selección de 160 compuestos que interaccionan con el CYP 3A4
Siguiendo el procedimiento general resumido en el Ejemplo 35, se seleccionaron 160 compuestos adquiridos en Chembridge, San Diego, Calif., que interaccionaban con CYP 3A4. Se dispensó un nanomol de compuesto por pocillo, ochenta por placa de 96 pocillos. En los 16 pocillos restantes se dispensó lo siguiente: tres nanomoles de miconazol como testigo para 100% de inhibición, un inhibidor moderado, verapamilo, con cuatro concentraciones para indicar la sensibilidad del ensayo y un patrón de producto de fluorescencia (sal sódica de resorufina). Los resultados de aplicar el procedimiento resumido en el Ejemplo 35 con BOMR 5 \muM como sustrato, se ilustran en la Figura 13. Se representó gráficamente la potencia de los compuestos en la muestra (expresada en % de inhibición) comparado con el testigo miconazol para todos los compuestos. Se detectaron varios compuestos con potencia intermedia (30-60% de inhibición respecto al testigo). Ocho compuestos en el muestreo presentaron actividad inhibidora mayor que 60%. Como comprenderán los expertos en la técnica, estos resultados demuestran que los sensores que contienen el conector oximetilo de la presente invención son útiles, por ejemplo, para detectar la actividad inhibidora del CYP 3A4 en una variedad y/o matriz de compuestos.
Ejemplo 37 Detección de subestructuras de compuestos que se correlacionan con la actividad inhibidora del CYP 3A4
Siguiendo el procedimiento general resumido en el Ejemplo 35, se clasificaron 160 compuestos adquiridos en Chembridge, que interaccionaban con el CYP 3A4. Ocho compuestos en la muestra presentaron una actividad inhibidora mayor que 60%. Las estructuras de seis de éstos, y su porcentaje de actividad inhibidora comparado con el testigo se ilustran en la Figura 14. Como comprenderán los expertos en la técnica, los sustratos que contienen conector oximetilo son útiles para detectar compuestos con subestructuras relacionadas así como compuestos que no están estructuralmente relacionados que presentan actividad inhibidora de CYP 3A4. Por ejemplo, un sensor de la presente invención reveló actividad inhibidora para dos compuestos que contenían subestructuras aromáticas planas y con tiourea (Figura 14, cuadro de la izquierda), y se identificaron potentes inhibidores que tenían subestructuras de idonio (Figura 14, cuadro central). También se identificó que tenían actividad inhibidora otros dos compuestos menos estrechamente relacionados estructuralmente con resto anilina y/o heterocíclico.
Ejemplo 38 Procedimiento para seleccionar compuestos que interaccionan con el CYP 2D6
Se llevó a cabo y se describe un procedimiento de ensayo general para el ensayo de inhibición de la isozima CYP 2D6 usando sensores que contienen conector oxifenilmetilo de esta invención. Las Tablas 17 y 18 listan las condiciones del tampón específicas usadas con esta enzima. Los ensayos se llevaron a cabo en placas de fondo transparente y paredes negras de 96 pocillos, con 100 \mul/pocillo a temperatura ambiente. La fluorescencia se midió en un lector de fluorescencia de placas de microvaloración.
Se disolvió el sustrato MOBFC en acetonitrilo para preparar soluciones madre 10 mM, por adición de 100 \mul de acetonitrilo a un vial que contenía 1 \mumol de sustrato. Las soluciones madre de sustrato eran estables cuando se almacenaban a 4ºC en la oscuridad. El patrón de colorante 7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina se preparó con concentración 1 mM en DMSO. Todas las soluciones acuosas se prepararon al principio del experimento y se mantuvieron en hielo hasta su uso.
1. Se dispensó un nanomol de compuesto de ensayo o inhibidor en el pocillo de la placa en agua destilada (40 \mul de compuesto 25 \muM en agua destilada), para una concentración final de ensayo del compuesto 10 \muM.
