WO2012121396A1 - 蛍光プローブ及びその利用 - Google Patents

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WO2012121396A1
WO2012121396A1 PCT/JP2012/056204 JP2012056204W WO2012121396A1 WO 2012121396 A1 WO2012121396 A1 WO 2012121396A1 JP 2012056204 W JP2012056204 W JP 2012056204W WO 2012121396 A1 WO2012121396 A1 WO 2012121396A1
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WO
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target molecule
group
probe
molecule
chelator
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Application number
PCT/JP2012/056204
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English (en)
French (fr)
Inventor
阿部　洋
尚郎 實吉
伊藤　嘉浩
Original Assignee
独立行政法人理化学研究所
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C247/00—Compounds containing azido groups
    • C07C247/16—Compounds containing azido groups with azido groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
    • C07C247/18—Compounds containing azido groups with azido groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent probe for detecting a target molecule such as a biomolecule. Furthermore, the present invention relates to a method for detecting a target molecule and a method for screening an inhibitor of a splicing reaction.
  • Patent Documents 1 and 2 describe ON / OFF-type organic fluorescent compounds.
  • Non-Patent Document 1 describes a method for detecting DNA using a phosphor obtained by chelating a lanthanoid.
  • Non-Patent Document 1 cannot control the ON / OFF of fluorescence, for example, it is difficult to detect the presence or absence of a target molecule by causing a labeled probe to interact with the target molecule. is there.
  • the organic fluorescent compounds described in Patent Documents 1 and 2 described above are ON / OFF type fluorescent compounds.
  • development of a fluorescent compound capable of performing detection with higher sensitivity is desired.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and an object thereof is to provide a fluorescent probe that can be detected with high sensitivity by eliminating the background.
  • the fluorescent probe according to the present invention has the following formula (1):
  • a 1 and A 2 each independently represents an aromatic ring
  • X represents an arbitrary group
  • Y is reduced to be —NH 2 , —NHRa, or —NRa.
  • 2 represents a group which becomes -NH 2 , -NHRa or -NRa 2 by hydrolysis
  • Ra is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • -SO 2 represents —R, —OH, or —NR 2
  • R represents a hydrogen atom, an alkyl group, or an aryl group, and two R in —NR 2 may be different from each other
  • 2 in —NRa 2 Two Ras may be different from each other.
  • a chelator that chelates a rare earth element and is bonded to at least one of A 1 and A 2 in the above formula (1).
  • a 2 represents a 5-membered ring or 6-membered ring which may have a substituent, and the chelator moiety is A 2 is preferable.
  • X preferably represents an alkoxy group or an amino group.
  • a linker part having one end bonded to a molecule including the switch part and the chelator part, and It may include a molecular recognition unit that is bound to the end and specifically binds to the target molecule.
  • the fluorescent probe according to the present invention is the same as the above-described formula (2) in 4).
  • R 2 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 3 represents the chelator portion
  • R 4 represents the molecular recognition portion
  • Z 1 and Z 2 are each independent.
  • Z 3 represents the linker moiety
  • Y represents a group that is reduced to —NH 2 , —NHRa, or —NRa 2 , or —NH 2 , —NHRa, or — Represents a group to be NRa 2.
  • Ra represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 10 carbon atoms, —SO 2 —R, —OH, or —NR 2 (R represents a hydrogen atom, an alkyl group) Or an aryl group, and two R in —NR 2 may be different from each other.) And two Ra in —NRa 2 may be different from each other. May be preferred. 6) In any one of the above 1) to 5), in the above formula (1) or the above formula (2), Y preferably represents an azide group, an azo group, or a nitroso group.
  • the target molecule detection method includes a contact step of bringing a fluorescent probe into contact with the target molecule, and a detection step, wherein the fluorescent probe includes a switch unit represented by the above formula (1), A chelator for chelating a rare earth element, which is bonded to at least one of A 1 and A 2 in the formula (1), and the detection step is performed by contacting the target molecule with the switch unit.
  • Y is reduced or hydrolyzed to produce —NH 2 , —NHRa, or —NRa 2 , and the presence or absence of generation of fluorescence emitted from the chelator is detected by the structural change of the switch.
  • the target molecule detection method includes a binding step of binding the first probe and the second probe to the target molecule, and a detection step, wherein the first probe is the target A first molecular recognition unit that specifically binds to a molecule, a switch unit represented by the above formula (1), and at least one of A 1 and A 2 in the above formula (1), A chelator comprising a chelator of a rare earth element, and a linker part that binds a molecule containing the switch part and the chelator part to the first molecular recognition part.
  • a second molecule recognition unit that specifically binds to a site adjacent to the site to which the first molecule recognition unit binds in the target molecule; and a reduction action or hydrolysis action that is coupled to the second molecule recognition unit.
  • -NH 2 by molecules with the reducing action or hydrolytic action Y of the switch portion is reduced or hydrolyzed, -NHRa, or -NRa 2 is produced, further the switch section structural changes
  • -NHRa, or -NRa 2 is produced, further the switch section structural changes
  • the presence or absence of generation of fluorescence emitted from the chelator portion is detected.
  • the target molecule is a nucleic acid
  • the first molecule recognition unit has a sequence complementary to a partial region of the target molecule.
  • the nucleic acid is preferably contained.
  • the target molecule is a protein
  • the first molecule recognition unit and the second molecule recognition unit are aptamers for the protein. It is preferable.
  • a method for screening an inhibitor of a splicing reaction according to the present invention is a method for screening an inhibitor of a splicing reaction using a mature mRNA generated by splicing a pre-mRNA as a target molecule, comprising: a first probe; 2, a reaction step of reacting the pre-mRNA and the test compound in a splicing reaction solution, and a detection step, wherein the first probe specifically binds to the target molecule.
  • the second probe is bound to the second molecule recognition unit that specifically binds to a site adjacent to the site to which the first molecule recognition unit binds in the target molecule, and the second molecule recognition unit.
  • Y in the switch part is reduced or hydrolyzed by the molecule having the reducing action or hydrolysis action, and -NH 2 , -NHRa Or -NRa 2 is generated, and the presence or absence of generation of fluorescence emitted from the chelator is detected by the structural change of the switch.
  • the fluorescent probe according to the present invention is a fluorescent probe for detecting a target molecule, and includes a switch part and a chelator part.
  • the fluorescent probe according to the present invention may further include a linker part and a molecular recognition part.
  • the switch portion has a group that becomes —NH 2 , —NHRa, or —NRa 2 by reduction or a group that becomes —NH 2 , —NHRa, or —NRa 2 by hydrolysis in the molecule.
  • these groups are reduced or hydrolyzed to become —NH 2 , —NHRa, or —NRa 2 , an intramolecular cyclization reaction occurs and the structure changes. Due to this structural change, the absorption maximum wavelength of the switch section changes. That is, the switch part after the structural change has an excitation wavelength different from that before the structural change.
  • the switch part after the structure change becomes a donor that absorbs energy of a specific wavelength and supplies excitation energy to the chelator part that is an acceptor.
  • the chelator part includes a structure capable of chelating rare earth elements, and the chelator part chelating rare earth elements emits fluorescence by receiving excitation energy.
  • the switch section has a switch function for switching the fluorescence from the chelator section chelated with the rare earth element from OFF to ON by a structural change.
  • Fluorescence from a chelator chelated with a rare earth element has delayed fluorescence and has a long fluorescence lifetime (Li and Selvin, J. Am. Chem. Soc., Vol. 117, No. 31, 1995). Therefore, for example, the background can be eliminated by detecting the subsequent fluorescence without detecting several microseconds after the start of detection. Therefore, when the fluorescent probe according to the present invention is used, the background due to biological components can be eliminated under high background conditions, for example, in living cells, and the target molecule can be detected with high sensitivity.
  • the chelator portion in the fluorescent probe according to the present invention only needs to accept energy from the switch portion, and does not need to have a structure that absorbs light from the outside. Therefore, a molecule that emits strong fluorescence can be used as the chelator portion. Therefore, according to the present invention, detection with higher sensitivity is possible.
  • the fluorescent probe according to the present invention includes both a compound in which a rare earth element is chelated and a compound in which the chelator is not chelated.
  • switch part The switch part is represented by the above formula (1).
  • a 1 and A 2 each independently represent an aromatic ring.
  • the aromatic ring may be a single ring or a condensed ring in which two or more rings are condensed.
  • the ring constituting the aromatic ring is preferably a 5-membered ring or a 6-membered ring. Further, at least one of A 1 and A 2 is preferably a benzene ring.
  • the aromatic ring may have a substituent.
  • substituents include an alkyl group, an alkenyl group, a carboxyl group, a cyano group, a carbamoyl group, a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, an aryl group, and various heteroatoms.
  • alkenyl group include an allyl group.
  • hetero atom include a fluoro group.
  • X represents an arbitrary group.
  • X is preferably an alkoxy group, an amino group, a phenolic hydroxyl group, a secondary amine, or the like.
  • alkoxy group include an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, which may be linear or branched.
  • alkoxy group include methoxy group, ethoxy group, propoxy group, butoxy group, pentyloxy group, hexyloxy group and the like.
  • Ra represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 10 carbon atoms, —SO 2 —R, —OH, or —NR 2 .
  • R represents a hydrogen atom, an alkyl group (preferably having 1 to 6 carbon atoms), or an aryl group (preferably having 6 to 10 carbon atoms).
  • Two Ras in —NRa 2 may be different from each other. Further, two Rs in —NR 2 may be different from each other.
  • Examples of the group that is reduced to —NH 2 include an azide group, an azo group, a nitroso group, and a nitro group.
  • Examples of the group that becomes —NHRa by reduction include a hydroxylamino group.
  • Examples of the group that becomes —NH 2 by hydrolysis include a phthaloyl group and a dialkylformamidine group.
  • Examples of the group that becomes —NHRa by hydrolysis include an acyl group and a carbamoyl group.
  • Y is preferably a group that becomes —NH 2 or —NHRa when reduced or hydrolyzed, more preferably a group that becomes —NH 2 by reduction or hydrolysis, and is an azido group, an azo group, or a nitroso group. More preferably, it is an azide group.
  • the switch part include those having a biphenyl skeleton, for example.
  • the chelator portion includes a structure capable of chelating rare earth elements and is bonded to at least one of A 1 and A 2 in the above formula (1).
  • the chelator moiety is preferably bonded to one of the carbon atoms constituting at least one of the aromatic rings of A 1 and A 2 and is bonded to one of the carbon atoms constituting the aromatic ring of A 2. More preferably.
  • the structure capable of chelating the rare earth element is not particularly limited as long as it is a structure that emits fluorescence by receiving excitation energy from the switch part after the structure change.
  • FIG. 2 is a diagram showing a specific example of a structure that can be used in the chelator portion of the fluorescent probe according to the present invention.
  • the chelator portion is any one of the structures (i) to (xv) shown in FIG. 2, the carbon atom or nitrogen atom constituting the structures (i) to (xv) is directly or via a linker through the switch portion. It may be combined with.
  • the rare earth element that can be chelated to the chelator portion is not particularly limited, and examples thereof include europium (Eu), terbium (Tb), samarium (Sm), and dysprosium (Dy). Among these, europium or terbium is preferable from the viewpoint of fluorescence intensity.
  • the distance between the switch part and the chelator part is preferably 1 to 50 mm, more preferably 1 to 25 mm, from the viewpoint of efficiently transferring excitation energy.
  • the chelator part may be connected to the switch part via a linker.
  • the linker any structure may be used as long as the switch portion and the chelator portion can be efficiently maintained at a distance and a positional relationship in which excitation energy moves.
  • a chain structure including a carbon-carbon bond, a carbon-nitrogen bond and the like in the main chain may be used, and examples include a chain structure having an amide bond in the main chain, a hydrocarbon chain, and the like.
  • Linker part In the case of further including a linker part and a molecular recognition part, one end of the linker part is bonded to a molecule including a switch part and a chelator part. One end of the linker unit may be coupled to the switch unit, or may be coupled to the chelator unit. One end of the linker part may be coupled to a linker that connects the switch part and the chelator part.
