ES2199605T3 - Indicadores moleculares opticos de actividad del citocromo p450. - Google Patents
Indicadores moleculares opticos de actividad del citocromo p450.Info
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Abstract
Un compuesto que tiene la estructura: Y-L-Q en la que: Y se selecciona del grupo que consta de Q como se ha definido en la presente invención, alquilo C1-C20 saturado, alquenilo C1-C20 insaturado, alquinilo C1-C20 insaturado, alquilo C1-C20 saturado sustituido, alquenilo C1-C20 insaturado sustituido, alquinilo C1-C20 insaturado sustituido, cicloalquilo C1-C20, cicloalquenilo C1-C20, cicloalquilo C1-C20 saturado sustituido, cicloalquenilo C1- C20 insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido; en la que si Y se selecciona de Q como se ha definido en la presente invención, L es L'', en el que L'' se selecciona del grupo de -(CR4H)(-OCR2H)p-, -(CR4H) (-O(fenil orto sustituido)CR2H)p-, -(CR4H)(-O(fenil meta sustituido)CR2H)p-, y -(CR4H) (- O(fenil para sustituido)CR2H)p-, en los que cada R2 y cada R4 se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C1-C20 saturado, alquenilo C1- C20 insaturado, alquinilo C1-C20 insaturado, alquilo C1-C20 saturado sustituido, alquenilo C1-C20 insaturado sustituido, alquinilo C1-C20 insaturado sustituido, cicloalquilo C1-C20, cicloalquenilo C1-C20, cicloalquilo C1- C20 saturado sustituido, cicloalquenilo C1-C20 insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce.
Description
Indicadores moleculares ópticos de actividad del
citocromo P450.
Esta invención se desarrolló en parte con la
subvención número 1R43GM60114-01 del Instituto
Nacional de Ciencias Médicas Generales. El gobierno puede tener
algunos derechos en esta invención.
Esta invención se refiere a nuevos compuestos
químicos, útiles como indicadores ópticos de la actividad del
citocromo P450, y especialmente a indicadores fluorogénicos de la
actividad del citocromo P450. Más específicamente, la invención se
refiere a compuestos que contienen grupo éter con la estructura
genérica Y-L-Q, y a métodos para
ensayar sustratos e inhibidores de enzimas citocromo P450 usando
estos compuestos en formatos de ensayo tradicionales, así como en
formatos de selección de alta y ultra alta producción.
La familia de enzimas citocromo P450 (CYP450)
comprende enzimas oxidasas implicadas en el metabolismo xenobiótico
de fármacos hidrófobos, carcinógenos, y otros compuestos y
metabolitos potencialmente tóxicos que circulan por la sangre. Se
sabe que el hígado es el órgano principal para el metabolismo
xenobiótico, y que contiene altos niveles de
CYP450-oxidasa de función mixta. Hay muchas
subfamilias de enzimas P450 humanas, a menudo denominadas
"isozimas" o "isoformas". Se sabe que las de las
subfamilias CYP 3A4, CYP 2D6, CYP 2C, CYP 2A1 y CYP 2E1, son
importantes en el metabolismo de fármacos. Véase, por ejemplo,
Murray, M., 23 Clin. Pharmacokinetics 132-46
(1992). De estas isoformas, el CYP 3A4 es de lejos la isoforma
principal en el hígado y el intestino delgado, comprendiendo 30% y
70% respectivamente de la proteína CYP450 total en estos tejidos.
Basándose principalmente en estudios in vitro, se ha
calculado que el metabolismo de 40% a 50% de todos los fármacos
usados en seres humanos implica oxidaciones catalizadas por el CYP
3A4. Véase Thummel, K.E. & Wilkinson, G.R. In
vitro and In vivo Drug Interactions
Involving Human CYP 3A, 38 Ann. Rev. Pharmacol.
Toxicol., 389-430 (1998).
El metabolismo eficaz de un fármaco candidato por
una enzima CYP450 puede conducir a propiedades farmacocinéticas
pobres, mientras que fármacos candidatos que actúan como potentes
inhibidores de una enzima CYP450 pueden producir interacciones
fármaco-fármaco indeseables, cuando se administran
con otros fármacos que interaccionan con el mismo CYP450. Véase,
por ejemplo, Peck, C.C. et al., Understanding Consequences of
Concurrent Therapies, 269 JAMA 1550-52
(1993). De acuerdo con esto, una indicación fiable y temprana de que
un fármaco candidato interacciona (es decir, es un sustrato o
inhibidor) con un CYP450 puede reducir mucho el ciclo de
descubrimiento de la investigación y desarrollo farmacéutico, y por
lo tanto puede reducir el tiempo necesario para comercializar el
fármaco candidato. Por consiguiente, esta información
farmacocinética del CYP450 fiable y de la que se puede disponer
pronto, puede dar como resultado costes de desarrollo de fármacos
muy reducidos y/o aumento de los beneficios por la entrada antes en
el mercado. Además, esta información farmacocinética del CYP450
fiable y de la que se puede disponer pronto, puede permitir que un
fármaco candidato llegue al público antes, con menores costes de lo
que sería posible de otra forma. De acuerdo con esto, recientemente
los estudios farmacocinéticos exhaustivos de interacciones de
fármacos en seres humanos se han convertido en una parte integrante
del desarrollo farmacéutico de fármacos y de los procedimientos de
evaluación de la seguridad. Véase, por ejemplo, Parkinson, A.,
24 Toxicological Pathology 45-57 (1996). Por
lo tanto se desean metodologías que permitan (1) la adquisición más
rápida de información sobre las interacciones de los fármacos
candidatos con enzimas CYP450, antes en el proceso de
descubrimiento del fármaco de lo que es posible actualmente, y por
lo tanto, que permitan (2) la eliminación más pronto de compuestos
y series químicas inadecuadas con esfuerzos de desarrollo
adicionales.
La necesidad de información en relación con las
interacciones del candidato a fármaco/CYP450 ha creado una
necesidad concurrente de ensayos suficientemente sensibles para
ensayar, de una forma rentable, las interacciones de amplios
conjuntos de compuestos con las principales enzimas CYP450 humanas
implicadas en el metabolismo de fármacos. Algunas técnicas
conocidas, incluyendo (1) ensayos de inhibición de CYP450 en los
que se produce el metabolismo del metabolito conocido del CYP450 en
presencia del compuesto de ensayo, seguido de parada de la reacción
de la enzima y análisis del grado de metabolismo, (2) metabolismo
por CYP450 de análogos del compuesto de ensayo radiomarcados, y (3)
dosificación "cassette" in vivo de animales
(normalmente ratas, perros o monos), véase Berman, J. et al.,
"Simultaneous Pharmacokinetic Screening of a Mixture of Compounds
in the Dog using API LC/MS/MS Analysis for Increased Throughput"
40 J. Medicinal Chemistry, 827-29 (1997), no
se pueden adaptar a la miniaturización, o a los otros requisitos de
selección de alta o ultra alta producción.
Sin embargo, los ensayos ópticos que usan, por
ejemplo, cromóforos o fenoles luminiscentes, y especialmente los
ensayos basados en fluorescencia se pueden adaptar a la
miniaturización y a la selección de alta o ultra alta producción.
Particularmente, se han usado ensayos basados en fluorescencia en
estudios farmacocinéticos de interacciones de fármacos en seres
humanos, más particularmente en ensayos que implican cultivos de
hepatocitos humanos, donde el número de células disponibles está
seriamente limitado. Véase Donato, M.T. et al., 213 Anal.
Biochem. 29-33 (1993).
Específicamente, los sustratos fluorogénicos del
citocromo P450 han estado disponibles en el comercio durante una
serie de años, por ejemplo en Molecular Probes, Inc. (Eugen,
Oregón), SIGMA (St. Louis, Misuri), y más recientemente en GENTEST
Corp. (Woburn, Massachusetts). En general, estos sustratos
fluorogénicos conocidos del CYP450 son derivados éter de
fluoróforos de tipo fenóxido bien conocidos, incluyendo:
7-hidroxicumarina, fluoresceína, y resorufina. Así,
en general, las enzimas CYP450 catalizarán una reacción de
desalquilación y convertirán el sustrato éter relativamente no
fluorescente en un producto que contiene fenóxido relativamente
mucho más fluorescente.
Sin embargo, incluso los sustratos fluorogénicos
del CYP450 más recientemente desarrollados o tienen cinéticas
relativamente pobres, o los productos enzimáticos no tienen las
propiedades físicas y ópticas deseadas para permitir la reducción
de la cantidad de enzima necesaria a niveles que harían la
selección a gran escala razonable y viable. Más específicamente,
estos sustratos fluorogénicos del CYP450 presentan velocidades de
recuperación relativamente pequeñas, poca solubilidad acuosa, bajos
coeficientes de extinción y rendimientos cuánticos, y/o
fluorescencia débil del colorante fenólico resultante. Además,
algunos de estos sustratos fluorogénicos de CYP450 se excitan en el
espectro ultravioleta, en oposición al visible, y por lo tanto sus
señales a menudo están enmascaradas por el fondo que resulta del
compuesto de ensayo sin reaccionar. Finalmente, la mayoría de estos
sustratos fluorogénicos del CYP450 no son específicos para la
isozima CYP450 que se supone que detectan, y por lo tanto no se
pueden usar para mediciones en preparaciones microsomales de hígado
humano, un método analítico preferido que evita potenciales
productos producidos por el método alternativo de usar una
preparación microsomal de células de insecto. Véase Palamanda J.R.
et al., "Validation of a rapid microtiter plate assay to conduct
cytochrome P450 2D6 enzyme inhibition studies", 3 Drug
Discovery Today, 446-470 (1998). Por estas y
otras razones, existe una necesidad no satisfecha de sustratos del
CYP450 ópticos, y especialmente fluorogénicos, que presenten
especificidad por la isozima CYP450, mejores cinéticas, y que den
productos enzimáticos que tengan mejores propiedades físicas y
ópticas, para usar en la selección de interacciones de
CYP450/candidato a fármaco, especialmente para usar en la selección
de alta o ultra alta producción, y como parte del proceso de
descubrimiento de un fármaco.
La invención proporciona un compuesto útil como
una sonda, modulador o sensor óptico de la actividad de al menos
una enzima citocromo P450. La sonda óptica de la invención es un
compuesto que tiene la estructura genérica
Y-L-Q, en la que Y se selecciona
del grupo que consta de Q como se define en la presente invención
(tal que la sonda tiene la estructura general
Q-L'-Q), y alquilo
C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido; L se selecciona del grupo de (-OCR^{2}H)_{p}-, (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, (-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y (-O(fenil para sustituido)
CR^{2}H)_{p}-, y L' se selecciona del grupo de -(CR^{4}H)(-OCR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H) (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H)
(-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y -(CR^{4}H)(-O(fenil para sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en los que para cada p, cada R^{2} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce; y Q es un resto químico que da lugar a propiedades ópticas en su forma hidroxi o hidroxilato, fenol o fenóxido que son diferentes de las propiedades ópticas que surgen de su forma éter. Más preferiblemente, p es uno, R^{2} es hidrógeno, y Q es la forma éter de un fluoróforo fenóxido. Más preferiblemente, la forma éter del fluoróforo fenóxido son derivados éter de los fluoróforos de tipo fenóxido conocidos 7-hidroxicumarina, fluoresceína, y resorufina.
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido; L se selecciona del grupo de (-OCR^{2}H)_{p}-, (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, (-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y (-O(fenil para sustituido)
CR^{2}H)_{p}-, y L' se selecciona del grupo de -(CR^{4}H)(-OCR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H) (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H)
(-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y -(CR^{4}H)(-O(fenil para sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en los que para cada p, cada R^{2} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce; y Q es un resto químico que da lugar a propiedades ópticas en su forma hidroxi o hidroxilato, fenol o fenóxido que son diferentes de las propiedades ópticas que surgen de su forma éter. Más preferiblemente, p es uno, R^{2} es hidrógeno, y Q es la forma éter de un fluoróforo fenóxido. Más preferiblemente, la forma éter del fluoróforo fenóxido son derivados éter de los fluoróforos de tipo fenóxido conocidos 7-hidroxicumarina, fluoresceína, y resorufina.
La invención también proporciona métodos para
usar los compuestos sensores ópticos de la invención para
determinar si un fármaco candidato, o una clase de fármacos
candidatos, es un sustrato del CYP450 y/o si el fármaco candidato, o
la clase de fármacos candidatos, es un inhibidor del CYP450, y
métodos relacionados para seleccionar un fármaco candidato, y para
formular y administrar dicho fármaco, habiendo determinado que el
fármaco no será metabolizado por al menos una enzima CYP450, y/o
que el fármaco no actuará como un inhibidor de al menos una enzima
CYP450, y por lo tanto, habiendo determinado que el fármaco no será
metabolizado demasiado eficazmente por una enzima CYP450 y/o
provocará una interacción fármaco-fármaco
desfavorable, respectivamente. Los métodos para seleccionar el
fármaco candidato de la presente invención pueden ser métodos
convencionales o pueden ser parte de la selección de alta o
ultraalta producción de bibliotecas de candidatos a fármaco.
Los dibujos que acompañan, los cuales se
incorporan y forman parte de la memoria descriptiva, simplemente
ilustran realizaciones de la presente invención. Junto con el resto
de la memoria descriptiva, sirven para explicar los principios de
la invención a los expertos en la técnica. En los dibujos:
La Figura 1 ilustra el Esquema de reacción 1, el
cual muestra un mecanismo de reacción para la desalquilación por el
CYP450 de un sustrato fluorogénico del CYP450 normalmente
disponible, la fenoxazona.
La Figura 2 ilustra el Esquema de reacción 2, el
cual muestra una estructura genérica del sensor/sustrato óptico de
CYP450 de la presente invención, y la reacción de hidroxilación
catalizada por el CYP450.
La Figura 3 ilustra el Esquema de reacción 3, que
compara la reacción de hidroxilación que puede conducir a un
colorante fenólico libre de un sensor óptico de CYP450 conocido
(parte superior) y un compuesto sensor óptico de CYP450 de la
presente invención (parte de abajo).
La Figura 4 ilustra una representación gráfica de
la velocidad de conversión del éter de resorufina por el CYP 3A4 en
función de la concentración de sustrato/sensor del CYP450 para los
compuestos sustrato/sensor del CYP450 de la invención,
benciloximetilresorufina (BOMR) (círculos) y
n-octiloximetilresorufina (OOMR) (diamantes), y en
función del éter bencílico de la resorufina (BR) (triángulos).
La Figura 5 ilustra una representación gráfica
del porcentaje de inhibición del CYP 3A4 en función de la presencia
de inhibidores seleccionados y sustratos fármaco del CYP 3A4, y
demuestra el efecto que estos inhibidores (barras sombreadas con
rayas cruzadas) y sustratos fármaco (barras con rayas diagonales)
tienen en la velocidad de recuperación de un compuesto de la
invención, benciloximetil-éter (BOMR), por la enzima CYP 3A4. La
figura ilustra que los inhibidores reducen la velocidad de
recuperación de la BOMR más de aproximadamente 50%, mientras que
los sustratos fármacos bajan la velocidad de recuperación de la
BOMR hasta aproximadamente 30%.
La Figura 6 ilustra una representación gráfica
del porcentaje de inhibición del CYP 2C19 en función de la
presencia de diferentes fármacos en concentraciones 10 \muM que
interaccionan con el CYP 2C19, y demuestra que se puede usar la
7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina
(BOMCC) como un sensor óptico del CYP450 para detectar los fármacos
candidatos que interaccionan con el CYP 2C19.
La Figura 7 ilustra una representación gráfica
del porcentaje de inhibición del CYP 2C9 en función de la presencia
de diferentes fármacos en concentraciones 10 \muM que
interaccionan con el CYP 2C9, y demuestra que la
7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina
(BOMCC; barras oscuras) y la octiloximetilresorufina (OOMR; barras
claras) se pueden usar como un sensor óptico del CYP450 para
detectar fármacos que interaccionan con el CYP 2C9.
Las Figuras 8, 9, 10, 11 y 12, ilustran la señal
mejor frente al fondo, de los sensores que contienen el conector
oximetilo y oxifenilmetilo de esta invención (señales continuas)
frente a sustratos previos disponibles en el comercio (líneas
discontinuas). La señal de fondo acumulada que resulta de la adición
de NADP^{+} y de la adición del sustrato se manifiesta por una
señal fluorescente mayor que uno, 3 minutos después de la adición
del sustrato (la segunda flecha indica el tiempo de adición del
sustrato). El último aumento de la señal, 4 minutos después de la
2ª adición y en los tiempos posteriores, se debe a la conversión
enzimática del sustrato en el producto. En las figuras 8, 9, 10, 11
y 12, la señal enzimática sobre el fondo de adición de sustrato,
una media del rendimiento del ensayo, es mayor para los sensores
que contienen el conector oximetilo de esta invención (líneas
continuas) que para los sustratos previos disponibles en el
comercio (líneas discontinuas). La Figura 8 ilustra la señal
superior de la BOMR (señal continua) frente a la bencilresorufina
(señal discontinua) con la isozima CYP 3A4. La Figura 9 ilustra la
señal superior de la BOMCC (señal continua) frente a la
7-benciloxi-4-trifluorometilcumarina
(BFC, señal discontinua) con la isozima CYP 3A4. La Figura 10
ilustra la señal superior de la MOBFC (señal continua) frente a
AMMC (Gentest) (señal discontinua) con la isozima CYP 2D6. La
Figura 11 ilustra la señal superior tanto de la OOMR (señal
continua) como de la BOMC (señal continua) frente a la
7-metoxi-4-trifluorometilcumarina
(MFC, señal discontinua) con la isozima CYP 2C9. La Figura 12
ilustra la señal superior de la EOMCC (señal continua) frente a la
3-ciano-7-etoxicumarina
(CEC, señal discontinua) con la isozima CYP 2C19.
La Figura 13 ilustra la utilidad de los sensores
que contienen el conector oximetilo para seleccionar inhibidores
del CYP450. Se hizo una selección de una muestra aleatoria de 160
compuesto adquiridos en Chembridge que inhibían el CYP 3A4 usando
BOMR como sensor para evaluar el grado de inhibición.
La Figura 14 ilustra la utilidad de los sensores
que contienen conector oximetilo para identificar patrones
estructurales en productos químicos que estén asociados con la
inhibición del CYP 3A4.
La Figura 15 ilustra la utilidad de los sensores
que contienen conector oxifenilmetilo en la selección de
inhibidores de CYP450. Se hizo una selección de una muestra
aleatoria de 240 compuestos adquiridos en Chembridge que inhibieran
el CYP 2D6 usando MOBFC como sensor para evaluar el grado de
inhibición.
La Figura 16 ilustra la utilidad de los sensores
que contienen conector oxifenilmetilo para identificar patrones
estructurales en productos químicos, que estén asociados con la
inhibición del CYP 2D6.
Los miembros de la familia de enzimas citocromos
P450 (CYP) catalizan principalmente reacciones de epoxidación e
hidroxilación. La hidroxilación de un éter fenóxido fluorogénico
libera el fenóxido libre que es detectado fácilmente en virtud de
su fluorescencia. Se ha estudiado exhaustivamente los mecanismos de
las reacciones de desalquilación catalizadas por el CYP450 y se
puede prever que transcurren por la vía descrita en el Esquema de
reacción 1, ilustrado en la Fig. 1. Véase Groves, J.T. et al.,
Models and Mechanisms of Cytochrome P450 Action, en
``Cytochrome P450: Structure, Mechanism, Biochemistry'',
Plenum Press, 3-48, 1997. Las pruebas
experimentales sugieren que la etapa determinante de la velocidad
en la reacción es la reacción de abstracción de hidrógeno ilustrada
en la primera etapa del Esquema de reacción 1, ilustrado en la Fig.
1. De acuerdo con esto, se puede desear que un sustrato
fluorogénico con una velocidad de recuperación más rápida,
especialmente en relación con la etapa limitante de la velocidad,
alcance las necesidades inherentes de la técnica. Se proporciona un
tipo de dichos sustratos/sensores, los compuestos sensores ópticos
de la presente invención, en los que la abstracción de cualquiera de
los hidrógenos adicionales todavía genera un compuesto libre y su
forma hidroxi o hidroxilato, normalmente fenóxido, que presenta
propiedades ópticas superiores que las del compuesto en su forma
éter.
La presente invención proporciona, en una
realización preferida, la "inserción" de un conector oximetilo
entre el fluoróforo y el resto éter reactivo unido al grupo lábil.
Dicha "inserción" se lleva a cabo, de acuerdo, por ejemplo, con
los métodos sintéticos de los Ejemplos 1 a 7, que son métodos
preferidos para preparar los sensores ópticos del CYP450 de la
presente invención.
En general, como será evidente cuando los
expertos en la técnica revisen los Ejemplos 1 a 7, los compuestos
de la presente invención se pueden sintetizar de acuerdo con el
siguiente esquema de reacción:
H-Q + R^{3}CH_{2}OCHX
\rightarrow
R^{3}CH_{2}OCH_{2}-Q
en el que X es un grupo lábil adecuado, por
ejemplo un átomo de halógeno, un grupo tosilo, un grupo mesilo, un
grupo triflato, y en el que la reacción se lleva a cabo,
preferiblemente, en presencia de DMF/K_{2}CO_{3},
diisopropiletilamina/DMF a temperaturas iguales o ligeramente por
enzima del punto de congelación del agua; en el que Q es un
compuesto que presenta propiedades ópticas superiores en su forma
hidroxi o hidroxilato, típicamente pero no exclusivamente fenóxido,
que las que tiene en su forma éter, y preferiblemente es un
fluoróforo o un cromóforo, y más preferiblemente es un fluoróforo
seleccionado del grupo que consta de
7-hidroxicumarina, resorufina, y los fluoróforos
fenóxido conocidos; y R^{3} se selecciona del grupo que consta de
Q como se ha definido en la presente invención, R^{1} de los
sustratos fluorogénicos del citocromo P450 conocidos, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
Además, en una descripción más general de los
compuestos de la presente invención, uno de los protones del metilo
del conector se puede sustituir por un grupo químico distinto,
R^{2}, en el que R^{2} se selecciona del grupo que consta de
grupos alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido,
cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado
sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo
sustituido. Además, múltiples grupos oximetilo unidos, o más
general múltiples grupos OCR^{2}H pueden formar el conector del
sensor del CYP450 de la invención. En un conector multímero los
grupos R^{2} se seleccionan independientemente uno de otro. Por
ejemplo, un conector indicado como (CR^{2}H)_{p}
con
p = 3 tiene la siguientes estructura: -(OCR^{2_{(1)}}H)-(OCR^{2_{(2)}}H)-(OCR^{2_{(3)}}H)-, en la que R^{2_{(1)}} y R^{2_{(2)}} y R^{2_{(3)}} se seleccionan independientemente del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
p = 3 tiene la siguientes estructura: -(OCR^{2_{(1)}}H)-(OCR^{2_{(2)}}H)-(OCR^{2_{(3)}}H)-, en la que R^{2_{(1)}} y R^{2_{(2)}} y R^{2_{(3)}} se seleccionan independientemente del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
compuestos, útiles como sondas ópticas para cuantificar la
actividad de al menos una enzima citocromo P450; teniendo dicho
compuesto la estructura genérica
Y-L-Q en la que:
Y se selecciona del grupo que consta de (i) Q
como se define en la presente invención, siempre que L sea L' como
se define en la presente invención, y (ii) el grupo consta de
alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido,
cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
L se selecciona del grupo de
(-OCR^{2}H)_{p}-, (-O(fenil orto
sustituido)CR^{2}H)_{p}-, (-O(fenil meta
sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y (-O(fenil para
sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en el que para cada p,
cada R^{2} se selecciona por separado del grupo que consta de un
átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}
saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado,
alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado,
alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce. Cuando Y se selecciona de Q como se ha definido en la presente invención, L es L', en el que L' se selecciona del grupo de -(CR^{4}H)(-OCR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H) (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H)(-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y
-(CR^{4}H) (-O(fenil para sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en los que cada R^{2} y R^{4} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce.