Alternativamente, los compuestos se dispensan de una solución orgánica y se secan en la placa, en cuyo caso se añaden 40 \mul/pocillo de agua destilada y la placa se incuba a 37ºC durante 1 h para ayudar a la redisolución de los compuestos. Los pocillos testigo recibieron los testigos de inhibición adecuados para cada isozima. También se añaden los inhibidores a los pocillos que contienen los patrones colorantes para permitir la adición de sustrato y enzima a todos los pocillos de la placa.
2. Se añadieron 20 \mul/pocillo de tampón K+ fosfato 300 mM, pH 8,0.
3. Se añadieron 30 \mul/pocillo de tampón de enzima/sistema reciclado. Se añadieron los patrones de colorantes a los pocillos adecuados en la placa. Se añadieron 10 \mul/pocillo de los patrones de colorantes para tener concentraciones de ensayo finales de 5, 2,5 y 1,25 \muM.
TABLA 17 Concentración de los ingredientes en las soluciones madre de tampón de enzima/sistema reciclado (3,3X)
2D6
K+ fosfato, pH 8,0 (mM) 100
Glucosa-6-fosfato (mM) 11
Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (unidades/ml) 1,33
MgCl_{2} (mM) 33,33
Enzima (nanoM) 66
Equivalente a pmoles/pocillo 2
4. Las placas se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente para ayudar a la interacción de los compuestos con las isozimas (en ausencia de recuperación de la enzima). Se tomó una lectura previa de la placa.
5. Se añadieron 10 \mul/pocillo de tampón de sustrato/NADP+ en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. Inmediatamente después, la placa se transfirió al lector de fluorescencia de las placas de microvaloración para los análisis cinéticos, o alternativamente, la placa se deja reposar en la oscuridad durante el tiempo de reacción adecuado (Tabla 18) y se toma una lectura de punto final en el tiempo adecuado.
TABLA 18 Tampón de sustrato/NADP+ (10X)
2D6
Nombre del sustrato MOBFC
Sustrato (\muM) 50
NADP+ (mM) 0,3
Tiempo de ensayo (minutos) 120
Excitación, centro (ancho)/ 405(40)/
Emisión, centro (ancho) 490(40) 
\newpage
Ejemplo 39 Selección de 240 compuestos que interaccionan con el CYP 2D6
Siguiendo el procedimiento general resumido en el Ejemplo 38, se seleccionaron 240 compuestos adquiridos en Chembridge (incluyendo los compuestos seleccionados en el ejemplo 36) que interaccionaban con el CYP 2D6. Se dispensó un nanomol de compuesto por pocillo, ochenta por placa de 96 pocillos. En los 16 pocillos restantes se dispensó: 1 nmol de quinidina como testigo para 100% de inhibición y patrón del producto de fluorescencia
(7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina). Los resultados de aplicar el procedimiento resumido en el Ejemplo 38 con MOBFC 5 \muM como sustrato, se ilustran en la Figura 15. Se representó gráficamente la potencia de los compuestos en la muestra expresada en % de inhibición, comparado con el testigo quinidina para todos los compuestos. Se detectaron varios compuestos con potencia intermedia (30-60% de inhibición respecto al testigo). Aproximadamente 10% de los compuestos en la muestra presentaron actividad inhibidora mayor que 60%. Como comprenderán los expertos en la técnica, estos resultados demuestran que los sensores que contienen el conector oxifenilmetilo de la presente invención son útiles, por ejemplo, para detectar la actividad inhibidora del CYP 2CD en una variedad y/o matriz de compuestos.
