JP5419278B2 - 蛍光発生分子 - Google Patents
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Description
列を有する核酸分子を検出するための方法としては、その標的核酸配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いるハイブリダイゼーション法が広く使用されている。ハイブリダイゼーション法では、標的核酸配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用意し、そのプローブの塩基配列と相補的な塩基配列を持つ試料のみが高い選択性でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの結果として形成されるハイブリッド体を検出するための手段としては、プローブ核酸をラジオアイソトープで標識する方法、蛍光物質で標識する方法、発光試薬を利用する方法などが挙げられる。核酸の標識に使用することができる蛍光物質としては、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、Cy3、Cy5等が挙げられるが、これらの蛍光物質で標識した蛍光核酸プローブは、バックグラウンド蛍光シグナルが高く、高感度測定が困難であった。
好ましくは、本発明の標識試薬は、核酸の標識のために用いる。
好ましくは、本発明の標識試薬は、還元剤と組み合わせて使用される。
好ましくは、上記無蛍光性分子として、上記した本発明の化合物を用いる。
好ましくは、標的核酸配列はRNAである。
好ましくは、標的核酸配列の一塩基多型を検出する。
好ましくは、蛍光をフローサイトメトリーで検出し、蛍光を発する細胞を選別することができる。
本発明で開発した蛍光発生分子システムは、メチルアジド基の還元をトリガーとして、無蛍光性分子の構造変化が起こり蛍光を発する蛍光on/off型センサーシステムとして一般化できる(図1)。本発明の実施例として、蛍光分子フルオレセインを化学修飾し、メチルアジド基を導入した分子を合成した(図2)。フルオレセインを、モノアルキル化した。つづいて、水酸基をチオメチル化し、さらにナトリウムアジド等を加えることによりアジド体を得た。最後に、アルキル基をスクシイミド化することにより、目的物であるフルオレセインのモノメチルアジド誘導体(図2の化合物4)を得た。また,同様の合成手順を踏んで,フルオレセインのビスメチルアジド誘導体(図2の化合物8)を得た(図2)。
この蛍光シグナルの有無や強度を指標にすることによって、核酸配列を区別又は検出することができる。本反応は、他の試薬や酵素を必要とせず、プローブを検出サンプルに加えるのみで測定できる。
本発明において、アシル基としては、炭素数1から6のアシル基を挙げることができ、具体的にはアセチル基、プロピオニル基などを挙げることができる。
(1)モノアルキルフルオレセイン (図2の化合物1)の合成
フルオレセイン (3.00 g, 9.03 mmol) とヨウ化ナトリウム (271 mg, 1.81 mmol) を氷浴中でDMF (50 mL)に溶解し,THF (30 mL)に溶かしたカリウムt-ブトキシド (3.04 g, 27.1 mmol)を加えた。 溶液が透明になったら,methyl bromoacetate (944μL, 9.94 mmol)をゆっくり加え,徐々に室温に戻しながら2.5時間撹拌した。反応はEtOAcで停止し, H2O とbrineで分液した。有機層をNa2SO4で乾燥したのち,残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica, gradient elution 30:1 CHCl3/MeOH to 20:1 CHCl3/MeOH with 0.5% triethylamine) で精製した。得られたモノアルキルフルオレセイン (図2の化合物1)は透明な液体であった(820 mg, 23%)。
13C NMR ( 100MHz, CD3OD) δ 180.6, 172.5, 169.9, 163.5, 159.4, 155.1, 138.8, 137.6, 129.6, 129.1, 124.9, 116.3, 116.0, 114.5, 104.7, 102.3, 66.1, 52.7
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モノアルキルフルオレセイン (図2の化合物1) (720 mg, 1.78 mmol)をAr雰囲気下で脱水CH3CN (36 ml) に溶解した。酸化銀 (620 mg, 2.67 mmol)と クロロメチルメチルスルフィド(223 μl, 2.67 mmol)およびピリジンを5滴加え,40 oC で15時間撹拌した。その後反応液をセライトろ過し,濃縮したのち,フラッシュカラムクロマトグラフィー(hexane/AcOEt from 6:1 to 2:1 (v/v) with 0.5% triethylamine)で精製した。 得られたモノアルキルチオメチルフルオレセイン(図2の化合物2) は黄色の結晶であった (206 mg, 25%)。