  • the linker part is not particularly limited, and may be a chain structure including a carbon-carbon bond, a carbon-nitrogen bond, etc. in the main chain. For example, a chain structure having an amide bond in the main chain, a hydrocarbon Examples include chains.
  • the other end of the linker part can be bound to any other molecule.
  • numerator containing a switch part and a chelator part can be couple
  • a molecular recognition part is a molecule
  • the target molecule may be, for example, a biomolecule such as a nucleic acid or a protein, and the molecule recognition unit may be a nucleic acid or protein that specifically binds to the biomolecule.
  • nucleic acid is a concept including DNA (eg, cDNA, genomic DNA, etc.) and RNA (eg, mRNA).
  • the DNA may be double stranded or single stranded.
  • the nucleic acid may be a natural nucleic acid or a non-natural nucleic acid. Examples of the non-natural nucleic acid include BNA (LNA) and PNA.
  • the nucleic acid may be an oligonucleotide.
  • a compound represented by the above formula (2) may be used.
  • R 2 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 2 is preferably a methyl group or an ethyl group.
  • R 3 represents a chelator portion.
  • R 4 represents a molecular recognition unit.
  • Z 3 represents a linker moiety.
  • Z 1 and Z 2 each independently represent a linker.
  • Z 1 , Z 2 and Z 3 are not particularly limited, but may be hydrocarbon chains.
  • Z 1 is preferably a hydrocarbon chain having a main chain composed of 2 to 5 atoms.
  • Z 2 is preferably a hydrocarbon chain having a main chain composed of 1 to 3 atoms.
  • Z 3 is preferably a hydrocarbon chain having a main chain composed of 8 to 12 atoms.
  • Z 1 , Z 2 and Z 3 may contain a nitrogen atom in the main chain.
  • the atom which comprises a principal chain may have a substituent.
  • Y is the same as Y in the above formula (1).
  • the switch part, chelator part and linker part may be bonded to each other via one nitrogen atom.
  • the fluorescent probe according to the present invention can be manufactured by using a method as shown in Examples described later. That is, the fluorescent probe according to the present invention can be manufactured by preparing the structure of the switch part by a method described later and incorporating the chelator part, in some cases, the linker part and the molecular recognition part in this order. It is.
  • Target molecule detection method Next, the method for detecting a target molecule according to the present invention will be described in detail. Although it does not specifically limit as a target molecule detected by this invention, for example, a biomolecule may be sufficient and protein, a nucleic acid, etc. are mentioned.
  • the method for detecting a target molecule according to the present invention includes a binding step and a detection step. Below, each process is demonstrated in detail.
  • the binding step is performed on a detection target that can include a target molecule.
  • the detection target includes a target molecule
  • the first probe and the second probe are bound to the target molecule.
  • the first probe includes a first molecule recognition part, a switch part, a chelator part, and a linker part.
  • the linker unit binds a molecule including the switch unit and the chelator unit to the first molecule recognition unit.
  • the switch part and the linker part As the switch part and the linker part, the switch part and the linker part having the structure described above in the description of the fluorescent probe according to the present invention can be used. Moreover, as a chelator part, what chelated the rare earth element among the chelator parts mentioned above can be used.
  • the second probe includes a second molecular recognition unit and a molecule having a reducing action or a hydrolytic action, which is coupled to the second molecular recognition unit.
  • the molecule having a reducing action is not particularly limited, and examples thereof include a sulfur compound and a trivalent phosphorus compound.
  • examples of the sulfur compound include dithiothreitol (DTT).
  • examples of the trivalent phosphorus compound include triphenylphosphine and alkylphosphine.
  • the first molecular recognition unit is a molecule that specifically binds to the target molecule.
  • the second molecular recognition unit is a molecule that specifically binds to a site adjacent to the site to which the first molecule recognition unit binds in the target molecule.
  • the “site adjacent to the site to which the first molecule recognition unit binds in the target molecule” means that the second molecule recognition unit of the second probe binds to this site and binds to the same target molecule. It suffices if Y of the switch part of the first probe is a site that can be reduced or hydrolyzed by a molecule having a reducing action or hydrolyzing action.
  • a nucleic acid, a peptide, a protein, or the like that specifically binds to a target molecule can be used.
  • the nucleic acid include a nucleic acid containing a sequence complementary to the nucleic acid of the target molecule, a nucleic acid aptamer that specifically binds to the target molecule, and the like.
  • peptides include peptide aptamers that specifically bind to target molecules.
  • the first molecule recognition unit may be a nucleic acid containing a sequence complementary to a partial region of the nucleic acid
  • the second molecule recognition unit is Among these nucleic acids, a nucleic acid containing a sequence complementary to a region adjacent to the region to which the first molecular recognition unit binds via a space of 0 to 10 bases may be used.
  • first molecule recognition unit and the second molecule recognition unit may be aptamers for target molecules.
  • first molecule recognition unit and the second molecule recognition unit may be one and the other of two molecules obtained by dividing an aptamer for a target molecule.
  • Y of the switch part is reduced or hydrolyzed by a molecule having a reducing action or a hydrolyzing action to produce —NH 2 , —NHRa, or —NRa 2 , and the structure of the switch part is changed to form a chelator.
  • This is a step of detecting whether or not the fluorescence emitted from the unit is generated. That is, when the target to be detected includes a target molecule, in the above binding step, the first probe and the second probe fluoresce adjacent to each other on the same target molecule, but the target molecule is not included. Does not fluoresce.
  • a known method can be used as a method for detecting the presence or absence of the generation of fluorescence.
  • the present invention may include an introducing step before the combining step.
  • the introducing step is a step of introducing the first probe and the second probe into the cell.
  • the binding step is performed in the cell.
  • cell refers to a cell in a living organism (for example, a prokaryotic cell, a eukaryotic cell, etc.) and includes a living cell in a state in which these original functions are maintained.
  • a known method can be used.
  • methods such as lipofectamine method, osmotic pressure method, streptolysin O (SLO method), electroporation, calcium phosphate method, DEAE-dextran method, SDS method and the like can be used.
  • a method for detecting the presence or absence of the fluorescence emitted from the chelator part in the cell for example, a method using a fluorescence microscope can be used.
  • the background due to biological components can be eliminated, so that the target molecule can be detected with high sensitivity even in a living cell.
  • FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of a method for detecting a target molecule according to the present invention.
  • a nucleic acid is detected as a target molecule.
  • the switch part in the first probe has a biphenyl skeleton having an azide group.
  • a nucleic acid containing a sequence complementary to a part of a nucleic acid as a target molecule is bound to the other end of the linker part.
  • the second probe has a nucleic acid (second molecular recognition unit) containing a sequence complementary to a site adjacent to the site to which the first molecular recognition unit binds in the first probe.
  • the second probe has a trivalent phosphorus compound bonded to the second molecular recognition unit.
  • the azide group in the first probe approaches the trivalent phosphorus compound in the second probe. Is reduced.
  • the switch part undergoes an intramolecular cyclization reaction and changes its structure to a phenanthridinone skeleton.
  • the excitation energy absorbed by the switch part moves to the chelator part chelating europium, and the chelator part that has received the excitation energy emits fluorescence.
  • the presence or absence of the target molecule can be examined by detecting the presence or absence of fluorescence from the chelator in the detection step.
  • the target molecule detection method according to the present invention includes a contact step and a detection step. Below, each process is demonstrated in detail.
  • the contact step is performed on a detection target that can include a target molecule.
  • the detection target includes a target molecule
  • the fluorescent probe is brought into contact with the target molecule.
  • the fluorescent probe includes a switch part and a chelator part.
  • the switch unit the switch unit having the configuration described above in the description of the fluorescent probe according to the present invention can be used.
  • a chelator part what chelated the rare earth element among the chelator parts mentioned above can be used.
  • the target molecule is not particularly limited as long as Y of the switch part is reduced or hydrolyzed to generate —NH 2 , —NHRa, or —NRa 2 , for example, an enzyme that can reduce or hydrolyze Y Can be mentioned.
  • the enzyme capable of reducing Y include nitroreductase that reduces a nitro group, AzoR that reduces an azo group, GST (glutathionyltransferase), and the like.
  • Examples of the enzyme capable of hydrolyzing Y include caspases that hydrolyze peptide bonds, phosphodiesterases that hydrolyze phosphate amides, and the like.
  • Detection process In the detection step, when the fluorescent probe comes into contact with the target molecule, Y of the switch part is reduced or hydrolyzed to produce —NH 2 , —NHRa, or —NRa 2 , and the structure of the switch part changes to form a chelator. This is a step of detecting whether or not the fluorescence emitted from the unit is generated. That is, the fluorescence is emitted when the detection target includes the target molecule, but the fluorescence is not emitted when the detection target does not include the target molecule.
  • a known method can be used as a method for detecting the presence or absence of the generation of fluorescence.
  • the present invention may include an introducing step before the contacting step.
  • the introducing step is a step of introducing the fluorescent probe into the cell.
  • the contact step is performed inside the cell.
  • the background due to biological components can be eliminated, so that the target molecule can be detected with high sensitivity even in a living cell.
  • the switch part of the fluorescent probe has a biphenyl skeleton having a dinitrobenzenesulfonamide group, and the chelator part chelates europium.
  • the switch part undergoes an intramolecular cyclization reaction and changes its structure to a phenanthridinone skeleton.
  • the excitation energy absorbed by the switch part moves to the chelator part chelating europium, and the chelator part that has received the excitation energy emits fluorescence.
  • the presence or absence of the target molecule can be examined by detecting the presence or absence of fluorescence from the chelator in the detection step.
  • the screening method for a splicing reaction inhibitor according to the present invention includes a reaction step and a detection step. Below, each process is demonstrated in detail.
  • reaction step is a step of reacting the first probe, the second probe, the pre-mRNA, and the test compound in a splicing reaction solution.
  • the first probe and the second probe bind adjacent to the mature mRNA.
  • the Y of the switch part of the first probe bound to the mature mRNA is the same maturation.
  • the second probe bound to the mRNA is in a state where it can be reduced or hydrolyzed by the molecule having the hydrolytic action of the second probe.
  • the first probe and the second probe can detect mature mRNA as a target molecule and do not detect pre-mRNA as a target molecule. That is, the first probe and the second probe do not bind adjacent to the pre-mRNA.
  • the splicing reaction solution for example, a nuclear extract of HeLa cells or Heck 293 whole cell lysate can be used.
  • a test compound does not show an inhibitory effect on the splicing reaction
  • the pre-mRNA is spliced into the mature mRNA in the reaction step.
  • the test compound exhibits an inhibitory effect on the splicing reaction
  • the pre-mRNA is not spliced into the mature mRNA in the reaction step.
  • Y of the switch part is reduced or hydrolyzed by a molecule having a reducing action or a hydrolyzing action to produce —NH 2 , —NHRa, or —NRa 2 , and the structure of the switch part is changed to form a chelator.
  • This is a step of detecting whether or not the fluorescence emitted from the unit is generated.
  • a known method can be used as a method for detecting the presence or absence of the generation of fluorescence.
  • the test compound when fluorescence is detected, it indicates that splicing has been performed normally, and when fluorescence has not been detected, it indicates that splicing has not been performed normally. Therefore, when no fluorescence is detected in the detection step, the test compound can be selected as an inhibitor of the splicing reaction.
  • a splicing reaction solution generally has a very high background, but the present invention can effectively eliminate the background. Therefore, it is possible to efficiently screen for inhibitors of the splicing reaction.
  • the present invention preferably further includes a selection step.
  • the selection step is a step of selecting a test compound as an inhibitor of the splicing reaction when no fluorescence is detected in the detection step.
  • Example 1 Preparation of fluorescent probe
  • compound 9 was synthesized using the reaction formula shown in FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a method for producing a compound according to the present invention. Then, europium was chelated to the chelator part of this compound 9, and the fluorescent probe (1st probe) was produced.
  • the precipitated urea was filtered and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • the obtained residue was dissolved in ethyl acetate (100 mL) and washed with saturated brine.