Ejemplo 40 Detección de subestructuras de compuestos que se correlacionan con la actividad inhibidora del CYP 2D6
Siguiendo el procedimiento general resumido en el Ejemplo 38, se seleccionaron 240 compuestos adquiridos en Chembridge, que interaccionaban con CYP 2D6. Aproximadamente diez por ciento de los compuestos en la matriz de muestra presentaron una actividad inhibidora mayor que 60%. Las estructuras de siete de estos, y sus porcentajes de actividad inhibidora comparada con el testigo se ilustran en la Figura 16. Como comprenderán los expertos en la técnica, los sensores que contienen conector oxifenilmetilo de la presente invención son útiles, por ejemplo, para detectar compuestos con subestructuras relacionadas, así como para detectar compuestos que no están estructuralmente relacionados que presentan actividad inhibidora del CYP 2D6. Por ejemplo, un sensor de la presente invención reveló actividad inhibidora de tres compuestos estructuralmente relacionados que contenían subestructuras de ortofenilendiamina (Figura 16, cuadro de la izquierda), y reveló potentes inhibidores que tenían subestructuras de idonio (Figura 16, cuadro central). También se determinó que tenían actividad inhibidora otros tres compuestos menos estrechamente relacionados estructuralmente, que contenía cada uno restos que estaban cargados positivamente a pH neutro.
Ejemplo 41 Método para detectar si la actividad inhibidora de un compuesto frente a una isozima CYP450 depende de su metabolismo o de la activación por la enzima
Las enzimas CYP450 son inhibidas por compuestos que interfieren con la unión del sustrato, la unión del oxígeno molecular, y/o con la etapa catalítica en la que se oxida el sustrato. Véase Ortiz de Montellano, P.R., Correira, M.A., "Inhibition of cytochrome P450 enzymes". En Cythocrome P450: Structure, mechanism and biochemistry, 2nd edition, Plenum Press, New York (1995), 205-364. Los compuestos que se pueden unir al resto hemo en el sitio activo en su estado férrico o ferroso, inhiben la enzima; siendo particularmente potentes los compuestos que tienen afinidad por restos estructurales adicionales en el sitio activo de la enzima. Por ejemplo, los compuestos que contienen funciones imidazol y piridina se pueden unir al hierro hemo. Adicionalmente, una variedad de compuestos con azufre, y derivados que contienen olefina y que contienen acetileno, inhiben las enzimas CYP450 por activación a especies que se pueden unir covalentemente al sitio activo de las enzimas. También, algunos compuestos que contienen amina son metabolizados a productos intermedios que se unen fuertemente al hemo ferroso.
Los sensores de CYP450 de esta invención se han usado para evaluar si la potencia de inhibición del CYP450 por un compuesto o candidato a fármaco depende de la recuperación (metabolismo) dependiente de NADPH del compuesto. El procedimiento empleado usa la observación de que un inhibidor que es activado por la enzima a un producto intermedio que se une irreversiblemente al sitio activo de la enzima, tal como el llamado inhibidor suicida, inhibe progresivamente la enzima de una forma dependiente del tiempo. Esta observación está en contraste con un inhibidor competitivo verdadero cuya potencia varía poco (o posiblemente puede disminuir si es metabolizado) después de preincubar el compuesto con la enzima CYP450 en condiciones que permitan la recuperación de la enzima. Un compuesto que es metabolizado en un inhibidor potente o cuya recuperación "elimina la enzima" (inhibidor no competitivo, suicida), parecerá mas potente si se incuba previamente con la enzima en condiciones que permitan el metabolismo de dicho compuestos, ya que la inhibición es dependiente del metabolismo y por lo tanto progresiva con el tiempo. Como comprenderán los expertos en la técnica, pueden existir compuestos que pueden actuar como inhibidores suicidas que producen la inhibición progresiva y como inhibidores competitivos de la enzima. Los compuestos de esta invención se pueden usar para evaluar si un compuesto inhibe una isozima CYP450 de una forma dependiente del metabolismo y dependiente del tiempo.
A continuación se describen procedimientos de ensayo experimentales usados para la isozima CYP 3A4. Estos procedimientos permiten evaluar la inhibición dependiente del metabolismo progresiva de la enzima usando sensores de esta invención. Las tablas 19-22 listan las condiciones del tampón específicas usadas con esta enzima. Los ensayos se llevaron a cabo en placas de fondo transparente y paredes negras de 96 pocillos, con 100 \mul/pocillo a temperatura ambiente. La fluorescencia se midió en un lector de fluorescencia de placas de microvaloración.