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce. Cuando Y se selecciona de Q como se ha definido en la presente invención, L es L', en el que L' se selecciona del grupo de -(CR^{4}H)(-OCR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H) (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H)(-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y
-(CR^{4}H) (-O(fenil para sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en los que cada R^{2} y R^{4} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce.
El uso de las estructuras
Q-L'-Q del sensor de CYP450 de la
invención tiene la ventaja de dar dos restos Q ópticos, en lugar de
uno, en forma de hidroxi o hidroxilato cuando interacciona el
sensor óptico de la invención con al menos una enzima CYP450.
Las expresiones fenilo orto sustituido, fenilo
meta sustituido, y fenilo para sustituido, se refieren a un fenilo
que es parte del conector que conecta Y con Q, en el que orto, meta
y para se refiere a las posiciones de los carbonos en el anillo de
fenilo que sirven de unión para Y y Q. Orto sustituido se refiere a
la unión de Y y Q por carbonos adyacentes en el anillo de fenilo,
meta sustituido se refiere a la unión de Y y Q por carbonos
separados por un carbono en el anillo de fenilo, y para sustituido
se refiere a la unión de Y y Q en el anillo de fenilo por carbonos
que están separados por dos carbonos en el anillo de fenilo. Cuando
se usa para definir sustitución adicional del anillo de fenilo en
el conector oxifenilmetilo, el término sustituido se refiere a la
sustitución del resto de los carbonos no implicados en la unión de
Y y Q en el anillo de fenilo.
El término "sustituido" significa cualquier
sustitución de un átomo de hidrógeno por un grupo funcional. Los
grupos funcionales se seleccionan del grupo que consta de un átomo
de halógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado,
cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro,
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2},
-N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -N=N-R_{n1},
-P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c},
-C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c},
-OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o},
-PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano. También cuando se usa en el contexto en que se definen Y y R^{2}, el término "sustituido" significa cualquier sustitución de un hidrógeno por un grupo funcional como se ha definido en la presente invención siempre que no se produzca sustitución de heteroátomo en el carbono \alpha.
-OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o},
-PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano. También cuando se usa en el contexto en que se definen Y y R^{2}, el término "sustituido" significa cualquier sustitución de un hidrógeno por un grupo funcional como se ha definido en la presente invención siempre que no se produzca sustitución de heteroátomo en el carbono \alpha.
El término "desactivador" se refiere a una
molécula cromófora o parte de un compuesto que es capaz de reducir
la emisión de un donador fluorescente cuando se une al donador. La
desactivación se puede producir por cualquiera de los diferentes
mecanismos, incluyendo transferencia de energía de resonancia,
transferencia de electrón fotoinducida, potenciación paramagnética
del cruce entre sistemas, acoplamiento de intercambio de Dexter, y
acoplamiento de excitación tal como la formación de complejos
oscuros.
El término "aceptor" se refiere a un
desactivador que opera por transferencia de energía. Los aceptores
pueden reemitir la energía transferida en forma de fluorescencia y
son "restos fluorescentes aceptores". Entre los ejemplos de
aceptores se incluyen cumarinas y fluoróforos relacionados, xantenos
tales como fluoresceínas, rodoles y rodaminas, resorufinas,
cianinas, difluoroboradiazaindacenos, y ftalocianinas. Otras clases
químicas de aceptores generalmente no reemiten la energía
transferida en forma de luz. Entre los ejemplos se incluyen
índigos, benzoquinonas, antraquinonas, compuestos azo, compuestos
nitro, indoanilinas, y di y trifenilmetanos.
Q está unido a L por un enlace éter, por el
oxígeno indicado con la flecha, y tiene una estructura seleccionada
del grupo que consta de las siguientes estructuras:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las
que:
m es un número entero positivo no mayor que
cinco;
R_{a}, R_{b}, R_{c}, R_{d}, R_{e},
R_{f}, R_{g}, R_{h}, R_{i}, R_{j}, R_{k}, y R_{l}, se
selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo
de hidrógeno, un átomo de halógeno, alquilo
C_{1}-C_{20}, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado,
cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro, azido,
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2},
-N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -N=N-R_{n1},
-P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c},
-C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c},
-OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2},
-C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o},
-SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o},
-PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3},
-NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3},
-NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y
-NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s};
R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s}
se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un
átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20},
alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo,
cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo,
heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de
un heterociclo alifático o aromático;
R_{c} se selecciona del grupo que consta de un
átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20},
alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo
perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano, y
puede constituir partes de un homo o heterociclo alifático o
aromático;
A se selecciona del grupo que consta de un átomo
de oxígeno, un átomo de azufre, SO, SO_{2},
C(CH_{3})_{2} y
C(CF_{3})_{2};
E y E' se seleccionan por separado del grupo que
consta de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre y NR_{n1};
G se selecciona del grupo que consta de un átomo
de oxígeno, un átomo de azufre, y NR_{n1}R_{n2}, en el que si G
se selecciona de NR_{n1}R_{n2}, G y R_{c} así como G y
R_{d} pueden constituir partes de un heterociclo; y
T se selecciona del grupo que consta de un átomo
de oxígeno y NR_{n1}.
\newpage
Como se entenderá por referencia a los ejemplos
presentados ahora de sensores ópticos de CYP450 de la presente
invención, los sensores ópticos preferidos de la presente invención
son sensores fluorogénicos de CYP450, en los que Q es la forma éter
de un fluoróforo fenóxido. Además, los ejemplos precedentes de Q
ponen de relieve el punto de que Q puede ser cualquier estructura
química, siempre que Q sea un medio químico para generar una señal
óptica alterada por escisión de un enlace C-O. Los
expertos en la técnica reconocerán variaciones de las estructuras
de Q descritas en la presente invención para lograr esta función.
Además, la función de generar una señal óptica alterada por escisión
de un enlace C-O se puede lograr liberando un
colorante cuando se escinde un enlace C-O, e
incluso más preferiblemente, liberando un colorante fenólico
fluorescente cuando se escinde un enlace C-O.
Preferiblemente, la señal óptica alterada es una señal óptica
potenciada.
En el caso en el que Q es una forma éter de un
fluoróforo, Y puede actuar como un desactivador. En este caso, la
actividad del CYP450 se detecta por un aumento de la fluorescencia
de Q, que se debe a la pérdida de desactivación de su fluorescencia
por Y. Si la desactivación de la fluorescencia por Y se produce por
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, entonces Y
se denomina un aceptor. En el caso en el que Q sea una forma éter
de un fluoróforo e Y actúe como un desactivador, la unión de
Y-L a Q puede ser por sustitución de cualquier
hidrógeno en el fluoróforo por
Y-L-O-, indicando O un átomo de
oxígeno. En este caso Q puede ser cualquier fluoróforo, formándose
su forma éter por sustitución de uno o más átomos de hidrógeno del
fluoróforo por Y-L-O. Véase la
Patente nº: 5.741.657 de Tsien and Zlokarnik (cedida el 21 de Abril,
1998), que se incorpora como referencia en la presente
invención.
En los sensores ópticos de CYP450 de la presente
invención, Y se selecciona preferiblemente de alquilo
C_{1}-C_{8}, alquenilo
C_{1}-C_{8}, alquilo
C_{2}-C_{8} sustituido, alquenilo
C_{2}-C_{8} sustituido, alcoxialquilo, arilo,
arilo sustituido, aminoalquilo terciario y cuaternario y grupos
guanidinio. Entre los arilos y arilos sustituidos, se prefieren más
los grupos bencilo y bencilo sustituido. Más preferiblemente, Y se
selecciona de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo,
isobutilo, terc-butilo, pentilo, octilo y
bencilo.
Preferiblemente, L se selecciona del grupo que
consta de -(OCR^{2}H)_{p}- y
-(O-para-fenilo-CR^{2}H)_{p}
en los que R^{2} es un átomo de hidrógeno o metilo, y p es igual
a uno o dos. Más preferiblemente R^{2} es un átomo de hidrógeno y
p es igual a uno.
Preferiblemente, Q es un fluoróforo. Más
preferiblemente, Q se selecciona del grupo que consta de
7-hidroxicumarina, resorufina, fluoresceína y otros
fluoróforos fenóxido. Sin embargo, Q puede ser un cromóforo, siempre
que presente propiedades ópticas en sus forma hidroxi o
hidroxilato, por ejemplo, después de interaccionar con una enzima
CYP450 activa, que difieran de su forma éter, por ejemplo en su
estado sin reaccionar. Más generalmente, Q es un resto químico que
presenta propiedades ópticas en su forma de hidroxi libre o
hidroxilato, generalmente fenóxido, que son diferentes de las
propiedades ópticas que presenta en su forma éter. También se
pueden encontrar estructuras de Q adecuadas, usadas en la presente
invención, en la patente de EE.UU. nº 5.741.657, que se incorpora
como referencia en la presente invención.
Los compuestos sensores ópticos de CYP450 de la
presente invención se pueden usar para determinar las actividades
del CYP450 por una variedad de señales ópticas, incluyendo por
ejemplo, en el contexto de (a) formación de fenoles cromógenos o
fluorogénicos o luminiscentes catalizada por CYP450, (b) formación
de precipitados cromógenos o fluorogénicos catalizada por CYP450,
(c) generación de luz catalizada por CYP450 de la conversión de un
sustrato dioxetano fenólico, (d) liberación de un salicilato u otro
ligando fenólico catalizada por CYP450, detectable por la formación
de quelato con metal pesado para dar un producto fluorescente,
fosforescente o electroquimioluminiscente, y (e) liberación
catalizada por CYP450 de un sensibilizador para generar luz por
peróxido/luminol, y (f) liberación catalizada por CYP450 de un
sustrato adecuado para la detección secundaria de enzimas (por
ejemplo, la liberación de una luciferina, que se puede detectar con
una luciferasa).
Tal como se usa en la presente invención, las
expresiones "halógeno" y "átomo de halógeno" se refieren
a cualquiera de los átomos radioestables de la columna 17 de la
Tabla Periódica de los Elementos, es decir, flúor, cloro, bromo o
yodo, siendo más preferidos flúor y cloro.
Tal como se usa en la presente invención, el
término "alquilo" significa cualquier hidrocarburo saturado no
ramificado, ramificado o cíclico, prefiriéndose hidrocarburos
C_{1}-C_{8} no ramificados, saturados y no
sustituidos, y siendo más preferidos metilo, etilo, propilo,
isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo,
n-pentilo y n-octilo.
La expresión "alquilo sustituido" significa
cualquier hidrocarburo saturado sustituido, no ramificado,
ramificado o cíclico, sustituido con uno o más grupos funcionales.
Los grupos funcionales se seleccionan del grupo que consta de un
átomo de halógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado,
cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro,
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2},
-N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3},
-COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c},
-OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2},
-C(=N)NR_{n1}R_{n2},
\hbox{-CO _{2} R _{o} ,}
-SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o},
-PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3},
-NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3},
-NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano. Cuando se usa en el contexto en el que se definen Y y R^{2}, la expresión "alquilo sustituido" significa cualquier hidrocarburo saturado, sustituido, ramificado o no ramificado, siempre que no haya sustitución de heteroátomo en el carbono \alpha.
El término "alquenilo" significa cualquier
hidrocarburo insaturado, sustituido o no sustituido, no ramificado,
ramificado o cíclico, prefiriéndose C_{1}-C_{8}
no ramificado, monoinsaturado y diinsaturado. La expresión
"alquenilo sustituido" significa cualquier hidrocarburo
insaturado sustituido, no ramificado o ramificado, sustituido con
uno o más grupos funcionales. Los grupos funcionales se seleccionan
del grupo que consta de un átomo de halógeno, alquilo
C_{1}-C_{20}, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado,
cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro,
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2},
-N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3},
-COR_{c},
-C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}
R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S
(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano, y puede constituir partes de un homo o heterociclo alifático. Cuando se usa en el contexto en el que se definen Y y R^{2}, la expresión "alquenilo sustituido" significa cualquier hidrocarburo insaturado, sustituido, ramificado o no ramificado, siempre que no haya doble enlace carbono-carbono, ni sustitución de heteroátomo en el carbono \alpha.
-C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}
R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S
(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano, y puede constituir partes de un homo o heterociclo alifático. Cuando se usa en el contexto en el que se definen Y y R^{2}, la expresión "alquenilo sustituido" significa cualquier hidrocarburo insaturado, sustituido, ramificado o no ramificado, siempre que no haya doble enlace carbono-carbono, ni sustitución de heteroátomo en el carbono \alpha.
Las expresiones "arilo", "arilo
sustituido", "heteroarilo", y "heteroarilo sustituido"
se refieren a anillos hidrocarbonados aromáticos, que
preferiblemente tienen cinco o seis átomos que comprenden el anillo.
La expresión "arilo sustituido" incluye arilos mono y
polisustituidos, sustituidos con grupos funcionales seleccionados
del grupo de un átomo de halógeno, alquilo
C_{1}-C_{20}, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado,
cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro, azido,
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2},
-N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -N=N-R_{n1},
-P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c},
-C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c},
-OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c}, -CONR_{n1}R_{n2},
-C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o},
-SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o},
-PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3},
-NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3},
-NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y
-NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1},
R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por
separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{20}, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo,
cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo,
heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un
heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo
que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{20}, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado,
cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, y pueden
constituir partes de un homo o heterociclo alifático o aromático.
"Heteroarilo" y "heteroarilo sustituido" se refieren a
anillos hidrocarbonados aromáticos en los que hay al menos un
heteroátomo, por ejemplo, átomo de oxígeno, azufre o nitrógeno, en
el anillo junto con al menos un átomo de carbono.
Las expresiones fenilo orto sustituido, fenilo
meta sustituido, y fenilo para sustituido, se refieren a un fenilo
que es parte del conector que conecta Y con Q, en el que orto, meta
y para se refieren a las posiciones de los carbonos en el anillo de
fenilo que sirven de unión para Y y Q. Orto sustituido se refiere a
la unión de Y y Q por carbonos adyacentes en el anillo de fenilo,
meta sustituido se refiere a la unión de Y y Q por carbonos
separados por un carbono en el anillo de fenilo, y para sustituido
se refiere a la unión de Y y Q en el anillo de fenilo por carbonos
que están separados por dos carbonos en el anillo de fenilo. Cuando
se usa para definir sustitución adicional del anillo de fenilo en
el conector oxifenilmetilo, el término "sustituido" se refiere
a la sustitución de los hidrógenos del resto de los carbonos no
implicados en la unión de Y y Q en el anillo de fenilo. El término
"fenilo sustituido" incluye fenilos mono y polisustituidos,
sustituidos con grupos funcionales. Los grupos funcionales se
seleccionan del grupo que consta de un átomo de halógeno, alquilo
C_{1}-C_{20}, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado,
cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, azido,
nitro,
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c},
-CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, y pueden constituir partes de un homo o heterociclo alifático o aromático.
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c},
-CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s}. Los sustituyentes R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s} se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y pueden constituir partes de un heterociclo alifático o aromático. R_{c} se selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, y pueden constituir partes de un homo o heterociclo alifático o aromático.
La expresión "sustrato fluorogénico del
CYP450" en general se refiere a cualquier compuesto que, cuando
interacciona con una enzima CYP450, presenta propiedades de
fluorescencia superiores que las que presentaba el compuesto antes
de interaccionar con la enzima CYP450. Tal como se usa en la
presente invención, las expresiones "sonda óptica" y "sensor
óptico", son sinónimos, refiriéndose cada una a un compuesto que
se puede usar para ensayar una actividad que cataliza la conversión
de la forma éter del compuesto en la forma hidroxi o hidroxilato,
normalmente fenóxido, del compuesto, en virtud del hecho de que
cada uno contiene un resto químico que presenta propiedades ópticas
en su forma hidroxi o hidroxilato, normalmente fenóxido, que son
distintas y preferiblemente superiores a las propiedades ópticas
que el resto químico presenta en forma de un éter. Las expresiones
"sonda óptica de CYP450" y "sensor óptico de CYP450" son
sinónimos; cada una es una expresión más amplia que la expresión
"sustrato fluorgénico de CYP450"; y se refiere cada una a un
compuesto que se puede usar para ensayar la presencia, y
especialmente donde puede haber presente un inhibidor de CYP450, la
actividad de al menos una enzima CYP450 en virtud del hecho de que
cada uno contiene un resto químico que presenta propiedades ópticas
en sus formas hidroxi o hidroxilato, normalmente su fenóxido, que
son distintas, y preferiblemente superiores, a las propiedades
ópticas que el resto químico presenta en forma de un éter. En virtud
del hecho de que al menos una enzima CYP450 catalizará la
conversión de la forma éter en la forma hidroxi o hidroxilato,
normalmente fenóxido, estas sondas o sensores ópticos se pueden
usar para ensayar la presencia y actividad de al menos una enzima
CYP450.
La expresión "compuesto reactivo" se refiere
a los compuestos de la invención, descritos en la presente
invención, especialmente a los compuestos de estructura general
Y-L-Q. La expresión "compuesto
candidato" es una expresión más amplia que los términos
"fármaco candidato" y "modulador candidato", tal como se
usan dichos términos en la presente invención, y se refieren a
cualquier compuesto, cualquiera que sea su origen, adecuado para
ser seleccionado por su actividad como un sustrato o inhibidor de
una enzima CYP450 de acuerdo con los métodos de la presente
invención.
En la presente invención, se prefieren colorantes
fluorescentes de longitud de onda larga frente a colorantes que se
excitan en el UV, pero son útiles como Q todos los colorantes que
se excitan en el UV o IR, en los compuestos sensores ópticos y
métodos de la invención.
Muchas bibliotecas de compuestos para
seleccionar, a menudo contienen compuestos fluorescentes.
Típicamente los compuestos fluorescentes en las bibliotecas tienen
absorbancias en el UV o en la parte visible de longitud de onda
corta del espectro. Por lo tanto, para muchos ensayos
fluorescentes, las moléculas indicadoras de longitud de onda más
larga, normalmente dan como resultado ensayos que tienen menos
señal de fondo y menos interferencia. Además, los compuestos de la
presente invención preferiblemente tienen mejor solubilidad tanto
en agua como en acetonitrilo comparado con los sustratos de CYP450
más estrechamente relacionados disponibles actualmente. La
solubilidad acuosa es importante, puesto que son necesarias
concentraciones del sustrato 1-20 \muM para
conducir a una señal de fluorescencia fuerte en el ensayo. Una buena
solubilidad en acetonitrilo (1-10 mM) permite el
suministro de las moléculas de sustrato hidrófobas en el medio de
ensayo acuoso en pequeños volúmenes. El acetonitrilo es un
disolvente preferido, ya que no inhibe el CYP450 en concentraciones
de hasta 2%. Otros disolventes, tales como DMSO y etanol, usados
típicamente para suministrar moléculas hidrófobas en el medio de
ensayo acuoso, inhiben la actividad de la mayoría de las enzimas
CYP450 en concentraciones menores, y por lo tanto no son el
suministro de sustrato preferido. Sin embargo, se sabe que el
CYP450 y compuestos relacionados toleran el DMSO en concentraciones
de hasta 0,5%, permitiendo el suministro de los compuestos de
ensayo al medio de ensayo en este disolvente.
Con referencia a la siguiente estructura, se ha
demostrado que la introducción de un espaciador oximetilo
(R^{2} = H) entre el resto R^{1} y el colorante fenólico de sensores fluorogénicos de CYP450 actualmente disponibles, tiende a aumentar la eficacia (k_{cat}/K_{m}) de recuperación por muchas enzimas CYP450 y compuestos relacionados. Los R^{1} de los sensores fluorogénicos de CYP450 actualmente disponibles son alquilo o metilo sustituido, siendo el sustituyente un grupo arilo o esteroide, véase la patente de EE.UU. 5.110.725. Una sonda óptica de CYP450 de la presente invención, mostrada en la siguiente estructura, ilustra esta "inserción" para proporcionar los compuestos sensores ópticos de CYP450 de la presente invención.
(R^{2} = H) entre el resto R^{1} y el colorante fenólico de sensores fluorogénicos de CYP450 actualmente disponibles, tiende a aumentar la eficacia (k_{cat}/K_{m}) de recuperación por muchas enzimas CYP450 y compuestos relacionados. Los R^{1} de los sensores fluorogénicos de CYP450 actualmente disponibles son alquilo o metilo sustituido, siendo el sustituyente un grupo arilo o esteroide, véase la patente de EE.UU. 5.110.725. Una sonda óptica de CYP450 de la presente invención, mostrada en la siguiente estructura, ilustra esta "inserción" para proporcionar los compuestos sensores ópticos de CYP450 de la presente invención.
Esta mejor recuperación, y mejores propiedades
ópticas, se han demostrado para una variedad de sustratos
estructuralmente distintos. Además, las solubilidades de los
sensores de la invención en acetonitrilo, así como en agua, son
excelentes, superando una de las limitaciones antes mencionadas de
los sustratos fluorogénicos de CYP450 actualmente disponibles. De
acuerdo con esto, la estructura anterior ilustra compuestos
sensores ópticos de CYP450 de la presente invención, en la que
R^{1} es una estructura como se ha definido en la presente
invención para Y. Por lo tanto, R^{1} en la estructura anterior de
los compuestos sensores de CYP450 de la presente invención se
selecciona de un grupo que consta de todos los Y definidos en la
presente invención. Sin embargo, los grupos correspondientes a
R^{1} que se encuentran en los sustratos
éter-fenol de CYP450 actualmente disponibles en el
comercio, son un subconjunto de Y como se ha definido en la
presente invención; los compuestos que tienen el conector de la
presente invención y usan grupos R^{1} que se encuentran en los
compuestos sustratos éter-fenol de CYP450
actualmente disponibles en el comercio que carecen del conector de
la presente invención, presentan mejores propiedades físicas y
ópticas con respecto a los sustratos éter-fenol de
CYP450 actualmente disponibles en el comercio.