  • the obtained organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the title compound as a white solid.
  • HS0611 (704 mg, 1.91 mmol) was dissolved in CH 2 Cl 2 (20 mL) and TFA (213 mL, 2.86 mmol) and trimethylsilyl azide (278 mL, 2.10 mmol) were added. After stirring at room temperature for 10 minutes, the solvent was distilled off under reduced pressure. The obtained residue was dissolved in ethyl acetate (50 mL), and washed with saturated brine, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column hexane / ethyl acetate (10: 1, v / v) to obtain compound 4.
  • reaction solution was diluted with ethyl acetate (100 mL).
  • organic layer obtained by washing the solution with 1M HCl was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • HS0635 105 mg, 0.200 mmol
  • HS0604 C6-linker 67 mg, 0.199 mmol
  • potassium carbonate K 2 CO 3
  • thiophenol 22 mL, 0.214 mmol
  • the reaction solution was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • the obtained residue was purified by silica gel column CHCl 3 / MeOH (100: 0 ⁇ 95: 5, v / v) to obtain compound 7.
  • diethylenetriaminepentaacetic dianhydride 134 mg, 0.375 mmol was dissolved in DMF (2 mL), and triethylamine (31 mL, 0.227 mmol) was added.
  • Methyl 6′-azido-3 ′-(2,2-dimethyl-4,13-dioxo-3-oxa-5,12,15-triazaheptadecan-17-ylcarbamoyl) biphenyl-2-carboxylate ( Methyl 6'-azido-3 '-(2,2-dimethyl-4,13-dioxo-3-oxa-5,12,15-triazaheptadecan-17-ylcarbamoyl) biphenyl-2-carboxylate) (45 mg, 76 micromol) In DMF (2 mL) was slowly added and stirred at room temperature for 2 hours. Et 3 N—H 2 O (1 mL, v / v) was added to stop the reaction. The solvent was removed under reduced pressure and the residue was purified by HPLC to give compound 8 (53 mg, 65%).
  • this solution (containing the precursor of the probe (ca 750 nmol)) and 5 mM thiolated DNA (SEQ ID NO: 5′-GCCGGCGG-3 ′) (75 nmol) are dissolved in 400 mM TEAB buffer, and the solution is added at room temperature for 18 hours. Reacted for hours.
  • To the reaction solution were added 3M sodium acetate (20 mL) and ethanol (600 mL), and the mixture was cooled at ⁇ 20 ° C. for 1 hour. Then, it centrifuged at 4 degreeC and 15000 rpm for 30 minutes, and obtained precipitate was fractionated by HPLC. As a result, compound 9 was obtained.
  • Example 2 Change in absorption spectrum due to change in structure of switch part
  • the absorption spectrum before and after the structural change by the reduction reaction in the switch part of the fluorescent probe produced in Example 1 was measured.
  • a fluorescent probe (50 ⁇ M) was reacted for 10 minutes under the conditions of 20 mM TCEP, 50% DMF-H 2 O, and room temperature. Absorption spectra before and after this reaction were measured. The absorption spectrum was measured with a UV-visible spectrophotometer (V-550, manufactured by JASCO Corporation) using the spectrum measurement mode.
  • V-550 UV-visible spectrophotometer
  • FIG. 4 is a diagram showing absorption spectra before and after the structural change of the switch part in one embodiment of the fluorescent probe according to the present invention.
  • the switch part after the structure change has an absorption maximum wavelength in the vicinity of 340 nm. This absorption maximum wavelength was not observed in the structure before the structural change.
  • Example 3 Detection of target molecule
  • triphenylphosphine-binding DNA was prepared as a phosphine probe (second probe).
  • triphenylphosphine group was performed by reacting with a 5 ′ amino-modified oligo (SEQ ID NO: 5′-TGTGGGCA-3 ′).
  • 5′amino-modified oligo 5′amino-modified 5 (Glen Research) was used. The reaction was carried out by vigorously stirring a mixture containing 8 mM triphenylphosphine NHS ester (in DMF), 50 mM sodium tetraborate buffer, and 200 ⁇ M 5 ′ amino-modified oligo solution at room temperature for 3 hours ( The DMF concentration in the reaction solution is 46%).
  • reaction product was recovered by ethanol precipitation and purified by reverse phase HPLC (gradient conditions: 0-50% acetonitrile / 50 mM triethylammonium acetate). Moreover, it was confirmed by ESI-TOF mass spectrometry that the desired product was obtained. 5'-TGTGGGCA triphenylphosphine -3 ': calculated mass, C 104 H 126 N 33 O 51 P 9 2931.6; found 2932.6.
  • the fluorescent probe (500 nM), phosphine probe (500 nM) prepared in Example 1 and DNA (SEQ ID NO: 3′-CGCGGCCGCCACACCCGTTC-5 ′) (500 nM) used as a target molecule were added to 100 mM NaCl, 50 mM MOPS buffer (pH 7. 0), and after 30 minutes, time-resolved fluorescence measurement was performed in phosphorescence measurement mode (ex340 nM) using Fluorolog-3 (manufactured by HORIBA Jobin Yvon). (Measurement conditions: delay time 0.05 ms, gate time 3 ms, slit 10, 10,) In addition, the same experiment was performed under conditions that do not include the target molecule.
  • FIG. 5 is a graph showing the fluorescence intensity when a target molecule is detected using an embodiment of the fluorescent probe according to the present invention.
  • fluorescence was detected under conditions including the target molecule.
  • almost no fluorescence was detected under conditions that did not contain the target molecule.
  • the fluorescence detected under conditions including the target molecule showed a 35-fold signal / background ratio (S / B).
  • the use of the fluorescent probe according to the present invention can eliminate the background and detect the target molecule with high sensitivity.
  • Example 4 Detection of target nucleic acid in living cells
  • a lanthanoid probe (Tb 3+ ) (SEQ ID NO: 5′-CTGGCGGTCTGGGTT-3 ′) was prepared as a fluorescent probe (first probe).
  • a phosphine probe (second probe) having a sequence that binds to the target DNA (match sequence; SEQ ID NO: 5: 5′-GTTTCCCTCTTCACG-3 ′) was prepared. These were produced using the same method as in Examples 1 to 3.
  • a phosphine probe having a scrambled sequence (SEQ ID NO: 5′-TGTGGGCA-3 ′) was used.
  • E. coli 23S rRNA target molecule; SEQ ID NO: 6: 3'-GACCGCCAGACCCAACAAAGGGAGAAGUGC-5 '
  • a lanthanoid probe, a phosphine probe, and 1.0 OD of cultured E. coli (JM109) were reacted at room temperature for 30 minutes in the presence of 50 mM MOPS, 1M NaCl, and 0.05% SDS.
  • fluorescence intensity was measured by a time-resolved fluorescence measurement method, and the following spectra were obtained (measurement conditions: ex: 340 nm, delay time 0.1 ms, gate time 6 ms, slit 10, 10,).
  • FIG. 6 is a diagram showing fluorescence intensity when a target molecule in a living cell is detected using another embodiment of the fluorescent probe according to the present invention.
  • a fluorescent probe and a phosphine probe having a matching sequence were used, a fluorescence signal could be observed by a time-resolved fluorescence measurement method. Therefore, it was shown that the use of the fluorescent probe according to the present invention can selectively detect an RNA sequence in a living cell and generate a fluorescent signal.
  • FIG. 7 shows a fluorescence spectrum when the fluorescence intensity of a living cell is measured by a normal fluorescence measurement method.