Se disolvió el sustrato BOMR a una concentración 2 mM en acetonitrilo (se añaden 500 \mul de acetonitrilo a un vial que contiene 1 \mumol de sustrato). Se disolvió sustrato BOMCC en acetonitrilo para preparar soluciones madre 10 mM por adición de 100 \mul de acetonitrilo a un vial que contenía 1 \mumol de sustrato. Se disolvió sustrato DBOMF en acetonitrilo para preparar una solución madre 2 mM por adición de 500 \mul de acetonitrilo a un vial que contenía 1 \mumol de sustrato. Se disolvió patrón de colorante resorufina sódica en agua destilada a 1 mM, se preparó patrón de colorante 3-ciano-7-hidroxicumarina 1 mM en DMSO. Se preparó patrón de colorante fluoresceína 1 mM en DMSO. Todas las soluciones acuosas se prepararon recientes al inicio del experimento y se guardaron en hielo hasta su uso.
Los ensayos se llevaron a cabo en dos condiciones. Condiciones A (etapas A1-A5) y Condiciones B (Etapas B1-B5). Los resultados se resumen en la Tabla 23.
Condiciones experimentales. Condiciones A:
Se dispensó un nanomol de compuesto de ensayo o inhibidor en el pocillo de la placa en agua destilada (40 \mul de compuesto 25 \muM en agua destilada), para tener una concentración de ensayo final del compuesto 10 \muM.
6. Se añadieron 20 \mul/pocillo de tampón K+ fosfato 300 mM, pH 8,0.
7. Se añadieron 30 \mul/pocillo de tampón de enzima/sistema reciclado (Véase Tabla 19). Los patrones de colorantes se añadieron a los pocillos adecuados de la placa. Se añadieron 10 \mul/pocillo de los patrones de colorante para tener concentraciones de ensayo finales 5, 2,5 y 1,25 \muM.
TABLA 19 Concentración de los ingredientes en las soluciones madre de tampón de enzima/sistema reciclado (3,3X)
BOMR BOMCC DBOMF
K+ fosfato, pH 8,0 (mM) 100 100 100
Glucosa-6-fosfato (mM) 11 11 11
Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (unidades/ml) 1,33 1,33 1,33
MgCl_{2} (mM) 33,33 33,33 33,33
Enzima (nanoM) 16,5 16,5 16,5
Equivalente a pmoles/pocillo 0,5 0,5 0,5
8. Las placas se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente para ayudar a la interacción de los compuestos con el CYP 3A4 (en ausencia de recuperación de la enzima). Se tomó una lectura previa de la placa. (Véase la Tabla 20 para los filtros de excitación y emisión usados para cada sustrato).
9. Se añadieron 10 \mul/pocillo de tampón de sustrato/NADP+ en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0 (Tabla 20). Inmediatamente después, las placas se transfirieron al lector de fluorescencia de placas de microvaloración para los análisis cinéticos.
TABLA 20 Tampón de sustrato/NADP+ (10X)
Nombre del sustrato BOMR BOMCC DBOMF
Sustrato (\muM) 50 200 50
NADP+ (mM) 1 1 1
Tiempo del ensayo (minutos) 45 45 45
Excitación, centro (ancho)/ 530(25)/ 405(20)/ 485(20)/
Emisión, centro (ancho) 605(55) 460(40) 530(25)
Condiciones experimentales. Condiciones B:
Se dispensó un nanomol de compuesto de ensayo o inhibidor en el pocillo de la placa en agua destilada (40 \mul de compuesto 25 \muM en agua destilada), para tener una concentración de ensayo final del compuesto 10 \muM.
B1. Se añadieron 20 \mul/pocillo de tampón K+ fosfato 300 mM, pH 8,0.
