JP2005047898A - スルホン酸エステル化合物およびそれを用いた蛍光プローブ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の化合物は、単純な脱保護からなる全く新しい発蛍光反応に基づき、スーパーオキサイド、ヒドロキシルラジカルおよび一重項酸素には応答せず、過酸化水素だけに対して応答する高選択的な蛍光プローブとして機能する。その例として、下記スキーム2に示す蛍光性化合物フルオレセイン類3a〜3cのO−ペンタフルオロベンゼンスルフォニル化体 1a〜1c(無蛍光性化合物)がある。また、1a〜1c のアセチル化体 2a〜2c (スキーム3)、 特に 2a と 2c は、細胞内で発生する過酸化水素を検出するための蛍光プローブとして、淡水性緑藻クラミドモナス・ラインハーディにおける過酸化水素に起因する細胞内酸化ストレスを選択的に検出できる。図1はその結果を示すグラフである。
【化10】
【選択図】 図1
Description
H. Maeda, S. Matsu-ura, M. Nishida, T. Semba, Y. Yamauchi, H. Ohmori, Chem. Pharm. Bull. 2001, 49, 294-298; H. Maeda, S. Matsu-ura, M. Nishida, Y. Yamauchi, H. Ohmori, Chem. Pharm. Bull. 2002, 50, 169-174.
核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、測定機器として、JEOL社製EX-270(商品名)(1H測定時270MHz)を用いて測定した。ケミカルシフトは百万分率(ppm)で表している。内部標準0ppmには、テトラメチルシラン(TMS)を用いた。結合定数(J)は、ヘルツで示しており、略号s、d、t、q、mおよびbrは、それぞれ、一重線(singlet)、二重線(doublet)、三重線(triplet)、四重線(quartet)、多重線(multiplet)および広幅線(broad)を表す。質量分析(MS)は、JEOL社製JMS-700(商品名)を用い、高分解能(HRMS)/高速原子衝撃法(FAB)により行った。赤外吸収(IR)スペクトルは、日本分光株式会社製VALOR-III(商品名)を用い、KBr法により行った。元素分析は、ヤナコ株式会社製CHN CORDER MT-5(商品名)を用いて行った。融点は、ヤナコ株式会社製MP-S3(商品名)を用いて測定した。カラムクロマトグラフィー分離には、シリカゲル(メルク社製、シリカゲル60(商品名))を用いた。全ての化学物質は、試薬級であり、アルドリッチ社、ランカスター社、東京化成株式会社、ナカライテスク株式会社、および和光純薬株式会社から購入した。
[1a〜1c の合成]
化合物1a〜1c は全て同様の方法により合成した。すなわち、まず、目的化合物1a〜1cのいずれかに対応するフルオレセイン誘導体 (1.0 g) の2,6−ルチジン (5.0 mL)−ジクロロメタン (20 mL) 懸濁液にテトラフルオロベンゼンスルホニルクロリド (1.1 eq) を0℃で加えた。得られた混合液を室温で一晩撹拌した。反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、1M 塩酸 (200 mL x 2) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン−アセトン=20:1)により精製した。以下に1a〜1cの機器分析値を示す。
2a〜2c は全て同様の方法により合成した。すなわち、まず、化合物1a〜1cのうち目的化合物2a〜2cのいずれかに対応する化合物を前記の通りに合成し、この化合物0.5 g とアセチルクロリド (1.1 eq) とのジクロロメタン溶液にトリエチエルアミン (1.1 eq) を0℃で加えた。得られた混合液を室温で2時間撹拌した。反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、1M 塩酸 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン)により精製した。以下に、2a〜2cの機器分析値を示す。