13C NMR ( 100MHz, CDCl3 ) δ 168.94, 168.43, 159.04, 152.64, 151.86, 134.80, 129.08, 128.87, 126.41, 124.75, 123.78, 112.66, 102.82, 101.65, 82.57, 72.34, 65.12, 52.27, 14.59
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モノアルキルチオメチルフルオレセイン(図2の化合物2) (164 mg, 350 μmol) をジクロロメタン (7 ml)に溶解した。続いて N-クロロスクシンイミド (51.8 mg, 390 μmol) とトリメチルメチルシリルクロライド (42.0 mg, 390 μmol)を加えて1 時間撹拌し,Na2CO3水溶液で反応を停止した。CHCl3で2度分液を行い,有機層を濃縮したのち,真空乾燥した。残渣をDMF (7 ml) に溶解し, 3.5 mlのH2O に溶かしたアジ化ナトリウム(34.4 mg, 530 mmol) を加え,室温で1時間撹拌し,Na2CO3水溶液で反応を停止した。AcOEtで2度分液を行い,有機層を濃縮したのち,フラッシュカラムクロマトグラフィー(hexane/AcOEt from 5:1 to 3:2 (v/v) with 0.5% triethylamine)で精製した。得られたモノアルキルアジドメチルフルオレセイン(図2の化合物3) は黄色の結晶であった (71.3 mg, 44%)。
13C NMR ( 100MHz, CDCl3 ) δ 169.02, 168.54, 157.87, 152.64, 152.76, 152.08, 134.95, 129.70, 129.27, 126.46, 124.95, 123.80, 111.79, 103.26, 101.80, 82.46, 79.43, 65.27, 52.42
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モノアルキルアジドメチルフルオレセイン(図2の化合物3) (27.8 mg, 60 μmol) をメタノール(605 μl)に溶解し,1M NaOHaq. (66.6 μl, 66.6 μmol) を加え,1時間撹拌した。反応を0.1M HClで停止し,AcOEtで2度分液を行い,有機層を濃縮したのち,フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3/MeOH from 30:1 to 20:1 (v/v) with 0.5% triethylamine)で精製した。得られたモノアルキルアジドメチルフルオレセイン(下記化合物) は黄色の結晶であった (28.2 mg, 105%)。
13C NMR ( 100MHz, CDCl3 ) δ 173.69, 169.17, 157.76, 152.79, 152.30, 134.83, 129.23, 128.61, 126.62, 124.82, 123.91, 112.30, 103.22, 101.74, 82.50, 79.41, 67.57
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上記(4)で得られたモノアルキルアジドメチルフルオレセイン(4.60 mg, 10.3 μmol) とN-ヒドロキシスクシンイミド (1.30 mg, 11.4 μmol)をDMF (205 μl)に溶解し,DCC (2.35 mg, 11.4 μmol) を加え,室温で48時間撹拌した。析出した結晶をフィルターろ過したのち,残渣を直接3’ amino DNA とのカップリングに用いた。
(1)ヨードフルオレセイン(図2の化合物5)の合成
フルオレセイン(1.60 g, 4.61 mmol) を12N HCl (16.4 ml) と 8.2 g の氷に溶解した。亜硝酸ナトリウム水溶液 (397 mg, 5.76 mmol, 8.2 ml)をゆっくり加え,2.5時間撹拌した。ヨウ化カリウム水溶液(15.3 g, 92.2 mmol, 13.2 ml) をゆっくり加え,反応液を徐々に室温に戻した。 5時間の反応後,CHCl3 で反応を停止し,H2O とbrineで分液した。有機層をNa2SO4で乾燥したのち,残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー (silica, gradient elution 10:1 hexane/AcOEt to 3:1 hexane/AcOEt (v/v) with 0.5% triethylamine)で精製した。得られたヨードフルオレセイン(図2の化合物5) は黄色の結晶であった (1 g, 47%).