R^{2} en la estructura anterior de compuestos
sensores de CYP450 de la presente invención se selecciona del grupo
que consta de un átomo de hidrógeno, grupos alquilo
C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, tal como se han definido dichas expresiones en la presente invención.
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, tal como se han definido dichas expresiones en la presente invención.
\newpage
Además, se ha demostrado que la introducción de
un espaciador oxifenilmetilo (R^{2} = H) entre el resto R^{1} y
el colorante fenólico de sensores fluorogénicos de CYP450
actualmente disponibles, también tiende a aumentar la eficacia
(k_{cat}/K_{m}) de recuperación por las enzimas CYP450 y
compuestos relacionados.
De acuerdo con esto, la estructura anterior
ilustra compuestos sensores ópticos de CYP450 de la presente
invención que contienen oxifenilmetilo, en la que R^{1} es una
estructura como se ha definido en la presente invención para Y. Por
lo tanto, R^{1} en la estructura anterior de los compuestos
sensores de CYP450 de la presente invención, se selecciona de un
grupo que consta de todos los Y como se ha definido en la presente
invención. Sin embargo, los grupos correspondientes a R^{1} que
se encuentran en los sustratos éter-fenol de CYP450
actualmente disponibles en el comercio, son un subconjunto de Y como
se ha definido en la presente invención; los compuestos que tienen
el conector de la presente invención y usan grupos que corresponden
a los R^{1} que se encuentran en los compuestos sustratos
éter-fenol de CYP450 actualmente disponibles en el
comercio que carecen del espaciador de la presente invención,
presentan mejores propiedades físicas y ópticas con respecto a los
que sustratos éter-fenol de CYP450 actualmente
disponibles en el comercio.
R^{2} en la estructura anterior de los
compuestos sensores de CYP450 de la presente invención se
selecciona del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido,
cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado
sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo
sustituido, tal como se han definido dichas expresiones en la
presente invención.
De acuerdo con la presente invención, la Fig. 2
ilustra el Esquema de reacción 2, que muestra una estructura
genérica del sustrato/sensor óptico de CYP450 de la presente
invención, y la reacción de hidroxilación catalizada por el CYP450.
La Fig. 3 ilustra el Esquema de Reacción 3, que compara la reacción
de hidroxilación que puede conducir a un colorante fenólico libre
de un sensor óptico de CYP450 conocido (parte superior) y un
compuesto sensor óptico de CYP450 de la presente invención (parte
inferior).
Como se describe en la presente invención, los
fármacos candidatos se pueden seleccionar y evaluar por sus
actividades como sustratos de, o inhibidores de una enzima CYP450,
usando los sensores ópticos de CYP450 de la presente invención. Se
puede determinar si un fármaco candidato es un inhibidor o un
sustrato de una enzima citocromo P450 poniendo en contacto una
enzima citocromo P450 con el fármaco candidato, en condiciones
adecuadas para que interaccionen entre ellos, proporcionando al
menos un sensor óptico de la enzima citocromo P450, en condiciones
que, en ausencia de un inhibidor o sustrato de la enzima citocromo
P450, serían adecuadas para la interacción entre el sensor óptico de
la enzima citocromo P450 y la enzima citocromo P450, y detectando
la presencia de señal de un colorante fenólico libre, en el que el
colorante fenólico, en ausencia de un inhibidor de la enzima
citocromo P450, sería el producto de reacción entre la enzima
citocromo P450 y el sensor óptico de la enzima citocromo P450.
Dichos sustratos e inhibidores de CYP450 eficaces, considerados
apropiados por los expertos en la técnica, se pueden sacar de una
biblioteca de selección en la que no se desean dichos sustratos e
inhibidores de CYP450 en el resto de la selección de un fármaco
candidato.
Para distinguir entre un sustrato y un inhibidor
de las enzimas citocromo P450, típicamente, el compuesto candidato
se incuba con al menos una enzima citocromo P450 en condiciones que
permitan el metabolismo del compuesto candidato antes de
proporcionar el sensor óptico de la enzima citocromo P450 en
condiciones que, en ausencia de un inhibidor o sustrato de la
enzima citocromo P450, serían adecuadas para la interacción entre
el sensor óptico de la enzima citocromo P450 y la enzima citocromo
P450. La señal óptica resultante se compara con la obtenida
poniendo en contacto una enzima citocromo P450 con el fármaco
candidato, en condiciones adecuadas para la interacción entre ellos,
proporcionando al menos un sensor óptico de la enzima citocromo
P450, en condiciones que, en ausencia de un inhibidor de la enzima
citocromo P450, serían adecuadas para la interacción entre el
sensor óptico de la enzima citocromo P450 y la enzima citocromo
P450. El metabolismo del fármaco candidato por una enzima citocromo
P450 reduce su concentración en el medio de ensayo y puede conducir
a una pérdida aparente de la actividad inhibidora del citocromo
P450 comparado con condiciones sin metabolismo del compuesto, lo
cual indicarían que era un sustrato para la enzima. Un compuesto
inhibidor que no fuera metabolizado mostraría igual potencia, sin
tener en cuenta el tiempo de adición del sustrato óptico de la
enzima citocromo P450.
Los siguientes procedimientos se pueden usar para
la posterior selección, formulación y administración de los
fármacos candidatos de la presente invención. Estos fármacos están
dentro de la presente invención en la medida en que no se han
identificado todavía como fármacos o moduladores candidatos, y en
la medida en que son identificados como fármacos o moduladores
candidatos mediante el uso de sensores ópticos de la presente
invención.
En algunos casos, se puede determinar que un
fármaco candidato es un sustrato de la enzima citocromo P450 de al
menos una enzima citocromo P450, seleccionando un sensor óptico de
la enzima citocromo P450 que es un derivado del fármaco candidato;
poniendo en contacto una enzima citocromo P450 con el sensor óptico
de la enzima citocromo P450 en condiciones adecuadas para la
interacción entre ellos, y detectando la ausencia de señal de un
colorante fenólico libre, que sería el producto de reacción entre
la enzima citocromo P450 y el sensor de la enzima citocromo
P450.
Una vez identificados, se puede evaluar además la
biodisponibilidad y efectos toxicológicos de los fármacos o
moduladores candidatos usando métodos conocidos. Véase, Lu, Basic
Toxicology, Fundamentals, Target Organs, and Risk Assessment,
Hemisphere Publishing Corp., Washington (1985); Patente de EE.UU.
nº: 5.196.313 de Culbreth (expedida el 23 de Marzo, 1993), patente
de EE.UU. nº 5.567.952 de Benet (expedida el 22 de Octubre, 1996).
Por ejemplo, se puede establecer la toxicología de un modulador
candidato determinando la toxicidad in vitro frente a una
línea celular, tal como una línea celular de mamífero, es decir, de
ser humano. Los moduladores candidatos se pueden tratar, por
ejemplo con extractos de tejidos, tal como preparaciones de hígado,
tal como preparaciones microsomales, para determinar el aumento o
disminución de las propiedades toxicológicas de los productos
químicos después de haber sido metabolizados por un organismo
entero. Los resultados de estos tipos de estudios a menudo predicen
las propiedades toxicológicas de productos químicos en animales,
tales como mamíferos, incluyendo seres humanos.
Dichos métodos de biodisponibilidad y
toxicológicos se pueden llevar a cabo como parte o complementarios
a los sistemas y métodos de selección de la presente invención.
Dichos métodos incluyen poner en contacto una muestra que tiene una
diana con al menos un agente productor de fotones, al menos un
agente reductor de fotones, y un producto químico de ensayo. Se
detecta una señal óptica de dicho agente productor de fotones, en
el que dicha señal óptica está relacionada con una actividad
toxicológica. La biodisponibilidad es cualquiera conocida en la
técnica, y se puede detectar, por ejemplo, midiendo los genes
indicadores que son activados durante los criterios de
biodisponibilidad. La actividad toxicológica es cualquiera conocida
en la técnica, tal como la apoptosis, lisis celular, crenación,
muerte celular y similares. La actividad toxicológica se puede
medir usando genes indicadores que son activados durante la
actividad toxicológica o por lisis celular (véase el documento WO
98/13353, publicado el 2/4/98). Los genes indicadores preferidos
producen un producto de traducción fluorescente o luminiscente (tal
como, por ejemplo, una proteína verde fluorescente (véase, por
ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.625.048 de Tsien et al, expedida el
29/4/98; patente de EE.UU. nº 5.777.079 de Tsien et al., expedida
el 7/7/98; documento WO 96/23810 de Tsien, publicado el 8/8/96;
documento WO 97/28261, publicado el 8/7/97; documento
PCT/US97/12410, presentado el 16/7/97; documento PCT/US97/14595,
presentado el 15/8/97)), o un producto de traducción que puede
producir un producto fluorescente o luminiscente (tal como, por
ejemplo, beta-lactamasa, por ejemplo, Patente de
EE.UU. nº 5.741.657 de Tsien, expedida el 21/4/98, y documento WO
96/30540, publicado el 3/10/96), tal como un producto de
degradación enzimática. La lisis celular se puede detectar en la
presente invención como una reducción de la señal de fluorescencia
en al menos un agente productor de fotones dentro de una célula en
presencia de al menos un agente reductor de fotones. Dichas
determinaciones toxicológicas se pueden hacer usando células
procariotas o eucariotas, opcionalmente usando perfiles
toxicológicos, como se describe en el documento PCT/US94/00583,
presentado el 21/1/94, patente Alemana nº
69406772.5-08, expedida el 25/11/97; documento EPC
0680517, expedido el 12/11/94; patente de EE.UU. nº 5.589.337,
expedida el 31/12/96; EPO 651825, expedida el 14/1/98, y patente de
EE.UU. nº 5.585.232, expedida el 17/12/96.
Alternativamente, o además de estos estudios
in vitro, se puede determinar la biodisponibilidad y
propiedades toxicológicas de un modulador candidato en un modelo
animal, tal como en ratones, ratas, conejos, o monos, usando métodos
establecidos. Véase, Lu. véase antes (1985); y Creasey.
Drug Disposition in Humans, The Basis of Clinical
Pharmacology, Oxford University Press, Oxford (1979), Osweiler,
Toxicology, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1995),
Yang, Toxicology of Chemical Mixtures, Case Studies, Mechanisms,
and Novel Approaches, Academic Press, Inc.. San Diego, CA
(1994), Burrell et al., Toxicology of the Immune System: A Human
Approach. Van Nostrand Reinhld. Co. (1997), Niesink el al,
Toxicology, Principles and Applications. CRC Press, Boca
Raton. FL (1996). Dependiendo de la toxicidad, órgano diana, tejido,
locus, y presunto mecanismo del modulador candidato, el experto en
la técnica no tendrá problemas para determinar las dosis adecuadas,
valores de DL_{50}, vías de administración y regímenes que serían
adecuados para determinar las propiedades toxicológicas del
modulador candidato. Además de los modelos animales, se pueden
llevar a cabo ensayos clínicos con seres humanos siguiendo los
procedimientos establecidos, tales como los descritos por la
administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (USFDA) o
equivalentes de otros gobiernos. Estos estudios de toxicidad
proporcionan la base para determinar los efectos indeseados de un
modulador candidato in vivo.
La eficacia de un modulador candidato se puede
establecer usando varios métodos reconocidos en la técnica, tales
como métodos in vitro, modelos animales, o ensayos clínicos
con seres humanos, véase, Creasey (véase antes) (1979). Existen
modelos in vitro reconocidos para varias enfermedades o
estados. Por ejemplo, la capacidad de un producto químico para
prolongar la duración de la vida de células infectadas por el VIH
in vitro, se reconoce como un modelo aceptable para
identificar productos químicos que se espera que sean eficaces para
tratar la infección por VIH o SIDA, véase, Daluge et al.,
Antimicro. Agents Chemother. 41: 1082-1093
(1995). Además, la capacidad de la ciclosporina a (CsA) para
prevenir la proliferación de células T in vitro, se ha
establecido como un modelo aceptable para identificar productos
químicos que se espera que sean eficaces como inmunosupresores,
véase, Suthanthiran et al., véase antes (1996). Para casi cada
clase de terapéutica, enfermedad o estado, hay disponible un modelo
in vitro o modelo animal. Por ejemplo, existen dichos
modelos para trastornos gastrointestinales, cánceres, cardiología,
neurobiología, e inmunología. Además, estos modelos in vitro
pueden usar extractos de tejidos, tales como preparaciones de
hígado, tales como preparaciones microsomales, para proporcionar
una indicación fiable de los efectos del metabolismo en un
modulador candidato. Igualmente, se pueden usar modelos animales
aceptables para establecer la eficacia de productos químicos para
tratar diferentes enfermedades o estados. Por ejemplo, la rodilla de
conejo es un modelo aceptado para ensayar la eficacia de productos
químicos para tratar la artritis. Véase Shaw and Lacy, J. Bone
Joint Surg. (Br) 55: 197-205 (1973). La
hidrocortisona, que está aprobada para usar en seres humanos para
tratar la artritis, es eficaz en este modelo, lo cual confirma la
validez de este modelo. Véase. Mc Donough, Phys. Ther. 62:
835-839 (1982). Cuando se elige un modelo adecuado
para determinar la eficacia de un modulador candidato, el experto
en la técnica se puede guiar por el estado de la técnica para elegir
un modelo, dosis, y vía de administración, régimen, y punto final
adecuados, y como tal no tendrá muchos problemas.
Además de los modelos animales, se pueden usar
ensayos clínicos con seres humanos para determinar la eficacia de
un modulador candidato en seres humanos. La USFDA, o agencias
gubernamentales equivalentes, han establecido procedimientos para
dichos estudios, véase, por ejemplo, http://www/fda.gov.
Los métodos in vitro e in vivo
descritos antes como parte de la presente invención también
establecen la selectividad de un fármaco o modulador candidato. Se
reconoce que los productos químicos pueden modular una gran
variedad de procesos biológicos o ser selectivos. Se pueden usar
paneles de células basados en la presente invención, para
determinar la especificidad del modulador candidato. Por ejemplo,
la selectividad es evidente en el campo de la quimioterapia, donde
obviamente se desea la selectividad de un producto químico para que
sea tóxico frente a células cancerosas, pero no frente a células no
cancerosas. Se prefieren los moduladores selectivos porque tienen
menos efectos secundarios en el cuadro clínico. La selectividad de
un modulador candidato se puede establecer in vitro
ensayando la toxicidad y efectos de un modulador candidato en una
pluralidad de líneas celulares que presentan una variedad de
caminos y sensibilidades celulares. Los datos obtenidos de estos
estudios de toxicidad in vitro se pueden extender a estudios
de modelos animales, incluyendo ensayos clínicos con seres humanos,
para determinar la toxicidad, eficacia y selectividad del modulador
candidato.
La invención incluye composiciones, tal como
nuevos productos químicos y composiciones terapéuticas, en los que
se ha identificado por al menos un método de la presente invención,
que tienen actividad como un sustrato o inhibidor del CYP450
mediante el uso de métodos, sistemas o componentes descritos aquí.
Nuevos productos químicos, como se usa en la presente invención, no
incluyen productos químicos que se sabe ya públicamente en la
técnica que son fármacos o moduladores útiles en la fecha de
presentación de esta solicitud. Típicamente, se identificará que un
producto químico tiene actividad para el CYP450 usando la presente
invención, y después se pondrá de manifiesto su estructura a partir
de una base de datos de estructuras químicas o se determinará
usando técnicas analíticas tales como espectroscopía de masas.
Una realización de la invención es un producto
químico con actividad útil, que comprende un producto químico
identificado por el método descrito en la presente invención.
Dichas composiciones incluyen pequeñas moléculas orgánicas, ácidos
nucleicos, péptidos u otras moléculas fácilmente sintetizadas por
técnicas disponibles y desarrolladas en el futuro. Por ejemplo, los
siguientes compuestos combinatorios son adecuados para seleccionar
como fármacos candidatos: peptoides (publicación PCT nº WO
91/19735, 26 de Diciembre, 1991), péptidos codificados (publicación
PCT nº WO 93/20242, 14 de Oct. 1993), biooligómeros aleatorios
(publicación PCT nº WO 92/00091, 9 de Enero, 1992), benzodiazepinas
(Patente de EE.UU. nº 5.288.514), diversómeros tales como
hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs DeWitt. S. et al.,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913
(1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al.. J. Amer. Chem.
Soc. 114: 6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con
andamiaje de Beta-D-Glucosa
(Hirschmann. R. et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:
9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas de análogos
de bibliotecas de pequeños compuestos (Chen. C. et al., J. Amer.
Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho, C.Y. et
al., Science 261: 1303 (1993)), y/o fosfonatos de peptidilo
(Campbell. D.A. et al., J. Org. Chem. 59: 658 (1994)). Véase,
en general, Gordon, E. M. et al., J. Med Chem. 37: 1385
(1994). Los contenidos de todas las publicaciones mencionadas se
incorporan en la presente invención como referencia.
La presente invención también abarca las
composiciones, identificadas por los métodos de la presente
invención, comprendiendo una composición farmacéutica un vehículo
farmacéuticamente aceptable preparado para almacenamiento y
posterior administración, que tiene una cantidad farmacéuticamente
eficaz de los productos antes descritos en un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes aceptables
para uso terapéutico son conocidos en la técnica farmacéutica, y se
describen por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack
Publishing Co. (ABR. Gennaro edit. 1985. Se pueden proporcionar
conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes de sabor
en la composición farmacéutica. Por ejemplo, se puede añadir
benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres de ácido
p-hidroxibenzoico, como conservantes. Además, se
pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.
Estas composiciones se pueden formular y usar
como comprimidos, cápsulas o elixires para administración oral;
supositorios para administración rectal; solución estériles,
suspensiones para administración inyectable; y similares. Las
composiciones inyectables se pueden preparar de forma convencional,
como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas
para solución o suspensión en líquido antes de inyección, o como
emulsiones. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución
salina, dextrosa, manitol, lactosa, lecitina, albúmina, glutamato
sódico, hidrocloruro de cisteína, y similares. Además, si se desea,
las composiciones farmacéuticas inyectables pueden contener
cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no tóxicas, tales
como agentes humectantes, agentes de tamponamiento de pH, y
similares. Si se desea, se pueden usar preparaciones que potencian
la absorción (por ejemplo, liposomas).
La cantidad farmacéutica eficaz de la composición
como una dosis necesaria, dependerá de la vía de administración, el
tipo de animal que se va a tratar, y las características físicas
del animal específico que se considera. La dosis se puede diseñar
para lograr un efecto deseado, pero dependerá de factores tales
como peso, dieta, medicación concurrente y otros factores que
reconocerán los expertos en la técnica médica.
Cuando se practican los métodos de la invención,
los productos o composiciones se pueden usar solos o combinados
entre sí, o una combinación con otros agentes terapéuticos o de
diagnóstico. Estos productos se pueden usar in vivo,
normalmente en un mamífero, preferiblemente en un ser humano, o
in vitro. Cuando se usan in vivo, los productos o
composiciones se pueden administrar a un mamífero en una variedad
de formas, incluyendo vía parenteral, intravenosa, subcutánea,
intramuscular, colónica, rectal, nasal o intraperitoneal, usando una
variedad de formas de dosificación. Dichos métodos también se
pueden aplicar para ensayar la actividad química in
vivo.
Como verá enseguida claramente un experto en la
técnica, la dosificación in vivo útil que se va a
administrar y el modo particular de administración variará
dependiendo de la edad, peso y especie mamífera que se va a tratar,
los compuestos particulares usados, y el uso específico para el que
se usan estos compuestos. La determinación de niveles de
dosificación eficaces, que son los niveles de dosificación
necesarios para lograr el resultado deseado, puede ser llevada a
cabo por un experto en la técnica usando métodos farmacológicos
rutinarios. Típicamente, las aplicaciones clínicas de los productos
en seres humanos se empiezan con niveles de dosificación más bajos,
aumentándose el nivel de dosificación hasta que se logre el efecto
deseado. Alternativamente, los estudios in vitro aceptables
se pueden usar para establecer las dosis útiles y vías de
administración de las composiciones identificadas por los métodos
de la presente invención, usando métodos farmacológicamente
establecidos.
En estudios con animales no humanos, las
aplicaciones de los potenciales productos se empiezan con niveles
de dosificación más altos, diminuyéndose la dosis hasta que ya no
se logra el efecto deseado o desaparecen los efectos adversos. La
dosificación para los productos de la presente invención puede
variar ampliamente dependiendo de los efectos deseados y la
indicación terapéutica. Típicamente, las dosificaciones pueden
estar entre aproximadamente 10 microg/kg y 100 mg/kg de peso
caporal, preferiblemente entre aproximadamente 100 microg/kg y 10
mg/kg de peso corporal. La administración preferiblemente es por
vía oral en una base diaria.
La formulación exacta, vía de administración y
dosificación pueden ser elegidos por el médico individual en vista
del estado del paciente. Véase por ejemplo, Fingl et al., en The
Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975. Hay que indicar
que el médico que atiende sabrá como y cuando terminar, interrumpir,
o ajustar la administración debido a toxicidad, o a disfunciones de
órganos. A la inversa, el médico que atiende también sabrá ajustar
el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera
adecuada (excluyendo toxicidad). La magnitud de una dosis
administrada para manejar el trastorno que interese, variará con la
gravedad del estado que se va a tratar y con la vía de
administración. La gravedad del estado se puede evaluar, por
ejemplo, en parte por métodos patrón de evaluación de pronóstico.
Además, la dosis y quizás la frecuencia de la dosis, también
variarán de acuerdo con la edad, el peso corporal, y la respuesta
del paciente individual. Se puede usar un programa comparable con
el discutido antes en medicina veterinaria.
Dependiendo de los estados específicos que se van
a tratar, dichos agentes se pueden formular y administrar
sistémicamente o localmente. Se pueden encontrar una variedad de
técnicas de formulación y administración en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton
PA (1990). Entre las vías de administración adecuadas se pueden
incluir la administración por vía oral, rectal, transdérmica,
vaginal, transmucosa, o intestinal; administración parenteral,
incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas,
intramedulares, así como inyecciones intratecales,
intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales,
intranasales, o intraoculares.
Para inyección, los agentes de la invención se
pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones
fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución
de Ringer, o tampón salino fisiológico. Para dicha administración
transmucosa, se usan en la formulación penetrantes adecuados para
penetrar la barrera. Dichos penetrantes en general son conocidos en
la técnica. El uso de vehículos farmacéuticamente aceptables para
formular los compuestos descritos en la presente invención para la
práctica de la invención en dosificaciones adecuadas para la
administración sistémica, está dentro del alcance de la invención.