  • a large autofluorescence peak derived from E. coli was observed over 400 nM-600 nM, and it was confirmed that it overlapped with the signal from the fluorescent probe.
  • the present invention can provide a fluorescent probe that can be detected with high sensitivity by eliminating the background, it is suitable for a probe for detecting a target molecule under a high background condition, a detection method, and the like. Can be used.

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Abstract

本発明の蛍光化合物は、下記式（１）で表されるスイッチ部と、上記式（１）中のＡ１及びＡ２の少なくとも一方に結合された、希土類元素をキレートするキレーター部とを含む。

Description

蛍光プローブ及びその利用
　本発明は、生体分子などの標的分子を検出するための蛍光プローブに関する。さらに本発明は、標的分子を検出する方法及びスプライシング反応の阻害剤のスクリーニング方法に関する。
　生体分子などの標的分子を標識あるいは検出するための蛍光化合物がいくつか知られている。例えば特許文献１及び２には、ＯＮ／ＯＦＦ型の有機蛍光化合物が記載されている。また、非特許文献１には、ランタノイドをキレートした蛍光体を用いてＤＮＡを検出する方法が記載されている。
国際公開第２００８／０７５７１８号パンフレット（２００８年６月２６日公開） 国際公開第２００９／０３４７９０号パンフレット（２００９年３月１９日公開）
Hashino et al., Analytical Biochemistry 364 (2007) 89-91
　しかしながら、上述した非特許文献１に記載されている技術では、蛍光のＯＮ／ＯＦＦの制御ができないため、例えば標的分子に標識プローブを相互作用させることによって標的分子の有無を検出することは困難である。
　また、上述した特許文献１及び２に記載の有機蛍光化合物は、ＯＮ／ＯＦＦ型の蛍光化合物であるが、細胞内における検出、未精製の生体材料における検出など、バックグラウンドが高い環境下での検出をより高感度に行なうことができる蛍光化合物の開発が望まれている。
　本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、バックグラウンドを排除して高感度に検出することが可能な蛍光プローブを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、新規な化合物を見出し、本発明を完成させた。
１）すなわち、本発明に係る蛍光プローブは、下記式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （上記式（１）中、Ａ１、Ａ２は、それぞれ独立して芳香族環を表し、Ｘは任意の基を表し、Ｙは還元されることにより－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基、又は、加水分解により－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基を表す。Ｒａは、炭素数１～６のアルキル基、炭素数６～１０のアリール基、－ＳＯ２－Ｒ、－ＯＨ、又は－ＮＲ２（Ｒは水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、－ＮＲ２における２つのＲは互いに異なっていてもよい。）を表し、－ＮＲａ２における２つのＲａは互いに異なっていてもよい。）
で表されるスイッチ部と、上記式（１）中のＡ１及びＡ２の少なくとも一方に結合された、希土類元素をキレートするキレーター部とを含むことを特徴とする。
２）また、本発明に係る蛍光プローブでは、上記１）において、上記式（１）中、Ａ２は置換基を有してもよい５員環又は６員環を表し、上記キレーター部はＡ２に結合されていることが好ましい。
３）また、本発明に係る蛍光プローブでは、上記１）又は２）において、上記式（１）中、Ｘはアルコキシ基又はアミノ基を表すことが好ましい。
４）また、本発明に係る蛍光プローブでは、上記１）～３）のいずれかにおいて、さらに、上記スイッチ部及び上記キレーター部を含む分子に一端が結合されたリンカー部と、上記リンカー部の他端に結合されており、かつ標的分子に対して特異的に結合する分子認識部とを含む場合がある。
５）また、本発明に係る蛍光プローブは、上記４）において、下記式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （上記式（２）中、Ｒ２は炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ３は上記キレーター部を表し、Ｒ４は上記分子認識部を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してリンカーを表し、Ｚ３は上記リンカー部を表し、Ｙは還元されることにより－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基、又は、加水分解により－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基を表す。Ｒａは、炭素数１～６のアルキル基、炭素数６～１０のアリール基、－ＳＯ２－Ｒ、－ＯＨ、又は－ＮＲ２（Ｒは水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、－ＮＲ２における２つのＲは互いに異なっていてもよい。）を表し、－ＮＲａ２における２つのＲａは互いに異なっていてもよい。）
で表されることが好ましい場合がある。
６）上記１）～５）のいずれかにおいて、上記式（１）又は上記式（２）中、Ｙがアジド基、アゾ基、又はニトロソ基を表すことが好ましい。
７）本発明に係る標的分子の検出方法は、蛍光プローブを標的分子と接触させる接触工程と、検出工程とを含んでおり、上記蛍光プローブは、上記式（１）で表されるスイッチ部と、上記式（１）中のＡ１及びＡ２の少なくとも一方に結合された、希土類元素をキレートするキレーター部とを含んでおり、上記検出工程は、上記標的分子と接触することにより上記スイッチ部のＹが還元又は加水分解されて－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、又は－ＮＲａ２が生成し、さらに上記スイッチ部が構造変化することによって上記キレーター部から発する蛍光の、発生の有無を検出することを特徴とする。
８）本発明に係る標的分子の検出方法は、第１のプローブと第２のプローブとを標的分子に結合させる結合工程と、検出工程とを含んでおり、上記第１のプローブは、上記標的分子に対して特異的に結合する第１の分子認識部と、上記式（１）で表されるスイッチ部と、上記式（１）中のＡ１及びＡ２の少なくとも一方に結合された、希土類元素をキレートしているキレーター部と、上記スイッチ部及び上記キレーター部を含む分子を上記第１の分子認識部に結合させているリンカー部とを含んでおり、上記第２のプローブは、上記標的分子における上記第１の分子認識部が結合する部位と隣接する部位に特異的に結合する第２の分子認識部と、上記第２の分子認識部に結合された還元作用又は加水分解作用を有する分子とを含んでおり、上記検出工程は、上記還元作用又は加水分解作用を有する分子によって上記スイッチ部のＹが還元又は加水分解されて－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、又は－ＮＲａ２が生成し、さらに上記スイッチ部が構造変化することによって上記キレーター部から発する蛍光の、発生の有無を検出することを特徴とする。
９）また、本発明に係る標的分子の検出方法では、上記８）において、上記標的分子が核酸であり、上記第１の分子認識部が上記標的分子の一部の領域と相補的な配列を含む核酸であり、上記第２の分子認識部が、上記標的分子のうち、上記第１の分子認識部が結合する領域に０～１０塩基のスペースを介して隣接する領域と相補的な配列を含む核酸であることが好ましい。
１０）また、本発明に係る標的分子の検出方法では、上記８）において、上記標的分子がタンパク質であり、上記第１の分子認識部及び上記第２の分子認識部が上記タンパク質に対するアプタマーであることが好ましい。
１１）また、本発明に係る標的分子の検出方法では、上記８）～１０）のいずれかにおいて、上記結合工程の前に、上記第１のプローブと上記第２のプローブとを細胞内に導入する導入工程を含み、上記結合工程は、上記細胞内において行なうことが好ましい。
１２）本発明に係るスプライシング反応の阻害剤のスクリーニング方法は、プレｍＲＮＡがスプライシングされて生じる成熟ｍＲＮＡを標的分子として用いる、スプライシング反応の阻害剤のスクリーニング方法であって、第１のプローブと、第２のプローブと、上記プレｍＲＮＡと、試験化合物とをスプライシング反応溶液中で反応させる反応工程と、検出工程とを含んでおり、上記第１のプローブは、上記標的分子に対して特異的に結合する第１の分子認識部と、上記式（１）で表されるスイッチ部と、上記式（１）中のＡ１及びＡ２の少なくとも一方に結合された、希土類元素をキレートしているキレーター部と、上記スイッチ部及び上記キレーター部を含む分子を上記第１の分子認識部に結合させているリンカー部とを含んでおり、上記第２のプローブは、上記標的分子における上記第１の分子認識部が結合する部位と隣接する部位に特異的に結合する第２の分子認識部と、上記第２の分子認識部に結合された還元作用又は加水分解作用を有する分子とを含んでおり、上記検出工程は、上記還元作用又は加水分解作用を有する分子によって上記スイッチ部のＹが還元又は加水分解されて－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、又は－ＮＲａ２が生成し、さらに上記スイッチ部が構造変化することによって上記キレーター部から発する蛍光の、発生の有無を検出することを特徴とする。
　本発明を用いれば、バックグラウンドを排除して高感度に検出することが可能な蛍光プローブを提供することができる。
本発明に係る標的分子の検出方法の一実施形態を示す図である。 本発明に係る蛍光プローブのキレーター部に用いることができる構造の具体例を示す図である。 本発明に係る蛍光プローブを製造する方法の一例を示す図である。 本発明に係る蛍光プローブの一実施例において、スイッチ部の構造変化前後の吸収スペクトルを示す図である。 本発明に係る蛍光プローブの一実施例を用いて標的分子を検出した際の蛍光強度を示すグラフである。 本発明に係る蛍光プローブの他の実施例を用いて、生細胞内の標的分子を検出した際の蛍光強度を示す図である。 通常の蛍光測定法によって生細胞の蛍光強度を測定した際の蛍光スペクトルを示す。
　〔蛍光プローブ〕
　本発明に係る蛍光プローブは、標的分子を検出するための蛍光プローブであり、スイッチ部と、キレーター部とを含む。また、本発明に係る蛍光プローブは、さらに、リンカー部と、分子認識部とを含んでもよい。
　スイッチ部は、分子中に、還元されることにより－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基、又は、加水分解により－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基を有しており、これらの基が還元又は加水分解されて－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２になることにより分子内環化反応が起こり、構造変化する。この構造変化によって、スイッチ部の吸収極大波長が変化する。すなわち、構造変化後のスイッチ部は、構造変化前とは異なる励起波長を有する。構造変化後のスイッチ部は、特定の波長のエネルギーを吸収し、励起エネルギーを受容体であるキレーター部に供与する供与体となる。
　キレーター部は、希土類元素をキレートしうる構造を含んでおり、希土類元素をキレートしたキレーター部は、励起エネルギーを受容することによって蛍光を発する。このように、スイッチ部は、構造変化によって、希土類元素をキレートしたキレーター部からの蛍光をＯＦＦからＯＮに切り替えるスイッチ機能を有する。
　希土類元素をキレートしたキレーター部からの蛍光は、遅延蛍光性を有し、蛍光の寿命が長い（Li and Selvin, J. Am. Chem. Soc., Vol. 117, No. 31, 1995）。そのため、例えば検出開始後の数マイクロ秒を検出せず、その後の蛍光を検出することによって、バックグラウンドを排除することができる。したがって、本発明に係る蛍光プローブを用いれば、バックグラウンドが高い条件下、例えば生細胞内において、生体成分によるバックグラウンドを排除し、標的分子を高感度に検出することができる。
　また、本発明に係る蛍光プローブにおけるキレーター部は、スイッチ部からのエネルギーを受容できればよく、外部からの光を吸収する構造である必要がない。そのため、強い蛍光を発する分子をキレーター部として用いることが可能である。したがって、本発明によれば、より高感度での検出が可能となる。
　なお、本発明に係る蛍光プローブは、キレーター部に希土類元素がキレートされている化合物と、キレートされていない化合物とのいずれをも包含する。
　以下に各部分について詳細に説明する。
　（スイッチ部）
　スイッチ部は、上記式（１）で表される。
　上記式（１）中、Ａ１、Ａ２は、それぞれ独立して芳香族環を表す。芳香族環は、単環であってもよいし、２個以上の環が縮合した縮合環であってもよい。芳香族環を構成する環は、５員環又は６員環であることが好ましい。また、Ａ１及びＡ２の少なくとも一方は、ベンゼン環であることが好ましい。
　芳香族環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルケニル基、カルボキシル基、シアノ基、カルバモイル基、水酸基、チオール基、アミノ基、アリール基、各種のへテロ原子などが挙げられる。アルケニル基としては、アリル基等が挙げられる。ヘテロ原子としては、フルオロ基等が挙げられる。
　上記式（１）中、Ｘは任意の基を表す。なお、Ｘは、アルコキシ基、アミノ基、フェノール性水酸基、２級アミン等であることが好ましい。アルコキシ基としては、炭素数１～６のアルコキシ基を挙げることができ、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。アルコキシ基として、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
　上記式（１）中、Ｙは還元されることにより－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基、又は、加水分解により－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基を表す。Ｒａは、炭素数１～６のアルキル基、炭素数６～１０のアリール基、－ＳＯ２－Ｒ、－ＯＨ、又は－ＮＲ２を表す。Ｒは水素原子、アルキル基（好ましくは炭素数１～６）、又はアリール基（好ましくは炭素数６～１０）を表す。－ＮＲａ２における２つのＲａは互いに異なっていてもよい。また、－ＮＲ２における２つのＲは互いに異なっていてもよい。還元されることにより－ＮＨ２となる基としては、アジド基、アゾ基、ニトロソ基、ニトロ基等が挙げられる。還元されることにより－ＮＨＲａとなる基としては、ヒドロキシルアミノ基等が挙げられる。また、加水分解により－ＮＨ２となる基としては、フタロイル基、ジアルキルホルムアミジン基等が挙げられる。加水分解により－ＮＨＲａとなる基としては、アシル基、カルバモイル基等が挙げられる。Ｙは、還元又は加水分解されることにより－ＮＨ２、－ＮＨＲａとなる基が好ましく、還元又は加水分解されることにより－ＮＨ２となる基がより好ましく、アジド基、アゾ基、ニトロソ基であることがさらに好ましく、アジド基であることが特に好ましい。