13C NMR ( 100MHz, CD3OD ) δ 169.5, 161.3, 153.9, 145.1, 134.7, 130.3, 130.0, 127.1, 113.6, 110.7, 103.5, 95.6
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ヨードフルオレセイン(図2の化合物5) (1 g, 2.18 mmol) をAr雰囲気下で脱水CH3CN (36 ml) に溶解した。酸化銀 (1.52 g, 6.55 mmol)と クロロメチルメチルスルフィド (550 μl, 6.55 mmol) およびピリジンを5滴加え,40 oC で24時間撹拌した。その後反応液をセライトろ過し,濃縮したのち,フラッシュカラムクロマトグラフィー(hexane/AcOEt from 10:1 to 3:1 (v/v) with 0.5% triethylamine)で精製した。 得られたトリメチルフルオレセイン(図2の化合物6) は黄色の結晶であった (234 mg, 19%)。
13C NMR ( 100MHz, CDCl3 ) δ 167.3, 158.6, 152.2, 152.0, 143.6, 133.9, 128.9, 128.6, 125.6, 112.9, 111.3, 103.0, 94.9, 83.1, 72.5, 14.8
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トリメチルフルオレセイン(図2の化合物6) (200 mg, 350 μmol) をジクロロメタン (7 ml)に溶解した。続いて N-クロロスクシンイミド (102 mg, 760 μmol) を加え,室温で2時間撹拌した。 その後,トリメチルシリルクロライド (97.3 μl, 760 μmol)を加えて6 時間撹拌し,Na2CO3水溶液で反応を停止した。CHCl3で2度分液を行い,有機層を濃縮したのち,真空乾燥した。残渣をDMF (7 ml) に溶解し, 3.5 mlのH2O に溶かしたアジ化ナトリウム(67.5 mg, 1.04 mmol) を加え,室温で30時間撹拌し,Na2CO3水溶液で反応を停止した。AcOEtで2度分液を行い,有機層を濃縮したのち,フラッシュカラムクロマトグラフィー(hexane/AcOEt from 10:1 to 3:1 (v/v) with 0.5% triethylamine)で精製した。得られたアジドメチルフルオレセイン(図2の化合物7) は黄色の結晶であった (41.0 mg, 21%)。
13C NMR ( 100MHz, CDCl3 ) δ 167.3, 158.1, 152.1, 152.0, 143.7, 134.0, 129.2, 128.5, 125.5, 112.7, 112.3, 103.4, 95.0, 82.6, 79.4
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プロパルギルアミン (116.28 μl, 1.82 mmol)と 炭酸カリウム (251 mg, 1.82 mmol) を氷浴中でベンゼン (18.2 ml ) に溶解し、ブロモアセチルブロミド (159μl, 1.82 mmol)を加えて20 時間撹拌した。Ether/H2Oで2回分液し,有機層を濃縮した。残渣 (118 mg, 37.1%) は直接次の反応に用いた。
アジドメチルフルオレセイン(図2の化合物7) (50 mg, 88 μmol)をTHF (1.6 ml)に溶解し,テトラキス (トリフェニルホスフィン)パラジウム(10.2 mg, 8.8 μmol), ヨウ化銅 (3.35 mg, 1.8 μmol), トリエチルアミン(61.9 μl, 440 μmol)を加え,最後に ブロモアセチルアセチレンリンカー (77.0 mg, 440 μmol)を加えて3時間撹拌した。析出した化合物をフィルターろ過で除去したのち,残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(hexane/AcOEt from 5:1 to 1:1 (v/v) with 0.5% triethylamine)で精製した。 得られたアジドメチルブロモアセチルリンカーフルオレセイン(図2の化合物8) は黄色の結晶であった(20 mg, 37%)。
13C NMR ( 100MHz, CDCl3 ) δ 168.1, 166.6, 158.0, 152.3, 152.0, 138.2, 131.8, 129.2, 128.3, 123.9, 113.0, 112.6, 112.5, 103.4, 86.7, 82.5, 81.8, 79.4, 30.9, 28.8
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実施例1及び実施例2で得たフルオレセインのモノメチルアジド誘導体(図2の化合物4)およびビスメチルアジド誘導体(図2の化合物8)の蛍光特性を解析した。モノメチルアジド誘導体(図2の化合物4)およびビスメチルアジド誘導体(図2の化合物8)は、無蛍光性であったのに対し,これらを還元剤で処理したところ(化合物4:100 mMのジチオスレイトールで室温条件下2時間の反応,化合物8:トリスカルボキシメチルホスフィンで室温条件下1時間の反応)、アジド基は水酸基に変換され、高い蛍光性を示した。処理前と比較し、約300倍(図2の化合物4),約2600倍(図2の化合物8)に蛍光強度が増加した(図3)。
図6Aに記載の塩基配列(配列表の配列番号1から3にも記載)を有するオリゴヌクレオチドは、0.2 μMスケールのカラムを用いて、一般的なホスホロアミダイト法に基づいて、DNA自動合成機(H-8-SE; Gene World)で合成した。塩基の脱保護およびCPG担体からの切り出しは、アンモニア水中で、55℃、4時間インキュベートすることにより行った。オリゴヌクレオチドの精製は、逆相カラム(MicroPure II; Biosearch Technologies)にて行い、UV absorbanceを測定することにより濃度を決定した。