Con la elección adecuada del vehículo y la práctica de fabricación
adecuada, las composiciones de la presente invención, en particular
las formuladas como soluciones, se pueden administrar por vía
parenteral, tal como por inyección intravenosa. Los compuestos se
pueden formular fácilmente usando vehículos farmacéuticamente
aceptables conocidos en la técnica, en dosificaciones adecuadas
para administración oral. Dichos vehículos permiten que los
compuestos de la invención se formulen en comprimidos, pastillas,
cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, y similares para
ingestión oral por un paciente que se trate.
Los agentes que se pretenden administrar
intracelularmente se pueden administrar usando técnicas conocidas
por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dichos agentes se
pueden encapsular en liposomas, y después administrar como se ha
descrito antes. Todas las moléculas presentes en una solución acuosa
en el momento de la formación del liposoma son incorporadas al
interior acuoso. El contenido del liposoma está protegido del
microentorno exterior y debido a que los liposomas se funden con
las membranas celulares, se liberan eficazmente en el citoplasma
celular. Adicionalmente, debido a su hidrofobicidad, se pueden
administrar por vía intracelular directamente pequeñas moléculas
orgánicas.
Entre las composiciones farmacéuticas adecuadas
para usar como se ha descrito en la presente invención, se incluyen
composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos
en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. La
determinación de las cantidades eficaces, depende de la competencia
del experto en la técnica, especialmente a la luz de la descripción
detallada proporcionada en la presente invención. Además de los
ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden
contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que
comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento
de los compuestos activos en las preparaciones que se pueden usar
farmacéuticamente. Las preparaciones formuladas para administración
por vía oral pueden estar en forma de comprimidos, grageas,
cápsulas o soluciones. Las composiciones farmacéuticas de la
presente invención se pueden fabricar de una forma que es conocida,
por sí misma, por ejemplo, mediante procedimientos convencionales
de mezcla, disolución, granulación, formación de gragea,
levitación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o
liofilización.
Las formulaciones farmacéuticas para
administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los
compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las
suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como
suspensiones aceitosas para inyección. Entre los disolventes o
vehículos lipófilos adecuados se incluyen aceites grasos tales como
aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como
oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones
acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la
viscosidad de la suspensión, tales como
carboximetil-celulosa sódica, sorbitol, o dextrano.
Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes
adecuados o agentes que aumenten la solubilidad de los compuestos
para permitir preparar soluciones altamente concentradas.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se
pueden obtener combinando los compuestos activos con excipiente
sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando
la mezcla de gránulos, después de añadir agentes auxiliares
adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de
grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales
como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol;
preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de
maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata,
gelatina, goma de tragacanto, metil-celulosa,
hidroxipropilmetil-celulosa,
carboximetil-celulosa sódica, y/o
polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes
disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o
ácido algínico o una de sus sales, tales como alginato sódico. Los
núcleos de las grageas se proporcionan con revestimientos
adecuados. Para este propósito, se pueden usar soluciones de azúcar
concentradas, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco,
polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido
de titanio, soluciones de barniz, y disolventes orgánicos adecuados
o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a
los comprimidos o revestimientos de las grageas para identificar o
caracterizar diferentes combinaciones de las dosis de compuesto
activo. Para este propósito, se pueden usar soluciones concentradas
de azúcar, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco,
polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de
titanio, soluciones barniz, y disolventes orgánicos adecuados o
mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a
los comprimidos o revestimientos de las grageas para identificar o
caracterizar diferentes combinaciones de las dosis del compuesto
activo. Dichas formulaciones se pueden preparar usando métodos
conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, patentes de EE.UU. nº
5.733.888 (composiciones inyectables); 5.762.181 (compuestos poco
solubles en agua); 5.707.641 (proteínas o péptidos terapéuticamente
activos); 5.667.809 (agentes lipófilos); 5.576.012 (agentes
polímeros solubilizantes); 5.707.615 (formulaciones antivíricas);
5.683.676 (medicamentos en partículas); 5.654.286 (formulaciones
tópicas); 5.688.529 (suspensiones orales); 5.445.829 (formulaciones
de liberación prolongada); 5.653.987 (formulaciones líquidas);
5.641.515 (formulaciones de liberación controlada) y 5.601.845
(formulaciones de esferoides)).
Los siguientes ejemplos son para describir los
modos preferidos de los autores de la invención de llevar a cabo la
invención, es decir, de preparar, caracterizar, y usar las
realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la
técnica percibirán sin duda las variaciones de los detalles de los
métodos particulares usados y de las composiciones químicas
precisas usadas.
Para todas las síntesis de los compuestos de la
invención, como se describen aquí y en los siguientes Ejemplos, se
siguieron los siguientes protocolos (o se siguen respecto al
Ejemplo 7), salvo que se indique otra cosa. Las condiciones de
reacción se llevaron (o se llevan) a cabo en atmósfera de nitrógeno.
Todos los disolventes usados se secaron sobre tamices moleculares
de 3 \ring{A}. Todos los productos químicos y reactivos se usaron
como se adquirieron sin purificación adicional salvo que se
indique. El bencil-clorometil-éter se adquirió en
Fluka Chemie AG. La resorufina se adquirió en Aldrich Chemical Co.
La
7-hidroxi-3-trifluorometilcumarina
y
7-hidroxi-3-cianocumarina
se adquirieron en Molecular Probes, y todos se usaron tal como se
recibieron. Véase también, Wolfbeis, Otto, Z. Naturforsch
(1977) 32a, 1065-1067. La cromatografía en columna
se realizó con gel de sílice J.T. Baker (tamaño de partículas =
0,04-0,061 mm) usando combinaciones de disolventes
determinadas por análisis inicial por TLC con placas de gel de
sílice prerrevestidas Merk Kieselgel 60 F_{254}. Los espectros de
^{1}H RMN se registraron a 500 MHz, se analizaron por NuMega
Resonance Labs, Inc. Los espectros de masas se midieron por ESI con
un aparato PE-SCIEX API 150EX.
La benciloximetil-resorufina
(BOMR) se preparó como sigue: Se agitó vigorosamente una suspensión
de la sal sódica de resorufina (235 mg, 1 mmol) y K_{2}CO_{3}
(248 mg, 1,5 mmoles) en DMF (15 ml) a 0-5ºC durante
25 min. Después se añadió rápidamente a la mezcla de reacción
bencil-clorometil-éter (2,32 ml, 10,0 mmoles). La
mezcla rojo oscuro se agitó a 0ºC durante 1,5 horas. Después de
este tiempo la reacción se convirtió en una solución naranja. La
reacción se siguió hasta completarse por TLC (R_{f} = 0,42,
EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,05, CHCl_{3}). Después la reacción
se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con solución saturada
de NaHCO_{3} (30 ml). La capa acuosa se extrajo dos veces más con
Et_{2}O (30 ml). Después la bicapa de éter y de resorufina se
combinaron y se filtraron a través de celita. Después el filtrado
se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro, y se evaporó a presión
reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice
(gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio la
benciloximetiloxiresorufina en forma de un sólido naranja
(106 mg, 32%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 4,74 (s, 2H), 5,39 (s, 2H), 6,32 (s, 1H), 6,85-6,83 (m, 1H), 7,06-7,09 (m, 2H), 7,30-7,37 (m, 5H), 7,42 (d, 1H), 7,72 (d, 1H).
(106 mg, 32%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 4,74 (s, 2H), 5,39 (s, 2H), 6,32 (s, 1H), 6,85-6,83 (m, 1H), 7,06-7,09 (m, 2H), 7,30-7,37 (m, 5H), 7,42 (d, 1H), 7,72 (d, 1H).
La
7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina
(BOMCC) se preparó como sigue:
Se agitó vigorosamente una mezcla de
7-hidroxi-3-cianocumarina
(187 mg, 1 mmol) y K_{2}CO_{3} (248 mg, 1,5 mmoles) en DMF (15
ml), a 0ºC durante 25 min. Después se añadió rápidamente a la
reacción bencil-clorometil-éter
(2,32 ml, 10,0 mmoles). La mezcla amarillo brillante se agitó a 0ºC durante 45 min. Después de este tiempo la reacción se convirtió en una solución incolora. La reacción se siguió hasta completarse por TLC (R_{f} = 0,5, EtOAc:Hex 1:1, y
R_{f} = 0,24, CHCl_{3}). Después la reacción se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con solución saturada de NaHCO_{3}
(30 ml). La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30 ml). Después se combinaron las capas de éter y después se secaron con Na_{2}SO_{4} anhidro y se evaporaron a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio la 7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina pura en forma de un sólido blanco (9,21 mg, 3%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 4,73 (s, 2H), 5,39 (s, 2H), 7,08 (m, 2H), 7,32 (m, 5H), 7,49 (d, 1H), 8,17 (s, 1H).
(2,32 ml, 10,0 mmoles). La mezcla amarillo brillante se agitó a 0ºC durante 45 min. Después de este tiempo la reacción se convirtió en una solución incolora. La reacción se siguió hasta completarse por TLC (R_{f} = 0,5, EtOAc:Hex 1:1, y
R_{f} = 0,24, CHCl_{3}). Después la reacción se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con solución saturada de NaHCO_{3}
(30 ml). La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30 ml). Después se combinaron las capas de éter y después se secaron con Na_{2}SO_{4} anhidro y se evaporaron a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio la 7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina pura en forma de un sólido blanco (9,21 mg, 3%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 4,73 (s, 2H), 5,39 (s, 2H), 7,08 (m, 2H), 7,32 (m, 5H), 7,49 (d, 1H), 8,17 (s, 1H).
La
7-(p-metoxibenciloxi)-4-trifluorometilcumarina
(MOBFC) se preparó como sigue:
Se agitó vigorosamente una mezcla de
7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina
(230 mg, 1 mmol), K_{2}CO_{3} (248 mg, 1,5 mmoles), y KI (1,66
g, 10 mmoles) en DMF (15 ml), a 25ºC durante 25 min. Después se
añadió rápidamente a la reacción cloruro de
para-metoxibencilo (1,35 ml, 10,0 mmoles). La mezcla
amarillo brillante se agitó a 25ºC durante 1 h. Después de este
tiempo la reacción se convirtió en una solución incolora. La
reacción se siguió hasta completarse por TLC (R_{f} = 0,67,
EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,3, CHCl_{3}). Después la reacción se
recogió en Et_{2}O
(35 ml), y se extrajo con solución saturada de NaHCO_{3} (30 ml). La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O
(30 ml). Después se combinaron las capas de éter y después se secaron con Na_{2}SO_{4} anhidro y se evaporaron a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio la
7-parametoxibenciloxi-4-trifluorometilcumarina en forma de un sólido blanco (280 mg, 80%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 3,83 (s, 3H), 5,08 (s, 2H), 6,62 (s, 1H), 6,94 (m, 4H), 7,39 (m, 2H), 7.62 (m, 1H).
(35 ml), y se extrajo con solución saturada de NaHCO_{3} (30 ml). La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O
(30 ml). Después se combinaron las capas de éter y después se secaron con Na_{2}SO_{4} anhidro y se evaporaron a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio la
7-parametoxibenciloxi-4-trifluorometilcumarina en forma de un sólido blanco (280 mg, 80%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 3,83 (s, 3H), 5,08 (s, 2H), 6,62 (s, 1H), 6,94 (m, 4H), 7,39 (m, 2H), 7.62 (m, 1H).
La octiloximetilresorufina (OOMR) se preparó como
sigue: Se agitó vigorosamente una suspensión de la sal sódica de
resorufina (235 mg, 1 mmol) y K_{2}CO_{3} (248 mg, 1,5 mmoles)
en DMF (15 ml) a 0-5ºC durante 25 min. Después se
añadió rápidamente a la mezcla de reacción
bromometil-octil-éter (2,20 ml, 10,0 mmoles). La
mezcla se agitó a
0-5ºC durante 1,5 h, y durante este tiempo la mezcla de reacción rojo oscuro se convirtió en una solución naranja. La reacción se continuó agitando a 0-5ºC mientras se seguía por TLC (R_{f} = 0,44, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,05, CHCl_{3}), y se paró en el momento en que se detectó la descomposición del producto. Después la reacción se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con 30 ml de solución saturada de NaHCO_{3}. La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30 ml), después las fracciones de éter se combinaron y se filtraron a través de celita. Después el filtrado se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro, y se evaporó a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio 62 mg de octiloximetilresorufina (OOMR) en forma de un sólido naranja. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 0,83 (t, 3H), 1,21-1,31 (m, 12H), 3,68 (t, 2H), 5,31 (s, 1H), 6,32 (s, 1H), 6,83 (dd, 1H), 7,02-7,06 (m, 2H), 7,42 (d, 1H), 7,72 (d, 1H).
0-5ºC durante 1,5 h, y durante este tiempo la mezcla de reacción rojo oscuro se convirtió en una solución naranja. La reacción se continuó agitando a 0-5ºC mientras se seguía por TLC (R_{f} = 0,44, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,05, CHCl_{3}), y se paró en el momento en que se detectó la descomposición del producto. Después la reacción se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con 30 ml de solución saturada de NaHCO_{3}. La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30 ml), después las fracciones de éter se combinaron y se filtraron a través de celita. Después el filtrado se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro, y se evaporó a presión reducida. La cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio 62 mg de octiloximetilresorufina (OOMR) en forma de un sólido naranja. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 0,83 (t, 3H), 1,21-1,31 (m, 12H), 3,68 (t, 2H), 5,31 (s, 1H), 6,32 (s, 1H), 6,83 (dd, 1H), 7,02-7,06 (m, 2H), 7,42 (d, 1H), 7,72 (d, 1H).
La
7-metiloximetiloxi-4-trifluorometilcumarina
(MOMFC) se preparó como sigue:
Se agitó vigorosamente una mezcla de
7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina
(230 mg, 1 mmol) y K_{2}CO_{3} (248 mg, 1,5 mmoles), en DMF (15
ml), a 0-5ºC durante 25 min. Después se añadió
rápidamente a la reacción bromometil-metil-éter
(0,97 ml, 10,0 mmoles). La mezcla amarillo brillante se agitó a
0-5ºC durante 45 min, y durante este tiempo la
reacción se convirtió en una solución incolora. La reacción se
siguió agitando a 0-5ºC mientras se seguía por TLC
(R_{f} = 0,54, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,24, CHCl_{3}), y se
paró en el momento en el que se detectó la descomposición del
producto. Después la reacción se recogió en Et_{2}O (35 ml), y se
extrajo con 30 ml de solución saturada de NaHCO_{3}. La capa
acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30 ml), después las
fracciones de éter se combinaron, se secaron con Na_{2}SO_{4}
anhidro, se filtraron y se evaporaron a presión reducida. La
cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de
MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) dio 11 mg de la
7-metiloximetiloxi-4-trifluorometilcumarina
(MOMFC) purificada en forma de un sólido blanco. ^{1}H RMN (500
MHz, CDCl_{3}): \delta 3,49 (s, 3H), 5,26 (s, 2H), 6,64 (s,
1H), 7,08-7,02 (m, 2H), 7,64 (d, 1H).
La para-metoxibencilresorufina
(MOBR) se preparó como sigue: Se agitó vigorosamente una mezcla de
la sal sódica de resorufina (235 mg, 1 mmol) y K_{2}CO_{3} (248
mg, 1,5 mmoles) en DMF (15 ml) a 0ºC durante 25 min. Después se
añadió rápidamente a la mezcla de reacción cloruro de
para-metoxibencilo (1,35 ml, 10,0 mmoles). La mezcla
rojo oscuro se agitó a 25ºC durante 1,5 h. Después de este tiempo
la reacción se convirtió en una solución naranja. La reacción se
siguió hasta completarse por TLC (R_{f} = 0,32, EtOAc:Hex 1:1, y
R_{f} = 0,05, CHCl_{3}). Después la reacción se recogió en
Et_{2}O (35 ml), y se extrajo con solución saturada de NaHCO_{3}
(30 ml). La capa acuosa se extrajo dos veces más con Et_{2}O (30
ml). Después la bicapa de éter y resorufina se combinaron y se
filtraron a través de celita. Después el filtrado se secó con
Na_{2}SO_{4} anhidro, y se evaporó a presión reducida. La
cromatografía del producto bruto en gel de sílice (gradiente de MeOH
en CHCl_{3} al 0-5%) dio la
para-metoxibencil-resorufina en
forma de un sólido naranja (60 mg, 18%). ^{1}H RMN (500 MHz,
CDCl_{3}): \delta 3,83 (s, 3H), 5,10 (s, 2H), 6,32 (s, 1H),
6,82-6,88 (m, 2H), 6,94 (d, 2H),
6,99-7,01 (dd, 1H), 7,37 (d, 2H), 7,42 (d, 1H),
7,70 (d, 1H).
Los siguientes esquemas de reacción se usan para
sintetizar otros sensores ópticos de CYP450 de la presente
invención:
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ DMF\+\cr Q-H + CH _{2} Br _{2} \+
------------> \+ Q-CH _{2} -Q\cr
\+
K _{2} CO _{3} \+\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ DMF\+\cr Q-H + ClCH _{2} OCH _{2} Cl \+
------------> \+
Q-CH _{2} OCH _{2} -Q\cr \+
K _{2} CO _{3} \+\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ ZnCl _{2} \+\cr Q-H + (CH _{2} O) _{n}
\+ ------------> \+
Q-(CH _{2} O) _{n} CH _{2} -Q\cr \+ o HCl \+
\hskip7mm n = 2, 3, 4, 5,
etc.\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ NaH \+ \+ Q-H\+\cr R-OH +
ClCH _{2} OCH _{2} Cl \+ ------------> \+ ROCH _{2} OCH _{2} Cl
\+ ------------> \+ ROCH _{2} OCH _{2} -Q\cr
(exceso) \+ \+ \+
DMF/K _{2} CO _{3} \+\cr}
La aplicación de la presente invención para
"modificar" la bencilresorufina (BR) conduce, en una
realización de la invención, a un compuesto de la invención, la
benciloximetilresorufina (BOMR), la cual tiene la siguiente
estructura:
Cualquiera de los cuatro hidrógenos que se pueden
abstraer (indicados como H^{1} y H^{2} en esta representación
de la BOMR) que se quite en la etapa de reacción inicial, con
referencia al Esquema de reacción 1 de la Figura 1, el producto de
hidroxilación se descompondrá espontáneamente al colorante
resorufina libre. Además, el grupo benciloxi, unido al carbono que
lleva los dos hidrógenos indicados como H^{2}, contribuye con un
efecto electrónico inductivo en este carbono, que puede estabilizar
el radical formado durante la abstracción de uno de los hidrógenos
H^{2} por el citocromo P450. Este nuevo sensor de CYP450 de la
invención, BOMR, tiene una serie de ventajas frente a la
bencilresorufina como sustrato del CYP 3A4, como se ha demostrado y
se ilustra en la Figura 4. Los datos ilustrados en la Figura 4 se
adquirieron de acuerdo con el método descrito por Henderson,
P.J.F., Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data.
"Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993).
La optimización de las condiciones de ensayo, se
llevaron, y preferiblemente se llevan a cabo, por el Diseño de
metodologías experimentales validadas estadísticamente, usando el
paquete de software comercial "Design-Expert®"
producido por Stat-Ease® Inc. Los datos mostrados en
las Figuras 4 y 5 se obtuvieron con optimización inicial.
Analizando los datos ilustrados en la Figura 4,
se determinó que la velocidad de recuperación por el CYP 3A4 de la
BOMR es aproximadamente cinco veces mayor que la velocidad de
recuperación por el CYR 3A4 de la BR; la velocidad de recuperación
de la BOMR (k_{cat}) era 0,5 s^{-1} (K_{m} de 1,9 \muM),
mientras que la velocidad de recuperación de la BR (k_{cat}) era
0,10 min^{-1} (K_{m} = 5,3 \muM). Basándose en las
velocidades de recuperación calculadas y los valores de K_{m},
también se determinó que la eficacia enzimática (k_{cat}/K_{m})
del CYP 3A4 frente a la BOMR era 14 veces superior que la eficacia
enzimática (k_{cat}/K_{m}) del CYP 3A4 frente a la BR.
Para demostrar la eficacia de la BOMR como un
sensor para una subfamilia específica de CYP450 humano, se incubó
CYP 3A4 con concentraciones 10 \muM de diferentes inhibidores
conocidos y sustratos fármaco, y se usó BOMR para evaluar la
actividad residual del CYP450 en un formato de selección típico.
Como se muestra en la Figura 5, se llevó a cabo un ensayo de
inhibición de CYP 3A4 usando BOMR. Este ensayo se llevó a cabo en
una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente y con un volumen de
100 \mul/pocillo. Se preparó tampón de enzima 1,82X y se
añadieron 55 \mul a cada pocillo de la placa, para tener
concentraciones finales de ensayo de NADP^{+} 1,3 mM,
glucosa-6-fosfato 3,3 mM,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0.
Los fármacos inhibidores, miconazol, eritromicina, verapamilo,
dilitazem, etinilestradiol, tamoxifeno, y los sustratos, digoxina,
estrona, estradiol, warfarina, prednisona, y acetaminofeno, se
diluyeron a partir de soluciones madre 10 mM en acetonitrilo, a 100
\muM en K+ fosfato 100 mM. Se añadieron 10 \mul de esta
dilución a los pocillos adecuados en la placa para tener una
concentración final del inhibidor de 10 \muM. El CYP 3A4 se
diluyó para dar una solución que contenía 2 pmoles/10\mul en
tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron 10 \mul a los pocillos
adecuados de la placa. Se añadieron 20 \mul de tampón a los
pocillos que contenían los patrones. Los fármacos inhibidores se
dejaron incubaran previamente con la enzima CYP 3A4 durante 1 h
antes de añadir el sensor BOMR. El sensor BOMR se diluyó a 4 \muM
(concentración final de ensayo 4X) en tampón K+ fosfato 100 mM, y se
añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados en la placa.
Se generaron datos para una curva de calibración
patrón de la fluorescencia del producto de la siguiente forma: Se
diluyó resorufina a 40 \muM en tampón K+ fosfato, y se hicieron
siete diluciones 1:2 consecutivas. Se añadieron 25 \mul de cada
dilución a los pocillos adecuados en la placa que contenía 75 \mul
de tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0, y se empezó inmediatamente la
lectura de las placas. Para la BOMR el filtro de excitación era 530
nm y el filtro de emisión era 580 nm.
\newpage
Los resultados de estos experimentos se muestran
en la Figura 5. Los compuestos que se sabía que eran inhibidores
eficaces (por ejemplo, miconazol y verapamilo) inhibieron
aproximadamente 100% la actividad del CYP 3A4 sobre la BOMR,
inhibiendo de hecho completamente la actividad del CYP 3A4 sobre la
BOMR.
Por lo tanto, como se demuestra con la BOMR, y se
ilustra en las Figuras 4 y 5, la introducción del conector
oximetilo en los sustratos fluorogénicos con fluoróforos de
longitud de onda larga, tales como la resorufina, da los nuevos
sensores de CYP450 de la invención con propiedades cinéticas
superiores a las de los sustratos de CYP450 conocidos más
estrechamente relacionados estructuralmente.