B2. Se añadieron 30 \mul/pocillo de tampón de enzima/sistema reciclado (Véase Tabla 21). Los patrones de colorantes se añadieron a los pocillos adecuados de la placa. Se añadieron 10 \mul/pocillo de los patrones de colorante para tener concentraciones de ensayo finales 5, 2,5 y 1,25 \muM.
TABLA 21 Concentración de los ingredientes en las soluciones madre de tampón de enzima/sistema de reciclaje (3,3X)
BOMR BOMCC DBOMF
K+ fosfato, pH 8,0 (mM) 100 100 100
Glucosa-6-fosfato (mM) 11 11 11
Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (unidades/ml) 1,33 1,33 1,33
NADP+ (mM) 0,33 0,33 0,33
MgCl_{2} (mM) 33,33 33,33 33,33
Enzima (nanoM) 16,5 16,5 16,5
Equivalente a pmoles/pocillo 0,5 0,5 0,5
B3. Las placas se incubaron durante 40 minutos a temperatura ambiente en presencia de NADP+ para permitir la interacción de los compuestos con el CYP 3A4 en condiciones que permitan la recuperación de la enzima. Se tomaron lecturas previas de las placas. (Véase la Tabla 22 para los filtros de excitación y emisión usados para cada sustrato).
B4. Se añadieron 10 \mul/pocillo de tampón de sustrato en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0 (Tabla 22). Inmediatamente después, la placa se transfirió al lector de fluorescencia de placas de microvaloración para los análisis cinéticos.
TABLA 22 Tampón de sustrato/NADP+ (10X)
Nombre del sustrato BOMR BOMCC DBOMF
Sustrato (\muM) 50 200 20
Tiempo de ensayo (minutos) 20 20 20
Excitación, centro (ancho)/ 530(25)/ 405(20)/ 485(20)/
Emisión, centro (ancho) 605(55) 460(40) 530(25)
Se recogieron los datos de las intensidades de fluorescencia en cada pocillo que contenía 1 nanomol de fármacos como se lista en la Tabla 23. Los datos se convirtieron para reflejar el porcentaje de inhibición en relación al testigo. Los testigos eran clotrimazol 10 \muM para las Condiciones A, y elipticina 10 \muM para las Condiciones B. Los resultados se presentan en la Tabla 23, en la que se lista el porcentaje de inhibición del metabolismo de BOMR, BOMCC y DBOMF para 15 fármacos, tanto en Condiciones A como en Condiciones B. Algunos fármacos candidatos (los nueve fármacos superiores de la lista) eran inhibidores más potentes del metabolismo de los sensores de esta invención en condiciones que permitían el metabolismo del compuesto (condiciones B), que en condiciones A. Algunas diferencias de los valores del porcentaje de inhibición para los fármacos ensayados en las condiciones separadas se indican en tipo negrita (Tabla 23). La DBOMF era particularmente insensible a la inhibición por los fármacos en las condiciones A, pero indicaba fiablemente la inhibición dependiente del metabolismo de los mismos (condiciones B). Los datos para la DBOMF indicaban que los nueve fármacos candidatos superiores (diciclomina, verapamilo, elipticina, eritromicina, clemastina, aniodarona, mifepristona, doxorrubicina, papaverina) tienen al menos actividad inhibidora parcial dependiente del metabolismo frente a la isozima CYP3A4. Como comprenderán los expertos en la técnica, los sensores de esta invención son útiles para evaluar si un producto químico, compuesto de ensayo, candidato a fármaco o fármaco, actúa como un inhibidor dependiente de la recuperación de una isozima CYP450. Además, los compuestos, caracterizados como inhibidores suicidas o sustratos suicidas, agentes químicos eliminadores de CYP450, o inhibidores no competitivos de CYP450, pueden presentar inhibición dependiente de la recuperación de una isozima CYP450 y se pueden detectar usando sensores de esta invención. También se pueden detectar compuestos de ensayo que se convierten en metabolitos con la actividad inhibidora de CYP450 (inhibidores del producto).