　スイッチ部の具体例としては、例えばビフェニル骨格を有するものが挙げられる。
　（キレーター部）
　キレーター部は、希土類元素をキレートしうる構造を含み、上記式（１）中のＡ１及びＡ２の少なくとも一方に結合されている。キレーター部は、Ａ１及びＡ２の少なくとも一方の芳香族環を構成する炭素原子の１つに結合されていることが好ましく、Ａ２の芳香族環を構成する炭素原子の１つに結合されていることがより好ましい。
　希土類元素をキレートしうる構造としては、構造変化後のスイッチ部から励起エネルギーを受容して蛍光を発光する構造であれば特に限定されないが、例えば、図２に示す構造（ｉ）～（ｘｖ）等が挙げられる。図２は、本発明に係る蛍光プローブのキレーター部に用いることができる構造の具体例を示す図である。なお、キレーター部が図２に示す構造（ｉ）～（ｘｖ）のいずれかである場合、構造（ｉ）～（ｘｖ）を構成する炭素原子又は窒素原子が、直接又はリンカーを介してスイッチ部に結合されていてもよい。
　キレーター部にキレートされうる希土類元素としては、特に限定されないが、ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓｍ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）等が挙げられる。なかでも蛍光の強さの観点からはユウロピウム又はテルビウムが好ましい。
　スイッチ部とキレーター部との間の距離は、効率よく励起エネルギーを移動させるという観点から、１～５０Åであることが好ましく、１～２５Åであることがより好ましい。
　キレーター部は、スイッチ部にリンカーを介して結合されていてもよい。リンカーとしては、スイッチ部とキレーター部とを、効率よく励起エネルギーが移動する距離及び位置関係に保つことができる構造であればよい。リンカーとして、炭素－炭素結合、炭素－窒素結合等を主鎖中に含む鎖状構造を用いてもよく、例えば主鎖中にアミド結合を有する鎖状構造、炭化水素鎖等が挙げられる。
　（リンカー部）
　リンカー部と分子認識部とをさらに有する場合、リンカー部は、その一端がスイッチ部及びキレーター部を含む分子に結合されている。リンカー部の一端は、スイッチ部に結合されていてもよいし、キレーター部に結合されていてもよい。また、リンカー部の一端は、スイッチ部とキレーター部とをつなぐリンカーに結合されていてもよい。リンカー部としては、特に限定されないが、炭素－炭素結合、炭素－窒素結合等を主鎖中に含む鎖状構造であってもよく、例えば主鎖中にアミド結合を有する鎖状構造、炭化水素鎖等が挙げられる。
　リンカー部の他端は、任意の他の分子に結合されることができる。これにより、スイッチ部及びキレーター部を含む分子は、リンカー部を介して分子認識部に結合され得る。
　（分子認識部）
　リンカー部と分子認識部とをさらに有する場合、分子認識部とは、標的分子に対して特異的に結合する分子である。標的分子としては、例えば核酸、タンパク質等の生体分子であってもよく、分子認識部は、この生体分子に特異的に結合する核酸、タンパク質等であってもよい。
　本明細書中、「核酸」とは、ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等）及びＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を含む概念である。ＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。また、核酸は、天然型の核酸であっても非天然型の核酸であってもよく、非天然型の核酸としては、例えばＢＮＡ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ等が挙げられる。また、核酸は、オリゴヌクレオチドであってもよい。
　なお、分子認識部に非天然の核酸を用いれば、生細胞内における蛍光プローブの分解を抑制することができるため、好ましい。
　本発明に係る蛍光プローブの一実施形態としては、例えば上記式（２）で表される化合物であってもよい。
　上記式（２）中、Ｒ２は炭素数１～６のアルキル基を表す。なお、Ｒ２は、メチル基又はエチル基であることが好ましい。
　Ｒ３はキレーター部を表す。また、Ｒ４は分子認識部を表す。また、Ｚ３はリンカー部を表す。Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してリンカーを表す。
　Ｚ１、Ｚ２及びＺ３としては、特に限定されないが、炭化水素鎖であってもよい。Ｚ１は、２～５個の原子により構成される主鎖を有する炭化水素鎖であることが好ましい。また、Ｚ２は、１～３個の原子により構成される主鎖を有する炭化水素鎖であることが好ましい。また、Ｚ３は、８～１２個の原子により構成される主鎖を有する炭化水素鎖であることが好ましい。またＺ１、Ｚ２及びＺ３は、主鎖中に窒素原子を含んでいてもよい。また、主鎖を構成する原子は、置換基を有していてもよい。
　Ｙは上記式（１）中のＹと同じである。
　上記式（２）で表されるように、本発明に係る蛍光プローブは、スイッチ部、キレーター部及びリンカー部が、１個の窒素原子を介して互いに結合されていてもよい。
　なお、標的分子が直接Ｙを還元又は加水分解する場合には、リンカー部及び分子認識部は不要である。
　〔蛍光プローブの製造方法〕
　本発明に係る蛍光プローブは、後述する実施例に示したような方法を用いて製造することができる。すなわち、スイッチ部の構造を後述する方法などによって作製し、これにキレーター部、場合によっては、リンカー部、分子認識部を順に組み込んでいくことによって、本発明に係る蛍光プローブを製造することが可能である。
　〔標的分子の検出方法〕
　次に、本発明に係る標的分子の検出方法について、詳細に説明する。本発明により検出する標的分子としては、特に限定されないが、例えば生体分子であってもよく、タンパク質、核酸等が挙げられる。
　＜スイッチ部と、キレーター部と、リンカー部と、分子認識部とを含む蛍光プローブを用いる場合＞
　スイッチ部と、キレーター部と、リンカー部と、分子認識部とを含む蛍光プローブを用いる場合、本発明に係る標的分子の検出方法は、結合工程と、検出工程とを含む。以下に、各工程について詳細に説明する。
　（結合工程）
　結合工程は、標的分子を含みうる検出対象に対して行われ、当該検出対象が標的分子を含む場合に、第１のプローブと、第２のプローブとを標的分子に結合させる工程である。
　第１のプローブは、第１の分子認識部と、スイッチ部と、キレーター部と、リンカー部とを含んでいる。リンカー部は、スイッチ部とキレーター部とを含む分子を第１の分子認識部に結合させている。
　スイッチ部、リンカー部としては、本発明に係る蛍光プローブの説明において上述した構成のスイッチ部、リンカー部をそれぞれ用いることができる。また、キレーター部としては、上述したキレーター部のうち、希土類元素をキレートしているものを用いることができる。
　第２のプローブは、第２の分子認識部と、この第２の分子認識部に結合された、還元作用又は加水分解作用を有する分子とを含んでいる。
　還元作用を有する分子としては、特に限定されないが、例えば硫黄化合物、三価のリン化合物等が挙げられる。硫黄化合物としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）等が挙げられる。三価のリン化合物としては、トリフェニルホスフィン、アルキルホスフィン等が挙げられる。
　第１の分子認識部は、標的分子に対して特異的に結合する分子である。また、第２の分子認識部は、標的分子における第１の分子認識部が結合する部位と隣接する部位に特異的に結合する分子である。
　なお、「標的分子における第１の分子認識部が結合する部位と隣接する部位」とは、第２のプローブの第２の分子認識部がこの部位に結合することによって、同じ標的分子に結合している第１のプローブのスイッチ部のＹが、還元作用又は加水分解作用を有する分子によって還元又は加水分解されうる状態となるような部位であればよい。
　第１の分子認識部及び第２の分子認識部としては、標的分子に特異的に結合する核酸、ペプチド、タンパク質等を用いることができる。核酸としては、例えば標的分子の核酸と相補的な配列を含む核酸、標的分子と特異的に結合する核酸アプタマー等が挙げられる。ペプチドとしては、例えば標的分子と特異的に結合するペプチドアプタマー等が挙げられる。
　例えば、標的分子が核酸である場合には、第１の分子認識部がこの核酸の一部の領域と相補的な配列を含む核酸であってもよく、また、第２の分子認識部が、この核酸のうち、第１の分子認識部が結合する領域に０～１０塩基のスペースを介して隣接する領域と相補的な配列を含む核酸であってもよい。
　また、第１の分子認識部と第２の分子認識部とは、標的分子に対するアプタマーであってもよい。例えば、第１の分子認識部と第２の分子認識部とは、標的分子に対するアプタマーを分断して得られる２つの分子の一方と他方とであってもよい。
　（検出工程）
　検出工程は、還元作用又は加水分解作用を有する分子によってスイッチ部のＹが還元又は加水分解されて－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、又は－ＮＲａ２が生成し、さらにスイッチ部が構造変化することによってキレーター部から発する蛍光の、発生の有無を検出する工程である。すなわち、検出対象が標的分子を含む場合には、上記結合工程において、第一のプローブと第二のプローブとが同じ標的分子上に隣接して蛍光が発されるが、標的分子を含まない場合は蛍光が発されない。なお、蛍光の発生の有無を検出する方法としては、公知の方法を用いることができる。
　なお、本発明に係る標的分子の検出方法は、細胞内において行なってもよい。すなわち、本発明は、結合工程の前に導入工程を含んでいてもよい。導入工程は、第１のプローブと第２のプローブとを細胞内に導入する工程である。この場合、結合工程は、細胞内において行なわれる。
　細胞とは、生物における細胞（例えば原核細胞、真核細胞等）であり、これらの本来の機能を維持した状態の生細胞を含む概念である。
　第１のプローブと第２のプローブとを細胞内に導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、リポフェクタミン法、浸透圧法、ストレプトライシンＯ（ＳＬＯ法）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ-デキストラン法、ＳＤＳ法等の方法を用いることができる。
　細胞内においてキレーター部から発する蛍光の発生の有無を検出する方法としては、例えば蛍光顕微鏡を用いる方法等を用いることができる。
　本発明を用いれば、生体成分によるバックグラウンドを排除することができるため、生細胞内であっても標的分子を高感度に検出することができる。
　ここで、本発明を用いて標的分子を検出する方法の具体例について、図１を参照して説明する。図１は、本発明に係る標的分子の検出方法の一実施形態を示す図である。ここでは、標的分子として核酸を検出する場合について説明する。
　図１に示す例では、第１のプローブにおけるスイッチ部は、アジド基を有するビフェニル骨格を持っている。また、第１のプローブは、リンカー部の他端に、標的分子としての核酸の一部と相補的な配列を含む核酸（第１の分子認識部）が結合している。
　第２のプローブは、第１のプローブにおける第１の分子認識部が結合する部位と隣接する部位と相補的な配列を含む核酸（第２の分子認識部）を有する。また、第２のプローブは、第２の分子認識部に結合された三価のリン化合物を有する。
　結合工程において、標的分子の核酸に第１のプローブと第２のプローブとを結合させると、第１のプローブにおけるアジド基と第２のプローブにおける三価のリン化合物とが近づくことによって、アジド基が還元される。その結果、スイッチ部は、分子内環化反応を起こし、フェナンスリジノン骨格に構造変化する。スイッチ部が吸収した励起エネルギーは、ユウロピウムをキレートしたキレーター部に移動し、励起エネルギーを受容したキレーター部は、蛍光を発する。
　したがって、検出工程においてキレーター部からの蛍光の発生の有無を検出することにより、標的分子の有無を調べることができる。
　＜スイッチ部と、キレーター部とを含む蛍光プローブを用いる場合＞
　スイッチ部と、キレーター部とを含むが分子認識部を含まない蛍光プローブを用いる場合、本発明に係る標的分子の検出方法は、接触工程と、検出工程とを含む。以下に、各工程について詳細に説明する。
　（接触工程）
　接触工程は、標的分子を含みうる検出対象に対して行われ、当該検出対象が標的分子を含む場合に、蛍光プローブを標的分子と接触させる工程である。
　蛍光プローブは、スイッチ部と、キレーター部とを含んでいる。スイッチ部としては、本発明に係る蛍光プローブの説明において上述した構成のスイッチ部を用いることができる。また、キレーター部としては、上述したキレーター部のうち、希土類元素をキレートしているものを用いることができる。
　標的分子としては、スイッチ部のＹを還元又は加水分解して－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、又は－ＮＲａ２を生成させるものであれば特に限定されないが、例えば、Ｙを還元又は加水分解できる酵素が挙げられる。Ｙを還元できる酵素としては、例えば、ニトロ基を還元するニトロレダクダーゼ、アゾ基を還元するＡｚｏＲ、ＧＳＴ（グルタチオン転移酵素）等が挙げられる。Ｙを加水分解できる酵素としては、例えば、ペプチド結合を加水分解するカスパーゼ、リン酸アミドを加水分解するホスホジエステラーゼ等が挙げられる。
　（検出工程）
　検出工程は、蛍光プローブが標的分子と接触することによりスイッチ部のＹが還元又は加水分解されて－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、又は－ＮＲａ２が生成し、さらにスイッチ部が構造変化することによってキレーター部から発する蛍光の、発生の有無を検出する工程である。すなわち、検出対象が標的分子を含む場合には蛍光が発されるが、標的分子を含まない場合は蛍光が発されない。なお、蛍光の発生の有無を検出する方法としては、公知の方法を用いることができる。
　なお、本発明に係る標的分子の検出方法は、細胞内において行なってもよい。すなわち、本発明は、接触工程の前に導入工程を含んでいてもよい。導入工程は、蛍光プローブを細胞内に導入する工程である。この場合、接触工程は、細胞内において行なわれる。細胞の定義、細胞内に導入する方法、及び細胞内においてキレーター部から発する蛍光の発生の有無を検出する方法については、上述の＜スイッチ部と、キレーター部と、リンカー部と、分子認識部とを含む蛍光プローブを用いる場合＞と同様である。
　本発明を用いれば、生体成分によるバックグラウンドを排除することができるため、生細胞内であっても標的分子を高感度に検出することができる。
　ここで、本発明を用いて標的分子を検出する方法の具体例について説明する。ここでは、標的分子としてＧＳＴ（グルタチオン転移酵素）を検出する場合の一例について説明する。蛍光プローブのスイッチ部はジニトロベンゼンスルホンアミド基を有するビフェニル骨格を持っており、キレーター部はユウロピウムをキレートしている。
　接触工程において、標的分子のＧＳＴと蛍光プローブとが接触すると、ＧＳＴの働きによってスルホンアミド基が還元される。その結果、スイッチ部は、分子内環化反応を起こし、フェナンスリジノン骨格に構造変化する。スイッチ部が吸収した励起エネルギーは、ユウロピウムをキレートしたキレーター部に移動し、励起エネルギーを受容したキレーター部は、蛍光を発する。
　したがって、検出工程においてキレーター部からの蛍光の発生の有無を検出することにより、標的分子の有無を調べることができる。
　〔スプライシング反応の阻害剤のスクリーニング方法〕
　次に、本発明に係るスプライシング反応の阻害剤のスクリーニング方法について説明する。本発明は、プレｍＲＮＡがスプライシングされて生じる成熟ｍＲＮＡを標的分子として用いる。
　本発明に係るスプライシング反応の阻害剤のスクリーニング方法は、反応工程と検出工程とを含んでいる。以下に、各工程について詳細に説明する。
　（反応工程）
　反応工程は、第１のプローブと、第２のプローブと、上記プレｍＲＮＡと、試験化合物とをスプライシング反応溶液中で反応させる工程である。