La utilidad para detectar las interacciones
fármaco-CYP450 de sensores seleccionados que
contienen el conector oximetilo de la presente invención, se
demostró además para la
7-benciloximetoxi-3-cianocumarina
(BOMCC), y el éter n-octiloximetílico de la
resorufina (OMOMR), como se ilustra respectivamente en las Figuras
6, y Figuras 6 y 7. En la Figura 6, se ilustran los resultados de un
ensayo de inhibición del CYP 3A4 usando BOMMC. Esta Figura ilustra
que otro compuesto de la invención, la BOMCC, es útil como medio
para detectar la presencia de inhibidores de la enzima CYP450, CYP
3A4. Este ensayo se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos a
temperatura ambiente y con un volumen de 100 \mul/pocillo. Se
preparó tampón de enzima 1,82X y se añadieron 55 \mul a cada
pocillo en la placa, para tener concentraciones finales de ensayo de
NADP^{+} 1,3 mM,
glucosa-6-fosfato 3,3 mM,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0.
Los fármacos inhibidores, difenilhidantoína, propanolol,
imipramina, lansoprazol, pentamidina y tranilcipromina, se
diluyeron a partir de soluciones madre 10 mM en acetonitrilo, a 100
\muM en K+ fosfato 100 mM. Se añadieron 10 \mul de esta
dilución a los pocillos adecuados en la placa para una concentración
final del inhibidor de 10 \muM. El CYP 3A4 se diluyó para dar una
solución que contenía 2 pmoles/10\mul en tampón K+ fosfato 100
mM, y se añadieron 10 \mul a los pocillos adecuados de la placa.
Se añadieron 20 \mul de tampón a los pocillos que contenían los
patrones. Los fármacos inhibidores se dejaron incubar previamente
con la enzima 3A4 durante 1 h antes de añadir el sustrato BOMCC. El
sensor BOMCC se diluyó a 40 \muM (concentración final de ensayo
4X) en tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0, y se añadieron 25 \mul a
los pocillos adecuados en la placa.
Se generaron datos para una curva de calibración
patrón de la fluorescencia del producto de la siguiente forma: Se
diluyó
7-hidroxi-3-cianocumarina
a 40 \muM en tampón K+ fosfato, y se hicieron siete diluciones
1:2 consecutivas. Se añadieron 25 \mul de cada dilución a los
pocillos adecuados en las placas que contenían 75 \mul de tampón
K+ fosfato
100 mM, pH 8,0, y se empezó inmediatamente la lectura de las placas. Para la BOMCC el filtro de excitación era 395 nm y el filtro de emisión era 460 nm.
100 mM, pH 8,0, y se empezó inmediatamente la lectura de las placas. Para la BOMCC el filtro de excitación era 395 nm y el filtro de emisión era 460 nm.
En la Figura 7 se ilustran los resultados de un
ensayo de inhibición del CYP 2C9 usando dos compuestos de la
invención BOMCC y OOMR. Esta Figura ilustra que la BOMCC y la OOMR
son útiles para detectar la presencia de inhibidores de la enzima
CYP450 2C9. Este ensayo se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos
a temperatura ambiente y con un volumen de 100 \mul/pocillo. Se
preparó tampón de enzima 1,82X y se añadieron 55 \mul a cada
pocillo de la placa, para tener concentraciones finales de ensayo
de NADP^{+} 1,3 mM,
glucosa-6-fosfato 3,3 mM,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0.
Los fármacos inhibidores, diclofenaco, fenitoina, tenoxicam,
tolbutamida y sulfinpirazona, se diluyeron a partir de soluciones
madre 10 mM en acetonitrilo, a 100 \muM en K+ fosfato 100 mM. Se
añadieron 10 \mul de esta dilución a los pocillos adecuados en la
placa para una concentración final del inhibidor 10 \muM. El CYP
2C9 se diluyó para dar una solución que contenía 10 pmoles/10\mul
en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron 10 \mul a los
pocillos adecuados de la placa. Se añadieron 20 \mul de tampón a
los pocillos que contenían los patrones. Los fármacos inhibidores se
dejaron incubar previamente con la enzima 2C9 durante 1 h antes de
añadir los sensores BOMCC o OOMR. El sensor BOMCC se diluyó
a
40 \muM (concentración final de ensayo 4X) en tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0, y se añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados. El sensor OOMR se diluyó a 8 \muM (concentración final de ensayo 4X) en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados en la placa. Los patrones 7-hidroxi-3-cianocumarina y resorufina se diluyeron a 40 \muM en tampón K+ fosfato, y se hicieron siete diluciones 1:2. Se añadieron 25 \mul de cada dilución a los pocillos adecuados en la placa que contenía 75 \mul de tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0, y se empezó inmediatamente la lectura de las placas. Para la BOMCC el filtro de excitación era 395 nm y el filtro de emisión era 460 nm. Para la MOBR el filtro de excitación era 530 nm y el filtro de emisión era 580 nm.
40 \muM (concentración final de ensayo 4X) en tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0, y se añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados. El sensor OOMR se diluyó a 8 \muM (concentración final de ensayo 4X) en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados en la placa. Los patrones 7-hidroxi-3-cianocumarina y resorufina se diluyeron a 40 \muM en tampón K+ fosfato, y se hicieron siete diluciones 1:2. Se añadieron 25 \mul de cada dilución a los pocillos adecuados en la placa que contenía 75 \mul de tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0, y se empezó inmediatamente la lectura de las placas. Para la BOMCC el filtro de excitación era 395 nm y el filtro de emisión era 460 nm. Para la MOBR el filtro de excitación era 530 nm y el filtro de emisión era 580 nm.
Se ha ensayado una variedad de sensores de la
invención que contienen oximetilo frente a isozimas CYP450 humanas
conocidas, implicadas principalmente en el metabolismo de fármacos
en seres humanos. Se encontraron nuevos sustratos adecuados para la
selección de alta producción, para CYP 3A4, CYP 2C19, CYP 2C9, CYP
1A2 y CYP 2B6. Las Tablas 1 a 9 como se describe con detalle en este
y en los siguientes Ejemplos, proporcionan datos relacionados con
las propiedades cinéticas de diferentes sensores fluorogénicos de
CYP450 de la presente invención, comparadas con las propiedades
cinéticas de los sustratos fluorogénicos de CYP450, más
estrechamente relacionados estructuralmente, y actualmente
disponibles.
La Tabla 1 se preparó de acuerdo con el método
general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of
Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University
Press, 277-313 (1993). Las filas de la Tabla 1
corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente
al CYP 3A4; las columnas corresponden, respectivamente, a las
abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la
velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación
a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los
valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas.
Para entender mejor estos términos en el contexto de esta
invención, se dirige la atención a la Figura 4 y el análisis de la
Figura 4. Como habrán comprendido los expertos en la técnica, los
análogos de oximetilo de la presente invención (BOMR, BOMFC, BOMCC
y EOMR) presentan una conversión más eficaz al mismo producto
fluorescente que cada uno de los sustratos más estrechamente
relacionados estructuralmente (respectivamente, BR, BFC, BCC, y ER).
Realmente, en todos los casos estudiados hasta el momento, excepto
para el caso de un sustrato fluorogénico de CYP450 evaluado frente
a una enzima CYP450 (el efecto de la MOMFC como un sustrato del CYP
2B6 como se muestra en la Tabla 5), los derivados de oximetilo de
la presente invención presentaron mejores cinéticas frente a los
sustratos fluorogénicos más estrechamente relacionados
estructuralmente.
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos
con el CYP 3A4. La bencilresorufina (BR) y
7-benciloxi-4-trifluorometilcumarina
(BFC) son sustratos del CYP450 disponibles en el comercio. Sus
análogos de oximetilo (BOMR, BOMFC) se convierten más eficazmente
en el correspondiente producto fluorescente. Los análogos de
oximetilo de la
7-benciloxi-3-cianocumarina
y etilresorufina son mejores sustratos que los sustratos
relacionados (uM = \muM;
n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, ()del ajuste de Michaelis-Menten).
n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, ()del ajuste de Michaelis-Menten).
\newpage
La Tabla 2 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por
Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic
Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993). Las filas de la Tabla 2
corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente
al CYP 2C19; las columnas corresponden, respectivamente, a las
abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la
velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación
a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los
valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas
detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, los
análogos de oximetilo de la presente invención (EOMCC, BOMCC, y
MOMCC) presentaron una conversión más eficaz al mismo producto
fluorescente que cada uno de los sustratos más estrechamente
relacionados estructuralmente (respectivamente, 3CEC, BCC, y
3CMC).
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos
con CYP 2C19. La
3-ciano-7-etoxicumarina
(3CEC) es un sustrato del CYP450 disponible en el comercio. Su
análogo de oximetilo (EOMCC) se convierte más eficazmente en el
correspondiente producto fluorescente. Los análogos de oximetilo de
la
7-benciloxi-3-cianocumarina
y
3-ciano-7-metoxicumarina
son mejores sustratos que los sustratos relacionados (uM = \muM;
n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, () del
ajuste de Michaelis-Menten).
La Tabla 3 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por
Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic
Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993). Las filas de la Tabla 3
corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente
al CYP 2C19; las columnas corresponden, respectivamente, a las
abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la
velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación
a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los
valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas
detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, los
análogos de oximetilo de la presente invención (MOMFC, BOMCC, y
MOMCC) presentaron una conversión más eficaz al mismo producto
fluorescente que cada uno de los sustratos más estrechamente
relacionados estructuralmente (respectivamente, MFC, BCC, y
3CMC).
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos
con CYP 2C9. La
7-metoxi-4-trifluorometilcumarina
(MFC) es un sustrato del CYP450 disponible en el comercio. Su
análogo de oximetilo (MOMFC) se convierte más eficazmente en el
correspondiente producto fluorescente. Los análogos de oximetilo de
la
7-benciloxi-3-cianocumarina
y de la
3-ciano-7-metoxicumarina
son mejores sustratos que los sustratos relacionados (uM = \muM;
n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, () del
ajuste de Michaelis-Menten).
La Tabla 4 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por
Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic
Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993). Las filas de la Tabla 4
corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente
al CYP 1A2; las columnas corresponden, respectivamente, a las
abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la
velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación
a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, los valores de la
relación de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas
detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, el
análogo de oximetilo de la presente invención (EOMCC) presentó una
conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que cada uno
de los sustratos más estrechamente relacionados estructuralmente
(3CEC).
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos
con CYP 1A2. La
3-ciano-7-etoxicumarina
(3CEC) es un sustrato del CYP450 disponible en el comercio. Su
análogo de oximetilo (EOMCC) se convierte de forma un poco más
eficaz en el correspondiente producto fluorescente (mayor
k_{cat}/K_{m}).
La Tabla 5 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por
Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic
Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993). Las filas de la Tabla 5
corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente
al CYP 2B6; las columnas corresponden, respectivamente, a las
abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la
velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación
a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los
valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas
detectadas. Como comprenderán los expertos en la técnica, dos de
los análogos de oximetilo de la presente invención ensayados en este
ejemplo (BOMCC, y BOMR) presentaron una conversión más eficaz al
mismo producto fluorescente que cada uno de los sustratos más
estrechamente relacionados estructuralmente (respectivamente, BCC,
y BR).
Como se ha indicado antes, el caso de MOMFC como
un sustrato del CYP 2B6 es el único caso en el que el sustrato
fluorogénico de CYP450 de la presente invención no presentó mejor
cinética, es decir, conversión más eficaz al mismo producto
fluorescente, que el sustrato más estrechamente relacionado
estructuralmente, en este caso MFC. Por el método usado para
identificar este único caso, o métodos comparables para seleccionar
las parejas de sustrato fluorogénico de CYP450 y enzima CYP450, los
expertos en la técnica pueden distinguir los sustrato fluorogénicos
de CYP450 más deseables de la presente invención para su uso
particular.
(TABLA 5 pasa a página
siguiente)
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos
con CYP 2B6. La
7-metoxi-4-trifluorometilcumarina
(MFC) es un sustrato del CYP450 disponible en el comercio. Este es
el caso en el que su análogo de oximetilo (MOMFC) se convierte
menos eficazmente en el correspondiente producto fluorescente
encontrado hasta la fecha (15/11/98). Los análogos de oximetilo de
la
7-benciloxi-3-cianocumarina
y de bencilresorufina son mejores sustratos que los sustratos
relacionados (uM = \muM; n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo
para cuantificar, () del ajuste de
Michaelis-Menten).
La Tabla 6 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por
Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic
Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993). Las filas de la Tabla 6
corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente
al CYP 3A4 y CYP 2D6, como se ha indicado; las columnas
corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato
fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a
10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de
k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y
K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas.
Otros sustratos sintetizados primero y ensayados
con CYP 3A4 y CYP 2D6. Los derivados de oximetil-éter de la
invención (OOMR, BOM-DDAO, OOMCC, MOMR) están
listados en negrita; otros éteres están listados en itálica.
La Tabla 7 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por
Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic
Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993). Las filas de la Tabla 7
corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente
al CYP 2C9 y CYP 2C19, como se ha indicado; las columnas
corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato
fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a
10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de
k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y
K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas.
Otros sustratos sintetizados primero y ensayados
con CYP 2C9 y CYP 2C19. Los derivados de oximetil-éter de la
invención (OOMR, OOMCC, MOMR) están listados en negrita; otros
éteres están listados en itálica.
La Tabla 8 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general que la Tabla 1, el método general descrito por
Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic
Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993). Las filas de la Tabla 8
corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente
al CYP 3A4 y CYP 2D6, como se ha indicado; las columnas
corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato
fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a
10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de
k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y
K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Como comprenderán los
expertos en la técnica, los análogos de oxifenilmetilo de la
presente invención (MOBFC y MOBR) presentaron una conversión más
eficaz al mismo producto fluorescente que cada uno de los sustratos
más estrechamente relacionados estructuralmente (respectivamente,
MFC y MR). Realmente, en todos los casos estudiados hasta el
momento, los derivados de oxifenilmetilo de la presente invención
presentaron mejores cinéticas frente a los sustratos fluorogénicos
más estrechamente relacionados estructuralmente.
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos
con CYP 3A4 y CYP 2D6. La
7-metoxi-4-trifluorometilcumarina
(MFC) y la metilresorufina (MR) son sustratos del CYP450
disponibles en el comercio. Sus análogos de oxifenilmetilo (MOBFC y
MOBR) se convierten más eficazmente en los correspondientes
productos fluorescentes (uM = \muM;
n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, () del ajuste de Michaelis-Menten).
n.a. = no aplicable; --- demasiado bajo para cuantificar, () del ajuste de Michaelis-Menten).
La Tabla 9 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general de la Tabla 1, el método general descrito por
Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic
Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993). Las filas de la Tabla 9
corresponden a sustratos fluorogénicos específicos ensayados frente
al CYP 2C9, CYP 2C19 y CYP 2B6, como se ha indicado; las columnas
corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato
fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a
10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de
k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y
K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Como comprenderán los
expertos en la técnica, los análogos de oxifenilmetilo de la
presente invención (MOBFC y MOBR) presentaron una conversión más
eficaz al mismo producto fluorescente que cada uno de los sustratos
más estrechamente relacionados estructuralmente (respectivamente,
MFC y MR). Realmente, en todos los casos estudiados hasta el
momento, los derivados de oxifenilmetilo de la presente invención
presentaron mejores cinéticas frente a los sustratos fluorogénicos
más estrechamente relacionados estructuralmente.
Propiedades cinéticas de sustratos fluorogénicos
con CYP 2C9, CYP 2C19 y CYP 2B6. La
7-metoxi-4-trifluorometilcumarina
(MFC) y la metil-resorufina (MR) son sustratos de
CYP450 disponibles en el comercio. Sus análogos de oxifenilmetilo
(MOBFC y MOBR) se convierten más eficazmente en los correspondientes
productos fluorescentes (uM = \muM; n.a. = no aplicable; ---
demasiado bajo para cuantificar, () del ajuste de
Michaelis-Menten).
Para demostrar la eficacia de la MOBFC como
sensor para una subfamilia específica de CYP450 humano, CYP 2D6, y
su uso para determinar constantes de inhibición aparentes, se
llevaron a cabo los siguientes experimentos. Se incubó CYP 2D6 con
concentraciones 10 \muM de diferentes inhibidores conocidos y
sustratos fármacos, y se ensayó la actividad residual del CYP 2D6
con el sustrato fluorogénico MOBFC. El ensayo se llevó a cabo en
una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente con un volumen de
100 \mul/pocillo. Se preparó tampón de enzima 4X y se añadieron
25 \mul a cada pocillo en la placa, para tener concentraciones
finales de ensayo de
glucosa-6-fosfato 3,3 mM,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0.
Los fármacos inhibidores, quinidina, clorfeniramina, yohimbina,
imipramina, amjalina, propanolol, doxorrubicina, haloperidol y
corinantina, se diluyeron a partir de soluciones madre 10 mM en
acetonitrilo, a 120 \muM en K+ fosfato 100 mM. Se hicieron seis
diluciones consecutivas 1:3 y se añadieron 50 \mul de cada una a
los pocillos adecuados en la placa de ensayo. El CYP 2D6 se diluyó
para dar una solución que contenía 2 pmoles/10\mul en tampón K+
fosfato 100 mM, y se añadieron
10 \mul a cada pocillos. Se añadieron 20 \mul de tampón a cada pocillo que contenía el patrón. Los fármacos inhibidores se dejaron incubar previamente con la enzima CYP 2D6 durante 1 h antes de añadir el sustrato MOBF. El sustrato MOBFC se diluyó a 26,6 \muM (concentración final de ensayo 6,7X) en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron
15 \mul a los pocillos adecuados en la placa. Los datos para una curva de calibración patrón de la fluorescencia del producto se generaron de la siguiente forma: Se diluyó hidroxi-trifluoro-metilcumarina a 100 \muM en tampón K+ fosfato, y se hicieron siete diluciones consecutivas 1:2. Se añadieron 10 \mul de cada dilución a los pocillos adecuados en la placa que contenía 90 \mul de tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. Después de añadir 10 \mul de soluciones de NADP+ 13 mM a todos los pocillos, la placa de ensayo se puso en el lector de fluorescencia de placas de microvaloración y se midió la fluorescencia en intervalos de 3 minutos durante 60 min. Para la MOBFC el filtro de excitación era 395/25 nm y el filtro de emisión era 530/25 nm. Se determinaron los valores de CI_{50} (valor para inhibir 50% de la recuperación del sustrato fluorogénico) y se convirtieron en los valores de ki aparente de acuerdo con el método general descrito por Henderson, P.J.F., Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993).
10 \mul a cada pocillos. Se añadieron 20 \mul de tampón a cada pocillo que contenía el patrón. Los fármacos inhibidores se dejaron incubar previamente con la enzima CYP 2D6 durante 1 h antes de añadir el sustrato MOBF. El sustrato MOBFC se diluyó a 26,6 \muM (concentración final de ensayo 6,7X) en tampón K+ fosfato 100 mM, y se añadieron
15 \mul a los pocillos adecuados en la placa. Los datos para una curva de calibración patrón de la fluorescencia del producto se generaron de la siguiente forma: Se diluyó hidroxi-trifluoro-metilcumarina a 100 \muM en tampón K+ fosfato, y se hicieron siete diluciones consecutivas 1:2. Se añadieron 10 \mul de cada dilución a los pocillos adecuados en la placa que contenía 90 \mul de tampón K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. Después de añadir 10 \mul de soluciones de NADP+ 13 mM a todos los pocillos, la placa de ensayo se puso en el lector de fluorescencia de placas de microvaloración y se midió la fluorescencia en intervalos de 3 minutos durante 60 min. Para la MOBFC el filtro de excitación era 395/25 nm y el filtro de emisión era 530/25 nm. Se determinaron los valores de CI_{50} (valor para inhibir 50% de la recuperación del sustrato fluorogénico) y se convirtieron en los valores de ki aparente de acuerdo con el método general descrito por Henderson, P.J.F., Statistical Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press, 277-313 (1993).
| Fármaco | Valores de k_{i} aparente [uM] |
| Quinidina | 0,15 |
| Clorfeniramina | 2,5 |
| Yohimbina | 10 |
| Imipramina | 0,1 |
| Amjalina | > 30 |
| Propanolol | > 30 |
| Doxorrubicina | 8 |
| Haloperidol | 3 |
| Corinantina | > 30 |
Valores de k_{i} aparentes para la inhibición
del CYP 2D6 por fármacos que se sabe que interaccionan con la
enzima, determinados a partir de los valores de CI_{50} de la
inhibición del metabolismo de la MOBFC por la enzima.
El éster de succinimidilo del ácido
7-benciloximetiloxicumarina-3-carboxílico
se preparó por el siguiente procedimiento: Se agitó vigorosamente
una mezcla del éster de succinimidilo del ácido
7-hidroxicumarina-3-carboxílico
(303 mg, 1 mmol) en carbonato potásico seco (248 mg, 1,5 mmoles) en dimetilformamida seca (15 ml), a 0ºC durante
25 min. Después se añadió rápidamente a la reacción bencil-clorometil-éter (2,32 ml, 10,0 mmoles). La mezcla amarillo brillante se agitó a 0ºC durante 45 min y durante 2 h a 25ºC. Después de este tiempo la reacción se convirtió en una solución incolora. La reacción se siguió por TLC (R_{f} = 0,5, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,24, CHCl_{3}). Después de separar la materia prima cumarina, el medio de reacción se diluyó con éter dietílico (100 ml) y se extrajo con 50 ml de ácido acético acuoso al 5%. La capa de éter se separó y se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró, y los disolventes se evaporaron a presión reducida. El sólido se recristalizó en metanol y se lavó con hexanos (20 ml, 0ºC). El producto, el éster de succinimidilo del ácido 7-benciloximetiloxicumarina-3-carboxílico, se secó a presión reducida dando un sólido blanco (85 mg, 20%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 2,91 (s, 4H), 4,74 (s, 2H), 5,40 (s, 2H), 7,07 (m, 2H), 7,32 (m, 5H), 7,53 (d, 1H), 8,75 (s, 1H).