化合物4および5は同様の方法により合成した。すなわち、まず、レゾルフィン・ナトリウム塩 (2.0 g) のピリジン (20 mL) 懸濁液に−40℃でペンタフルオロベンゼンスルホニルクロリドまたは2,4,6−トリフルオロベンゼンスルホニルクロリド (1.1 eq) を加えた。得られた混合液を−40〜−20℃で6時間撹拌した。反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、1M 塩酸 (200 mL x 2) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン−アセトン=20:1)により生成した。以下に化合物4および5の機器分析値を示す。
スキーム2中の化合物1a、1bおよび1cは、全て、96ウェルミクロプレートアッセイでH2O2濃度依存応答を示した。前記アッセイでは、まず、1aのDMSO溶液 (10 mM)、 1bのDMSO溶液(2 mM)、および1cのDMSO溶液(2 mM)を準備し、これらをそれぞれHEPES 緩衝液 (pH 7.4, 10 mM)で400 倍に希釈して各化合物のプローブ溶液を調製した。これらプローブ溶液中の各化合物の濃度は、1a について25 μM、1b について5 μM、1c について5 μMである。さらに、前記各プローブ溶液150μLをH2O2水(0.92 mM, 10 μL)と25℃で60分間反応させた。1a、1bおよび1cの検出限界値は、それぞれ46.0 (RSD, n= 8; 1.2%), 23.1 (0.5%), および 4.6 (1.0%) pmolであり、細胞レベルの解析に対応可能な値であった。92.3 nmol以下の範囲において、相関係数0.999以上の直線較正曲線が得られた。その傾きは、1a、1bおよび1cのそれぞれについて172, 215 および 591 au/nmolであった。
蛍光強度(RFU)
1a 1b 1c
H2O2 1150 2193 4375
H2O2+Fe2+ 28 195 184
HPX+XO 566 1733 3580
HPX+XO+カタラーゼ −49 −51 −44
HPX+XO+SOD 899 1733 3340
光刺激により、緑藻に酸化的ストレス(Oxidative stress)を引き起こすことができる。Cu2+による刺激は、スーパーオキサイド、過酸化水素およびヒドロキシルラジカル等の種々のROSの細胞内形成を引き起こす。細胞は、さらに、パラコート(PQ)またはメチレンブルー(MB)により特異的に活性化されることで、スーパーオキサイドまたは1O2の生成による酸化的ストレスを起こす。したがって、淡水性緑藻クラミドモナス・ラインハーディ(Chlamydomonas reinharadtii)を用いた実験モデルは、本発明のプローブの細胞系への適応を評価するために有益であった。藻の細胞に1a、1bおよび1cをロードするために、それらのアセチル化誘導体2a、2bおよび2c(スキーム3)を用いた。2a、2bおよび2cが過酸化水素検出用プローブとして機能するためにはエステラーゼが必要であることを、前記と同様のミクロプレートアッセイにより確認した。
Claims (23)
- 下記一般式(I)で表される構造を含むスルホン酸エステル化合物。
- 前記式(I)中の原子団Bが、1個または複数の電子吸引基で置換された芳香環または複素芳香環である請求項1に記載のスルホン酸エステル化合物。
- 前記式(I)中の原子団Bにおいて、前記電子吸引基が、ハロゲン、カルボキシル基、カルバモイル基、炭素数1〜6の直鎖もしくは分枝アルキルカルバモイル基、炭素数1〜6の直鎖もしくは分枝アルカノイル基、炭素数1〜6の直鎖もしくは分枝アルコキシカルボニル基、炭素数1〜6の直鎖もしくは分枝ハロゲン化アルキル基、および −NR3 +基(3個のRはそれぞれ水素原子または炭素数1〜6の直鎖もしくは分枝アルキル基であり、同一でも異なっていても良い)からなる群から選択される少なくとも一つを含む請求項1または2に記載のスルホン酸エステル化合物。
- 前記式(I)中の原子団Bにおいて、前記電子吸引基が、フルオロ基、トリフルオロメチル基および −N+(CH3)3基からなる群から選択される少なくとも一つである請求項1〜3のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
- 前記式(I)中の原子団Bにおいて、前記環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ピレン環、ピリジン環、ピロール環、チオフェン環、フラン環、ベンゾピリジン環、ベンゾピロール環、ベンゾチオフェン環、およびベンゾフラン環からなる群から選択される少なくとも一つである請求項1〜4のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