　第１のプローブ及び第２のプローブとしては、「標的分子の検出方法」の＜スイッチ部と、キレーター部と、リンカー部と、分子認識部とを含む蛍光プローブを用いる場合＞において上述した構成のものを好適に用いることができる。第１のプローブと第２のプローブとは、成熟ｍＲＮＡに対して隣接して結合するものである。これにより、反応工程で成熟ｍＲＮＡが生じた場合（すなわち、試験化合物がスプライシング反応の阻害作用を示さない場合）には、当該成熟ｍＲＮＡに結合した第１のプローブのスイッチ部のＹが、同じ成熟ｍＲＮＡに結合した第２のプローブの還元作用加水分解作用を有する分子によって還元又は加水分解されうる状態となる。
　なお、第１のプローブと第２のプローブとは、成熟ｍＲＮＡを標的分子として検出しうるものであり、かつプレｍＲＮＡを標的分子として検出しないものである。すなわち、第１のプローブと第２のプローブとは、プレｍＲＮＡに対しては隣接して結合しないものである。
　スプライシング反応溶液としては、例えばＨｅＬａ細胞の核抽出液もしくはＨｅｃｋ２９３　ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ等を用いることができる。これにより、試験化合物がスプライシング反応の阻害作用を示さない場合には、反応工程においてプレｍＲＮＡが成熟ｍＲＮＡにスプライシングされる。試験化合物がスプライシング反応の阻害作用を示す場合には、反応工程においてプレｍＲＮＡが成熟ｍＲＮＡにスプライシングされない。
　（検出工程）
　検出工程は、還元作用又は加水分解作用を有する分子によってスイッチ部のＹが還元又は加水分解されて－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、又は－ＮＲａ２が生成し、さらにスイッチ部が構造変化することによってキレーター部から発する蛍光の、発生の有無を検出する工程である。蛍光の発生の有無を検出する方法としては、公知の方法を用いることができる。
　ここで、蛍光が検出された場合には、スプライシングが正常に行なわれたことを示し、蛍光が検出されなかった場合には、スプライシングが正常に行なわれなかったことを示す。したがって、検出工程において蛍光が検出されなかった場合に、試験化合物をスプライシング反応の阻害剤として選抜することができる。
　スプライシング反応溶液は、一般的にバックグラウンドが非常に高いが、本発明であれば、バックグラウンドを効果的に排除することができる。したがって、スプライシング反応の阻害剤を効率よくスクリーニングすることが可能である。
　（選抜工程）
　なお、本発明はさらに選抜工程を含んでいることが好ましい。選抜工程は、検出工程において蛍光が検出されない場合に、試験化合物を、スプライシング反応の阻害剤として選抜する工程である。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
　〔実施例１：蛍光プローブの作製〕
　本実施例では、図３に示す反応式を用いて化合物９を合成した。図３は、本発明に係る化合物を製造する方法の一例を示す図である。その後、この化合物９のキレーター部にユウロピウムをキレートさせ、蛍光プローブ（第１のプローブ）を作製した。
　（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル　２－ブロモ酢酸塩（2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 2-bromoacetate）の合成）
　まず、下記反応式Ａにより、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル　２－ブロモ酢酸エステルを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　ブロモ酢酸（Bromo acetic acid）（６９５ｍｇ，５．００ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシスクシニミド（N-hydroxy succnimide）（５７５ｍｇ，５．００ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Dicyclohexylcarbodiimide）（１０３１ｍｇ，５．００ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（EtOAc）（２５０ｍＬ）に溶解させ、室温で５時間反応させた。
　析出したウレアをろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させ、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、溶媒を減圧留去することで表記化合物を白色固体として得た。
　ＨＳ０４５２（１１０３ｍｇ、９４％）
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．１１（１Ｈ，ｓ，ＢｒＣＨ２ＣＯ－），２．８７（４Ｈ，ｓ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）；１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１６８．５，１６２．９，２５．５，２１．２。
　（三級ブチル２－（２－ニトロフェニルスルホンアミド）エチルカルバメート（tert-butyl 2-(2-nitrophenylsulfonamido)ethylcarbamate）の合成）
　下記反応式Ｂにより、三級ブチル２－（２－ニトロフェニルスルホンアミド）エチルカルバメートを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　三級ブチル２－アミノエチルカルバメート（tert-butyl 2-aminoethylcarbamate）（４８１ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ－ピリジン（CH3CN-pyridine）（３０ｍＬ，９：１）に溶解させ、Ｅｔ３Ｎ（４９２ｍＬ，３．６０ｍｍｏｌ）、２－ニトロベンゼンスルホニルクロライド（2-nitrobenzene sulphonyl chloride）（７３１ｍｇ，３．３０ｍｍｏｌ）を加えた。
　室温で１時間撹拌し溶媒を減圧下、留去した。酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶解し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム　ヘキサン／酢酸エチル（２：１，ｖ／ｖ）により精製し表記化合物を得た。
　ＨＳ０６２７（８９１ｍｇ，８６％）ａｓ　ａ　ｓｙｒｕｐ：１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．１２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝９．３，３．６Ｈｚ，Ａｒ），７．８５（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝６．４，３．４Ｈｚ，Ａｒ），７．７８－７．７２（２Ｈ，ｍ，Ａｒ），５．９０（１Ｈ，ｂｒ，－ＳＯ２ＮＨ－），５．０２（１Ｈ，ｂｒ，Ｂｏｃ－ＮＨ－），３．２９－３．２２（４Ｈ，ｍ，Ｈ－１，Ｈ－２），１．４１（９Ｈ，ｓ，ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ）；１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５６．３，１４８．１，１３３．８，１３３．６，１３３．０，１３１．１，１２５．５，７９．９，４３．９，４０．４，２８．４。
　（Ｎ－（２－アミノエチル）－２－ニトロベンゼンスルホンアミド塩酸塩（N-(2-aminoethyl)-2-nitrobenzenesulfonamide hydrochloride）の合成）
　下記反応式Ｃにより、Ｎ－（２－アミノエチル）－２－ニトロベンゼンスルホンアミド塩酸塩を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　三級ブチル２－（２－ニトロフェニルスルホンアミド）エチルカルバメート（６５３ｍｇ，１．８９ｍｍｏｌ）を４Ｍ　ＨＣｌ－ジオキサン（１０ｍＬ）に溶解させ室温で１３時間反応させた。溶媒を減圧留去して表記化合物を淡黄色固体として得た。
　ＨＳ０６３１（５３３ｍｇ，ｑｕａｎｔ）
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ８．１２－８．０７（１Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．９０－７．８０（３Ｈ，ｍ，Ａｒ），３．３２－３．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，－ＳＯ２ＮＨＣＨ２－），３．１０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２；１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１４９．６，１３５．５，１３３．９，１３３．７，１３１．７，１２６．２，４１．６，４０．８。
　（三級ブチル６－（２－ブロモアセトアミド）ヘキシルカルバメート（tert-butyl 6-(2-bromoacetamido)hexylcarbamate）の合成）
　下記反応式Ｄにより、三級ブチル６－（２－ブロモアセトアミド）ヘキシルカルバメートを合成した（ＨＳ０６０４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　三級ブチル６－アミノヘキシルカルバメート（tert-Butyl 6-aminohexylcarbamate）（１３０ｍｇ，０．６０１ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（６ｍＬ）に溶解させ、２，５－ジオキシピロリジン－１－イル　２－ブロモ酢酸塩（2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 2-bromoacetate）（１４２ｍｇ，０．６０２ｍｍｏｌ）を室温で２時間反応させた。その後、酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、溶媒を減圧留去し表記化合物を得た。
　ＨＳ０６０４（１９９ｍｇ，８８％）ａｓ　ａ　ｗｈｉｔｅ　ｓｏｌｉｄ：１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ６．８７（１Ｈ，ｂｒ，ＣＨ２ＢｒＣＯＮＨ），４．７６（１Ｈ，ｂｒ，ＮＨＢｏｃ），３．８８（１Ｈ，ｓ，ＣＨ２ＢｒＣＯＮＨ），３．１０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ－１），３．１０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ－６），１．３３－１．５７（１７Ｈ，ｍ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｂｏｃ）；１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１６５．７，１５６．１，７９．０，４０．３，３９．９，２９．９，２９．２，２９．１，２８．４，２６．３，２６．２。
　（メチル４－（３，３－ジエチルトリアズ－１－エニル）－３－ヨウ化ベンゾエート（Methyl 4-(3,3-diethyltriaz-1-enyl)-3-iodobenzoate）の合成）
　次に、化合物１を用いて、下記反応式Ｅにより化合物２を合成した（ＨＳ０５７２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　メチル４－アミノ－３－ヨウ化ベンゾエート（Methyl 4-amino-3-iodobenzoate）（２ｇ，７．２３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２－ＣＨ３ＣＮ（１：１，ｖ／ｖ，４０ｍＬ，）に溶解させた。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（８１７ｍＬ，１１．０ｍｍｏｌ），イソペンチル亜硝酸塩（isopenthyl nitrite）（１．２０ｍＬ，８．９１ｍｍｏｌ）と室温で３０分反応させた。
　その後、ジエチルアミン（diethylamine）（１．９ｍＬ，１８．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２．５時間反応させた。反応液をＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、最後に飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム　ヘキサン／酢酸エチル（５０：１，ｖ／ｖ）により精製し化合物２を得た。
　ＨＳ１５８　ＨＳ０５７２（１．９５ｇ，７５％）ａｓ　ａ　ｓｙｒｕｐ：１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８，Ａｒ），７．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．８Ｈｚ，Ａｒ），７．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ），３．８９（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．８３（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），１．３８－１．２９（６Ｈ，ｍ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２）；１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１６５．９，１５３．９，１４０．７，１３０．１，１２７．５，１１６．６，９５．８，５２．１，４９．６，４２．７，１４．５，１０．９。
　（ジメチル６’－（３，３－ジエチルトリアズ－１－エニル）ビフェニル－２，３’－ジカルボン酸（Dimethyl 6'-(3,3-diethyltriaz-1-enyl)biphenyl-2,3'-dicarboxylate）の合成）
　次に、化合物２を用いて、下記反応式Ｆにより化合物３を合成した（ＨＳ０６１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　化合物２（１７６ｍｇ，０．４８７ｍｍｏｌ）と２－（メトキシカルボニル）フェニルボロン酸（2-(methoxycarbonyl)phenylboronic acid）（８８ｍｇ，０．４８９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１ｍＬ）に溶解させた。次いで、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（５ｍｇ，０．０２２２ｍｍｏｌ），Ｐｈ３Ａｓ（２２ｍｇ，０．０７１８ｍｍｏｌ）、Ｋ３ＰＯ４（２８２ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）を加えた。１００℃で３時間反応させた。
　その後、酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈した。反応液を飽和食塩水で洗浄し無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム　ヘキサン／酢酸エチル（５０：１→１０：１，ｖ／ｖ）で精製し化合物３を得た。