(303 mg, 1 mmol) en carbonato potásico seco (248 mg, 1,5 mmoles) en dimetilformamida seca (15 ml), a 0ºC durante
25 min. Después se añadió rápidamente a la reacción bencil-clorometil-éter (2,32 ml, 10,0 mmoles). La mezcla amarillo brillante se agitó a 0ºC durante 45 min y durante 2 h a 25ºC. Después de este tiempo la reacción se convirtió en una solución incolora. La reacción se siguió por TLC (R_{f} = 0,5, EtOAc:Hex 1:1, y R_{f} = 0,24, CHCl_{3}). Después de separar la materia prima cumarina, el medio de reacción se diluyó con éter dietílico (100 ml) y se extrajo con 50 ml de ácido acético acuoso al 5%. La capa de éter se separó y se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró, y los disolventes se evaporaron a presión reducida. El sólido se recristalizó en metanol y se lavó con hexanos (20 ml, 0ºC). El producto, el éster de succinimidilo del ácido 7-benciloximetiloxicumarina-3-carboxílico, se secó a presión reducida dando un sólido blanco (85 mg, 20%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): \delta 2,91 (s, 4H), 4,74 (s, 2H), 5,40 (s, 2H), 7,07 (m, 2H), 7,32 (m, 5H), 7,53 (d, 1H), 8,75 (s, 1H).
Se mezclaron cinco (5) \mumoles de éster de
succinimidilo del ácido
7-benciloximetiloxicumarina-3-carboxílico
en dimetilformamida seca (50 \mul) con una solución 1 M de una
mezcla racémica de 1,2-diaminociclohexanos (50
\mumoles) en un tubo de centrífuga de plástico. La reacción se
dejo avanzar con tratamiento con ultrasonidos a temperatura
ambiente durante 2 h, y después de este tiempo se añadieron 500
\mul de agua desionizada al tubo y se formó un precipitado
blanco. La reacción se centrifugó en una centrífuga y se decantó el
disolvente. Los resultados de los espectros de
UV-visible (absorbancia máxima a 340 nm) y EM de
electropulverización (M+H = 423, M+Na = 445) llevados a cabo en una
muestra del sólido, estaban de acuerdo con la estructura del
siguiente producto (mezcla de estereoisómeros):
BOM-09B
Se ensayó la actividad de la mezcla racémica del
compuesto (indicado como BOM-09B) con isozimas
citocromo P450. BOM-09B mostró una actividad
particularmente alta con la isozima CYP 3A4. En ensayo con el CYP
3A4 se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos a 37ºC en un
volumen de 100 \mul/pocillo. Se diluyó BOM-09B de
una solución madre 1 mM en acetonitrilo a una concentración 4X de
80 \muM en tampón K+ fosfato 100 mM del cual se añadieron 25
\mul a los pocillos adecuados. Se preparó tampón de enzima y se
añadieron 65 \mul a cada pocillo en la placa, para tener
concentraciones finales de ensayo de NADP^{+} 1,3 mM,
glucosa-6-fosfato 3,3 mM,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. La
isozima citocromo P450 CYP 3A4 se diluyó para dar 2 pmoles de
enzima por pocillo. La conversión enzimática del sustrato en los
productos se dejó avanzar durante 1 hora tomando lecturas de
fluorescencia cada 4 minutos en un lector de fluorescencia de
placas de microvaloración. La solución se iluminó con un filtro de
excitación de 395/25 nm y se detectó la emisión de fluorescencia a
través de un filtro de emisión de 460/40 nm. La velocidad de
conversión de este sustrato (BOM-09B) se comparó
con el sustrato BOMCC en condiciones idénticas, y se encontró que
era la mitad de la de BOMCC (velocidad de conversión
_{(BOM-09B)} = 0,75 pmoles de sustrato/pmoles de
enzima \cdot min).
Se sintetizan bibliotecas de derivados de éteres
de 7-hidroxicumarinas y resorufinas como se indica
a continuación, es decir, a continuación se muestran los caminos de
reacción que conducen a bibliotecas de sustratos fluorogénicos
candidatos de CYP450. El éster de succinimidilo del ácido
7-hidroxicumarina-3-carboxílico
está disponible en el comercio en Molecular Probes. Las materias
primas de resorufina se preparan fácilmente siguiendo los
procedimientos de las patentes de EE.UU. 4.954.630 y 5.304.645, que
describen la preparación de los ácidos y su conversión en ésteres
activos usando TSTU. Los ésteres activos de los colorantes son
estables en las condiciones de alquilación necesarias para preparar
los éteres de los fenoles colorantes. Después de alquilación, los
éteres colorantes fluorogénicos resultantes se modifican en el
resto éster activo por reacción con una biblioteca de aminas
alifáticas primarias y secundarias. Las cadenas laterales
alifáticas se eligen para que incluyan diversos restos aromáticos y
heterocíclicos. También se incluyen 20 diaminas en la biblioteca de
aminas. Cuando se hacen reaccionar con los ésteres colorantes
activos con grandes excesos molares, las reacciones con diaminas dan
como resultado sustratos candidatos cargados positivamente, que se
seleccionan por su actividad frente a la isozima CYP 2D6, que se
sabe que prefiere sustratos cargados positivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos se purifican por cromatografía en
columna o recristalización después de la alquilación del fenol
colorante. El acoplamiento con las aminas se lleva a cabo en una
escala de 10 \mumoles en dimetilformamida y normalmente se
produce con alto rendimiento. Las reacciones se siguen en paralelo
por cromatografía en capa fina para asegurar que las reacciones se
completan y detectar y separar los miembros de la biblioteca que
reaccionan mal. El disolvente se separa con alto vacío y el exceso
de amina se separa suspendiendo el residuo en ácido acético acuoso
al 10%, seguido de recuperación del producto por centrifugación.
Este procedimiento conduce a compuestos con suficiente pureza
(ensayados por TLC) para el ensayo inicial del metabolismo por las
enzimas CYP450. Los sustratos prometedores se vuelven a sintetizar
en una escala mayor (100 \mumoles), se purifican por
cromatografía incluyendo separación de regioisómeros (sustratos
basados en resorufina) y se analizan por EM de electropulverización
y se analizan por ^{1}H-RMN.
Las bibliotecas de sustratos putativos recién
sintetizados se disuelven a una concentración 2 mM en disolventes
orgánicos miscibles con el agua adecuados, prefiriéndose
generalmente el acetonitrilo, porque las enzimas CYP450
generalmente toleran hasta 2%. Los diferentes derivados de éter de
cualquier colorante fenólico tienen coeficientes de extinción
similares, que permite la calibración de la concentración de
sustrato por absorbancia. Las soluciones se transfieren a placas de
almacenamiento de 96 pocillos, para permitir la dispensación
paralela múltiple automática en placas de ensayo de microvaloración
de 96 pocillos. Para los ensayos rápidos, todos los ensayos se
llevan acabo en placas de microvaloración usando un lector de
fluorescencia de placa Fluorstar o Cytofluor, para obtener las
velocidades de la enzima.
Los experimentos iniciales determinan las
condiciones para cada isozima CYP450 (usando isozimas CYP450
humanas disponibles en el comercio expresadas en microsomas de
insecto de GENTEST) dando velocidades lineales de formación del
producto; la velocidad es proporcional a la concentración de enzima.
Las isozimas CYP450 ensayadas para encontrar sustratos más activos
son: CYP 3A4, CYP 2D6, CYP 2C9, CYP 2C19. El ensayo también incluye
las isozimas CYP450 CYP 1A2, CYP 2E1, CYP 2B6, y CYP 2A6. Esto es
para evaluar si cualquier sustrato que sea activo con una de las
isozimas 3A4, 2D6 o 2C9 y 2C19, es selectivo para esa isozima. Cada
isozima requiere condiciones ligeramente diferentes, y las
variables optimizadas incluyen pH, concentración de NADPH,
concentración de CYP450, si es necesario añadir citocromo b como
cofactor, tiempo de incubación, y efecto de la temperatura, y otras
variables que serán evidentes para los expertos en la técnica. En
la selección inicial de sustratos, se ensayan candidatos basados en
cumarina con concentraciones 5 y 20 \muM, y candidatos basados en
resorufina 2 y 10 \muM. La elección de diferentes concentraciones
para los éteres de resorufinas frente a éteres de cumarinas tiene en
cuenta la menor solubilidad acuosa de los derivados de resorufina
comparado con los derivados de cumarina, y del descubrimiento en
experimentos preliminares de que los derivados de resorufina,
siendo más hidrófobos, tienden a unirse más ávidamente a las
enzimas CYP450 (menor K_{m}). Se usa un pmol por pocillo de
enzima expresada por insecto coexpresada con
NADPH-citocromo P450-reductasa. El
tampón de ensayo contendrá Mg^{2+} 10 mM y la fuerza iónica
adecuada de la solución de ensayo se ajusta con soluciones madre de
tampón concentrado. El NADPH necesario para la
NADPH-citocromo P450-reductasa se
suministra en forma de NADP^{+} 1,3 mM, que es convertido en
niveles estacionarios de NADPH por la
gluocosa-6-fosfato-deshidrogenasa
y glucosa-6-fosfato 3 mM añadidos al
tampón de ensayo. Los valores de k_{cat} aparente y K_{m} para
todos los candidatos activos se determinan a partir de diluciones
de ocho puntos de cada sustrato por duplicado, usando los
resultados de los ensayos preliminares para determinar el intervalo
de concentración real para la evaluación precisa de la cinética.
La optimización de las condiciones de ensayo se
lleva a cabo por metodologías de Diseño de Experimentos validados
estadísticamente, usando el paquete de software comercial
"Design-Expert®" producido por
Stat-Ease® Inc. Los datos mostrados en las Figuras
4 y 5 se obtuvieron con optimización inicial.
Los sustratos encontrados en la ronda inicial de
síntesis y ensayos se vuelven a sintetizar en una escala
mayor
(100 \mumoles) y se purifican por cromatografía y/o recristalización. Los éteres de resorufina regioisómeros obtenidos en la síntesis se separan y se determinan las propiedades cinéticas de cada isómero por separado, como se ha descrito antes. Los datos cinéticos obtenidos para estos sustratos se usarán para dirigir la síntesis de unas pocas bibliotecas centradas pequeñas. Se adquieren o sintetizan haluros de alquilo y aminas adicionales, estrechamente relacionados con los que dan como resultado actividad con la isozima, con el objetivo de obtener sustratos incluso con mayor actividad, y sustratos que pueden ser específicos de la isozima. Se siguen las mismas rutas sintéticas discutidas en el Ejemplo 23, excepto que todos los compuestos se purifican y analizan por RMN y EM antes de llevar a cabo las cinéticas enzimáticas. Estos candidatos a sustrato se ensayan por duplicado en diluciones de ocho puntos usando los resultados de los sustratos estructuralmente relacionados para determinar el intervalo de concentración real para la evaluación precisa de la cinética.
(100 \mumoles) y se purifican por cromatografía y/o recristalización. Los éteres de resorufina regioisómeros obtenidos en la síntesis se separan y se determinan las propiedades cinéticas de cada isómero por separado, como se ha descrito antes. Los datos cinéticos obtenidos para estos sustratos se usarán para dirigir la síntesis de unas pocas bibliotecas centradas pequeñas. Se adquieren o sintetizan haluros de alquilo y aminas adicionales, estrechamente relacionados con los que dan como resultado actividad con la isozima, con el objetivo de obtener sustratos incluso con mayor actividad, y sustratos que pueden ser específicos de la isozima. Se siguen las mismas rutas sintéticas discutidas en el Ejemplo 23, excepto que todos los compuestos se purifican y analizan por RMN y EM antes de llevar a cabo las cinéticas enzimáticas. Estos candidatos a sustrato se ensayan por duplicado en diluciones de ocho puntos usando los resultados de los sustratos estructuralmente relacionados para determinar el intervalo de concentración real para la evaluación precisa de la cinética.
Debido a que los microsomas de hígado humano
contienen una variedad de isozimas CYP450, sólo se ensayan
sustratos que son específicos para una de las enzimas CYP450
humanas expresada en insecto en preparaciones de microsomas de
hígado humano disponibles en el comercio. Esto verifica que, como
se esperaba en general, la especificidad observada con los CYP450
microsomales de insecto se mantiene en los microsomas de hígado
humano. Inicialmente, las condiciones para los ensayos son las
especificadas por los suministradores de microsomas. Sin embargo,
debido a que los sustratos pueden tener cinéticas diferentes a
aquellas para las que se diseñaron las condiciones publicadas, se
lleva a cabo alguna optimización como se describe en el Ejemplo 24.
Todos los ensayos se llevan a cabo en placas de microvaloración de
96 ó 384 pocillos como en el Ejemplo 24.
La especificidad para una isozima en las
preparaciones microsomales de hígado humano, se confirma por la
falta de metabolismo del sustrato en presencia de un inhibidor
selectivo de la isozima CYP450 para la isozima que se está
investigando. Por ejemplo, los inhibidores selectivos para la CYP
3A4, CYP 2D6 y CYP 2C9 son troleandomicina, quinidina, y
sulfafenazol, respectivamente. Además, los sustratos/sensores
fluorogénicos se usan para determinar los valores de CI_{50} para
un panel de inhibidores de isozima CYP450 conocidos, y los datos se
comparan con los valores publicados. Para esta etapa, se lleva a
cabo una curva de concentración de 8 puntos de los inhibidores, por
duplicado. Se puede encontrar alguna dificultad en cuanto que la
bibliografía publicada contiene una gran variedad de valores de
CI_{50} para cualquier inhibidor dado, a menudo debido a
diferentes condiciones experimentales entre los estudios. Los
resultados de la invención se compararán con los estudios publicados
más relevantes que tengan las condiciones de ensayo más
parecidas.
Se seleccionaron las isozimas CYP450 más
relevantes (CYP 3A4, CYP 2D6, CYP 2C9, CYP 2C19) con sus nuevos
sustratos/sensores fluorogénicos más adecuados frente a una
biblioteca de compuestos que contienen inhibidores del CYP450
conocidos. Para este ejemplo, se usan isozimas CYP450 humanas
recombinantes expresadas en microsomas de insectos de GENTEST. La
biblioteca que se va a ensayar es la biblioteca de farmacóforos
genéricos de Microsource® que tiene 480 moléculas biológicamente
activas, incluyendo inhibidores y sustratos conocidos de CYP450.
Puesto que el valor comercial final de los nuevos
sustratos/sensores de CYP450 se produce si los ensayos se adaptan a
los protocolos de selección automáticos de alto rendimiento, es
necesario verificar que las condiciones de ensayo desarrolladas en
el Ejemplo 24 son adecuadas para el uso automático, y si no
modificarlas de forma adecuada. Esto es una práctica común con
cualquier ensayo que se va a realizar en un sistema robótico, e
implica comprobar parámetros tales como: estabilidad de la enzima y
sustrato para permitir realizar un gran número de ensayos sin la
intervención manual constante; reproducibilidad del ensayo con los
sistemas de manejo de líquidos automáticos; tiempos y temperaturas
de incubación específicos adecuados para el programa robótico;
captura de datos adecuada y reducción de rutinas, y otros parámetros
similares. También se determina si será necesaria una "lectura
previa" de las placas antes de añadir el NADPH para iniciar la
reacción, puesto que esto a veces puede eliminar falsos positivos
producidos por compuestos fluorescentes de la biblioteca.
Inicialmente, todos los compuestos se ensayan con
una concentración 10 \muM usando las condiciones robóticas
optimizadas, para determinar de una forma sencilla de acierto/fallo
qué compuestos están interaccionando con qué isozima CYP450. Aunque
esto implica ensayar cuatro enzimas frente a 480 compuestos
(aproximadamente 2.000 ensayos con testigos), esto sólo requiere 25
placas de microvaloración de 96 pocillos o 6 de 384 pocillos, los
cual se puede realizar en un solo día usando los formatos
automáticos actualmente disponibles.
Todos los aciertos se vuelven a ensayar con
concentraciones 1 y 10 \muM, y se ensayan con concentración 10
\muM usando un colorante fluorescente rojo sensible a la reacción
redox identificado como adecuado para comprobar que un compuesto no
está interfiriendo con la etapa de la citocromo
P450-reductasa. Se determinan los valores de
CI_{50} (usando una curva de ocho puntos por duplicado) para los
inhibidores o sustratos conocidos y se comparan los datos con los
valores publicados. Para considerar que los nuevos
sustratos/sensores son adecuados para la selección de compuestos de
alta producción rutinaria como parte del procedimiento de
desarrollo de fármacos, los ensayos deben detectar 100% de los
compuestos con afinidades para la isozima CYP450 relevante <1
\muM, y >90% de los compuestos con afinidades entre 1 y 10
\muM.
Para determinar si un compuesto de ensayo es un
sustrato para una isozima CYP450 se lleva a cabo el siguiente
experimento. Una preparación de isozima CYP450 humana se trata con
compuesto de ensayo durante un periodo de incubación de varias
horas en condiciones adecuadas para el metabolismo del compuesto de
ensayo por la isozima CYP450. Se ensaya la actividad residual de la
isozima CYP450 con un sustrato fluorogénico para esta isozima
CYP450. La isozima CYP450 también se trata con el mismo compuesto
de ensayo durante el mismo periodo de tiempo pero en ausencia de
NADP+, unas condiciones que no permiten el metabolismo del
compuesto de ensayo. Después del periodo de incubación, se añade
NADP+, y se ensaya la actividad residual de la isozima CYP450 con un
sustrato fluorogénico para esa isozima CYP450. Una actividad de la
isozima CYP450 ensayada en condiciones adecuadas para el
metabolismo del compuesto de ensayo que sea mayor que la actividad
de la enzima en condiciones que no permiten el metabolismo del
compuesto de ensayo durante el periodo de incubación, indica que el
compuesto de ensayo es un sustrato de la isozima CYP450.
El ensayo se lleva a cabo en una placa de 96
pocillos a temperatura ambiente y con un volumen de 100
\mul/pocillo. Se prepara tampón de enzima 4X y se añaden 25
\mul a cada pocillo en la placa, para concentraciones finales de
ensayo de glucosa-6-fosfato 3,3 mM,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en un tampón K+ fosfato de
concentración adecuada, y a pH 8,0. El compuesto de ensayo se
disuelve a una concentración 20 \muM en agua y se añaden 50
\mul de la solución a dos pocillos de cada, seguido de adición de
10 \mul de tampón que contiene
10 pmoles de isozima CYP450. Uno de los dos pocillos ahora recibe 10 \mul de NADP+ 13 mM y el compuesto de ensayo en ambos pocillos se incuba con la isozima CYP450 durante 2 h. Después de la incubación, el otro pocillo recibe
10 \mul de NADP+ 13 mM, y ambos reciben sustrato fluorogénico adecuado para detectar la actividad de la isozima CYP450, en un volumen de 5 \mul de tampón. La placa de ensayo de microvaloración se transfiere a un lector de fluorescencia de placas de microvaloración y se mide la fluorescencia de los pocillos en intervalos de 3 min durante 60 min. La velocidad de aumento de la fluorescencia del pocillo se usa para evaluar la actividad residual de la isozima CYP450 en los pocillos. Un resultado en el que la actividad residual del CYP450 en el pocillo que recibe el NADP+ antes de la incubación con el compuesto de ensayo es mayor que en el pocillo duplicado al que se añade el NADP+ después del periodo de incubación, indica que el compuesto de ensayo es un sustrato para la isozima CYP450.
10 pmoles de isozima CYP450. Uno de los dos pocillos ahora recibe 10 \mul de NADP+ 13 mM y el compuesto de ensayo en ambos pocillos se incuba con la isozima CYP450 durante 2 h. Después de la incubación, el otro pocillo recibe
10 \mul de NADP+ 13 mM, y ambos reciben sustrato fluorogénico adecuado para detectar la actividad de la isozima CYP450, en un volumen de 5 \mul de tampón. La placa de ensayo de microvaloración se transfiere a un lector de fluorescencia de placas de microvaloración y se mide la fluorescencia de los pocillos en intervalos de 3 min durante 60 min. La velocidad de aumento de la fluorescencia del pocillo se usa para evaluar la actividad residual de la isozima CYP450 en los pocillos. Un resultado en el que la actividad residual del CYP450 en el pocillo que recibe el NADP+ antes de la incubación con el compuesto de ensayo es mayor que en el pocillo duplicado al que se añade el NADP+ después del periodo de incubación, indica que el compuesto de ensayo es un sustrato para la isozima CYP450.