TABLA 23 Actividad inhibidora del CYP 3A4 de 15 fármacos en condiciones A y B, evaluada por sensores de esta invención (BOMR, BOMCC, DBOMF)
Sustrato BOMR BOMCC DBOMF
Condiciones A B A B A B
Diclomicina 77 97 76 98 30 86
Verapamilo 83 95 88 101 36 89
Elipticina 97 100 92 100 40 100
Eritromicina 90 99 93 98 30 85
Clemastina 62 85 82 95 32 80
Amiodarona 35 71 73 98 1 77
Mifepristona 35 81 93 98 22 98
Doxorrubicina 29 72 81 79 3 33
Papaverina 69 92 34 99 48 90
Ticlopidina 77 84 13 55 -9 3
Isoniazod -8 30 59 48 -9 3
Nitrofurantoína -19 27 44 33 -9 -3
Difenilhidantoína -27 24 -11 21 21 5
Oxoprenolol -5 13 7 21 1 3
Ketoconazol 89 97 91 97 98 99
Las cifras se dan como % de inhibición comparado con 100% de inhibición del testigo.

Claims (23)

1. Un compuesto que tiene la estructura:
Y-L-Q en la que:
Y se selecciona del grupo que consta de Q como se ha definido en la presente invención, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido; en la que si Y se selecciona de Q como se ha definido en la presente invención, L es L', en el que L' se selecciona del grupo de -(CR^{4}H)(-OCR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H) (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H)(-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y -(CR^{4}H) (-O(fenil para sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en los que cada R^{2} y cada R^{4} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce.
L tiene la estructura química L', como se ha definido en la presente invención, o (-OCR^{2}H)_{p}-, en el que R^{2} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce; y
Q tiene un estructura seleccionada del grupo que consta de las siguientes estructuras:
\vskip1.000000\baselineskip
86 
\vskip1.000000\baselineskip
87 
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88
89 
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90 
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91 
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92
93 
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94 
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95 
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96
97 
\vskip1.000000\baselineskip
98
en las que:
m es un número entero positivo no mayor que cinco;
R_{a}, R_{b}, R_{c}, R_{d}, R_{e}, R_{f}, R_{g}, R_{h}, R_{i}, R_{j}, R_{k}, y R_{l}, se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro, azido,
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c},
-CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s};
R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, y heteroarilo sustituido, y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático;
R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano, y puede constituir partes de un homo o heterociclo alifático o aromático;
A se selecciona del grupo que consta de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, SO, SO_{2}, C(CH_{3})_{2} y C(CF_{3})_{2};
E y E' se seleccionan por separado del grupo que consta de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre y NR_{n1};
G se selecciona del grupo que consta de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, y NR_{n1}R_{n2}, en el que si G se selecciona de NR_{n1}R_{n2}, G y R_{c} así como G y R_{d} pueden constituir partes de un heterociclo; y
T se selecciona del grupo que consta de un átomo de oxígeno y NR_{n1}.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Y se selecciona del grupo que consta de alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
3. El compuesto de la reivindicación 2, en el que Y se selecciona del grupo que consta de alquilo C_{1}-C_{8}, alquenilo C_{1}-C_{8}, alquilo C_{2}-C_{8} sustituido, alquenilo C_{2}-C_{8} sustituido, alcoxialquilo, arilo, arilo sustituido, aminoalquilo terciario y cuaternario, y grupos guanidinio-alquilo.
4. El compuesto de la reivindicación 3, en el que Y se selecciona del grupo que consta de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, octilo, y bencilo.
5. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en el que T es un átomo de oxígeno y G es un átomo de oxígeno.
6. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, ó 4, en el que m es un número entero positivo no mayor que dos.
7. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, ó 4, en el que m es igual a uno.
8. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, ó 4, en el que Q es un fluoróforo fenóxido.