- 前記式(I)において、原子団Bが、ペンタフルオロフェニル基、2,4,6−トリフルオロフェニル基、2,4,6−トリス(トリフルオロメチル)フェニル基および2,4−ビス(トリフルオロメチル)フェニル基からなる群から選択される少なくとも一つである請求項1〜3のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
- 前記式(I)中の原子団A−Oにおいて、O原子が芳香環または複素芳香環に直接結合している請求項1〜6のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
- 前記原子団A−Oとスルホニル基との共有結合を切断することにより形成される蛍光性化合物が、フルオレセイン、レゾルフィン、7−ヒドロキシクマリン、1−ナフトール、2−ナフトール、1−ヒドロキシアントラセン、2−ヒドロキシアントラセン、9−ヒドロキシアントラセン、1−ヒドロキシピレン、1−ヒドロキシアクリジン、2−ヒドロキシアクリジン、9−ヒドロキシアクリジン、2−ヒドロキシキノロン、4−ヒドロキシキノロン、5−ヒドロキシキノロン、6−ヒドロキシキノロン、8−ヒドロキシキノロン、4−ヒドロキシ−7−ニトロ−2−オキサ−1,3−ジアゾール、またはそれらの誘導体である請求項1〜6のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
- 前記原子団A−Oとスルホニル基との共有結合を切断することにより形成される蛍光性化合物が、フルオレセイン、2,7−ジクロロフルオレセイン、2,7−ジフルオロフルオレセイン、4,5−ジフルオロフルオレセイン、2,4,5,7−テトラフルオロフルオレセイン、2,7−ジメチルフルオレセイン、4,5−ジメチルフルオレセイン、2,4,5,7−テトラメチルフルオレセイン、2,7−ジイソプロピルフルオレセイン、2,7−ジ−t−ブチルフルオレセイン、2,7−ジメトキシフルオレセイン、2,4−ジフルオロ−5,7−ジメチルフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、カルボキシ−2,7−ジクロロフルオレセイン、カルボキシ−2,4,5,7−テトラクロロフルオレセイン、カルボキシ−2,7−ジフルオロフルオレセイン、カルボキシ−2,4,5,7−テトラフルオロフルオレセイン、レゾルフィン、2,8−ジクロロレゾルフィン、7−ヒドロキシ−4−(トリフルオロメチル)クマリン、または7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンである請求項8に記載のスルホン酸エステル化合物。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物を含む蛍光プローブ。
- 過酸化水素検出に用いる、請求項12に記載の蛍光プローブ。
- バイオイメージングに用いる、請求項12または13に記載の蛍光プローブ。
- 請求項14に記載の蛍光プローブを含むバイオイメージング用キット。
- ブロッティング(転写)を用いたアッセイ方法、抗原抗体反応を用いたアッセイ方法、カタラーゼ定量方法、機能性食品または医薬の過酸化水素消去能測定方法、および臨床分析方法からなる群から選択される少なくとも一つの方法に使用する、請求項13に記載の蛍光プローブ。
- 標識された抗体であって、前記標識が請求項13に記載の蛍光プローブである抗体。
- 請求項13に記載の蛍光プローブまたは請求項17に記載の抗体と、前記支持体とを含む、ブロッティング(転写)を用いたアッセイ方法に使用するキット。
- 請求項13に記載の蛍光プローブとグルコースオキシダーゼ標識抗体とを含む、アッセイ用キット。
- 請求項17に記載の抗体を含むアッセイ用キット。
- 請求項13に記載の蛍光プローブを含む、ヒトまたは動物の体液中のカタラーゼ濃度を測定するためのキットであり、前記カタラーゼ濃度測定においては、請求項13に記載の蛍光プローブを過酸化水素と反応させた後の蛍光応答を、前記反応をヒトもしくは動物の体液またはその体液から抽出した試料の存在下で行なった場合と非存在下で行なった場合とで比較することにより、カタラーゼを定量するキット。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物を含む臨床分析用試薬。
- 請求項22に記載の臨床分析用試薬を含む臨床分析用キット。
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