Para demostrar las cualidades ópticas superiores
de los sensores moleculares de la invención, una de las cuales es
la mejor señal frente a la señal de fondo, se llevaron a cabo
comparaciones en paralelo con sustratos fluorogénicos actualmente
disponibles. Los ensayos se llevaron a cabo en una placa de 96
pocillos a temperatura ambiente y con un volumen de 100
\mul/pocillo. Se añadió tampón 2X NADPH/sistema reciclado a la
placa con un volumen de 50 \mul para concentraciones de ensayo
finales de glucosa-6-fosfato 3,3 mM,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en un tampón K+ fosfato 100 mM,
pH 8,0 (con excepción de los ensayos de CYP 2C9 y CYP 2C19 para los
que se usó K+ fosfato 50 mM, pH 8,0) (Véase Tabla 11). La enzima se
preparó en el tampón K+ fosfato adecuado a 10X, y se añadieron 10
\mul/pocillo a los pocillos adecuados (Véase Tabla 11). La placa
se leyó en intervalos de 3 minutos durante 12 minutos para obtener
los niveles de fluorescencia de fondo. Las lecturas se
interrumpieron brevemente para permitir la adición de 10 \mul de
10X NADP+ en tampón K+ fosfato a cada pocillo (Véase Tabla 11). Las
lecturas se reanudaron a intervalos de 3 minutos durante otros 12
minutos. Se interrumpieron otra vez las lecturas para permitir la
adición de sustrato 3,3X con un volumen de 30 \mul/pocillo (Véase
las concentraciones de sustrato en la Tabla 11). La conversión
enzimática del sustrato en productos se dejó avanzar durante 1
hora, tomándose lecturas de fluorescencia a intervalos de 3 ó 4
minutos en un lector de fluorescencia de placas de microvaloración
con la longitud de onda de excitación y emisión adecuadas (listadas
para cada sustrato en la Tabla 11). Las Figuras 8, 9, 10, 11 y 12
ilustran los cambios de la intensidad de fluorescencia, o su falta,
para la adición de reactivos y sustrato a los pocillos, y la señal
del metabolismo enzimático del sustrato. Para permitir la
comparación cuantitativa entre los sensores que se metabolizaron o
metabolizarían para dar productos fluorescentes de diferentes
propiedades ópticas, la intensidad de la señal correspondiente a
cada pocillo se normalizó por división entre la intensidad de la
señal inicial (pocillos que contenían enzima y tampón). Las Figuras
8, 9, 10, 11 y 12 ilustran la mejor señal frente a la señal de
fondo de los sustratos que contienen conector oximetilo y
oxifenilmetilo de esta invención (señales continuas) frente a
sustratos disponibles previamente en el comercio (líneas
discontinuas). La señal de fondo acumulada que resulta de la
adición de NADP+ y de la adición del sustrato se manifiesta por
una señal fluorescente mayor que una, 3 minutos después de la
adición de sustrato (la segunda flecha indica el tiempo de adición
del sustrato). El posterior aumento de la señal, aproximadamente
cuatro minutos después de la segunda adición y en los puntos de
tiempo posteriores, se cree que se debe a la conversión enzimática
del sustrato en el producto. En las Figuras 8, 9, 10, 11 y 12, la
señal enzimática frente a la señal de fondo de adición del
reactivo, como medida del rendimiento del ensayo, es mayor para los
sensores que contienen conector oximetilo de esta invención
(señales continuas) que para los sustratos previos disponibles en
el comercio (líneas discontinuas). La Figura 8 ilustra la señal
superior de BOMR (señal continua) frente a la
bencil-resorufina (señal discontinua) con la
isozima CYP 3A4. La Figura 9 ilustra la señal superior de la BOMCC
(señal continua) frente a la
7-benciloxi-4-trifluorometilcumarina
(BFC, señal discontinua) con la isozima CYP 3A4. La Figura 10
ilustra la señal superior de la MOBFC (señal continua) frente a la
AMMC (Gentest) (señal discontinua) con la isozima CYP 2D6. La Figura
11 ilustra la señal superior tanto de la OOMR (señal negra) como la
BOMCC (señal continua) frente a la
7-metoxi-4-trifluorometilcumarina
(MFC, señal discontinua) con la isozima CYP 2C9. La Figura 12
ilustra la señal superior de la EOMC (señal continua) frente a la
3-ciano-7-etoxicumarina
(CEC, señal discontinua) con la isozima CYP 2C19.
| Isozima | CYP 3A4 | CYP 3A4 | CYP 2D6 | CYP 2C9 | CYP 2C19 |
| Sustratos en poci- | BOMR 1 \muM | BOMCC 20 \muM | MOBFC 5 \muM | OOMR 2,5 \muM | EOMCC 20 \muM |
| llos separados | Bencil- | BFC 20 \muM | AMMC 2,5 \muM | BOMCC 10 \muM | CEC 20\muM |
| cada uno | resorufina 5 \muM | MFC 40 \muM | |||
| Glucosa-6-fosfato | 33 | 33 | 33 | 33 | 33 |
| (mM) | |||||
| Glucosa-6-fosfato- | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| deshidrogenasa | |||||
| (unidades/ml) | |||||
| MgCl_{2} (mM) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Tampón K+ fosfato, | 100 | 100 | 100 | 50 | 50 |
| pH 8,0 (mM) | |||||
| Concentración | 0,5 | 0,5 | 2 | 1 | 0,5 |
| de enzima | |||||
| (pmoles/100 \mul) | |||||
| NADP^{+} (\muM) | 100 | 100 | 30 | 100 | 100 |
| Excitación/ | Ex. 530(25)/ | Ex. 405(20)/ | Ex. 405(40)/ | Ex. 530(25)/ | Ex. 405(20)/ |
| emisión (nm) | Em. 605(50) | Em. 460(40) | Em. 490(40) | Em. 605(50) | Em. 460(40) |
| Longitud de | Ex. 405(40)/ | Ex. 360(40)/ | Ex. 405(20)/ | ||
| onda central | Em. 490(40) | Em. 460(40) | Em. 460(40) | ||
| (ancho de banda) | Ex. 405(40)/ | ||||
| Em. 490(40) | |||||
| Figuras | Fig. 8 | Fig. 9 | Fig. 10 | Fig. 11 | Fig. 12 |
| correspondientes |
Las molaridades indican concentraciones después
de añadir todos los reactivos a cada pocillo. Los sustratos se
compararon en pocillos paralelos con las concentraciones indicadas
(segunda fila). Diferentes tipos de letra para los sustratos indican
los filtros con los que se corresponden en la segunda a última fila
(por ejemplo, un filtro en itálica se usó para el sustrato en
itálica).
La dibenciloximetilfluoresceína se preparó como
sigue:
Se agitó vigorosamente una mezcla de fluoresceína
(332 mg, 1 mmol) y diisopropiletilamina (870 \mul, 5 mmoles) en
cloroformo (15 ml), a 0ºC durante 25 minutos. Después se añadió
rápidamente a la reacción bencil-clorometil-éter
(2,32 ml, 10,0 mmoles). La reacción desprendió gas durante la
adición, y se dejó agitar durante 2 horas a 25ºC. La reacción se
siguió por TLC (R_{f} = 0,36, MeOH 5%:CHCl_{3} 95%). Después la
solución de la reacción se purificó por cromatografía en gel de
sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) que
dio la DBOMF puro en forma de un sólido naranja (154 mg, 27%).
^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}): 4,37 (c, 2H), 4,70 (s, 2H), 5,29
(c, 2H), 5,33 (s, 2H), 6,47 (d, 1H), 6,57 (m, 1H),
6,86-6,93 (m, 3H), 7,14-7,24 (m,
2H), 7,25-7,36 (m, 10H), 7,67-7,77
(m, 2H), 8,23 (d, 1H).
La dibenciloximetilfluoresceína (BOMF) se preparó
como sigue:
Se agitó vigorosamente una mezcla de fluoresceína
(332 mg, 1 mmol) y diisopropiletilamina (870 \mul, 5 mmoles) en
cloroformo (15 ml), a 0ºC durante 25 minutos. Después se añadió
rápidamente a la reacción bencil-clorometil-éter
(2,32 ml, 10,0 mmoles). La reacción desprendió gas durante la
adición, y se dejó agitar durante 2 horas a 25ºC. La reacción se
siguió por TLC (R_{f} = 0,56, MeOH 5%:CHCl_{3} 95%). Después la
solución de la reacción se purificó por cromatografía en gel de
sílice (gradiente de MeOH en CHCl_{3} al 0-5%) que
dio la BOMF puro en forma de un sólido naranja (36 mg, 8%). ^{1}H
RMN (500 MHz, CDCl_{3}): 4,72 (s, 2H), 5,31 (s, 2H), 6,52 (c,
1H), 6,59 (d, 1H), 6,68-6,76 (m, 3H), 7,00 (d, 1H),
7,17 (d, 1H), 7,29-7,37 (m, 5H),
7,60-7,69 (m, 2H), 8,02 (d, 1H).
La Tabla 12 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general de la Tabla 1, que en general, es el método
descrito por Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme
Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993). Las filas de la Tabla 12
corresponden a sustratos fluorogénicos basados en fluoresceína
específicos ensayados frente al CYP 3A4; las columnas corresponden,
respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la
estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la
velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y
K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m},
v_{max} (para cinéticas sigmoidales), K_{1/2max} (concentración
a 1/2 de la velocidad máxima para cinéticas sigmoidales) y los
tipos de cinéticas detectadas. La dibencilfluoresceína (DBF) se
adquirió en Gentest, Woburn, Mass. El ensayo del CYP 3A4 se llevó a
cabo en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente con un
volumen de 100 \mul/pocillo. Se diluyeron DBF, BOMF y DBOMF a
partir de una solución madre 2 mM en acetonitrilo a una
concentración 4X de 80 \muM en tampón K+ fosfato 100 mM. Se
hicieron siete diluciones 1:2 de cada sustrato de las cuales se
añadieron 25 \mul a los pocillos adecuados. Se preparó tampón de
enzima 1,54X y se añadieron 65 \mul a cada pocillo en la placa,
para tener concentraciones de ensayo finales de NADP^{+} 100
\muM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
0,4 unidades/ml y MgCl_{2} 10 mM en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. La
isozima citocromo P450 CYP 3A4 se diluyó para dar 0,5 pmoles de
enzima por pocillo, y se añadió a un volumen de 10 \mul/pocillo en
K+ fosfato, pH 8,0. La conversión enzimática del sustrato en
productos se dejó avanzar durante 1 hora, tomando lecturas de
fluorescencia cada cuatro minutos en un lector de fluorescencia de
placas de microvaloración. La solución se iluminó usando un filtro
de excitación de 485/20 nm y la emisión de fluorescencia se detectó
por un filtro de emisión de 530/25 nm. Como comprenderán los
expertos en la técnica, los sensores de análogos de oximetilo de la
presente invención (DBOMF y BOMF) presentaron una conversión más
eficaz en el mismo producto fluorescente que el sensor
estructuralmente relacionado (DBF).
La dibencilfluoresceína (DBF) se adquirió en
Gentest. Su análogo de oxifenilmetilo la
dibenciloximetilfluoresceína (DBOMF) se convierte más eficazmente
en el correspondientes producto fluorescente. La
benciloximetilfluoresceína (BOMF) es otro derivado de éter
oxifenilmetílico de la fluoresceína estructuralmente relacionado
que también se convierte eficazmente en fluoresceína y presenta
cinética de tipo Michaelis-Menten.
La Tabla 13 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general de la Tabla 12 en el Ejemplo 32, que es el
método general descrito por Henderson, P.J.F. Statistical
Analysis of Enzyme Kinetic Data. "Enzyme Assays", Oxford
University Press, 277-313 (1993). En una desviación
del protocolo descrito en el Ejemplo 32, el tampón basado en
fosfato (K+ fosfato 100 mM, pH 8,0) se sustituyó en todo el
procedimiento por tampón Tris-HCl 200 mM, pH 7,5.
Las filas de la Tabla 13 corresponden a sensores fluorogénicos
basados en fluoresceína específicos ensayados frente al CYP 2C9;
las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del
sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de
recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25
\muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores
de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Como
comprenderán los expertos en la técnica, el análogo de
mono-oximetilo de la fluoresceína de la presente
invención, BOMF, presentaba una conversión muy eficaz al producto
fluorescente comparado con los sustratos listados en la Tabla 3.
La Tabla 14 se preparó de acuerdo con la misma
metodología general de la Tabla 12, el método general descrito por
Henderson, P.J.F. Statistical Analysis of Enzyme Kinetic
Data. "Enzyme Assays", Oxford University Press,
277-313 (1993). En una desviación del protocolo
descrito en el Ejemplo 32, el tampón basado en fosfato (K+
fosfato
100 mM, pH 8,0) se sustituyó en todo el procedimiento por tampón K+ fosfato 100 mM, pH 7,5. Las filas de la Tabla 13 corresponden a sensores fluorogénicos basados en fluoresceína específicos ensayados frente al CYP 2C8; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Específicamente, se ensayó la actividad del sustrato dibencilfluoresceína (DBF) (adquirida en Genstet, Woburn, Mass) y del sensor de la presente invención DBOMF con el CYP 2C8. Como comprenderán los expertos en la técnica, el análogo de oximetilo del sensor de la presente invención (DBOMF), presentaba una conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que el sustrato estructuralmente relacionado (DBF).
100 mM, pH 8,0) se sustituyó en todo el procedimiento por tampón K+ fosfato 100 mM, pH 7,5. Las filas de la Tabla 13 corresponden a sensores fluorogénicos basados en fluoresceína específicos ensayados frente al CYP 2C8; las columnas corresponden, respectivamente, a las abreviaturas del sustrato fluorogénico, la estructura química, la velocidad de recuperación a 10 \muM, la velocidad de recuperación a 1,25 \muM, valores de k_{cat} y K_{m}, la relación de los valores de k_{cat} y K_{m}, y los tipos de cinéticas detectadas. Específicamente, se ensayó la actividad del sustrato dibencilfluoresceína (DBF) (adquirida en Genstet, Woburn, Mass) y del sensor de la presente invención DBOMF con el CYP 2C8. Como comprenderán los expertos en la técnica, el análogo de oximetilo del sensor de la presente invención (DBOMF), presentaba una conversión más eficaz al mismo producto fluorescente que el sustrato estructuralmente relacionado (DBF).
La dibenzofluoresceína (DBF) se adquirió en
Gentest. su análogo de oxifenilmetilo, la
dibenciloximetilfluoresceína (DBOMF) se convierte más eficazmente
en el correspondiente producto fluorescente.
Se llevó a cabo y se describe un procedimiento de
ensayo general para los ensayos de inhibición de la isozima CYP 3A4
usando sensores de la presente invención. Las Tablas 15 y 16
describen las condiciones de tampón específicas usadas cuando se
ensaya la inhibición de esta enzima. Los ensayos se llevaron a cabo
en placas de fondo transparente y paredes negras de 96 pocillos, con
100 \mul/pocillo a temperatura ambiente. La fluorescencia se mide
en un lector de fluorescencia de placas de microvaloración.
Se disolvió la BOMR a una concentración 2 mM en
acetonitrilo por adición de 500 \mul de acetonitrilo a un vial
que contenía 1 \mumol de sustrato. Se disolvió la BOMCC en
acetonitrilo para preparar soluciones madre 10 mM por adición de
100 \mul de acetonitrilo a un vial que contenía 1 \mumol de
sustrato. El patrón de colorante resorufina sódica se disolvió a 1
mM en agua destilada; el patrón de colorante
3-ciano-7-hidroxicumarina
se preparó con concentración 1 mM en DMSO. Todas las soluciones
acuosas se prepararon al principio del experimento y se mantuvieron
en hielo hasta su uso.
1. Se dispensó un nanomol de compuesto de ensayo
o inhibidor en el pocillo de la placa en agua destilada (40 \mul
de compuesto 25 \muM en agua destilada), para una concentración
final de ensayo del compuesto 10 \muM.
Alternativamente, los compuestos se dispensan de
una solución orgánica y se secan en la placa, en cuyo caso se
añaden 40 \mul/pocillo de agua destilada y la placa se incuba a
37ºC durante 1 h para ayudar a la redisolución de los compuestos.
Los pocillos testigo recibieron los testigos de inhibición adecuados
para cada isozima. También se añaden los inhibidores a los pocillos
que contienen los patrones colorantes para permitir la adición de
sustrato y enzima a todos los pocillos de la placa.
2. Se añadieron 20 \mul/pocillo de tampón K+
fosfato 300 mM, pH 8,0.
3. Se añadieron 30 \mul/pocillo de tampón de
enzima/sistema reciclado (Tabla 15). Se añadieron los patrones de
colorantes a los pocillos adecuados en la placa. Se añadieron 10
\mul/pocillo de los patrones de colorantes para tener
concentraciones de ensayo finales de 5, 2,5 y 1,25 \muM.
| BOMR | BOMCC | |
| K+ fosfato, pH 8,0 (mM) | 100 | 100 |
| Glucosa-6-fosfato (mM) | 11 | 11 |
| Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (unidades/ml) | 1,33 | 1,33 |
| MgCl_{2} (mM) | 33,33 | 33,33 |
| Enzima (nanoM) | 16,5 | 16,5 |
| Equivalente a pmoles/pocillo | 0,5 | 0,5 |
4. La placa se incubó durante 20 minutos a
temperatura ambiente para ayudar a la interacción de los compuestos
con el CYP 3A4 (en ausencia de recuperación de la enzima). Se tomó
una lectura previa de la placa (Véase la siguiente Tabla 16 para
los filtros de excitación y emisión para cada sustrato).
5. Se añadieron diez \mul/pocillo de tampón de
sustrato/NADP+ en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0 (Tabla 16).
Inmediatamente después, la placa se transfirió al lector de
fluorescencia de placas de microvaloración para los análisis
cinéticos, o alternativamente, la placa se deja reposar en la
oscuridad durante el tiempo de reacción adecuado y se toma una
lectura de punto final en el tiempo adecuado.
| Nombre del sustrato | BOMR | BOMCC |
| Sustrato (\muM) | 50 | 200 |
| NADP+ (mM) | 1 | 1 |
| Tiempo del ensayo (minutos) | 34 | 45 |
| Excitación, centro (ancho)/ | 530(25)/ | 405(20)/ |
| Emisión, centro (ancho) | 605(55) | 460(40) |
Siguiendo el procedimiento general resumido en el
Ejemplo 35, se seleccionaron 160 compuestos adquiridos en
Chembridge, San Diego, Calif., que interaccionaban con CYP 3A4. Se
dispensó un nanomol de compuesto por pocillo, ochenta por placa de
96 pocillos. En los 16 pocillos restantes se dispensó lo siguiente:
tres nanomoles de miconazol como testigo para 100% de inhibición,
un inhibidor moderado, verapamilo, con cuatro concentraciones para
indicar la sensibilidad del ensayo y un patrón de producto de
fluorescencia (sal sódica de resorufina). Los resultados de aplicar
el procedimiento resumido en el Ejemplo 35 con BOMR 5 \muM como
sustrato, se ilustran en la Figura 13. Se representó gráficamente la
potencia de los compuestos en la muestra (expresada en % de
inhibición) comparado con el testigo miconazol para todos los
compuestos. Se detectaron varios compuestos con potencia intermedia
(30-60% de inhibición respecto al testigo). Ocho
compuestos en el muestreo presentaron actividad inhibidora mayor
que 60%. Como comprenderán los expertos en la técnica, estos
resultados demuestran que los sensores que contienen el conector
oximetilo de la presente invención son útiles, por ejemplo, para
detectar la actividad inhibidora del CYP 3A4 en una variedad y/o
matriz de compuestos.
Siguiendo el procedimiento general resumido en el
Ejemplo 35, se clasificaron 160 compuestos adquiridos en
Chembridge, que interaccionaban con el CYP 3A4. Ocho compuestos en
la muestra presentaron una actividad inhibidora mayor que 60%. Las
estructuras de seis de éstos, y su porcentaje de actividad
inhibidora comparado con el testigo se ilustran en la Figura 14.
Como comprenderán los expertos en la técnica, los sustratos que
contienen conector oximetilo son útiles para detectar compuestos
con subestructuras relacionadas así como compuestos que no están
estructuralmente relacionados que presentan actividad inhibidora de
CYP 3A4. Por ejemplo, un sensor de la presente invención reveló
actividad inhibidora para dos compuestos que contenían
subestructuras aromáticas planas y con tiourea (Figura 14, cuadro
de la izquierda), y se identificaron potentes inhibidores que
tenían subestructuras de idonio (Figura 14, cuadro central).
También se identificó que tenían actividad inhibidora otros dos
compuestos menos estrechamente relacionados estructuralmente con
resto anilina y/o heterocíclico.
Se llevó a cabo y se describe un procedimiento de
ensayo general para el ensayo de inhibición de la isozima CYP 2D6
usando sensores que contienen conector oxifenilmetilo de esta
invención. Las Tablas 17 y 18 listan las condiciones del tampón
específicas usadas con esta enzima. Los ensayos se llevaron a cabo
en placas de fondo transparente y paredes negras de 96 pocillos,
con 100 \mul/pocillo a temperatura ambiente. La fluorescencia se
midió en un lector de fluorescencia de placas de
microvaloración.
Se disolvió el sustrato MOBFC en acetonitrilo
para preparar soluciones madre 10 mM, por adición de 100 \mul de
acetonitrilo a un vial que contenía 1 \mumol de sustrato. Las
soluciones madre de sustrato eran estables cuando se almacenaban a
4ºC en la oscuridad. El patrón de colorante
7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina
se preparó con concentración 1 mM en DMSO. Todas las soluciones
acuosas se prepararon al principio del experimento y se mantuvieron
en hielo hasta su uso.
1. Se dispensó un nanomol de compuesto de ensayo
o inhibidor en el pocillo de la placa en agua destilada (40 \mul
de compuesto 25 \muM en agua destilada), para una concentración
final de ensayo del compuesto 10 \muM.
Alternativamente, los compuestos se dispensan de
una solución orgánica y se secan en la placa, en cuyo caso se
añaden 40 \mul/pocillo de agua destilada y la placa se incuba a
37ºC durante 1 h para ayudar a la redisolución de los compuestos.
Los pocillos testigo recibieron los testigos de inhibición adecuados
para cada isozima. También se añaden los inhibidores a los pocillos
que contienen los patrones colorantes para permitir la adición de
sustrato y enzima a todos los pocillos de la placa.
2. Se añadieron 20 \mul/pocillo de tampón K+
fosfato 300 mM, pH 8,0.
3. Se añadieron 30 \mul/pocillo de tampón de
enzima/sistema reciclado. Se añadieron los patrones de colorantes a
los pocillos adecuados en la placa. Se añadieron 10 \mul/pocillo
de los patrones de colorantes para tener concentraciones de ensayo
finales de 5, 2,5 y 1,25 \muM.
| 2D6 | |
| K+ fosfato, pH 8,0 (mM) | 100 |
| Glucosa-6-fosfato (mM) | 11 |
| Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (unidades/ml) | 1,33 |
| MgCl_{2} (mM) | 33,33 |
| Enzima (nanoM) | 66 |
| Equivalente a pmoles/pocillo | 2 |
4. Las placas se incubaron durante 20 minutos a
temperatura ambiente para ayudar a la interacción de los compuestos
con las isozimas (en ausencia de recuperación de la enzima). Se
tomó una lectura previa de la placa.
5. Se añadieron 10 \mul/pocillo de tampón de
sustrato/NADP+ en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0. Inmediatamente
después, la placa se transfirió al lector de fluorescencia de las
placas de microvaloración para los análisis cinéticos, o
alternativamente, la placa se deja reposar en la oscuridad durante
el tiempo de reacción adecuado (Tabla 18) y se toma una lectura de
punto final en el tiempo adecuado.
| 2D6 | |
| Nombre del sustrato | MOBFC |
| Sustrato (\muM) | 50 |
| NADP+ (mM) | 0,3 |
| Tiempo de ensayo (minutos) | 120 |
| Excitación, centro (ancho)/ | 405(40)/ |
| Emisión, centro (ancho) | 490(40) |
\newpage
Siguiendo el procedimiento general resumido en el
Ejemplo 38, se seleccionaron 240 compuestos adquiridos en
Chembridge (incluyendo los compuestos seleccionados en el ejemplo
36) que interaccionaban con el CYP 2D6. Se dispensó un nanomol de
compuesto por pocillo, ochenta por placa de 96 pocillos. En los 16
pocillos restantes se dispensó: 1 nmol de quinidina como testigo
para 100% de inhibición y patrón del producto de
fluorescencia
(7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina). Los resultados de aplicar el procedimiento resumido en el Ejemplo 38 con MOBFC 5 \muM como sustrato, se ilustran en la Figura 15. Se representó gráficamente la potencia de los compuestos en la muestra expresada en % de inhibición, comparado con el testigo quinidina para todos los compuestos. Se detectaron varios compuestos con potencia intermedia (30-60% de inhibición respecto al testigo). Aproximadamente 10% de los compuestos en la muestra presentaron actividad inhibidora mayor que 60%. Como comprenderán los expertos en la técnica, estos resultados demuestran que los sensores que contienen el conector oxifenilmetilo de la presente invención son útiles, por ejemplo, para detectar la actividad inhibidora del CYP 2CD en una variedad y/o matriz de compuestos.
(7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina). Los resultados de aplicar el procedimiento resumido en el Ejemplo 38 con MOBFC 5 \muM como sustrato, se ilustran en la Figura 15. Se representó gráficamente la potencia de los compuestos en la muestra expresada en % de inhibición, comparado con el testigo quinidina para todos los compuestos. Se detectaron varios compuestos con potencia intermedia (30-60% de inhibición respecto al testigo). Aproximadamente 10% de los compuestos en la muestra presentaron actividad inhibidora mayor que 60%. Como comprenderán los expertos en la técnica, estos resultados demuestran que los sensores que contienen el conector oxifenilmetilo de la presente invención son útiles, por ejemplo, para detectar la actividad inhibidora del CYP 2CD en una variedad y/o matriz de compuestos.