　ＨＳ０６１１（１３５ｍｇ，７６％）ａｓ　ａ　ｓｙｒｕｐ：１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．００－７．９７（２Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．１Ｈｚ，Ａｒ），７．５６－７．３２（４Ｈ，ｍ，Ａｒ），３．９０（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．７０－３．２５（７Ｈ，ｍ，　，ＯＭｅ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），１．２７（３Ｈ，ｂｒ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），０．８２７（３Ｈ，ｂｒ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２）；１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１６８．３，１６７．３，１５１．８，１４０．５，１３６．５，１３１．８，１３１．４，１３１．０，１２９．６，１２９．３，１２６．９，１２６．１，１１６．０，５１．９，５１．７，４９．１，４１．６，１４．４，１０．７。
　（ジメチル６’－アジドビフェニル－２，３’－ジカルボン酸（Dimethyl 6'-azidobiphenyl-2,3'-dicarboxylate）の合成）
　次に化合物３を用いて、下記反応式Ｇにより化合物４を合成した（ＨＳ０６１４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　ＨＳ０６１１（７０４ｍｇ，１．９１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解させ、ＴＦＡ（２１３ｍＬ，２．８６ｍｍｏｌ）、トリメチルシリル　アジド（trimethylsilyl azide）（２７８ｍＬ，２．１０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１０分撹拌後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶解させ、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム　ヘキサン／酢酸エチル（１０：１，ｖ／ｖ）で精製し化合物４を得た。
　ＨＳ０６１４（５５７ｍｇ，９４％）ａｓ　ａ　ｓｙｒｕｐ：１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．８Ｈｚ，Ａｒ），８．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．１Ｈｚ，Ａｒ），７．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ａｒ），７．５９（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．５，１．３Ｈｚ，Ａｒ），７．４８（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．６，１．２Ｈｚ，Ａｒ），７．２７－７．２３（２Ｈ，ｍ，Ａｒ），３．９０（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．７０（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ）；１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１６７．２，１６６．３，１４２．３，１３８．３，１３３．７，１３２．０，１３１．６，１３１．４，１３０．３３，１３０．２６，１３０．２２，１２８．２，１２６．５，１１７．８，５２．２，５２．０。
　（メチル６’－アジド－３’－（２－（２－ニトロフェニルスルホンアミド）エチルカルバモイル）ビフェニル－２－カルボン酸塩（Methyl 6'-azido-3'-(2-(2-nitrophenylsulfonamido)ethylcarbamoyl)biphenyl-2-carboxylate）の合成）
　次に化合物４を用いて、下記反応式Ｈにより化合物５を合成した（ＨＳ０６３５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　アルゴン雰囲気下、ジメチル６’－アジドビフェニル－２，３’－ジカルボン酸（２３０ｍｇ，０．７７４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ，８ｍＬ）に溶解させた。次いで、ＬｉＯＨ（８１７ｍＬ，１０．９ｍｍｏｌ）ｉｎ　Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）を室温で加えた。
　２４時間撹拌した後、反応液を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈した。溶液を１Ｍ　ＨＣｌで洗浄して得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、溶媒を減圧下留去した。得られたカルボン酸中間体をＭｅＯＨ（８ｍＬ）に溶解させ、Ｎ－（２－アミノエチル）－２－ニトロベンゼンスルホンアミド塩酸塩（N-(2-aminoethyl)-2-nitrobenzenesulfonamide hydrochloride）（２１８ｍｇ，０．７７４ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルフォリン（N-methyl morpholine）（８５ｍＬ，０．７７３ｍｍｏｌ）そして４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルフォリニウム塩化物（4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl morpholiniumchloride）（３２１ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）を加えた。
　室温で２時間撹拌し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈した。反応液を蒸留水、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム　ヘキサン／酢酸エチル（１：１→１：２，ｖ／ｖ）で精製し化合物５を得た。
　ＨＳ０６３５（２２４ｍｇ，５５％）ａｓ　ａ　ｆｏａｍ：１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．１２－８．０９（１Ｈ，ｍ，Ａｒ），８．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．９，１．３Ｈｚ，Ａｒ），７．８１－７．６６（４Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．６１－７．５５（１Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．４７（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．６，１．２Ｈｚ，Ａｒ），７．２５－７．１７（２Ｈ，ｍ，Ａｒ），６．８２（１Ｈ，ｂｒ，ＮＨ），５．９２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，ＮＨ），３．７２（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．５８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨ２ＮＮｓ），３．３４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨ２ＮＮｓ）；１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１６７．５，１６７．１，１４７．９，１４１．０，１３８．２，１３３．７，１３３．６，１３３．２，１３２．９，１３２．１，１３１．４，１３１．０，１３０．４，１３０．１，１３０．０，１２９．３，１２８．２，１２７．７，１２５．３，１１７．９，５２．２，４３．２，４０．０。
　（メチル６’－アジド－３’－（２，２－ジメチル－４，１３－ジオキソ－３－オキサ－５，１２，１５－トリアザヘプタデカン－１７－イルカルバモイル）ビフェニル－２－カルボン酸塩（Methyl 6'-azido-3'-(2,2-dimethyl-4,13-dioxo-3-oxa-5,12,15-triazaheptadecan-17-ylcarbamoyl)biphenyl-2-carboxylate）の合成）
　次に、化合物５を用いて、下記反応式Ｉにより化合物７を合成した（ＨＳ０６２１，ＨＳ０６３７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　ＨＳ０６３５（１０５ｍｇ，０．２００ｍｍｏｌ），ＨＳ０６０４　Ｃ６－ｌｉｎｋｅｒ（６７ｍｇ，０．１９９ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）（８３ｍｇ，０．６０１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた。室温で２時間撹拌後，チオフェノール（２２ｍＬ，０．２１４ｍｍｏｌ）を加え、さらに２時間撹拌後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈した。反応液を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１００：０→９５：５，ｖ／ｖ）で精製し化合物７を得た。
　ＨＳ０６３７（１１２ｍｇ，９４％）ａｓ　ａ　ｓｙｒｕｐ：１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ａｒ），７．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．８Ｈｚ，Ａｒ），７．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ａｒ），７．５８（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．５，１．３Ｈｚ，Ｈ－１），７．４８（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．７，１．１Ｈｚ，Ａｒ），７．２４－７．２０（２Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．０４（２Ｈ，ｂｒ，ＮＨ），４．６２（１Ｈ，ｂｒ，ＮＨ），３．７１（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．５４（２Ｈ，　ｑ，　Ｊ　＝　５．５　Ｈｚ，　ｌｉｎｋｅｒ），　３．２６　（２Ｈ，　ｓ，　ＣＯＣＨ２ＮＨ），３．２４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ｌｉｎｋｅｒ）３．０９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ｌｉｎｋｅｒ），２．８４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，ｌｉｎｋｅｒ），１．９６（１Ｈ，ｂｒ，ＮＨ），１．４６－１．２９（１７Ｈ，ｍ，Ｂｏｃ，ｌｉｎｋｅｒ）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７１．４，１６７．４，１６６．８，１５６．２，１４０．９，１３８．４，１３３．７，１３２．０，１３１．４，１３０．６，１３０．４，１３０．１，１２９．１，１２８．２，１２７．８，１１７．９，７９．１，５２．３，５２．１，４９．４，４０．２，４０．０，３８．８，２９．８，２９．４，２８．４，２６．２，２６．０。
　（１１－（２－（６－アジド－６’－（メトキシカルボニル）ビフェニル－３－イルカルボキシアミド）－２，５，８－トリス（カルボキシメチル）－２４，２４－ジメチル－１０，１３，２２－トリオキソ－２３－オキサ－２，５，８，１１，１４，２１－ヘキサアザペンタコサン－１－カルボン酸Ｅｔ３Ｎ塩（11-(2-(6-azido-6'-(methoxycarbonyl)biphenyl-3-ylcarboxamido)ethyl)-2,5,8-tris(c arboxymethyl)-24,24-dimethyl-10,13,22-trioxo-23-oxa-2,5,8,11,14,21- hexaazapentacosane-1-carboxylic acidEt3N salt）の合成）
　次に、化合物７を用いて、下記反応式Ｊにより化合物８を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　アルゴン雰囲気下、ジエチレントリアミン五酢酸二無水物（１３４ｍｇ，０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（３１ｍＬ，０．２２７ｍｍｏｌ）を加えた。メチル６’－アジド－３’－（２，２－ジメチル－４，１３－ジオキソ－３－オキサ－５，１２，１５－トリアザヘプタデカン－１７－イルカルバモイル）ビフェニル－２－カルボン酸塩（Methyl 6'-azido-3'-(2,2-dimethyl-4,13-dioxo-3-oxa-5,12,15-triazaheptadecan-17-ylcarbamoyl)biphenyl-2-carboxylate）（４５ｍｇ，７６ｍicro ｍｏｌ）ｉｎ　ＤＭＦ（２ｍＬ）をゆっくりと加え、室温で２時間撹拌した。Ｅｔ３Ｎ－Ｈ２Ｏ（１ｍＬ，ｖ／ｖ）を加え反応を停止した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣにより精製し、化合物８を得た（５３ｍｇ，６５％）。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ８．０４－７．９３（２Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．９，２．２Ｈｚ，Ａｒ），７．６４（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．６，１．２Ｈｚ，Ａｒ），７．５０（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．７，１．２Ｈｚ，Ａｒ），７．５０（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．７，１．２Ｈｚ，Ａｒ），７．３９－７．３３（２Ｈ，ｍ，Ａｒ），４．２０－４．０９（４Ｈ，ｍ，ｌｉｎｋｅｒ），３．７５－３．３９（１８Ｈ，ｍ，ｌｉｎｋｅｒ），３．２３－２．９８（１５Ｈ，ｍ，ｌｉｎｋｅｒ，Ｅｔ３Ｎ），１．４２－１．２７（２６Ｈ，ｍ，ｌｉｎｋｅｒ，Ｅｔ３Ｎ）。
　（チオ化ＤＮＡとのカップリング）
　次に、下記反応式Ｋにより、得られた化合物８をチオ化ＤＮＡとカップリングさせ、化合物９を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　１１－（２－（６－アジド－６’－（メトキシカルボニル）ビフェニル－３－イルカルボキシアミド）－２，５，８－トリス（カルボキシメチル）－２４，２４－ジメチル－１０，１３，２２－トリオキソ－２３－オキサ－２，５，８，１１，１４，２１－ヘキサアザペンタコサン－１－カルボン酸Ｅｔ３Ｎ塩（化合物８）（１２ｍｇ，１１ｍｍｏｌ）を０℃でＴＦＡ（５００ｍＬ）に溶解させ、３時間攪拌した。
　溶媒を留去し、ＣＨ３ＣＮ－Ｈ２Ｏ（１ｍＬ，１：１，ｖ／ｖ）に溶解させた後ＮａＨＣＯ３（９ｍｇ）を加え、ブロモアセチルヒドロキシスクシンイミドエステル（３ｍｇ，１２．７マイクロｍｏｌ）を加え２０時間攪拌した。この溶液を次の反応に精製せずに用いた。
　次に、この溶液（プローブの前駆体（ｃａ　７５０ｎｍｏｌ）を含む）と５ｍＭチオ化ＤＮＡ（配列番号１：５’－GCCGGCGG－３’）（７５ｎｍｏｌ）とを４００ｍＭ　ＴＥＡＢ　ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、室温で１８時間反応させた。反応液に３Ｍ　酢酸ナトリウム（２０ｍＬ）とエタノール（６００ｍＬ）とを加え、－２０℃で１時間冷却した。その後、４℃、１５０００ｒｐｍにて３０分遠心機にかけ、得られた沈殿をＨＰＬＣで分取した。その結果、化合物９を得た。