トリフェニルホスフィン基の付加は、 5’ amino-modifiedオリゴと反応させることにより行った。 5’ amino-modified オリゴの合成には、5’ amino-modifier 5 (Glen Research)を用いた。反応は、8 mM のトリフェニルホスフィンNHSエステル(in DMF)、50 mMのsodium tetraborate buffer、200 μMの5’ amino-modifiedオリゴ溶液を含む混合液を、室温で3時間激しく撹拌することにより行った(反応液中のDMF濃度は46%)。 反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相HPLC (グラジエント条件: 0−50 % アセトニトリル/50 mM トリエチルアンモニウムアセテート)にて精製を行った。また、ESI-TOF mass spectrometryにより目的の産物が得られていることを確認した。
アジドメチルフルオレセインNHSエステル (図2の化合物4)の付加は、 3’ ホスホロチオエートDNAと反応させることにより行った。3’ ホスホロチオエートオリゴの合成は、3’-ホスフェートCPGに始めのモノマーをカップリングしたのち、sulfrizing reagent (Glen research)でホスホロチオエート化することにより行った。反応は、3 mM のブロモアセチルアミド-Rh110-アジド(in DMF)、80 mMのトリエチルアンモニウムビスカーボネート緩衝液、300 μMの3’ ホスホロチオエートオリゴ溶液を含む混合液を、室温で5時間激しく撹拌することにより行った(反応液中のDMF濃度は80%)。 反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相HPLC (グラジエント条件: 0−80 % アセトニトリル/50 mM トリエチルアンモニウムアセテート)にて精製を行った。また、ESI-TOF mass spectrometryにより目的の産物が得られていることを確認した。 アジドメチルブロモアセチルリンカーフルオレセイン(図2の化合物8)の付加も同様の方法で行った。
DNAテンプレート上での反応は、それぞれ50 nMのDNAテンプレート、5’ トリフェニルホスフィン結合プローブ、3’ アジドメチルフルオレセイン結合プローブをバッファー中(20 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2 6H2O, 0.01 mg/ml BSA; pH 7.2)において、37℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP-6500; JASCO)を用いて解析した。30秒おきに蛍光を測定し、励起波長は490 nm、蛍光波長は520 nmとした。
ターンオーバー数の測定は、それぞれ50 nMの5’ トリフェニルホスフィン結合プローブ、3’ アジドメチルフルオレセイン結合プローブに,DNAテンプレートを5nM(プローブに対して0.1等量), 0.5nM(プローブに対して0.01等量), 0.05nM(プローブに対して0.001等量)加え,バッファー中(20 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2 6H2O, 0.01 mg/ml BSA; pH 7.2)において、37℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP-6500; JASCO)を用いて解析した。30秒おきに蛍光を測定し、励起波長は490 nm、蛍光波長は520 nmとして,4時間測定した。4時間後のそれぞれの蛍光シグナルから,水酸基への物質量を求め,それをテンプレートの物質量で除することにより,ターンオーバー数を求めた。測定結果を図7に示す。
RPMI-1640培地中で培養したHL60細胞をMg, CaフリーのPBSで2度洗浄した。洗浄した細胞に、50U/mlのStreptolysin O(SLO;Sigma-aldrich)を300μL各チャンバーに加え、室温で15分間インキュベートした。このときSLOは、100mMのDTT中で2時間インキュベートし、十分に活性化したものを用いた。15分のインキュベート後、図8(配列番号4から7)及び図9(配列番号8から19)に示す各々のプローブを100nMとなるように加え、さらに5分間インキュベートした。その後、0.2g/LのCaCl2を含むMEM培地を各ウェルに300uL加えてSLOの不活性化した。さらに4℃で1hrインキュベートした。検出した細胞は、蛍光顕微鏡(Zeiss)下で、励起 470/40, 蛍光 525/50のフィルターを用いて撮影した。同様にして,フローサイトメトリー(ベックマンコールター)を用いた検出も行った。結果を図8及び図9に示す。細胞内RNAを検出することができた。
Claims (9)
- 請求項1に記載の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬。
- 核酸の標識のために用いる、請求項2に記載の試薬。
- 還元剤と組み合わせて使用される、請求項2又は3に記載の試薬。
- 標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、請求項1に記載の化合物からなる無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、還元作用を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子の−O−C(Y1)(Y2)―N3で示される基が水酸基又はオキソ基に還元されることにより生成する蛍光を検出する工程を含む、インビトロにおける標的核酸配列の検出方法。
- 標的核酸配列がRNAである、請求項5に記載の方法。
- 標的核酸配列の一塩基多型を検出する、請求項5又は6に記載の方法。
- 細胞内の標的核酸配列を検出することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 蛍光をフローサイトメトリーで検出し、蛍光を発する細胞を選別することを特徴とする、請求項8に記載の方法。
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