Siguiendo el procedimiento general resumido en el
Ejemplo 38, se seleccionaron 240 compuestos adquiridos en
Chembridge, que interaccionaban con CYP 2D6. Aproximadamente diez
por ciento de los compuestos en la matriz de muestra presentaron
una actividad inhibidora mayor que 60%. Las estructuras de siete de
estos, y sus porcentajes de actividad inhibidora comparada con el
testigo se ilustran en la Figura 16. Como comprenderán los expertos
en la técnica, los sensores que contienen conector oxifenilmetilo
de la presente invención son útiles, por ejemplo, para detectar
compuestos con subestructuras relacionadas, así como para detectar
compuestos que no están estructuralmente relacionados que presentan
actividad inhibidora del CYP 2D6. Por ejemplo, un sensor de la
presente invención reveló actividad inhibidora de tres compuestos
estructuralmente relacionados que contenían subestructuras de
ortofenilendiamina (Figura 16, cuadro de la izquierda), y reveló
potentes inhibidores que tenían subestructuras de idonio (Figura
16, cuadro central). También se determinó que tenían actividad
inhibidora otros tres compuestos menos estrechamente relacionados
estructuralmente, que contenía cada uno restos que estaban cargados
positivamente a pH neutro.
Las enzimas CYP450 son inhibidas por compuestos
que interfieren con la unión del sustrato, la unión del oxígeno
molecular, y/o con la etapa catalítica en la que se oxida el
sustrato. Véase Ortiz de Montellano, P.R., Correira, M.A.,
"Inhibition of cytochrome P450 enzymes". En Cythocrome P450:
Structure, mechanism and biochemistry, 2nd edition, Plenum
Press, New York (1995), 205-364. Los compuestos que
se pueden unir al resto hemo en el sitio activo en su estado
férrico o ferroso, inhiben la enzima; siendo particularmente
potentes los compuestos que tienen afinidad por restos
estructurales adicionales en el sitio activo de la enzima. Por
ejemplo, los compuestos que contienen funciones imidazol y piridina
se pueden unir al hierro hemo. Adicionalmente, una variedad de
compuestos con azufre, y derivados que contienen olefina y que
contienen acetileno, inhiben las enzimas CYP450 por activación a
especies que se pueden unir covalentemente al sitio activo de las
enzimas. También, algunos compuestos que contienen amina son
metabolizados a productos intermedios que se unen fuertemente al
hemo ferroso.
Los sensores de CYP450 de esta invención se han
usado para evaluar si la potencia de inhibición del CYP450 por un
compuesto o candidato a fármaco depende de la recuperación
(metabolismo) dependiente de NADPH del compuesto. El procedimiento
empleado usa la observación de que un inhibidor que es activado por
la enzima a un producto intermedio que se une irreversiblemente al
sitio activo de la enzima, tal como el llamado inhibidor suicida,
inhibe progresivamente la enzima de una forma dependiente del
tiempo. Esta observación está en contraste con un inhibidor
competitivo verdadero cuya potencia varía poco (o posiblemente
puede disminuir si es metabolizado) después de preincubar el
compuesto con la enzima CYP450 en condiciones que permitan la
recuperación de la enzima. Un compuesto que es metabolizado en un
inhibidor potente o cuya recuperación "elimina la enzima"
(inhibidor no competitivo, suicida), parecerá mas potente si se
incuba previamente con la enzima en condiciones que permitan el
metabolismo de dicho compuestos, ya que la inhibición es dependiente
del metabolismo y por lo tanto progresiva con el tiempo. Como
comprenderán los expertos en la técnica, pueden existir compuestos
que pueden actuar como inhibidores suicidas que producen la
inhibición progresiva y como inhibidores competitivos de la enzima.
Los compuestos de esta invención se pueden usar para evaluar si un
compuesto inhibe una isozima CYP450 de una forma dependiente del
metabolismo y dependiente del tiempo.
A continuación se describen procedimientos de
ensayo experimentales usados para la isozima CYP 3A4. Estos
procedimientos permiten evaluar la inhibición dependiente del
metabolismo progresiva de la enzima usando sensores de esta
invención. Las tablas 19-22 listan las condiciones
del tampón específicas usadas con esta enzima. Los ensayos se
llevaron a cabo en placas de fondo transparente y paredes negras de
96 pocillos, con 100 \mul/pocillo a temperatura ambiente. La
fluorescencia se midió en un lector de fluorescencia de placas de
microvaloración.
Se disolvió el sustrato BOMR a una concentración
2 mM en acetonitrilo (se añaden 500 \mul de acetonitrilo a un
vial que contiene 1 \mumol de sustrato). Se disolvió sustrato
BOMCC en acetonitrilo para preparar soluciones madre 10 mM por
adición de 100 \mul de acetonitrilo a un vial que contenía 1
\mumol de sustrato. Se disolvió sustrato DBOMF en acetonitrilo
para preparar una solución madre 2 mM por adición de 500 \mul de
acetonitrilo a un vial que contenía 1 \mumol de sustrato. Se
disolvió patrón de colorante resorufina sódica en agua destilada a
1 mM, se preparó patrón de colorante
3-ciano-7-hidroxicumarina
1 mM en DMSO. Se preparó patrón de colorante fluoresceína 1 mM en
DMSO. Todas las soluciones acuosas se prepararon recientes al
inicio del experimento y se guardaron en hielo hasta su uso.
Los ensayos se llevaron a cabo en dos
condiciones. Condiciones A (etapas A1-A5) y
Condiciones B (Etapas B1-B5). Los resultados se
resumen en la Tabla 23.
Condiciones experimentales. Condiciones A:
Se dispensó un nanomol de compuesto de ensayo o
inhibidor en el pocillo de la placa en agua destilada (40 \mul de
compuesto 25 \muM en agua destilada), para tener una
concentración de ensayo final del compuesto 10 \muM.
6. Se añadieron 20 \mul/pocillo de tampón K+
fosfato 300 mM, pH 8,0.
7. Se añadieron 30 \mul/pocillo de tampón de
enzima/sistema reciclado (Véase Tabla 19). Los patrones de
colorantes se añadieron a los pocillos adecuados de la placa. Se
añadieron 10 \mul/pocillo de los patrones de colorante para tener
concentraciones de ensayo finales 5, 2,5 y 1,25 \muM.
| BOMR | BOMCC | DBOMF | |
| K+ fosfato, pH 8,0 (mM) | 100 | 100 | 100 |
| Glucosa-6-fosfato (mM) | 11 | 11 | 11 |
| Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (unidades/ml) | 1,33 | 1,33 | 1,33 |
| MgCl_{2} (mM) | 33,33 | 33,33 | 33,33 |
| Enzima (nanoM) | 16,5 | 16,5 | 16,5 |
| Equivalente a pmoles/pocillo | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
8. Las placas se incubaron durante 20 minutos a
temperatura ambiente para ayudar a la interacción de los compuestos
con el CYP 3A4 (en ausencia de recuperación de la enzima). Se tomó
una lectura previa de la placa. (Véase la Tabla 20 para los filtros
de excitación y emisión usados para cada sustrato).
9. Se añadieron 10 \mul/pocillo de tampón de
sustrato/NADP+ en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0 (Tabla 20).
Inmediatamente después, las placas se transfirieron al lector de
fluorescencia de placas de microvaloración para los análisis
cinéticos.
| Nombre del sustrato | BOMR | BOMCC | DBOMF |
| Sustrato (\muM) | 50 | 200 | 50 |
| NADP+ (mM) | 1 | 1 | 1 |
| Tiempo del ensayo (minutos) | 45 | 45 | 45 |
| Excitación, centro (ancho)/ | 530(25)/ | 405(20)/ | 485(20)/ |
| Emisión, centro (ancho) | 605(55) | 460(40) | 530(25) |
Condiciones experimentales. Condiciones B:
Se dispensó un nanomol de compuesto de ensayo o
inhibidor en el pocillo de la placa en agua destilada (40 \mul de
compuesto 25 \muM en agua destilada), para tener una
concentración de ensayo final del compuesto 10 \muM.
B1. Se añadieron 20 \mul/pocillo de tampón K+
fosfato 300 mM, pH 8,0.
B2. Se añadieron 30 \mul/pocillo de tampón de
enzima/sistema reciclado (Véase Tabla 21). Los patrones de
colorantes se añadieron a los pocillos adecuados de la placa. Se
añadieron 10 \mul/pocillo de los patrones de colorante para tener
concentraciones de ensayo finales 5, 2,5 y 1,25 \muM.
| BOMR | BOMCC | DBOMF | |
| K+ fosfato, pH 8,0 (mM) | 100 | 100 | 100 |
| Glucosa-6-fosfato (mM) | 11 | 11 | 11 |
| Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (unidades/ml) | 1,33 | 1,33 | 1,33 |
| NADP+ (mM) | 0,33 | 0,33 | 0,33 |
| MgCl_{2} (mM) | 33,33 | 33,33 | 33,33 |
| Enzima (nanoM) | 16,5 | 16,5 | 16,5 |
| Equivalente a pmoles/pocillo | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
B3. Las placas se incubaron durante 40 minutos a
temperatura ambiente en presencia de NADP+ para permitir la
interacción de los compuestos con el CYP 3A4 en condiciones que
permitan la recuperación de la enzima. Se tomaron lecturas previas
de las placas. (Véase la Tabla 22 para los filtros de excitación y
emisión usados para cada sustrato).
B4. Se añadieron 10 \mul/pocillo de tampón de
sustrato en K+ fosfato 100 mM, pH 8,0 (Tabla 22). Inmediatamente
después, la placa se transfirió al lector de fluorescencia de
placas de microvaloración para los análisis cinéticos.
| Nombre del sustrato | BOMR | BOMCC | DBOMF |
| Sustrato (\muM) | 50 | 200 | 20 |
| Tiempo de ensayo (minutos) | 20 | 20 | 20 |
| Excitación, centro (ancho)/ | 530(25)/ | 405(20)/ | 485(20)/ |
| Emisión, centro (ancho) | 605(55) | 460(40) | 530(25) |
Se recogieron los datos de las intensidades de
fluorescencia en cada pocillo que contenía 1 nanomol de fármacos
como se lista en la Tabla 23. Los datos se convirtieron para
reflejar el porcentaje de inhibición en relación al testigo. Los
testigos eran clotrimazol 10 \muM para las Condiciones A, y
elipticina 10 \muM para las Condiciones B. Los resultados se
presentan en la Tabla 23, en la que se lista el porcentaje de
inhibición del metabolismo de BOMR, BOMCC y DBOMF para 15 fármacos,
tanto en Condiciones A como en Condiciones B. Algunos fármacos
candidatos (los nueve fármacos superiores de la lista) eran
inhibidores más potentes del metabolismo de los sensores de esta
invención en condiciones que permitían el metabolismo del compuesto
(condiciones B), que en condiciones A. Algunas diferencias de los
valores del porcentaje de inhibición para los fármacos ensayados en
las condiciones separadas se indican en tipo negrita (Tabla 23). La
DBOMF era particularmente insensible a la inhibición por los
fármacos en las condiciones A, pero indicaba fiablemente la
inhibición dependiente del metabolismo de los mismos (condiciones
B). Los datos para la DBOMF indicaban que los nueve fármacos
candidatos superiores (diciclomina, verapamilo, elipticina,
eritromicina, clemastina, aniodarona, mifepristona, doxorrubicina,
papaverina) tienen al menos actividad inhibidora parcial
dependiente del metabolismo frente a la isozima CYP3A4. Como
comprenderán los expertos en la técnica, los sensores de esta
invención son útiles para evaluar si un producto químico, compuesto
de ensayo, candidato a fármaco o fármaco, actúa como un inhibidor
dependiente de la recuperación de una isozima CYP450. Además, los
compuestos, caracterizados como inhibidores suicidas o sustratos
suicidas, agentes químicos eliminadores de CYP450, o inhibidores no
competitivos de CYP450, pueden presentar inhibición dependiente de
la recuperación de una isozima CYP450 y se pueden detectar usando
sensores de esta invención. También se pueden detectar compuestos
de ensayo que se convierten en metabolitos con la actividad
inhibidora de CYP450 (inhibidores del producto).
| Sustrato | BOMR | BOMCC | DBOMF | |||
| Condiciones | A | B | A | B | A | B |
| Diclomicina | 77 | 97 | 76 | 98 | 30 | 86 |
| Verapamilo | 83 | 95 | 88 | 101 | 36 | 89 |
| Elipticina | 97 | 100 | 92 | 100 | 40 | 100 |
| Eritromicina | 90 | 99 | 93 | 98 | 30 | 85 |
| Clemastina | 62 | 85 | 82 | 95 | 32 | 80 |
| Amiodarona | 35 | 71 | 73 | 98 | 1 | 77 |
| Mifepristona | 35 | 81 | 93 | 98 | 22 | 98 |
| Doxorrubicina | 29 | 72 | 81 | 79 | 3 | 33 |
| Papaverina | 69 | 92 | 34 | 99 | 48 | 90 |
| Ticlopidina | 77 | 84 | 13 | 55 | -9 | 3 |
| Isoniazod | -8 | 30 | 59 | 48 | -9 | 3 |
| Nitrofurantoína | -19 | 27 | 44 | 33 | -9 | -3 |
| Difenilhidantoína | -27 | 24 | -11 | 21 | 21 | 5 |
| Oxoprenolol | -5 | 13 | 7 | 21 | 1 | 3 |
| Ketoconazol | 89 | 97 | 91 | 97 | 98 | 99 |
Las cifras se dan como % de inhibición comparado
con 100% de inhibición del testigo.
Claims (23)
1. Un compuesto que tiene la estructura:
Y-L-Q en la
que:
Y se selecciona del grupo que consta de Q como se
ha definido en la presente invención, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido; en la que si Y se selecciona de Q como se ha definido en la presente invención, L es L', en el que L' se selecciona del grupo de -(CR^{4}H)(-OCR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H) (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H)(-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y -(CR^{4}H) (-O(fenil para sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en los que cada R^{2} y cada R^{4} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce.
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido; en la que si Y se selecciona de Q como se ha definido en la presente invención, L es L', en el que L' se selecciona del grupo de -(CR^{4}H)(-OCR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H) (-O(fenil orto sustituido)CR^{2}H)_{p}-, -(CR^{4}H)(-O(fenil meta sustituido)CR^{2}H)_{p}-, y -(CR^{4}H) (-O(fenil para sustituido)CR^{2}H)_{p}-, en los que cada R^{2} y cada R^{4} se selecciona por separado del grupo que consta de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo C_{1}-C_{20}, cicloalquilo C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un número entero positivo no mayor que doce.
L tiene la estructura química L', como se ha
definido en la presente invención, o (-OCR^{2}H)_{p}-,
en el que R^{2} se selecciona por separado del grupo que consta
de un átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20}
saturado, alquenilo C_{1}-C_{20} insaturado,
alquinilo C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido,
cicloalquilo C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, arilo,
arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido, y p es un
número entero positivo no mayor que doce; y
Q tiene un estructura seleccionada del grupo que
consta de las siguientes estructuras:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las
que:
m es un número entero positivo no mayor que
cinco;
R_{a}, R_{b}, R_{c}, R_{d}, R_{e},
R_{f}, R_{g}, R_{h}, R_{i}, R_{j}, R_{k}, y R_{l}, se
selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un átomo
de hidrógeno, un átomo de halógeno, alquilo
C_{1}-C_{20}, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo perhalogenado,
cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ciano, nitro,
azido,
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c},
-CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s};
-SR_{s}, -OR_{o}, -NR_{n1}R_{n2}, -N^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -P^{+}R_{n1}R_{n2}R_{n3}, -COR_{c}, -C(=NOR_{o})R_{c}, -CSR_{c}, -OCOR_{c}, -OCONR_{n1}R_{n2}, -OCO_{2}R_{c},
-CONR_{n1}R_{n2}, -C(=N)NR_{n1}R_{n2}, -CO_{2}R_{o}, -SO_{2}NR_{n1}R_{n2}, -SO_{3}R_{o}, -SO_{2}R_{o}, -PO(OR_{o})_{2}, -NR_{n1}CSNR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}C(=N)NR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}CONR_{n2}R_{n3}, -NR_{n1}COR_{c} y -NR_{n1}S(=O)_{2}R_{s};
R_{n1}, R_{n2}, R_{n3}, R_{o} y R_{s}
se selecciona cada uno por separado del grupo que consta de un
átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20},
alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, cicloalquilo,
cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo,
heteroarilo, y heteroarilo sustituido, y pueden constituir partes
de un heterociclo alifático o aromático;
R_{c} se selecciona del grupo que consta de un
átomo de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20},
alquilo C_{1}-C_{20} sustituido, alquilo
perhalogenado, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, bencilo, heteroarilo, heteroarilo sustituido y ciano, y
puede constituir partes de un homo o heterociclo alifático o
aromático;
A se selecciona del grupo que consta de un átomo
de oxígeno, un átomo de azufre, SO, SO_{2},
C(CH_{3})_{2} y
C(CF_{3})_{2};
E y E' se seleccionan por separado del grupo que
consta de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre y NR_{n1};
G se selecciona del grupo que consta de un átomo
de oxígeno, un átomo de azufre, y NR_{n1}R_{n2}, en el que si G
se selecciona de NR_{n1}R_{n2}, G y R_{c} así como G y
R_{d} pueden constituir partes de un heterociclo; y
T se selecciona del grupo que consta de un átomo
de oxígeno y NR_{n1}.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que
Y se selecciona del grupo que consta de alquilo
C_{1}-C_{20} saturado, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado, alquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido, alquenilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, alquinilo
C_{1}-C_{20} insaturado sustituido, cicloalquilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquenilo
C_{1}-C_{20}, cicloalquilo
C_{1}-C_{20} saturado sustituido,
cicloalquenilo C_{1}-C_{20} insaturado
sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo
sustituido.
3. El compuesto de la reivindicación 2, en el que
Y se selecciona del grupo que consta de alquilo
C_{1}-C_{8}, alquenilo
C_{1}-C_{8}, alquilo
C_{2}-C_{8} sustituido, alquenilo
C_{2}-C_{8} sustituido, alcoxialquilo, arilo,
arilo sustituido, aminoalquilo terciario y cuaternario, y grupos
guanidinio-alquilo.
4. El compuesto de la reivindicación 3, en el que
Y se selecciona del grupo que consta de metilo, etilo, propilo,
isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo,
pentilo, octilo, y bencilo.
5. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3 ó 4,
en el que T es un átomo de oxígeno y G es un átomo de oxígeno.
6. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, ó
4, en el que m es un número entero positivo no mayor que dos.
7. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, ó
4, en el que m es igual a uno.
8. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, ó
4, en el que Q es un fluoróforo fenóxido.
9. El compuesto de la reivindicación 8, en el que
Q es un fluoróforo fenóxido seleccionado del grupo que consta de un
derivado de 7-hidroxicumarina, una resorufina, y
una fluoresceína.
10. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, ó
4, en el que R^{2} y R^{4} son átomos de hidrógeno para todos
los valores de p.
11. El compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, 4
ó 10, en el que p es igual a uno.
12. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-8, seleccionado del grupo
que consta de:
benciloximetilresorufina (BOMR),
7-(p-metoxibenciloxi)-4-trifluorocumarina
(MOBFC),
7-benciloximetiloxi-3-cianocumarina
(BOMCC),
etiloximetilresorufina (EOMR),
7-etiloximetiloxi-3-cianocumarina
(EOMCC),
7-metiloximetiloxi-3-cianocumarina
(MOMCC),
7-metiloximetiloxi-4-trifluorocumarina
(MOMFC),
7-(p-metoxibenciloxi)-4-trifluorocumarina
(MOBFC),
n-octiloximetilresorufina
(OOMR),
7-benciloximetiloxi-9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)
(BOM-DDAO),
n-octiloximetil-trifluorometilcumarina
(OOMCC),
metiloximetilresorufina (MOMR),
para-metoxibencilresorufina
(MOBR),
dibenciloximetilfluoresceina (DBOMF), y
benciloximetilfluoresceina (BOMF).
13. Un método para cuantificar la actividad de
una enzima CYP450, usando el compuesto de la reivindicación 1, 3,
7, 9, 11 ó 12.
14. Un método para seleccionar un compuesto
candidato con actividad como sustrato de al menos una enzima
CYP450, que comprende las etapas de:
poner en contacto una enzima CYP450 con el
compuesto candidato y un compuesto reactivo de acuerdo con la
reivindicación 1, 3, 7, 9, 11 ó 12; y
detectar una señal óptica, si hay alguna, que
resulta de la interacción del compuesto reactivo con la enzima
CYP450.
15. Un método para seleccionar un compuesto
candidato con actividad inhibidora de CYP450, que comprende las
etapas de:
poner en contacto el compuesto candidato con una
enzima CYP450;
poner en contacto la enzima CYP450 con un
compuesto reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, 3, 7, 9, 11
ó 12; y
detectar una señal óptica, si hay alguna, que
resulta de la interacción del compuesto reactivo con la enzima
CYP450.
16. Un método para seleccionar un compuesto
candidato, que comprende:
una etapa para ensayar la eficacia del compuesto
candidato,
una etapa para ensayar la toxicidad del compuesto
candidato, y
una etapa para ensayar la actividad del compuesto
candidato como sustrato o como inhibidor de al menos una enzima
CYP450 usando un compuesto reactivo de acuerdo con las
reivindicaciones 1, 3, 7, 9, 11 ó 12.
17. El método de la reivindicación 15 ó 16, en el
que el compuesto reactivo interacciona con la enzima CYP450 como un
inhibidor competitivo o no competitivo.
18. El método de la reivindicación 14, 15 ó 16,
en el que el método comprende una selección de ultra alta
producción de una biblioteca de compuestos fluorogénicos
candidatos.
19. El método de la reivindicación 13, 14 ó 15,
en el que la enzima CYP450 es una enzima CYP450 humana.
20. El método de la reivindicación 14, 15 ó 16,
en el que el compuesto candidato es un miembro de la biblioteca de
derivados de fármacos.
21. El método de la reivindicación 13, 14, 15 ó
16, en el que la enzima CYP450 se selecciona del grupo que consta
de CYP 3A4, CYP 2D6, CYP 2C9, CYP 2C19, CYP 2C8, CYP 2A1, CYP 2B6,
CYP 2E1 y CYP 1A2.
22. Un fármaco candidato seleccionado de acuerdo
con el método de la reivindicación 14, 15, 16, 18, 19, 20, ó
21.
23. Un método para cuantificar la actividad de
una enzima CYP450, seleccionar un compuesto candidato con actividad
como sustrato de al menos una enzima CYP450, o seleccionar un
compuesto candidato con actividad como inhibidor de al menos una
enzima CYP450, usando un compuesto de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-12.
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