　その後、１ｍＭ　ＥｕＣｌ３存在下、５０ｍＭ　ＭＯＰＳバッファー中３７℃１時間反応させ、ＨＰＬＣで分取した。これにより、化合物９のキレーター部にユウロピウムをキレートさせ、蛍光プローブを得た。
　〔実施例２：スイッチ部の構造変化による吸収スペクトルの変化〕
　本実施例では、実施例１で作製した蛍光プローブのスイッチ部における、還元反応による構造変化の前後での吸収スペクトルを測定した。
　蛍光プローブ（５０μＭ）を、２０ｍＭ　ＴＣＥＰ，５０％ＤＭＦ－Ｈ２Ｏ、及び室温の条件下で１０分間反応させた。この反応の前後における吸収スペクトルを測定した。吸収スペクトルは、紫外可視分光光度計（Ｖ－５５０、日本分光社製）によりスペクトル測定モードを用いて測定した。
　その結果を図４に示す。図４は、本発明に係る蛍光プローブの一実施例において、スイッチ部の構造変化前後の吸収スペクトルを示す図である。
　図４に示すように、構造変化後のスイッチ部は、３４０ｎｍ近傍に吸収極大波長を有していることが分かった。この吸収極大波長は、構造変化前の構造では見られないものであった。
　〔実施例３：標的分子の検出〕
　実施例１で作製した蛍光プローブを用いて、標的分子として核酸を検出した。
　まず、ホスフィンプローブ（第２のプローブ）として、トリフェニルホスフィン結合ＤＮＡを作製した。
　トリフェニルホスフィン基の付加は、５’ａｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｄオリゴ（配列番号２：5'-TGTGGGCA-3'）と反応させることにより行なった。５’ａｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｄオリゴの合成には、５’ａｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｒ５（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。反応は、８ｍＭのトリフェニルホスフィンＮＨＳエステル（ｉｎ　ＤＭＦ）、５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウムバッファー、２００μＭの５’ａｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｄオリゴ溶液を含む混合液を、室温で３時間激しく撹拌することにより行なった（反応液中のＤＭＦ濃度は４６％）。反応産物をエタノール沈殿により回収した後、逆相ＨＰＬＣ（グラジエント条件：０－５０％アセトニトリル／５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート）にて精製を行なった。また、ＥＳＩ－ＴＯＦ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙにより目的の産物が得られていることを確認した。
5'-TGTGGGCAtriphenylphosphine-3'：calculated mass, C104H126N33O51P92931.6；found 2932.6。
　実施例１で作製した蛍光プローブ（５００ｎＭ）、ホスフィンプローブ（５００ｎＭ）、及び標的分子として用いるＤＮＡ（配列番号３：３’－CGCGGCCGCCACACCCGTTC－５’）（５００ｎＭ）を１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＭＯＰＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）中にて反応させ、３０分後に、Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ－３（ＨＯＲＩＢＡＪｏｂｉｎＹｖｏｎ社製）を用いてリン光測定モード（ｅｘ３４０　ｎＭ）にて時間分解蛍光測定を行った。（測定条件：ｄｅｌａｙ　ｔｉｍｅ　０．０５ｍｓ，ｇａｔｅ　ｔｉｍｅ　３ｍｓ，ｓｌｉｔ　１０，１０，）また、標的分子を含まない条件で、同様の実験を行なった。
　その結果を図５に示す。図５は、本発明に係る蛍光プローブの一実施例を用いて標的分子を検出した際の蛍光強度を示すグラフである。
　図５に示すように、標的分子を含む条件下では蛍光が検出された。一方、標的分子を含まない条件下では、ほとんど蛍光が検出されなかった。また、標的分子を含む条件下で検出された蛍光は、３５倍のシグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を示した。
　したがって、本発明に係る蛍光プローブを用いれば、バックグラウンドを排除し、高感度で標的分子を検出できることが示された。
　〔実施例４：生細胞内における標的核酸の検出〕
　蛍光プローブ（第１のプローブ）としてランタノイドプローブ（Ｔｂ３＋）（配列番号４：5’-CTGGCGGTCTGGGTT-3’）を作製した。また、標的ＤＮＡと結合する配列（マッチ配列；配列番号５：5’-GTTTCCCTCTTCACG-3’）を持つホスフィンプローブ（第２のプローブ）を作製した。これらは、実施例１～３と同様の方法を用いて作製した。なお、対照として、スクランブル配列（配列番号２：5’-TGTGGGCA-3’）を持つホスフィンプローブを用いた。
　これらの蛍光プローブ及びホスフィンプローブを用いて、大腸菌内において大腸菌の２３ＳｒＲＮＡ（標的分子；配列番号６：3’-GACCGCCAGACCCAACAAAGGGAGAAGUGC-5’）を検出した。
　ランタノイドプローブ、ホスフィンプローブ、及び培養した大腸菌（ＪＭ１０９）１．０ＯＤを、５０ｍＭ　ＭＯＰＳ，１ＭＮａＣｌ，０．０５％ＳＤＳ存在下、室温で３０分反応させた。反応液をそのまま用い、時間分解蛍光測定法によって蛍光強度を測定し、以下のスペクトルを得た（測定条件：ｅｘ：３４０ｎｍ，ｄｅｌａｙ　ｔｉｍｅ　０．１ｍｓ，ｇａｔｅ　ｔｉｍｅ　６ｍｓ，ｓｌｉｔ　１０，１０，）。
　図６は、本発明に係る蛍光プローブの他の実施例を用いて、生細胞内の標的分子を検出した際の蛍光強度を示す図である。蛍光プローブと、マッチ配列を持つホスフィンプローブとを用いた場合には、時間分解蛍光測定法により蛍光シグナルを観測することができた。したがって、本発明に係る蛍光プローブを用いれば、生細胞内のＲＮＡ配列を選択的に検出し、蛍光シグナルを発生させることができることが示された。
　なお、参考として、上述した反応液の蛍光強度と、大腸菌のみを含むサンプルとを、通常の蛍光測定法（すなわち遅延時間がない）によって測定した。図７に、通常の蛍光測定法によって生細胞の蛍光強度を測定した際の蛍光スペクトルを示す。通常の蛍光測定法では、４００ｎＭ－６００ｎＭにわたって大腸菌由来の大きな自家蛍光のピークが観測され、蛍光プローブによるシグナルと重なることが確認された。
　本発明は、バックグラウンドを排除して高感度に検出することが可能な蛍光プローブを提供することができるので、バックグラウンドが高い条件下で標的分子を検出するためのプローブ、検出方法などに好適に利用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (12)

  1. 　標的分子を検出するための蛍光プローブであって、
    　下記式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （上記式（１）中、Ａ１、Ａ２は、それぞれ独立して芳香族環を表し、Ｘは任意の基を表し、Ｙは還元されることにより－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基、又は、加水分解により－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基を表す。Ｒａは、炭素数１～６のアルキル基、炭素数６～１０のアリール基、－ＳＯ２－Ｒ、－ＯＨ、又は－ＮＲ２（Ｒは水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、－ＮＲ２における２つのＲは互いに異なっていてもよい。）を表し、－ＮＲａ２における２つのＲａは互いに異なっていてもよい。）
    で表されるスイッチ部と、
    　上記式（１）中のＡ１及びＡ２の少なくとも一方に結合された、希土類元素をキレートするキレーター部とを含むことを特徴とする蛍光プローブ。
  2. 　上記式（１）中、Ａ２は置換基を有してもよい５員環又は６員環を表し、
    　上記キレーター部はＡ２に結合されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光プローブ。
  3. 　上記式（１）中、Ｘはアルコキシ基又はアミノ基を表すことを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
  4. 　さらに、上記スイッチ部及び上記キレーター部を含む分子に一端が結合されたリンカー部と、
    　上記リンカー部の他端に結合されており、かつ上記標的分子に対して特異的に結合する分子認識部とを含むことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の蛍光プローブ。
  5. 　下記式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （上記式（２）中、Ｒ２は炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ３は上記キレーター部を表し、Ｚ３は上記リンカー部を表し、Ｒ４は上記分子認識部を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してリンカーを表し、Ｙは還元されることにより－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基、又は、加水分解により－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基を表す。Ｒａは、炭素数１～６のアルキル基、炭素数６～１０のアリール基、－ＳＯ２－Ｒ、－ＯＨ、又は－ＮＲ２（Ｒは水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、－ＮＲ２における２つのＲは互いに異なっていてもよい。）を表し、－ＮＲａ２における２つのＲａは互いに異なっていてもよい。）
    で表されることを特徴とする請求項４に記載の蛍光プローブ。
  6. 　上記式（１）又は上記式（２）中、Ｙがアジド基、アゾ基、又はニトロソ基を表すことを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の蛍光プローブ。
  7. 　蛍光プローブを標的分子と接触させる接触工程と、
    　検出工程とを含んでおり、
    　上記蛍光プローブは、
    　下記式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （上記式（１）中、Ａ１、Ａ２は、それぞれ独立して芳香族環を表し、Ｘは任意の基を表し、Ｙは還元されることにより－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基、又は、加水分解により－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基を表す。Ｒａは、炭素数１～６のアルキル基、炭素数６～１０のアリール基、－ＳＯ２－Ｒ、－ＯＨ、又は－ＮＲ２（Ｒは水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、－ＮＲ２における２つのＲは互いに異なっていてもよい。）を表し、－ＮＲａ２における２つのＲａは互いに異なっていてもよい。）
    で表されるスイッチ部と、
    　上記式（１）中のＡ１及びＡ２の少なくとも一方に結合された、希土類元素をキレートするキレーター部とを含んでおり、
    　上記検出工程は、上記標的分子と接触することにより上記スイッチ部のＹが還元又は加水分解されて－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、又は－ＮＲａ２が生成し、さらに上記スイッチ部が構造変化することによって上記キレーター部から発する蛍光の、発生の有無を検出することを特徴とする、標的分子の検出方法。
  8. 　第１のプローブと第２のプローブとを標的分子に結合させる結合工程と、
    　検出工程とを含んでおり、
    　上記第１のプローブは、
    　　上記標的分子に対して特異的に結合する第１の分子認識部と、
    　　下記式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （上記式（１）中、Ａ１、Ａ２は、それぞれ独立して芳香族環を表し、Ｘは任意の基を表し、Ｙは還元されることにより－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基、又は、加水分解により－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、もしくは－ＮＲａ２となる基を表す。Ｒａは、炭素数１～６のアルキル基、炭素数６～１０のアリール基、－ＳＯ２－Ｒ、－ＯＨ、又は－ＮＲ２（Ｒは水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、－ＮＲ２における２つのＲは互いに異なっていてもよい。）を表し、－ＮＲａ２における２つのＲａは互いに異なっていてもよい。）
    で表されるスイッチ部と、
    　　上記式（１）中のＡ１及びＡ２の少なくとも一方に結合された、希土類元素をキレートしているキレーター部と、
    　　上記スイッチ部及び上記キレーター部を含む分子を上記第１の分子認識部に結合させているリンカー部とを含んでおり、
    　上記第２のプローブは、
    　　上記標的分子における上記第１の分子認識部が結合する部位と隣接する部位に特異的に結合する第２の分子認識部と、
    　　上記第２の分子認識部に結合された還元作用又は加水分解作用を有する分子とを含んでおり、
    　上記検出工程は、上記還元作用又は加水分解作用を有する分子によって上記スイッチ部のＹが還元又は加水分解されて－ＮＨ２、－ＮＨＲａ、又は－ＮＲａ２が生成し、さらに上記スイッチ部が構造変化することによって上記キレーター部から発する蛍光の、発生の有無を検出することを特徴とする、標的分子の検出方法。
  9. 　上記標的分子が核酸であり、
    　上記第１の分子認識部が上記標的分子の一部の領域と相補的な配列を含む核酸であり、
    　上記第２の分子認識部が、上記標的分子のうち、上記第１の分子認識部が結合する領域に０～１０塩基のスペースを介して隣接する領域と相補的な配列を含む核酸であることを特徴とする請求項８に記載の標的分子の検出方法。
  10. 　上記標的分子がタンパク質であり、
    　上記第１の分子認識部及び上記第２の分子認識部が上記タンパク質に対するアプタマーであることを特徴とする請求項８に記載の標的分子の検出方法。
  11. 　上記結合工程の前に、上記第１のプローブと上記第２のプローブとを細胞内に導入する導入工程を含み、
    　上記結合工程は、上記細胞内において行なうことを特徴とする請求項８～１０のいずれかに記載の標的分子の検出方法。
  12. 　請求項８又は９に記載の標的分子の検出方法を用いて、スプラインシング反応の阻害剤をスクリーニングする方法であって、
    　プレｍＲＮＡがスプライシングされて生じる成熟ｍＲＮＡを上記標的分子とし、
    　上記第１のプローブと、上記第２のプローブと、上記プレｍＲＮＡと、試験化合物とをスプライシング反応溶液中で反応させることで、成熟ｍＲＮＡが生じている場合に上記第１のプローブと上記第２のプローブとを標的分子たる当該成熟ｍＲＮＡに結合させる上記結合工程と、上記キレーター部から発する蛍光の発生の有無を検出する上記検出工程とを行なうことを特徴とするスプライシング反応の阻害剤のスクリーニング方法。
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