9. El compuesto de la reivindicación 8, en el que Q es un fluoróforo fenóxido seleccionado del grupo que consta de un derivado de 7-hidroxicumarina, una resorufina, y una fluoresceína.
10. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, ó 4, en el que R^{2} y R^{4} son átomos de hidrógeno para todos los valores de p.
11. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 10, en el que p es igual a uno.
12. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, seleccionado del grupo que consta de:
benciloximetilresorufina (BOMR),
7-(p-metoxibenciloxi)-4-trifluorocumarina (MOBFC),
7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina (BOMCC),
etiloximetilresorufina (EOMR),
7-etiloximetiloxi-3-cianocumarina (EOMCC),
7-metiloximetiloxi-3-cianocumarina (MOMCC),
7-metiloximetiloxi-4-trifluorocumarina (MOMFC),
7-(p-metoxibenciloxi)-4-trifluorocumarina (MOBFC),
n-octiloximetilresorufina (OOMR),
7-benciloximetiloxi-9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona) (BOM-DDAO),
n-octiloximetil-trifluorometilcumarina (OOMCC),
metiloximetilresorufina (MOMR),
99
para-metoxibencilresorufina (MOBR),
dibenciloximetilfluoresceina (DBOMF), y
benciloximetilfluoresceina (BOMF).
13. Un método para cuantificar la actividad de una enzima CYP450, usando el compuesto de la reivindicación 1, 3, 7, 9, 11 ó 12.
14. Un método para seleccionar un compuesto candidato con actividad como sustrato de al menos una enzima CYP450, que comprende las etapas de:
poner en contacto una enzima CYP450 con el compuesto candidato y un compuesto reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, 3, 7, 9, 11 ó 12; y
detectar una señal óptica, si hay alguna, que resulta de la interacción del compuesto reactivo con la enzima CYP450.
15. Un método para seleccionar un compuesto candidato con actividad inhibidora de CYP450, que comprende las etapas de:
poner en contacto el compuesto candidato con una enzima CYP450;
poner en contacto la enzima CYP450 con un compuesto reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, 3, 7, 9, 11 ó 12; y
detectar una señal óptica, si hay alguna, que resulta de la interacción del compuesto reactivo con la enzima CYP450.
16. Un método para seleccionar un compuesto candidato, que comprende:
una etapa para ensayar la eficacia del compuesto candidato,
una etapa para ensayar la toxicidad del compuesto candidato, y
una etapa para ensayar la actividad del compuesto candidato como sustrato o como inhibidor de al menos una enzima CYP450 usando un compuesto reactivo de acuerdo con las reivindicaciones 1, 3, 7, 9, 11 ó 12.
17. El método de la reivindicación 15 ó 16, en el que el compuesto reactivo interacciona con la enzima CYP450 como un inhibidor competitivo o no competitivo.
18. El método de la reivindicación 14, 15 ó 16, en el que el método comprende una selección de ultra alta producción de una biblioteca de compuestos fluorogénicos candidatos.
19. El método de la reivindicación 13, 14 ó 15, en el que la enzima CYP450 es una enzima CYP450 humana.
20. El método de la reivindicación 14, 15 ó 16, en el que el compuesto candidato es un miembro de la biblioteca de derivados de fármacos.
21. El método de la reivindicación 13, 14, 15 ó 16, en el que la enzima CYP450 se selecciona del grupo que consta de CYP 3A4, CYP 2D6, CYP 2C9, CYP 2C19, CYP 2C8, CYP 2A1, CYP 2B6, CYP 2E1 y CYP 1A2.
22. Un fármaco candidato seleccionado de acuerdo con el método de la reivindicación 14, 15, 16, 18, 19, 20, ó 21.
23. Un método para cuantificar la actividad de una enzima CYP450, seleccionar un compuesto candidato con actividad como sustrato de al menos una enzima CYP450, o seleccionar un compuesto candidato con actividad como inhibidor de al menos una enzima CYP450, usando un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
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